JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Bioengineering

Fremstilling af magnetiske platforme til Micron-Scale Organisation af sammenkoblede neuroner

Published: July 14, 2021
doi:
10.3791/62013
, , , , , , , ,
1Department of Physics,Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering,Bar-Ilan University, 3Department of chemistry,Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials,Bar-Ilan University

Summary

Dette arbejde præsenterer en bottom-up tilgang til konstruktion af lokale magnetiske kræfter til kontrol af neuronal organisation. Neuron-lignende celler fyldt med magnetiske nanopartikler (PARP’er) er belagt på toppen og kontrolleret af en mikromønstret platform med vinkelret magnetisering. Også beskrevet er magnetisk karakterisering, MNP cellulære optagelse, celle levedygtighed, og statistisk analyse.

Abstract

Evnen til at lede neuroner ind i organiserede neurale netværk har store konsekvenser for regenerativ medicin, vævsteknik og biointerfacing. Mange undersøgelser har til formål at lede neuroner ved hjælp af kemiske og topografiske signaler. Der er imidlertid kun få rapporter om organisatorisk kontrol i mikronskala over store områder. Her er en effektiv metode blevet beskrevet til at placere neuroner på forudindstillede steder og vejlede neuronal udvækst med mikron-skala opløsning, ved hjælp af magnetiske platforme indlejret med mikro-mønstrede, magnetiske elementer. Det er blevet påvist, at lastning neuroner med magnetiske nanopartikler (PARP’er) konverterer dem til følsomme magnetiske enheder, der kan påvirkes af magnetiske gradienter. Efter denne tilgang er en unik magnetisk platform blevet fremstillet på hvilke PC12-celler, en fælles neuronlignende model, blev belagt og fyldt med superparamagnetiske nanopartikler. Tynde film af ferromagnetiske (FM) multilayers med stabil vinkelret magnetisering blev deponeret for at give effektive tiltrækning kræfter mod magnetiske mønstre. Disse MNP-belastede PC12-celler, belagt og differentieret oven på de magnetiske platforme, var fortrinsvis knyttet til de magnetiske mønstre, og neurite udvæksten var godt afstemt med mønsterformen og dannede orienterede netværk. Kvantitative karakteriseringsmetoder af de magnetiske egenskaber, cellulær MNP-optagelse, celle levedygtighed og statistisk analyse af resultaterne præsenteres. Denne tilgang gør det muligt at kontrollere neural netværksdannelse og forbedrer neuron-til-elektrode-grænsefladen gennem manipulation af magnetiske kræfter, som kan være et effektivt værktøj til in vitro-undersøgelser af netværk og kan tilbyde nye terapeutiske biointerfacing retninger.

Introduction

Mikromaling af neuroner rummer et stort potentiale for vævsregenerering1,2,3,4,5 og udvikling af neuroelektroniske enheder6,7,8. Imidlertid udgør den mikronskalerede positionering af neuroner ved høj rumlig opløsning, som i biologisk væv, en betydelig udfordring. Dannelse af foruddesignede strukturer i denne skala kræver vejledning af nervecelleprocesser ved lokalt at kontrollere soma motilitet og axonal udvækst. Tidligere undersøgelser har foreslået brugen af kemiske og fysiske signaler9,10,11,12 til at styre neuronal vækst. Her fokuserer en ny tilgang på at kontrollere cellepositionering ved hjælp af magnetfeltgradienter13,14,15,16,17, dreje celler fyldt med parlamentsmedlemmer til magnetisk følsomme enheder, som kan fjernstyres manipuleret.

