Dette arbeidet presenterer en nedenfra-og-opp-tilnærming til prosjektering av lokale magnetiske krefter for kontroll av nevronisk organisering. Nevronlignende celler lastet med magnetiske nanopartikler (MNPer) er belagt på toppen og styres av en mikromønstret plattform med vinkelrett magnetisering. Også beskrevet er magnetisk karakterisering, MNP cellulært opptak, celle levedyktighet og statistisk analyse.
Evnen til å lede nevroner inn i organiserte nevrale nettverk har store implikasjoner for regenerativ medisin, vevsteknikk og bio-grensesnitt. Mange studier har som mål å lede nevroner ved hjelp av kjemiske og topografiske signaler. Rapporter om organisatorisk kontroll på mikron-skala over store områder er imidlertid knappe. Her er det beskrevet en effektiv metode for å plassere nevroner på forhåndsinnstilte steder og veilede nevronal utvekst med mikron-skala oppløsning, ved hjelp av magnetiske plattformer innebygd med mikromønstrede, magnetiske elementer. Det har blitt demonstrert at lasting av nevroner med magnetiske nanopartikler (MNPer) konverterer dem til sensitive magnetiske enheter som kan påvirkes av magnetiske gradienter. Etter denne tilnærmingen har en unik magnetisk plattform blitt fabrikkert på hvilke PC12-celler, en vanlig nevronlignende modell, ble belagt og lastet med superparamagnetiske nanopartikler. Tynne filmer av ferromagnetiske (FM) flerlagsmotorer med stabil vinkelrett magnetisering ble avsatt for å gi effektive tiltrekningskrefter mot de magnetiske mønstrene. Disse MNP-lastede PC12-cellene, belagt og differensiert på toppen av de magnetiske plattformene, ble fortrinnsvis festet til de magnetiske mønstrene, og nevrittutveksten var godt tilpasset mønsterformen og dannet orienterte nettverk. Kvantitative karakteriseringsmetoder for magnetiske egenskaper, cellulært MNP-opptak, celle levedyktighet og statistisk analyse av resultatene presenteres. Denne tilnærmingen muliggjør kontroll av nevral nettverksdannelse og forbedrer nevron-til-elektrode-grensesnittet gjennom manipulering av magnetiske krefter, noe som kan være et effektivt verktøy for in vitro-studier av nettverk og kan tilby nye terapeutiske biointerfacing retninger.
Mikropattering av nevroner har stort potensial for vevregenerering1,2,3,4,5 og utvikling av nevro-elektroniske enheter6,7,8. Imidlertid utgjør den mikron-skalerte posisjoneringen av nevroner med høy romlig oppløsning, som i biologisk vev, en betydelig utfordring. Å danne predesignede strukturer i denne skalaen krever veiledning av nervecelleprosesser ved å lokalt kontrollere soma motilitet og axonal utvekst. Tidligere studier har antydet bruk av kjemiske og fysiske signaler9,10,11,12 for å veilede nevronvekst. Her fokuserer en ny tilnærming på å kontrollere celleposisjonering ved magnetiske feltgradienter13,14,15,16,17, snu celler lastet med MNPer til magnetiske sensitive enheter, som kan manipuleres eksternt.
Kunze et al., som karakteriserte kraften som trengs for å indusere cellulære responser ved hjelp av magnetiske chip- og MNP-ladede celler, viste at tidlig axonal forlengelse kan utløses av mekanisk spenning inne i celle18. Tay et al. bekreftet at mikro-fabrikkerte substrater med forbedrede magnetiske feltgradienter gir mulighet for trådløs stimulering av nevrale kretser dosert med MNPer ved hjelp av kalsiumindikatorfargestoffer19. Videre samlet Tseng et al. sammenknyttede nanopartikler inne i celler, noe som resulterte i lokaliserte nanopartikkelmediert krefter som nærmet seg cellulær spenning20. Dette førte til fabrikasjon av definerte mønstre av mikromagnetiske substrater som bidro til å studere cellulær respons på mekaniske krefter. Cellulær spenning som oppstår ved bruk av lokaliserte nanopartikkelmedierte krefter ble oppnådd ved å samle nanopartikler i celle20. Et komplementært metalloksid halvleder (CMOS)-mikrofluidisk hybridsystem ble utviklet av Lee et al. som innebygd en rekke mikroelektromagneter i CMOS-brikken for å kontrollere bevegelsen til individuelle celler merket med magnetiske perler21.
Alon et al. brukte mikroskala, forhåndsprogrammerte, magnetiske pads som magnetiske “hot spots” for å finne cellene22. Spesifikk aktivitet kan også stimuleres i celler ved hjelp av mikromønstrede magnetiske matriser for å lokalisere nanopartikler på bestemte subcellulære steder23. Cellulært MNP-opptak har blitt demonstrert i leech, rotte og mus primære nevroner24,25,26. Her har dette blitt demonstrert på en rotte PC12 pheochromocytoma cellelinje, som tidligere har blitt rapportert å vise høyt opptak av MNPs27. De siste årene har det vært ulike medisinske anvendelser av MNPer, inkludert legemiddellevering og termoterapi i kreftbehandlinger28,29,30,31. Spesielt håndterer studier anvendelsen av MNPer og nevronnettverk32,33,34,35. Imidlertid fortjener den magnetiske organiseringen av nevroner som bruker MNPer på et enkeltcellet nivå videre undersøkelse.
