Fabrication de plates-formes magnétiques pour l’organisation à l’échelle du micron de neurones interconnectés
Summary
Ce travail présente une approche ascendante de l’ingénierie des forces magnétiques locales pour le contrôle de l’organisation neuronale. Les cellules de type neurone chargées de nanoparticules magnétiques (MNF) sont plaquées au sommet et contrôlées par une plate-forme micro-modelée avec une aimantation perpendiculaire. Sont également décrits la caractérisation magnétique, l’absorption cellulaire MNP, la viabilité cellulaire et l’analyse statistique.
Abstract
La capacité de diriger les neurones dans des réseaux neuronaux organisés a de grandes implications pour la médecine régénérative, l’ingénierie tissulaire et la bio-interfaçage. De nombreuses études ont visé à diriger les neurones à l’aide de repères chimiques et topographiques. Cependant, les rapports de contrôle organisationnel à l’échelle du micron sur de grandes surfaces sont rares. Ici, une méthode efficace a été décrite pour placer les neurones dans des sites prédéfinis et guider l’excroissance neuronale avec une résolution à l’échelle du micron, en utilisant des plates-formes magnétiques intégrées avec des éléments magnétiques micro-modelés. Il a été démontré que le chargement des neurones avec des nanoparticules magnétiques (MNF) les convertit en unités magnétiques sensibles qui peuvent être influencées par des gradients magnétiques. Suite à cette approche, une plate-forme magnétique unique a été fabriquée sur laquelle les cellules PC12, un modèle commun de type neurone, ont été plaquées et chargées de nanoparticules superparamagnétiques. Des films minces de multicouches ferromagnétiques (FM) avec l’aimantation perpendiculaire stable ont été déposés pour fournir des forces d’attraction efficaces vers les modèles magnétiques. Ces cellules PC12 chargées de MNP, plaquées et différenciées au sommet des plates-formes magnétiques, ont été préférentiellement attachées aux modèles magnétiques, et l’excroissance de la neurite était bien alignée avec la forme du motif, formant des réseaux orientés. Des méthodes quantitatives de caractérisation des propriétés magnétiques, de la prise cellulaire de MNP, de la viabilité de cellules, et de l’analyse statistique des résultats sont présentées. Cette approche permet le contrôle de la formation de réseaux neuronaux et améliore l’interface neurone-électrode grâce à la manipulation des forces magnétiques, qui peut être un outil efficace pour les études in vitro des réseaux et peut offrir de nouvelles directions thérapeutiques de biointerfaçage.
Introduction
Le micropatterning des neurones présente un grandpotentiel de régénération tissulaire1,2,3,4,5 et le développement de dispositifs neuro-électroniques6,7,8. Cependant, le positionnement à l’échelle du micron des neurones à haute résolution spatiale, comme dans les tissus biologiques, pose un défi important. La formation de structures préconçues à cette échelle nécessite le guidage des processus des cellules nerveuses en contrôlant localement la motilité du soma et l’excroissance axonale. Des études antérieures ont suggéré l’utilisation d’indices chimiques et physiques9,10,11,12 pour guider la croissance neuronale. Ici, une nouvelle approche se concentre sur le contrôle du positionnement des cellules par des gradients de champ magnétique13,14,15,16,17,transformant les cellules chargées de MNF en unités sensibles au magnétique, qui peuvent être manipulées à distance.
Kunze et al., qui ont caractérisé la force nécessaire pour induire des réponses cellulaires à l’aide de cellules chargées de puces magnétiques et de MNP, ont prouvé que l’élongation axonale précoce peut être déclenchée par une tension mécanique à l’intérieur des cellules18. Tay et coll. ont confirmé que les substrats microfabriqués avec des gradients de champ magnétique améliorés permettent la stimulation sans fil des circuits neuronaux dosés avec des MLP à l’aide de colorants indicateurs de calcium19. De plus, Tseng et al. ont coalisé des nanoparticules à l’intérieur des cellules, ce qui a entraîné des forces localisées médiées par les nanoparticules qui se sont approchées de la tension cellulaire20. Cela a conduit à la fabrication de modèles définis de substrats micromagnétiques qui ont aidé à étudier la réponse cellulaire aux forces mécaniques. La tension cellulaire résultant de l’application de forces localisées médiées par les nanoparticules a été obtenue en coalisant des nanoparticules dans les cellules20. Un système hybride microfluidique à semi-conducteur à oxyde métallique complémentaire (CMOS) a été développé par Lee et al. qui ont intégré un réseau de micro-électro-aimants dans la puce CMOS pour contrôler le mouvement des cellules individuelles marquées avec des billes magnétiques21.
