Summary
Model antijen ovalbumin'in in vivo dendritik hücre hedeflemesi için endositoz reseptörüne özgü antikora kimyasal konjugasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, antikorun saflaştırılmasını, antijenin kimyasal konjugasyonunu, ayrıca konjugenin saflaştırılmasını ve verimli konjugasyonun doğrulanmasını içerir.
Abstract
Çapraz sunum dendritik hücrelere (DC) hedeflenen antijen in vivo, T efektör hücre yanıtlarını verimli bir şekilde indükler ve aşı tasarımında değerli bir yaklaşım sergiler. Antijen, DEC-205 gibi endositoz reseptörlerine özgü antikorlar aracılığıyla DC'ye teslim edilir ve bu da alımı, işlenmesini ve MHC sınıfı I ve II sunumlarını teşvik eder.
İstenilen antijenin uygun bir antikora verimli ve güvenilir bir şekilde konjugasyonu DC hedeflemesinde kritik bir adımdır ve diğer faktörlerin yanı sıra antijenin formatına bağlıdır. Tam boy proteinin saflaştırılmış antikorlara kimyasal konjugasyonu olası bir stratejidir. Geçmişte, farelerde in vivo DC hedefleme çalışmaları için antijen ovalbumin (OVA) ve DEC-205'e özgü IgG2a antikorunun (αDEC-205) çapraz bağlamasını başarıyla kurduk. Protokolün ilk adımı, antikorun NLDC (lenfoid olmayan dendritik hücreler)-145 hibridomanın afinite kromatografisi ile üstnatantından arındırılmasıdır. Saflaştırılmış antikor, sülfo-SMCC (sülfoksinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] sikloheksan-1-karboksila) tarafından kimyasal konjugasyon için aktive edilir.te) aynı zamanda OVA proteininin sülfhidrit grupları TCEP-HCl (tris (tris (2-karboksit) fosfin hidroklorür ile inkübasyon yoluyla maruz kalır. Aşırı TCEP-HCl ve sülfo-SMCC çıkarılır ve antijen gece kaplin için aktif antikor ile karıştırılır. Elde edilen αDEC-205/OVA konjuge konsantre edilir ve ilişkisiz OVA'dan kurtulur. OVA'nın αDEC-205'e başarılı bir şekilde konjugasyonu batı blot analizi ve enzime bağlı immünosorbent tahlil (ELISA) ile doğrulanır.
Karaciğerde sitotoksik T hücre yanıtlarını teşvik etmek ve DEC-205+ DC'nin in vivo hedeflemesini takiben humoral ve hücresel bağışıklığı teşvik etme potansiyelleri için farklı yardımcıları karşılaştırmak için kimyasal olarak çapraz bağlı αDEC-205/OVA'yı başarıyla kullandık. Bunun ötesinde, bu tür kimyasal olarak birleştirilmiş antikor/ antijen konjugeleri, tümör antijenlerine aşı yanıtlarının verimli bir şekilde indüksiyonu için değerli araçlar sunar ve çeşitli tümör türlerinin önlenmesi ve tedavisi ile ilgili klasik bağışıklama yaklaşımlarından daha üstün olduğu kanıtlanmıştır.
Introduction
Dendritik hücreler (DC) bağışıklık sisteminin merkezi oyuncularıdır. Antijen sunumu konusunda uzmanlaşmış çeşitli bir hücre grubudur ve başlıca işlevleri doğuştan gelen ve uyarlanabilir bağışıklık arasında köprü yapmaktır1,2. Daha da önemlisi, DC sadece verimli ve spesifik patojene yönelik yanıtlarda önemli bir rol oynamakla kalmaz, aynı zamanda antitümör bağışıklığının birçok yönüne de katılır1,3.
Konak bağışıklığındaki özel rolleri nedeniyle, DC aşılama için hedef hücreler olarak odak noktasına geldi4. Bir yaklaşım, antijene özgü immün yanıtları teşvik etmek için antijenleri DC in vivo'ya hedeflemektir ve son yıllarda, çok sayıda çalışma uygun reseptörleri tanımlamaya ve stratejileri hedeflemeye adanmıştır1,4. Örneklerden biri, endositoz indükleyen DEC-205 spesifik antikorlar tarafından hedeflenebilen C tipi lektin reseptörü DEC-205'tir. Daha da önemlisi, UYGUN adjuvanlarla kombinasyondaki DEC-205 hedeflemesinin, tümör antijenleri 3 ,5,6,7, 8, 9'akarşı antikor yanıtlarının yanı sıra uzun ömürlü ve koruyucu CD4 + veCD8+ T hücrelerini verimli bir şekilde teşvik ettiği gösterilmiştir.
DC'ye yönelik konjuge antijenlerin serbest konjuge edilmemiş antijen 3 ,5,10,11,12'denüstün olduğunu gösteren bir dizi çalışma vardır. Bu, antijenin ilgili DC hedefleme moiety'ye konjugasyonunu DC hedefleme yaklaşımlarında merkezi bir adım haline getirir. Antikorlar veya antikor parçaları aracılığıyla DC hedeflemesi durumunda, antijenler kimyasal veya genetik olarak bağlanabilir ve strateji kendi (dis) avantajlarını sağlar1. Bir yandan, genetik olarak tasarlanmış antikor-antijen yapılarında, antijen dozu üzerinde bir kontrol ve lotlar arasında üstün karşılaştırılma sağlayan konumvardır 1. Bununla birlikte, kimyasal konjugasyon daha az hazırlık gerekir ve özellikle deneysel ve klinik öncesi modellerde farklı antijenleri ve / veya aşılama stratejilerini test etmeye ve karşılaştırmaya çalışırken daha fazla esneklik sağlar.