Kunze et al., der karakteriserede den kraft, der er nødvendig for at fremkalde cellulære reaktioner ved hjælp af magnetiske chip- og MNP-belastede celler, beviste, at tidlig axonal forlængelse kan udløses af mekanisk spænding inde i celler18. Tay et al. bekræftede, at mikrofabrikerede substrater med forbedrede magnetfeltgradienter giver mulighed for trådløs stimulering af neurale kredsløb doseret med parlamentsmedlemmer ved hjælp af calciumindikatorfarvestoffer19. Desuden Tseng et al. coalesced nanopartikler inde i celler, hvilket resulterer i lokaliserede nanopartikel-medierede kræfter, der nærmede sig cellulære spændinger20. Dette førte til fremstilling af definerede mønstre af mikromagnetiske substrater, der hjalp med at studere cellulær reaktion på mekaniske kræfter. Cellulære spændinger som følge af anvendelsen af lokaliserede nanopartikelmedierede kræfter blev opnået ved at samle nanopartikler icellerne 20. En supplerende metaloxid halvleder (CMOS)-mikrofluidic hybrid system blev udviklet af Lee et al., der indlejrede en række mikro-elektromagneter i CMOS-chippen for at kontrollere bevægelsen af individuelle celler mærket med magnetiske perler21.

Alon et al. brugte mikroskala, forprogrammerede, magnetiske puder som magnetiske “hot spots” til at lokalisere celler22. Specifik aktivitet kan også stimuleres i celler ved hjælp af mikromønstrede magnetmatrixer til lokalisering af nanopartikler på bestemte subcellulære steder23. Cellulære MNP optagelse er blevet demonstreret med succes i igle, rotte, og musen primære neuroner24,25,26. Her er dette blevet påvist på en rotte PC12 pheochromocytoma cellelinje, som tidligere er blevet rapporteret til at vise høj optagelse af parlamentsmedlemmer27. I de senere år har der været forskellige medicinske anvendelser af parlamentsmedlemmer, herunder lægemiddellevering og termoterapi ikræftbehandlinger 28,29,30,31. Specifikt, undersøgelser beskæftiger sig med anvendelsen af parlamentsmedlemmer og neuron netværk32,33,34,35. Men den magnetiske organisering af neuroner ved hjælp af parlamentsmedlemmer på en enkelt celle niveau fortjener yderligere undersøgelse.

I dette arbejde er en bottom-up-tilgang blevet beskrevet for at konstruere lokale magnetiske kræfter via foruddesignede platforme til styring af neuronal arrangement. Fremstillingen af mikron-skala mønstre af FM multilayers er blevet præsenteret. Denne unikke, FM flerlags struktur skaber stabil vinkelret magnetisering, der resulterer i effektive attraktion kræfter mod alle de magnetiske mønstre. Via inkubation blev parlamentsmedlemmer indlæst i PC12-celler og omdannede dem til magnetiske følsomme enheder. MNP-belastede celler, belagt og differentieret oven på de magnetiske platforme, var fortrinsvis knyttet til de magnetiske mønstre, og neurite udvækst var godt afstemt med mønsteret form, danner orienterede netværk. Flere metoder er blevet beskrevet for at karakterisere de magnetiske egenskaber FM multilayers og parlamentsmedlemmer, og teknikker til cellulære MNP optagelse og celle levedygtighed assays er også blevet præsenteret. Derudover er morfometriske parametre for neuronal vækst og statistisk analyse af resultaterne detaljerede.

Protocol

BEMÆRK: Udfør alle biologiske reaktioner i et biosikkerhedsskab. 1. Magnetisk platform fabrikation litografi Skær glasrutsjebaner i 2 x 2 cm2 ved hjælp af en skrivepen. Rengør glasrutsjebanerne i acetone og isopropanol i 5 minutter hver i et ultra-sonikeringsbad. Tør med ultra-høj renhed (UHP) nitrogen. Glasglasset belægges med fotoresist med spin-coating ved 6.000 omdrejninger i minuttet i 60 s for at opnå en tykkelse på 1,5 μm og bages ved 1…

Representative Results

Magnetiske platforme med forskellige geometriske former blev fremstillet (Figur 1A). Magnetiske mønstre blev deponeret ved sputtering: 14 multilayers af Co80Fe20 og Pd, 0,2 nm og 1 nm, hhv. Elektronmikroskopi afslørede den samlede højde af de magnetiske mønstre til at være ~ 18 nm (Figur 1B). Denne unikke FM multilayer deposition skaber en stabil platform med vinkelret magnetisering anisotropi (PMA) i f…

