JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Tillverkning av magnetiska plattformar för mikron-skala organisation av sammankopplade nervceller

Published: July 14, 2021
doi:
10.3791/62013
, , , , , , , ,
1Department of Physics,Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering,Bar-Ilan University, 3Department of chemistry,Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials,Bar-Ilan University

Summary

Detta arbete presenterar en bottom-up strategi för konstruktion av lokala magnetiska krafter för kontroll av neuronal organisation. Neuronliknande celler laddade med magnetiska nanopartiklar (MNPs) pläteras ovanpå och styrs av en mikromönstrad plattform med vinkelrät magnetisering. Också beskrivna är magnetisk karakterisering, MNP cellupptag, cell livskraft och statistisk analys.

Abstract

Förmågan att leda nervceller till organiserade neurala nätverk har stora konsekvenser för regenerativ medicin, vävnadsteknik och biointerfacing. Många studier har syftat till att styra nervceller med kemiska och topografiska signaler. Det är dock ont om rapporter om organisatorisk kontroll i mikronskala över stora områden. Här har en effektiv metod beskrivits för att placera nervceller på förinställda platser och styra neuronal utväxt med mikron-skala upplösning, med hjälp av magnetiska plattformar inbäddade med mikromönstrade, magnetiska element. Det har visat sig att belastning av nervceller med magnetiska nanopartiklar (MNPs) omvandlar dem till känsliga magnetiska enheter som kan påverkas av magnetiska gradienter. Efter detta tillvägagångssätt har en unik magnetisk plattform tillverkats där PC12-celler, en vanlig neuronliknande modell, pläterades och laddades med superparamagnetiska nanopartiklar. Tunna filmer av ferromagnetic (FM) multilayers med stabil vinkelrät magnetisering deponerades för att ge effektiva attraktion krafter mot de magnetiska mönstren. Dessa MNP-laddade PC12 celler, pläterade och differentierade ovanpå de magnetiska plattformarna, var företrädesvis knutna till de magnetiska mönstren, och neurit utväxt var väl i linje med mönster form, bilda orienterade nätverk. Kvantitativa karakteriseringsmetoder för de magnetiska egenskaperna, cellulära MNP upptag, cell livskraft och statistisk analys av resultaten presenteras. Detta tillvägagångssätt möjliggör kontroll av neural nätverksbildning och förbättrar neuron-till-elektrodgränssnittet genom manipulering av magnetiska krafter, vilket kan vara ett effektivt verktyg för in vitro-studier av nätverk och kan erbjuda nya terapeutiska biointerfacing riktningar.

Introduction

Mikropapper av nervceller har stor potential för vävnadsregenerering1,2,3,4,5 och utvecklingen av neuroelektronatiska enheter6,7,8. Den mikronskalade positionering av nervceller med hög rumslig upplösning, som i biologiska vävnader, utgör dock en betydande utmaning. Att bilda fördesignade strukturer i denna skala kräver vägledning av nervcellsprocesser genom att lokalt kontrollera soma motilitet och axonal utväxt. Tidigare studier har föreslagit användning av kemiska och fysiska signaler9,10,11,12 för att vägleda neuronal tillväxt. Här fokuserar ett nytt tillvägagångssätt på att styra cellpositionering med magnetiska fältgradienter13,14,15,16,17, vilket förvandlar celler laddade med MNPs till magnetiska känsliga enheter, som kan fjärrmanipuleras.

Kunze et al., som karakteriserade kraften som behövs för att inducera cellulära svar med hjälp av magnetiska chip- och MNP-laddade celler, bevisade att tidig axonal förlängning kan utlösas av mekanisk spänning inuti celler18. bekräftade att mikrofabrikat med förbättrade magnetiska fältgradienter möjliggör trådlös stimulering av neurala kretsar som är doserade med MNPs med kalciumindikatorfärger19. Dessutom sammansmäckade Tseng et al. nanopartiklar inuti celler, vilket resulterade i lokaliserade nanopartikelmedlade krafter som närmade sig cellspänning20. Detta ledde till tillverkning av definierade mönster av mikromagnetiska substrat som hjälpte till att studera cellulärt svar på mekaniska krafter. Cellulära spänningar som härrör från tillämpningen av lokaliserade nanopartiklar medierade krafter uppnåddes genom sammanslagning nanopartiklar icellerna 20. Ett kompletterande halvledarsystem för metalloxid (CMOS)-mikrofluidiskt hybridsystem utvecklades av Lee et al. som inbäddade en rad mikroelektromagneter i CMOS-chippet för att styra rörelsen hos enskilda celler märkta med magnetiskapärlor 21.

Alon et al. använde mikroskale, förprogrammerade, magnetiska kuddar som magnetiska “hotspots” för att lokalisera celler22. Specifik aktivitet kan också stimuleras i celler med mikromönstrad magnetisk matris för att lokalisera nanopartiklar på specifika subcellulära platser23. CellulärT MNP upptag har framgångsrikt visats i leech, råtta och mus primära nervceller24,25,26. Här har detta visats på en råtta PC12 ferokroocytom cellinje, som tidigare har rapporterats visa högt upptag av MNPs27. Under de senaste åren har det funnits olika medicinska tillämpningar av MNPs, inklusive läkemedelsleverans och termoterapi icancerbehandlingar 28,29,30,31. Specifikt handlar studier om tillämpningen av MNPs och neuronnätverk32,33,34,35. Men den magnetiska organisationen av nervceller som använder MNPs på en encellig nivå förtjänar ytterligare undersökning.