Burada, ovalbumin (OVA) model protein antijeni olarak, farelerde in vivo DC hedeflemeye uygun bir DEC-205 spesifik IgG2a antikoru (αDEC-205) için verimli ve güvenilir kimyasal konjugasyon için bir protokol sunuyoruz. İlk olarak, αDEC-205 NLDC-145 hibridoma hücrelerinden arındırılır13. Kimyasal konjugasyon için, NHS (N-hydroxysuccinimide) ester ve maleimid gruplarını içeren heterobifunctional crosslinker sülfosinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] sikloheksane-1-karboksilat (sulfo-SMCC), amin ve sülfhidrit içeren moleküllerin kovalansiyel konjugasyonuna izin veren kullanılır. Spesifik olarak, antikorun birincil aminleri başlangıçta sülfo-SMCC ile reaksiyona girer ve ortaya çıkan maleimid-aktive αDEC-205 daha sonra TCEP-HCl (Tris (2-karboksit) fosfin hidroklorür yoluyla azaltılmış sülfhidrit içeren OVA proteini ile reaksiyona girer. Nihai ürün kimyasal olarak konjuge αDEC-205/OVA(Şekil 1). Kimyasal konjugasyonun kendisinin ötesinde, protokolümüz fazla OVA'nın konjugeden çıkarılmasını ve batı blot analizi ve belirli bir enzime bağlı immünorbent test yoluyla başarılı konjugasyonun doğrulanmasını açıklar. Ova ve diğer proteinleri veya immünojenik peptitleri αDEC-205'e kimyasal olarak konjuge etmek için bu yaklaşımı geçmişte başarıyla çalıştırdık. CD11c+ hücreler in vitro'ya verimli bağlamanın yanı sıra hücresel ve humoral bağışıklığın verimli indüksiyonunu vivo.
Elbette, bu yöntemin dezavantajları vardır, örneğin çok-çok karşılaştırılma ve antijenin son konjuge içinde tam olarak yapılması gibi. Bununla birlikte, kimyasal konjugasyon, genetik olarak tasarlanmış yapılara kıyasla antikor ve protein antijen seçiminde deneysel esneklik sağlar. Bu nedenle, bu yaklaşımın özellikle klinik öncesi fare modellerinde DC hedeflemesinde verimliliği için farklı antijenlerin değerlendirilmesinde, özellikle de spesifik antitümör immün yanıtlar bağlamında değerli olduğuna inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Açıklanan hayvan deneylerinin tümü yerel devlet kurumu (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; dosya numarası 33.12-42502-04-10/0108) tarafından onaylanmış ve ulusal ve kurumsal yönergelere göre gerçekleştirilmiştir.
1. NLDC-145 hibridoma hücre hattından αDEC-205 üretimi
- Antikor üretimi için, bir su banyosunda 37 °C'de αDEC-205 üreten NLDC-145 hücrelerini çözün. Hücreleri 37 °C ve %5 CO'da genişletin2. İki adet 75 cm2 antikor üretimine devam etmek için şişelere ihtiyaç duyulacaktır. Güvenli çalışma koşullarını sağlamak ve kültürlerin kirlenmesini önlemek için hücre kültürü prosedürleri bir güvenlik kabininde yapılmalıdır.
- 1 mL çözünülmüş hücreyi (1 x 106 - 5 x 106 hücre/mL) %1 penisilin/streptomisin (önceden 37 °C'ye ısıtılmış) ile desteklenmiş 9 mL ISF-1 ortamında hücre kültürü şişesine (25 cm2)yeniden biriktirin. Şişeyi yatay olarak 37 °C, %5 CO 2'de bir hücre kültürü inkübatörüneyerleştirin.
- Hücreleri 37 °C ve% 5 CO2'de kültüre edin, % 70'e kadar. Bu normalde 24 - 48 saat sonra elde edilmelidir.
- Hücreler %70 birleştiğinde, NLDC-145 hücre süspansiyonu (10 mL) tamamını 1-10 mL arasında bir hacim aralığında pipetli pipet denetleyicisi kullanarak 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleme ile hücreleri pelet.
- Bir su banyosunda önceden ısınan ISF-1 ortamı ile 37 °C arasında ve peletin%1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş 12 mL ISF-1 ortamında yeniden diriltin. Yeniden sulanan hücre süspansiyonu taze bir hücre kültürü şişesine (75 cm2)aktarın.
- ISF-1 ortamındaki hücreleri 37 °C'de %1 penisilin/streptomisinin ve %5 CO2ile desteklenmiş olarak%70 izdiah ve %99 uygulanabilir seviyeye kadar kültüre edin ve genişletin. Bu normalde 48 - 72 saat sonra elde edilmelidir.
- Hücreleri iki adet 75 cm2 şişeye bölün. Bunu yapmak için önce hücre kültürü şişesi alt/kültür yüzeyini hücre süspansiyonu ile yıkayarak tüm NLDC-145 hücrelerini yüzeyden çıkarın. NLDC-145 hücre süspansiyonunun 6 mL'sini her biri iki taze 75 cm2 şişeden birine aktarın ve 12 mL'ye kadar% 1 penisilin / streptomisi ile desteklenmiş önceden ısıtılmış ISF-1 ortamı ekleyin.
NOT: NLDC-145 hücreleri ortamı koşullandırmış olacağından hücre kültürü ortamını yenilemeyin. Hücreleri ortamlarıyla birlikte aktarın ve kültürü istenen hacme kadar taze ortamla doldurun. Bu, NLDC-145 hücrelerinin canlılığı ve maksimum antikor üretimi için çok önemlidir. - Hücre kültürlerini 37 °C ve% 5 CO2'de genişletin, genellikle 48 - 72 saat sonra elde edilen yaklaşık% 70 birleştiği zamana kadar.
- Hücreler% 70 birleştiğinde, genişletilmiş NLDC-145 hücre süspansiyonunun 10 mL'sini 75 cm2 şişenin her birinden bir PETG (polietilen tereftalat glikol) rulo şişesine (1.050 cm2)aktarın. Bunun için, bir pipet denetleyicisi ve 10 mL pipet kullanarak tüm hücreleri yüzeyden çıkarmak için hücre kültürü şişesi alt / kültür yüzeyini hücre süspansiyonu ile yıkayın.
- 140 mL ISF-1 ortamını% 1 penisilin/ streptomisi ile desteklenmiş (37 ° C'ye önceden ısıtılmış) doğrudan orta şişeden NLDC-145'in her birine ekleyin ve bunları 150 mL işaretine kadar dolduran rulo şişeler ekleyin.