I dette arbeidet har en nedenfra-og-opp-tilnærming blitt beskrevet for å konstruere lokale magnetiske krefter via forhåndsdesignede plattformer for å kontrollere nevronarrangement. Fabrikasjonen av mikron-skala mønstre av FM flerlags har blitt presentert. Denne unike, FM flerlags strukturen skaper stabil vinkelrett magnetisering som resulterer i effektive tiltrekningskrefter mot alle magnetiske mønstre. Via inkubasjon ble MNPer lastet inn i PC12-celler, og forvandlet dem til magnetiske sensitive enheter. MNP-lastede celler, belagt og differensiert på toppen av de magnetiske plattformene, ble fortrinnsvis festet til de magnetiske mønstrene, og nevrittutveksten var godt tilpasset mønsterformen og dannet orienterte nettverk. Flere metoder har blitt beskrevet for å karakterisere de magnetiske egenskapene til FM-flerlags- og MNP-ene, og teknikker for cellulære MNP-opptak og celle levedyktighetsanalyser har også blitt presentert. I tillegg er morfometriske parametere for nevronvekst og statistisk analyse av resultatene detaljert.
De representative resultatene viser effektiviteten av den presenterte metodikken for å kontrollere og organisere nevronal nettverksdannelse i mikronskala. De MNP-lastede PC12-cellene forble levedyktige og ble forvandlet til magnetiske sensitive enheter som ble tiltrukket av magnetkreftene fra FM-elektrodene til bestemte steder. Dette er best demonstrert i figur 5C, der cellene fortrinnsvis festet seg til de større toppunktene i sekskantene og ikke de tynne linjene. Videre utviklet forgreni…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av Vitenskaps- og teknologidepartementet, Israel, og av Den israelske vitenskapsstiftelsen (569/16).
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 15710 | |
6-well cell culture plate | FALCON | 353846 | |
96-well cell culture plate | SPL life sciences | 30096 | |
Amphotericin B solution | Biological Industries | 03-028-1B | |
AZ 1514H photoresist | MicroChemicals GmbH | ||
AZ 351 B developer | MicroChemicals GmbH | ||
Bovine serum albumin (BSA) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Cell and Tissue cultur flask | Biofil | TCF002250 | 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated |
Cell culture dish | Greiner Bio-One | 627-160 | 35 mm |
Cell Proliferation Kit (XTT-based) | Biological Industries | 20-300-1000 | |
Centrifuge tube | Biofil | CFT021500 | 50 mL |
Co80Fe20 at% sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
Collagen type I | Corning Inc. | 354236 | Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL |
Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-165-152 | |
DAPI fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Disposable needle | KDL | 23 G | |
Disposable syringe | Medispo | 1160227640 | 10 mL |
Donor horse serum | Biological Industries | 04-124-1A | |
ELISA reader | Merk Millipore | BioTek synergy 4 hybrid microplate reader | |
Ethanol 70% | ROMICAL LTD | 19-009102-80 | |
Ethanol absolute (Dehydrated) | Biolab-chemicals | 52505 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
Fresh murine β-NGF | Peprotech | 450-34 | |
GMW C-frame electromagnet . | Buckley systems LTD | 3470, 45 mm | |
Hydrochloric acid 32% | DAEJUNG CHEMICAL & METALS | 4170-4100 | |
ImageJ | US National Institutes of Health, Bethesda | NeuronJ plugin | |
Inductively coupled plasma (ICP) | Ametek Spectro | SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma | |
Keithley source-measure | Keithley | 2400 | |
Keithley switching system | Keithley | 3700 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
Light microscope | Leica | DMIL LED | |
Maskless photolithography | Heidelberg Inst. | MLA150 | |
Microscope Slides | BAR-NAOR | BN1042000C | |
Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 438073 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma | D9663 | |
PBS 10x | hylabs | BP507/1LD | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Pd sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
Penicillin-streptomycin nystatin solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
PrestoBlue cell viability reagent | Molecular probes | A-13261 | resazurin-based |
Rabbit antibody to α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | ||
RF magnetron sputtering system | Orion AJA Int. | Orion 8 | |
RPMI 1640 with l-glutamine | Biological Industries | 01-100-1A | |
Sonication bath | KUDOS | SK3210HP | Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W |
SQUID magnetometer | Quantum Design, CA | ||
Triton X-100 | CHEM-IMPEX INTERNATIONAL | 1279 | non-ionic surfactant |
XTT cell viability reagent |