Alon et al. ont utilisé des tampons magnétiques à micro-échelle, préprogrammés, comme « points chauds » magnétiques pour localiser les cellules22. Une activité spécifique pourrait également être stimulée au sein des cellules à l’aide de réseaux magnétiques micro-modelés pour localiser des nanoparticules à des emplacements subcellulaires spécifiques23. L’absorption cellulaire de MNP a été démontrée avec succès dans la sangsue, le rat, et les neurones primaires de souris24,25,26. Ici, ceci a été démontré sur une variété de cellule de phéochromocytome PC12 de rat, qui a été précédemment rapportée pour montrer la prise élevée des MNF27. Au cours des dernières années, il y a eu diverses applications médicales des MLP, y compris l’administration de médicaments et la thermothérapie dans les traitements du cancer28,29,30,31. Plus précisément, les études traitent de l’application des MLP et des réseaux neuronaux32,33,34,35. Cependant, l’organisation magnétique des neurones utilisant des MLP à un niveau unicellulaire mérite une enquête plus approfondie.
Dans ce travail, une approche ascendante a été décrite pour concevoir des forces magnétiques locales via des plates-formes prédéfinies pour contrôler l’arrangement neuronal. La fabrication des modèles à l’échelle du micron des multicouches FM a été présentée. Cette structure multicouche FM unique crée une aimantation perpendiculaire stable qui se traduit par des forces d’attraction efficaces vers tous les modèles magnétiques. Par incubation, les MLP ont été chargés dans des cellules PC12, les transformant en unités sensibles magnétiques. des cellules MNP-chargées, plaquées et différenciées au-dessus des plates-formes magnétiques, ont été préférentiellement attachées aux modèles magnétiques, et l’excroissance de neurite a été bien alignée avec la forme de modèle, formant des réseaux orientés. Plusieurs méthodes ont été décrites pour caractériser les propriétés magnétiques des multicouches FM et des MNP, et des techniques pour l’absorption cellulaire de MNP et les essais de viabilité cellulaire ont également été présentées. De plus, les paramètres morphométriques de la croissance neuronale et l’analyse statistique des résultats sont détaillés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les résultats représentatifs démontrent l’efficacité de la méthodologie présentée pour contrôler et organiser la formation de réseaux neuronaux à l’échelle du micron. Les cellules PC12 chargées de MNP sont restées viables et ont été transformées en unités sensibles magnétiques qui ont été attirées par les forces magnétiques des électrodes FM vers des sites spécifiques. Ceci est mieux démontré dans la figure 5C,où les cellules adhéraient préférentiellement au…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par le Ministère de la science et de la technologie, Israël, et par la Fondation israélienne pour la science (569/16).
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 15710 | |
| 6-well cell culture plate | FALCON | 353846 | |
| 96-well cell culture plate | SPL life sciences | 30096 | |
| Amphotericin B solution | Biological Industries | 03-028-1B | |
| AZ 1514H photoresist | MicroChemicals GmbH | ||
| AZ 351 B developer | MicroChemicals GmbH | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Biological Industries | 03-010-1B | |
| Cell and Tissue cultur flask | Biofil | TCF002250 | 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One | 627-160 | 35 mm |
| Cell Proliferation Kit (XTT-based) | Biological Industries | 20-300-1000 | |
| Centrifuge tube | Biofil | CFT021500 | 50 mL |
| Co80Fe20 at% sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
| Collagen type I | Corning Inc. | 354236 | Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-165-152 | |
| DAPI fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Disposable needle | KDL | 23 G | |
| Disposable syringe | Medispo | 1160227640 | 10 mL |
| Donor horse serum | Biological Industries | 04-124-1A | |
| ELISA reader | Merk Millipore | BioTek synergy 4 hybrid microplate reader | |
| Ethanol 70% | ROMICAL LTD | 19-009102-80 | |
| Ethanol absolute (Dehydrated) | Biolab-chemicals | 52505 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| Fresh murine β-NGF | Peprotech | 450-34 | |
| GMW C-frame electromagnet . | Buckley systems LTD | 3470, 45 mm | |
| Hydrochloric acid 32% | DAEJUNG CHEMICAL & METALS | 4170-4100 | |
| ImageJ | US National Institutes of Health, Bethesda | NeuronJ plugin | |
| Inductively coupled plasma (ICP) | Ametek Spectro | SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma | |
| Keithley source-measure | Keithley | 2400 | |
| Keithley switching system | Keithley | 3700 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Light microscope | Leica | DMIL LED | |
| Maskless photolithography | Heidelberg Inst. | MLA150 | |
| Microscope Slides | BAR-NAOR | BN1042000C | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 438073 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Sigma | D9663 | |
| PBS 10x | hylabs | BP507/1LD | |
| PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
| Pd sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
| Penicillin-streptomycin nystatin solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| PrestoBlue cell viability reagent | Molecular probes | A-13261 | resazurin-based |
| Rabbit antibody to α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | ||
| RF magnetron sputtering system | Orion AJA Int. | Orion 8 | |
| RPMI 1640 with l-glutamine | Biological Industries | 01-100-1A | |
| Sonication bath | KUDOS | SK3210HP | Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W |
| SQUID magnetometer | Quantum Design, CA | ||
| Triton X-100 | CHEM-IMPEX INTERNATIONAL | 1279 | non-ionic surfactant |
| XTT cell viability reagent |
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