NOT: 1.1.6 adımındaki nota bakın. - Silindir şişelerini üç gün boyunca 37 °C, %5 CO2 ve 25 mermi/dak'ta kültürleyin.
- NLDC-145 içeren silindir şişelerinin her birine 300 mL işaretine kadar dolduran NLDC-145'in her birine%1 penisilin/streptomisilin (önceden 37 °C'ye önceden ısıtılmış) ile desteklenmiş 150 mL ISF-1 ortamı ekleyin.
- Kültür silindir şişeleri artık her biri 37 °C'de 300 mL kültür, üç gün boyunca% 5 CO2 ve 25 mermi / dakika içeriyor.
- Silindir şişeleri içeren NLDC-145'in her birine% 1 penisilin / streptomisilin (önceden 37 ° C'ye önceden ısıtılmış) ile desteklenmiş 100 mL isf-1 ortamı ekleyin, böylece 400 mL işaretine kadar doldurun.
- Kültür silindir şişeleri artık her biri 37 °C'de 400 mL kültür, % 5 CO2 ve 25 tur / dakika yedi gün daha içeriyor.
NOT: Bu hafta boyunca, kültür çok yoğunlaşır (%95'e kadar yoğunluk) ve canlılık azalır (%50'ye kadar inerek maksimum antikor salınımı sağlar).
- αDEC-205'in kültür süperndanstantından arındırılması için NLDC-145 hücre süspansiyonunu (her iki silindir şişesinden) doğrudan 500 mL otomatik kapatılmış santrifüj şişesine dökün.
NOT: Toplam 800 mL kültür hacmi toplanmalıdır.- Hücreleri ve kalıntıları gidermek için kültürü 8.600 x g ve 4 °C'de 30 dakika santrifüj edin.
- Süpernatantları toplayın, peletleri atın ve süpernatantları steril bir reaktif şişede biriktin.
NOT: αDEC-205'in saflaştırılmasına hemen başlanabilir (adım 2.) veya süpernatant 4 °C'de kısa süreli saklanabilir.
2. ΑDEC-205 antikorunun NLDC-145 hücre süperndantantından arındırılması
NOT: NLDC-145 hücre süpernatantından, αDEC-205 bir protein G Sepharose sütunu (yeniden kullanılabilir) kullanılarak saflaştırılır. Sütun boyutları 15 mm x 74 mm'dir ve sütun başına 5 mL protein G Sepharose paketlenir.
- G Sepharose sütununun hazırlanması ve yıkanması için, protein G Sepharose sütununun üst açıklığına hava geçirmez bir kauçuk fiş takın. Kauçuk fişi iki steril kanonla (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 mm) delin.
- İki kanondan birine 10 mL şırınna ve ikinci kanolaya bir boru konektörü ile esnek bir silikon tüp (yaklaşık 100 cm uzunluğunda, 2,5 - 3 mm çapında) bağlayın.
NOT: Şırınd/kauçuk fiş yapısı yeniden kullanılabilir ve büyük kültür süpernatantının protein G Sepharose sütununa sürekli akışına neden olan bir vakum sağlar. Bu amaçla, aşağıdaki adımlarda sürekli sıvı akışını sağlamak için şırınnanın pistonu hafifçe geri çekin. - Önceki antikor saflaştırmasından kalan antikoru çıkarmak için sütunu 50 mL 0,1 M buzul asetik asit (pH 2) ile yıkayın. Silikon tüpün ucunu 0,1 M buzul asetik asit (pH 2) dolgulu reaktif şişeye koyun. İndüklenen vakumun bir sonucu olarak, 0.1 M buzul asetik asetik asidinin (pH 2) 50 mL'si damla yönünde G Sepharose protein kolonunun içinden geçer.
NOT: 0,1 M buzul asetik asit (pH 2) bir reaktif şişede saklanmalı veya bir behere taze doldurulmalıdır. - Kolonu 100-200 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Silikon tüpün ucunu PBS dolu bir reaktif şişesine veya behere koyun. 100-200 mL PBS protein G Sepharose sütunu boyunca damla yönünde çalışmasına izin verin.
- İki kanondan birine 10 mL şırınna ve ikinci kanolaya bir boru konektörü ile esnek bir silikon tüp (yaklaşık 100 cm uzunluğunda, 2,5 - 3 mm çapında) bağlayın.
- NLDC-145 süperndantanttan antikor saflaştırması için, sütuna NLDC-145 süpernatantının 800 mL'sini (adım 1.2.2.'den elde edilir) yükleyin. Silikon tüpün ucunu NLDC-145 süpernatant dolgulu reaktif şişesine koyun. 800 mL NLDC-145 supernatant sütun boyunca damla yönünde çalışmasına izin verin.
- Sütunu 500 mL PBS ile yıkayın. Silikon tüpün ucunu PBS dolu bir reaktif şişesine veya behere koyun. 500 mL PBS'nin sütun boyunca damla yönünde çalışmasına izin verin.
- Elution için, her 1,5 mL tüpe 20 adet 1,5 mL boru ve 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) pipet 100 μL kullanın. Antikorun kolondan elüte etmesi için kauçuk fişi sütundan ve pipetten 1 mL 0,1 M glisin (pH 3) protein G Sepharose sütununun üst odasına çıkarın. Akış akışını doğrudan hazırlanan 1,5 mL tüplerden birinde elüat olarak toplayın.
- 20 tüpün tümü (1,5 mL) için elution adımını (2,2,2.) tekrarlayın.
- Antikor içeren fraksiyonları tanımlamak için spektrofotometre kullanarak 280 nm (OD280)seviyesindeki tüm elution fraksiyonlarının optik yoğunluğunu belirleyin.
NOT: İlk elution kesirini boş olarak kullanın. - Tüm kesirleri 0,5'ten (yaklaşık 10 kesir) büyük bir OD280 ile bir depola.
- %20 etanol ile dolu G Sepharose sütununu 4 °C'de saklayın.