I detta arbete har en bottom-up-metod beskrivits för att konstruera lokala magnetiska krafter via fördesignade plattformar för att kontrollera neuronala arrangemang. Tillverkningen av mikron-skala mönster av FM multilayers har presenterats. Denna unika, FM-flerskiktade struktur skapar stabil vinkelrät magnetisering som resulterar i effektiva attraktionskrafter mot alla magnetiska mönster. Via inkubation laddades MNPs i PC12 celler, omvandla dem till magnetiska känsliga enheter. MNP-laddade celler, pläterade och differentierade ovanpå de magnetiska plattformarna, var företrädesvis knutna till de magnetiska mönstren, och neurit utväxten var väl i linje med mönsterformen, bildar orienterade nätverk. Flera metoder har beskrivits för att karakterisera de magnetiska egenskaperna hos FM-multiskikten och MNPs, och tekniker för cellulära MNP-upptag och cell livskraft analyser har också presenterats. Dessutom är morfometriska parametrar för neuronal tillväxt och statistisk analys av resultaten detaljerade.

Protocol

OBS: Utför alla biologiska reaktioner i ett biosäkerhetsskåp. 1. Magnetisk plattformstillverkning litografi Skär glas glider in i 2 x 2 cm2 med en skrivare penna. Rengör glaset glider i aceton och sedan isopropanol i 5 min vardera i ett ultraljudsbad. Torka med ultrahög renhet (UHP) kväve. Täck glaset med fotoresist med spinnbeläggning vid 6 000 varv/min i 60 s, uppnå 1,5 μm tjocklek och grädda vid 100 °C i 60 s. Exponera provet för en ljus…

Representative Results

Magnetiska plattformar med olika geometriska former tillverkades (figur 1A). Magnetiska mönster deponerades genom sputtering: 14 multilayers av Co80Fe20 och Pd, 0,2 nm respektive 1 nm. Elektronmikroskopi visade att den totala höjden på de magnetiska mönstren var ~18 nm (figur 1B). Denna unika FM-flerskiktsdeposition skapar en stabil plattform med vinkelrät magnetiseringsanisotropi (PMA) i förhållande …

Discussion

De representativa resultaten visar effektiviteten av den presenterade metoden för att kontrollera och organisera neuronal nätverksbildning på mikronskalan. De MNP-laddade PC12-cellerna förblev livskraftiga och omvandlades till magnetiska känsliga enheter som lockades av de magnetiska krafterna från FM-elektroderna till specifika platser. Detta visas bäst i figur 5C, där cellerna företrädesvis klibbade vid hexagonernas större hörn och inte de tunna linjerna. Dessutom utvecklades f…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna forskning stöddes av ministeriet för vetenskap & teknik, Israel, och av Israel Science Foundation (569/16).

Materials

16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 15710
6-well cell culture plate FALCON 353846
96-well cell culture plate SPL life sciences 30096
Amphotericin B solution Biological Industries 03-028-1B
AZ 1514H photoresist MicroChemicals GmbH
AZ 351 B developer MicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA) Biological Industries 03-010-1B
Cell and Tissue cultur flask Biofil TCF002250 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dish Greiner Bio-One 627-160 35 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based) Biological Industries 20-300-1000
Centrifuge tube Biofil CFT021500 50 mL
Co80Fe20 at% sputter target ACI Alloys 99.95%
Collagen type I Corning Inc. 354236 Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscope Leica TCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-165-152
DAPI fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Disposable needle KDL 23 G
Disposable  syringe Medispo 1160227640 10 mL
Donor horse serum Biological Industries 04-124-1A
ELISA reader Merk Millipore BioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70% ROMICAL LTD 19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated) Biolab-chemicals 52505
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
Fresh murine β-NGF Peprotech 450-34
GMW C-frame electromagnet . Buckley systems LTD 3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32% DAEJUNG CHEMICAL & METALS 4170-4100
ImageJ US National Institutes of Health, Bethesda NeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP) Ametek Spectro SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measure Keithley 2400
Keithley switching system Keithley 3700
L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
Light microscope Leica DMIL LED
Maskless photolithography Heidelberg Inst. MLA150
Microscope Slides BAR-NAOR BN1042000C
Nitric acid 70% Sigma-Aldrich 438073
Normal donkey serum (NDS) Sigma D9663
PBS 10x hylabs BP507/1LD
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Pd sputter target ACI Alloys 99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solution Biological Industries 03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagent Molecular probes A-13261 resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulin Santa Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering system Orion AJA Int. Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamine Biological Industries 01-100-1A
Sonication bath KUDOS SK3210HP Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometer Quantum Design, CA
Triton X-100 CHEM-IMPEX INTERNATIONAL 1279 non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
  3. Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
  4. Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
  5. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
  6. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  7. Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
  8. Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
  9. Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  10. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  11. Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
  12. Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
  13. Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560 (2020).
  14. Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
  15. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), 1425-1442 (2012).
  16. Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299 (2018).
  17. Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  18. Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
  19. Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
  20. Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
  21. Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system – CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
  22. Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030 (2015).
  23. Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
  24. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37 (2016).
  25. Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
  26. Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
  27. Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32 (2012).
  28. Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
  29. Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
  30. Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
  31. Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
  32. Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
  33. Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
  34. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  35. Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
  36. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  37. Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055 (2020).
  38. Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911 (2014).
  39. Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , (1999).
  40. Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
  41. Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
  42. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
  43. Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303 (2015).
  44. Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
  45. Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403 (2014).
  46. Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
  47. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
  48. Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707 (2018).

Tags

Magnetic PlatformsMicron-scale OrganizationInterconnected NeuronsNeural Network FormationMagnetic ManipulationsIn Vitro StudiesBiointerfacing DevicesMagnetic NanoparticlesPhotolithographyFerromagnetic Multilayers

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., Vardi, N., Marcus, M., Smith, A., Margel, S., Shefi, O., Sharoni, A. Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. Exp. (173), e62013, doi:10.3791/62013 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image