Discussion

De repræsentative resultater viser effektiviteten af den præsenterede metode til styring og organisering af neuronal netværksdannelse på mikron-skalaen. De MNP-belastede PC12-celler forblev levedygtige og blev omdannet til magnetiske følsomme enheder, der blev tiltrukket af de magnetiske kræfter fra FM-elektroderne til specifikke steder. Dette fremgår bedst af figur 5C, hvor cellerne fortrinsvis overholdt sekskanternes større knudepunkter og ikke de tynde linjer. Desuden udviklede fo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskning blev støttet af Ministeriet for Videnskab &Teknologi, Israel, og af den israelske Science Foundation (569/16).

Materials

16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 15710
6-well cell culture plate FALCON 353846
96-well cell culture plate SPL life sciences 30096
Amphotericin B solution Biological Industries 03-028-1B
AZ 1514H photoresist MicroChemicals GmbH
AZ 351 B developer MicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA) Biological Industries 03-010-1B
Cell and Tissue cultur flask Biofil TCF002250 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dish Greiner Bio-One 627-160 35 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based) Biological Industries 20-300-1000
Centrifuge tube Biofil CFT021500 50 mL
Co80Fe20 at% sputter target ACI Alloys 99.95%
Collagen type I Corning Inc. 354236 Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscope Leica TCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-165-152
DAPI fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Disposable needle KDL 23 G
Disposable  syringe Medispo 1160227640 10 mL
Donor horse serum Biological Industries 04-124-1A
ELISA reader Merk Millipore BioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70% ROMICAL LTD 19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated) Biolab-chemicals 52505
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
Fresh murine β-NGF Peprotech 450-34
GMW C-frame electromagnet . Buckley systems LTD 3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32% DAEJUNG CHEMICAL & METALS 4170-4100
ImageJ US National Institutes of Health, Bethesda NeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP) Ametek Spectro SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measure Keithley 2400
Keithley switching system Keithley 3700
L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
Light microscope Leica DMIL LED
Maskless photolithography Heidelberg Inst. MLA150
Microscope Slides BAR-NAOR BN1042000C
Nitric acid 70% Sigma-Aldrich 438073
Normal donkey serum (NDS) Sigma D9663
PBS 10x hylabs BP507/1LD
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Pd sputter target ACI Alloys 99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solution Biological Industries 03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagent Molecular probes A-13261 resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulin Santa Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering system Orion AJA Int. Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamine Biological Industries 01-100-1A
Sonication bath KUDOS SK3210HP Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometer Quantum Design, CA
Triton X-100 CHEM-IMPEX INTERNATIONAL 1279 non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
  3. Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
  4. Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
  5. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
  6. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  7. Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
  8. Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
  9. Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  10. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  11. Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
  12. Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
  13. Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560 (2020).
  14. Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
  15. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), 1425-1442 (2012).
  16. Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299 (2018).
  17. Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  18. Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
  19. Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
  20. Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
  21. Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system – CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
  22. Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030 (2015).
  23. Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
  24. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37 (2016).
  25. Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
  26. Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
  27. Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32 (2012).
  28. Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
  29. Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
  30. Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
  31. Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
  32. Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
  33. Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
  34. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  35. Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
  36. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  37. Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055 (2020).
  38. Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911 (2014).
  39. Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , (1999).
  40. Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
  41. Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
  42. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
  43. Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303 (2015).
  44. Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
  45. Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403 (2014).
  46. Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
  47. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
  48. Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707 (2018).

Tags

Magnetic PlatformsMicron-scale OrganizationInterconnected NeuronsNeural Network FormationMagnetic ManipulationsIn Vitro StudiesBiointerfacing DevicesMagnetic NanoparticlesPhotolithographyFerromagnetic Multilayers

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., Vardi, N., Marcus, M., Smith, A., Margel, S., Shefi, O., Sharoni, A. Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. Exp. (173), e62013, doi:10.3791/62013 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image