- 12 - 14 kDa moleküler ağırlığı kesilmiş (MWCO) diyaliz borularını kullanarak bir gecede 4 °C'de 1000 mL PBS'ye (2000 mL'lik bir beherde) karşı havuzlanmış elutionları dialyze edin.
- Diyaliz tüpünü 20 cm'lik parçalar halinde kesin. Diyaliz borularını 10 mM EDTA'nın (pH 7.5) 500-800 mL'sinde, kirlenmeyi gidermek için sıcak bir plaka kullanarak bir beherde 30 dakika kaynatın. 10 mM EDTA (pH 7.5) çözeltisini atın ve diyaliz borularını deiyonize suda 10 dakika kaynatın.
NOT: Diyaliz tüpü doğrudan kullanılabilir veya bir sonraki kullanıma kadar 4 °C'de % 0,01 sodyum azit (NaN3) / H2O çözeltisinde saklanabilir. - Diyaliz tüpünün altını uygun bir diyaliz boru kapatma/tek parça, menteşeli kelepçe ile kapatın ve antikor salınımını diyaliz tüpüne dikkatlice boruleyin. Diyaliz tüpünün üst kısmını ikinci bir kelepçe ile kapatın.
- Diyaliz tüpünün üst kelepçesini yüzen bir standa sabitleyin, PBS dolu kabın içine manyetik bir karıştırma çubuğu ile birleştirin ve kabı manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin.
- Dialyze gece boyunca 4 °C'de karıştırın.
- Diyaliz tüpünü 20 cm'lik parçalar halinde kesin. Diyaliz borularını 10 mM EDTA'nın (pH 7.5) 500-800 mL'sinde, kirlenmeyi gidermek için sıcak bir plaka kullanarak bir beherde 30 dakika kaynatın. 10 mM EDTA (pH 7.5) çözeltisini atın ve diyaliz borularını deiyonize suda 10 dakika kaynatın.
- αDEC-205 konsantrasyonu artırmak için, kadranın tamamını 10 kDa MWCO'lu bir santrifüj konsantratöre yükleyin. Borunun bir kelepçesini açın ve diyaliz tüpünün tamamını dikkatlice santrifüj konsantratöre (10 kDa MWCO) borulayın.
NOT: Pipet ucu ile konsantratörün altına dokunmayın.- 693 x g (2.000 rpm) ve 4 °C'de 30 dakika santrifüj.
- Santrifüj konsantratörü 10 mL PBS ve santrifüj ile 693 x g (2.000 rpm) ve 4 °C'de, kalan son antikor çözeltisi hacmi 1-1,5 mL olana kadar yükleyin.
NOT: Gerekirse, 2.4.1 santrifüjleme adımını tekrarlayın. istenen miktara ayarlamak için. - Spektrofotometre kullanarak, konsantre αDEC-205 çözeltisinin optik yoğunluğunu 280 nm'de (OD280)belirleyin. PBS'i boş olarak kullanın.
- Aşağıdaki formülü kullanarak αDEC-205 konsantrasyonunun hesaplanacağını hesaplayın:
konsantrasyon [mg/mL] = OD280/1.4. - αDEC-205 solüsyonını 0,22 μm şırınna filtre ünitesi kullanarak filtreleyin.
NOT: ΑDEC-205'in NLDC-145 hibridoma hücreli süpernatanttan arındırılması FPLC (hızlı protein sıvı kromatografisi) ile de sağlanabilir. Saflaştırılmış αDEC-205, uzun süreli depolama için 4 °C'de veya -18 °C'de saklanabilir.
3. OVA'nın αDEC-205'e kimyasal konjugasyonu
NOT: Optimal kimyasal konjugasyon için 0,5 mg OVA proteininin 2,5 mg αDEC-205 'e (1:5) oranı gereklidir. Bununla birlikte, bu oran diğer proteinler ve antikorlar için değişebilir ve alternatif konjugeler için optimize edilmesi gerekir. OVA proteininin disülfit bağlarının azaltılması, kimyasal konjugasyon için sülfhidrit gruplarını αDEC-205 ve 240 μl TCEP-HCl'ye maruz bırakan 30 mM TCEP-HCl ile inkübasyon yoluyla gerçekleştirilir. Her iki adımda da OVA'nın TCEP kaynaklı azaltılması (adım 3.1.) ve αDEC-205'in sülfo-SMCC aktivasyonu (adım 3.2.) tercihen paralel olarak yapılmalıdır.
- 125 mM TCEP-HCl çözümü (pH 7.0) hazırlayın. İstediğiniz miktarda TCEP-HCl tartın ve TCEP-HCl'yi 0,9 M Tris tabanında (pH 8,8) çözün. 125 mM TCEP-HCl çözeltisinin pH'ını test etmek (nötr olmalıdır) ve pH'ı Tris tabanı (pH 8.8) ile ayarlamak için pH gösterge şeritlerini kullanın.
- Pipet 200 μL OVA protein çözeltisi (0,5 mg OVA içeren) 1,5 mL steril bir tüpe. Ova proteinine pipet kullanarak 240 μl 125 mM TCEP-HCl ve 560 μL steril ultra saf su ekleyerek 0,5 mg/mL OVA proteini ve 30 mM TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl) konsantrasyonuna son bir konsantrasyon ekleyin.
NOT: 2.5 mg EndoGrade OVA (liyofilize) 1 mL PBS'de çözülür ve 2.5 mg/mL OVA çözeltisi ile sonuçlanır. - Elde ettiği OVA/TCEP-HCl'yi oda sıcaklığında 1,5 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Bu inkübasyon adımlarını uzatmayın.
- Pipet 200 μL OVA protein çözeltisi (0,5 mg OVA içeren) 1,5 mL steril bir tüpe. Ova proteinine pipet kullanarak 240 μl 125 mM TCEP-HCl ve 560 μL steril ultra saf su ekleyerek 0,5 mg/mL OVA proteini ve 30 mM TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl) konsantrasyonuna son bir konsantrasyon ekleyin.
- Konjugasyon için αDEC-205'i etkinleştirmek için, 100 μL ultra saf suda 2 mg sülfo-SMCC çözün.
NOT: Sulfo-SMCC hidrolize karşı hassastır. Bu nedenle, daha büyük miktarlarda çözülmemiş sülfo-SMCC hızla ele alınmalı veya mevcut 2 mg aliquots kullanılmalıdır.- PBS'de αDEC-205'i seyreltin, böylece 900 μL'de 2,5 mg bulunur.
- 2,5 mg αDEC-205 (900 μL hacim; adım 3.2.1.'den elde edilen) ve 100 μL sülfo-SMCC'yi (adım 3.2.'den elde edilir) 1,5 mL'lik bir tüpte karıştırın ve toplam 1 mL hacim elde edin.
- αDEC-205/sulfo-SMCC çözeltisini 37 °C'de 30 dakika ve ısıtma bloğunda 550 rpm kuluçkaya yatırın.
- Bu inkübasyonların ardından, aşırı sülfo-SMCC ve TCEP-HCl, tuzdan arındırma sütunları (MWCO 7 kDa; 5 mL sütun hacmi) kullanılarak çözeltilerden hemen çıkarılır.
- Sütunları (MWCO 7 kDa) alt kapamayı bükün, kapağı gevşetin ve sütunu 15 mL konik bir tüpe yerleştirin.
- Sıvıyı çıkarmak için oda sıcaklığında 1.000 x g'da 2 dakika santrifüj.
- Sütunu yeni bir tüpe yerleştirin ve kapağı çıkarın. Antikor/sülfo-SMCC ve OVA/TCEP-HCl'yi sırasıyla bir sütunlu kompakt reçine yatağının ortasına yavaşça yükleyin.
- Oda sıcaklığında 1.000 x g'da 2 dakika santrifüj.
- Kullandıktan sonra sütunları atın. Konjugasyon için astarlanmış antikor ve OVA içeren çözeltiler tüplerdedir.
- αDEC-205 ve OVA konjugasyonu için pipetleme yaparak her iki çözeltiyi de hemen karıştırın.
- Elde ettiği αDEC-205 ve OVA karışımını 4°C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
- Konjugasyondan sonra, aşırı ilişkisiz OVA çözeltiden çıkarılır ve eşleştirilmiş αDEC-205/OVA bir santrifüj protein konsantratör (MWCO 150 kDa) kullanılarak konsantre edilir.
- Santrifüj protein konsantratörunu (MWCO 150 kDa) kolona 12 mL PBS pipetleme ve oda sıcaklığında 2.000 x g'da 2 dakika santrifüjleme ile önceden durulayın.
NOT: Gerekirse, sütundan yaklaşık 5 mL'lik bir hacim geçene kadar santrifüjleme adımını (3.4.1.) tekrarlayın. - αDEC-205/OVA'yı santrifüj protein konsantratörüne yüklemeden önce, batı leke analizi için konsantre olmayan αDEC-205/OVA'nın 20 μL örneğini saklayın. Analize kadar bu aliquot'ı 4 °C'de saklayın.
- αDEC-205/OVA'yı pipetleme ile santrifüj protein konsantratörüne yükleyin.
NOT: Santrifüj konsantratörün üst odasının yatağıyla herhangi bir temastan kaçının. - Yoğunlaştırıcıyı PBS ile 15 mL'ye doldurun ve oda sıcaklığında 2.000 x g'da 5 dakika boyunca konsantratörü santrifüj edin.
- Batı blot analizi için akış (akış I) örneğini kaydedin ve kalan akış akışını atın.
- Yoğunlaştırıcıyı PBS ile 10 mL'ye doldurun ve oda sıcaklığında 2.000 x g'da en az 8 dakika boyunca konsantratörü santrifüj edin.
- Batı blot analizi için ikinci akış (akış II) için bir örnek kaydedin ve kalan akış akışını atın.
- İstenilen zenginleştirme elde edildikten sonra (αDEC-205/OVA çözeltisinin yaklaşık 1,5 mL'si üst bölmede bırakılmalıdır) konsantre numuneyi hafifçe epire edin.
NOT: Üst bölmede çok fazla sıvı bırakılırsa, santrifüj tekrarlanabilir, ancak mümkün olduğunca kısa tutulmalıdır.
- Santrifüj protein konsantratörunu (MWCO 150 kDa) kolona 12 mL PBS pipetleme ve oda sıcaklığında 2.000 x g'da 2 dakika santrifüjleme ile önceden durulayın.
- Elde ettiği αDEC-205/OVA'nın protein konsantrasyonunu mikrovolum spektrofotometresi kullanarak belirleyin. PBS'i boş olarak kullanın.
- αDEC-205/OVA'yı 0,22 μm şırınd filtresi ünitesi kullanarak filtreleyin.
NOT: Daha sonraki analizler ve in vivo deneyler için αDEC-205/OVA 4 °C veya -18 °C'de saklanabilir.
4. Kimyasal konjugasyonun batı lekesi tarafından doğrulanması
NOT: Başarılı kimyasal konjugasyonun doğrulanması için OVA (4.2) veya αDEC-205 (4.10) tespit eden batı blot analizi yapılır. Paralel olarak OVA (4.2.) veya αDEC-205 (4.10.) tespiti yapılmalıdır. Bir yörüngesel platform çalkalayıcı tercihen ilgili çözümlerin düzgün dağılımına izin vermek için batı leke zarlarının tüm kuluçka adımları için kullanılmalıdır.
- SDS-PAGE (sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforez) için standart %10 SDS (sodyum dodecyl sülfat) jelleri hazırlayın.
- Eşlenmemiş ve konjuge edilmemiş OVA'yı tespit etmek ve jel elektroforezi çalıştırmak için örnekleri SDS-PAGE için hazırlayın.
- Farklı miktarlarda eşleştirilmiş αDEC-205/OVA (örneğin, 200, 100 ve 50 ng), saf OVA (örneğin, 80, 70, 60, 50, 40 ve 30 ng), 3.4.2 adımından konsantre olmayan αDEC-205/OVA konjugesinin bir örneği olan αDEC-205 (örneğin, 100 ve 50 ng) bir aliquot. (örneğin, 125 ng) ve 4 x azaltmayan SDS örnek tamponunda akışlı I ve II aliquot (sırasıyla 3.4.5. ve 3.4.7. adımlar; isteğe bağlı).
NOT: Hem serbest OVA'nın hem de konjugenin aynı leke üzerinde tespit edilebilmesini sağlamak için farklı konjuge ve protein konsantrasyonları yüklenir. - Numuneleri 65 °C'de 10 dakika ve 550 rpm'de bir ısıtma bloğunda denature.
- Farklı miktarlarda eşleştirilmiş αDEC-205/OVA (örneğin, 200, 100 ve 50 ng), saf OVA (örneğin, 80, 70, 60, 50, 40 ve 30 ng), 3.4.2 adımından konsantre olmayan αDEC-205/OVA konjugesinin bir örneği olan αDEC-205 (örneğin, 100 ve 50 ng) bir aliquot. (örneğin, 125 ng) ve 4 x azaltmayan SDS örnek tamponunda akışlı I ve II aliquot (sırasıyla 3.4.5. ve 3.4.7. adımlar; isteğe bağlı).
- Numuneleri ve protein standardını bir SDS jeline yükleyin ve SDS-PAGE'i çalıştırın.
- Proteinlerin SDS jelinden metanolle aktive edilmiş bir PVDF (polivinyliden difluorid) membrana (75 dk, 125 mA) standart şişirilmesini gerçekleştirin.
- Şişkinlik sonrasında, membranı uygun bir yemeğe koyun ve membran içeren çanağa 25 mL%4 yemek değiştirme sallama tozu/TBS-T (Tris tamponlu salin/%0,1 Ara 20) bloke tamponu pipetleyarak zarı tıkayın.
- Membranı blokaj çözeltisinde oda sıcaklığında 60 dakika veya 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya bırakın.
- Bloklama solüsyonunu atın ve yemekteki zara 15 mL birincil antikor çözeltisi pipetleterek% 2 öğün değiştirme sallama tozu / TBS-T antikor tamponunda (seyreltme 1:3.000) tavşan αOVA birincil antikoru ile membranı lekeleyin.
- Membranı oda sıcaklığında 45 dakika veya 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya bırakın (platform çalkalayıcıyı kullanın).
- Antikor çözeltisini atın ve zarı bulaşıkta yıkayın (platform çalkalayıcıyı kullanın).
- Membrana 25 mL TBS-T ekleyin ve 5 dakika kuluçkaya yatırın. Çözümü atın.
- Membrana 25 mL TBS-T/0,5 M NaCl ekleyin ve 5 dakika kuluçkaya yatırın. Çözümü atın.
- Membrana 25 mL TBS-T/%0,5 Triton X-100 ekleyin ve 5 dakika kuluçkaya yatırın. Çözümü atın.
- Membrana 25 mL TBS-T ekleyin ve 5 dakika kuluçkaya yatırın. Çözümü atın.
- Yemekteki membrana 15 mL ikincil antikor çözeltisi pipetleterek% 2 öğün değiştirme sallama tozu / TBS-T antikor tamponunda (seyreltme 1:2.000) keçi αrabbit-IgG-HRPO (at turpu peroksidaz) ikincil antikor ile zarı lekeleyin.
- Membranı oda sıcaklığında 45 dakika veya 4 °C'de (platform çalkalayıcıda) gece boyunca kuluçkaya bırakın.
- Membranı 4.7.1.- 4.7.4 adımında açıklandığı gibi tekrar yıkayın. platform çalkalayıcıyı kullanarak. Bu zar için, bir sonraki adım 4.16 ile devam edin. (aşağıdaki adımlar 4.10.- 4.15. (αDEC-205'in tespiti) 4.2.- 4.9. adımlara paralel olarak gerçekleştirilebilir.
- Örnekleri SDS-PAGE için αDEC-205'in tespiti için hazırlayın ve jel elektroforezini çalıştırın.
- Farklı miktarlarda αDEC-205/OVA seyreltin (örn. 200, 100 ve 50 ng), un-conjugated αDEC-205 (örneğin, 250, 125, 62.5 ng), saf OVA (örneğin, 80 ve 70 ng), adım 3.4.2'den konsantre olmayan αDEC-205/OVA örneği. (örneğin, 125 ng) ve 4 x azaltmayan SDS örnek tamponunda akışlı I ve II aliquot (sırasıyla 3.4.5. ve 3.4.7. adımlar; isteğe bağlı).
- Numuneleri 65 °C'de 10 dakika ve 550 rpm'de bir ısıtma bloğunda denature.
- Numuneleri ve protein standardını bir SDS jeline yükleyin ve jel elektroforezi çalıştırın.
- Proteinlerin SDS jelinden metanol aktif PVDF (polivinyliden difluorid) membran (75 dk, 125 mA) kadar standart şişirilmesini gerçekleştirin.
- Şişkinliği takiben, membranı uygun bir kaba koyun ve membranı içeren kabın içine% 10 bloke tamponunun (süt tozu / TBS-T) 25 mL'sini pipetleyarak zarı tıkayın.
NOT: Engelleme çözümleri αDEC-205 ve OVA algılama (adım 4.5.- Membranı oda sıcaklığında 60 dakika veya 4 °C'de gece boyunca (platform çalkalayıcıyı kullanarak) blokaj çözeltisinde kuluçkaya bırakın.
- Blokaj çözeltisini atın ve membranı keçi αrat-IgG(H+L)-HRPO antikoru ile %5 süt tozu/TBS-T antikor tamponunda (seyreltme 1:5.000) bulaşıktaki zara 15 mL antikor çözeltisi pipetleterek lekeleyin.
NOT: Antikor tamponları αDEC-205 tespiti ile OVA tespiti arasında farklılık gösterir (adım 4.6./ 4.8.).- Membranı oda sıcaklığında 45 dakika veya 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya bırakın (platform çalkalayıcıyı kullanarak).
- Membranı, 4.7.1.- 4.7.4 adımlarında açıklandığı gibi tabakta iyice yıkayın. (platform çalkalayıcıyı kullanın).
- HRP sinyalini geliştirmek ve karanlık bir odadaki chemiluminescence'ı x-ray filmi veya görüntüleme sistemi aracılığıyla tespit etmek için uygun bir algılama reaktifi kullanın.
5. Kimyasal konjugasyonun ELISA tarafından doğrulanması
- αDEC-205/OVA ile sonuçlanan başarılı kimyasal konjugasyonun daha fazla doğrulanması için ELISA'yı gerçekleştirin.
- Uygun bir 96 kuyulu ELISA plakasını kaplama tamponunda 100 μL/kuyu 3 ng/μL tavşan αOVA antikoru ile kapla (0,1 M sodyum bikarbonat (NaHCO3) pH 9,6 H2O'da seyreltilmiştir).
- Plakayı 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.
- Kaplamadan sonra, plakayı PBS ile üç kez yıkayın, örneğin bir ELISA yıkayıcı kullanarak.
- Plakanın her kuyusuna 200 μL blokaj tamponu (PBS'de % 10 FCS) pipetleme yaparak plakayı tıkayın ve plakayı oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- 6 μg/m arasında değişen seyreltmeler elde etmek için αDEC-205/OVA'yı (adım 3.6.) 1:2 blokaj tamponunda (PBS'de %10 FCS) seri olarak seyreltin 93,8 ng/mL αDEC-205/OVA'ya kadar iner ve kuyulara bu azalan αDEC-205/OVA miktarlarının 100 μL/kuyusunun eklenmesini sağlar.
- Plakayı oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
- Plakayı PBS ile üç kez yıkayın, örneğin bir ELISA yıkayıcı kullanarak.
- Plakanın her kuyusuna 100 μL keçi αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO antikoru (blokaj tamponunda 1:2.000'e kadar seyreltilmiş (PBS'de %10 FCS)) ekleyin.
- Oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yaslanın.
- Plakayı PBS kullanarak, örneğin bir ELISA yıkayıcı kullanarak üç kez yıkayın.
- Kuyulara 50 μL HRPO substrat ekleyin. Net bir renk reaksiyonu gözlemlerken, kuyu başına 150 μl durdurma çözeltisi (1M H2SO4)eklenerek reaksiyonu durdurun.
- 5 dakika sonra, elisa okuyucu kullanarak 450 nm'de emilimi okuyun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol kullanılarak αDEC-205 ila OVA proteininin kimyasal konjugasyonu tipik olarak in vivo DC hedefleme yaklaşımları için verimli αDEC-205/OVA üretimine izin verecektir. Tekniğin kendisini doğrulamak ve verilen konjugenin işlevselliğini test etmek için farklı stratejiler vardır. Batı blot analizi ve ELISA başarılı konjugasyonu doğrulamak ve aynı zamanda potansiyel olarak serbest OVA'yı tespit etmek için kullanılır (Şekil 2). İn vitro bağlama çalışmaları (Şekil 3) ve in vivo bağışıklamalar (Şekil 4) konjugenin DEC-205'e bağlanmasını ve DC'nin hedef alınmasını doğrulamaz.
Paralel batı leke analizi hem konjuge OVA 'yı (Şekil 2A) hem de konjuge αDEC-205'i (Şekil 2B)tespit etmek için kullanılır. Özellikle, OVA için blottaki antikorun moleküler ağırlığı seviyesindeki pozitif sinyal, OVA ve antikorun ilişkisini doğrular (Şekil 2A). Ayrıca, batı leke analizinde OVA için lekeleme, 3.6. Büyük miktarlarda ücretsiz OVA tespit edilirse, adım 3.4.1. 'yi 3.4.8'e kadar karşıla. protokolün tekrarlanması gerekir. OVA için boyama tamamlayıcısı (Şekil 2A), batı leke analizinde αDEC-205 için boyama, Şekil 2B'degösterildiği gibi "çıplak" αDEC-205 ve konjuge arasındaki moleküler ağırlıktaki artışla başarılı konjugasyonu doğrular.
Batı şişkinliğinin yanında, belirli bir ELISA, αDEC-205'in OVA'ya başarılı bir şekilde konjugasyonunun doğrulanmasına izin verir. Bununla birlikte, batıdaki blot analizlerinin aksine, bu ELISA ücretsiz ve eşlenmemiş αDEC-205 veya OVA'nın tespit edilmesine izin vermez. Test kurulumu nedeniyle (Şekil 2C), pozitif bir sinyal ancak konjugasyon verimliyse üretilir. Tespit edilen sinyal (emilimi 450 nm'de) ve analiz edilen protein miktarı arasındaki pozitif ilişki, Şekil 2D'degösterildiği gibi kimyasal konjugasyon yoluyla αDEC-205/OVA'nın başarılı bir şekilde üretilmesini doğrular. Aynı zamanda, αDEC-205/OVA konjugesinin 9,38 ng'sinden zaten verilen pozitif sinyal, bu yöntemin güçlü hassasiyetini göstermektedir (Şekil 2D). Konjuge miktarının artması için adsorpsiyonda bir artış olmaması durumunda, konjugasyon muhtemelen başarılı olmadı. Bu durumda, batı leke analizleri de olumsuz sonuçlar verecektir, yani OVA için boyanmış blottaki konjugenin tespit edilmesi ve αDEC-205 için boyanmış blottaki moleküler ağırlıkta artış olmayacaktır.
Batı blot ve ELISA tahlilleri konjugasyonu ve serbest antijenin bu şekilde çıkarılmasını değerlendirmek için kullanılırken, DEC-205'e bağlanmayı ve DC'nin hedeflenmesini doğrulamak için sonraki fonksiyonel analizlere ihtiyaç vardır. Bu amaçla in vitro bağlama çalışmaları (Şekil 3) ve in vivo bağışıklamalar (Şekil 4) gerçekleştirdik. Bu deneyler için dişi 6-8 haftalık C57BL/6 ve 8-12 haftalık Balb/c fareleri ticari kaynaklardan elde edildi veya Helmholtz Enfeksiyon Araştırmaları Merkezi'nin (HZI) hayvan tesisinde yetiştirildi ve belirli patojen içermeyen koşullar altında barındırıldı. Şekil 3, αDEC-205 konjugesinin ve HCV Core proteininin (αDEC-205/Core) CD11c+ hücreler in vitro'ya bağlanması için fonksiyonel tahlillerigöstermektedir. Akış-sitometri, kemik iliği türetilmiş CD11c + hücrelerini (Şekil 3A, B) ve yeni izole edilmiş fare CD11c+ splenositleri (veriler gösterilmez) verimli bir şekilde bağlamak için αDEC-205 / Core'u açıkça göstermiştir. Bu tahliller, kimyasal konjugasyonun αDEC-205'in bağlama kapasitesine müdahale etmediğini göstermektedir. Bu, αDEC-205/Core'un in vitro oluşturulan kemik iliği türevli dendritik hücrelerden (BMDC) sıralanmış MHC-II+ CD11c+ hücrelerine bağlanmasını gösteren immünoresans analizleri ile daha da doğrulanır (Şekil 3C).
Geçmişte, farelerde OVA'ya özgü immün yanıtları verimli bir şekilde in vivo olarak teşvik etmek için gösterilen protokol tarafından üretilen αDEC-205/OVA konjugelerini gösterdik, bu da konjugenin başarılı üretimini ve DC'nin işlevsel hedeflemesini doğruladı (Şekil 4)12,14. Özellikle, αDEC-205/OVA ile deri altı aşılama, humoral ve hücresel OVA'ya özgü immün yanıtları verimli bir şekilde indükler. Daha da önemlisi, rekombinant adenovirüs meydan okuma modelinde, hepatotropik virüslere yönelik aşılar için güçlü etkileri olan virüs bulaşmış hepatositleri ortadan kaldırabilen antiviral CD8+ T hücreleri tespit ettik12. Ayrıca, antijene özgü sitotoksik T hücrelerinin son derece etkili indüksiyonu, antitümör bağışıklığın in vivo astarlanması için bu yaklaşımın potansiyelinin altını çizmektedir. Ayrıca, in vivo DC hedeflemesi bağlamında farklı adjuvanları test etmek ve karşılaştırmak için αDEC-205/OVA'yı başarıyla kullandık14. αDEC-205/OVA ile aşılamada, Poli(I:C) (poliinosinic-polisitikidylic asit) ve CpG (sentetik oligodeoksinükleot) kombinasyonu ile birlikte Unmethylated CpG motifleri içeren oksitler) genel olarak gözlemledik (Şekil 4A) ve bazı zaman dilimleri için sadece OVA ile aşılamaya kıyasla OVA'ya özgü IgG seviyeleri önemli ölçüde daha yüksektir(Şekil 4B). Ayrıca, αDEC-205/OVA verimli bir şekilde OVA'ya özgü CD4+ ve CD8+ T hücre yanıtları (Şekil 4C, D) ve αDEC-205/OVA kaynaklı CD8+ T hücre yanıtı sadece OVA tarafından indükleneni önemli ölçüde aşmıştır (Şekil 4D).
Şekil 1: αDEC-205 ve OVA kimyasal konjugasyonunun modeli. İlk adımda, αDEC-205'in birincil aminleri çapraz bağlantı sülfo-SMCC'nin NHS ester'i ile reaksiyona girer ve maleimid aktive αDEC-205 ile sonuçlanır. TCEP-HCl ile inkübasyon yoluyla OVA proteininin disülfid bağlarının azaltılmasından sonra, maleimid aktive αDEC-205, αDEC-205/OVA antikorunu/antijen konjugesini oluşturmak için TCEP-HCl azaltılmış OVA proteini ile reaksiyona girer. Kısaltmalar: N-hydroxysuccinimide ester (NHS ester); sülfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]sikloheksan-1-karboksilat (sulfo-SMCC); Tris(2-karboksitil)fosfin hidroklorür (TCEP-HCl). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kimyasal konjuge αDEC-205/OVA'nın doğrulanması. αDEC-205 ve OVA proteininin etkili kimyasal konjugasyonunu doğrulamak için batı leke analizi (A,B) ve ELISA (C,D) yapılır. αDEC-205/OVA örnekleri, αDEC-205 ve farklı OVA protein konsantrasyonları, ova proteinini(A)veya keçi αrat-IgG(H+L)-HRPO antikorunu tespit etmek için bir tavşan αOVA primer antikoru ve bir keçi αrabbit-IgG-HRPO ikincil antikoru kullanılarak SDS-PAGE (%10)ve sonraki batı blot analizine tabi tutuldu. (C) αDEC-205/OVA konjugesinin doğrulanması için ELISA'nın şematik gösterimi. Tavşan αOVA kaplama antikor, konjuge OVA aracılığıyla αDEC-205/OVA'yı bağlar. Goat αrat-IgG(H+L)-HRPO, bağlı konjugenin αDEC-205 fraksiyonunu tanır ve pozitif bir sinyal böylece etkili konjugasyonu doğrular. (D) ELISA (C) bölümünde açıklandığı gibi gerçekleştirildi. Seri seyreltilmiş αDEC-205/OVA (600 ng ila 9.38 ng) miktarları (1:2) analiz edildi. Veriler, temsili bir tahlilin üç taraflı ortalaması olarak gösterilir. Kısaltmalar: enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA); at turp peroksidaz (HRPO); ovalbumin (OVA); sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE). A ve B panelleri Volckmar ve ark.12'den değiştirilmiştir. http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: αDEC-205/Core'un akış-sitotomi ve immünoforezans mikroskopisi ile kemik iliği türetilmiş dendritik hücrelere (BMDC) bağlanması. αDEC-205/Core'un hedef molekülü DEC-205'i BMDC'lere in vitroolarak bağlama kapasitesini analiz etmek için floresan ile aktive hücre sıralama (FACS) analizi (A,B) ve immünofluoresans mikroskopisi (C) yapıldı. Kısacası, kemik iliği hücreleri dişi Balb/c farelerinin arka ayaklarından izole edildi (n=3) 8-12 haftalık ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş RPMI ortamında kültürlendi, %1 glutamin, 0,25 mM mercaptoethanol ve 5 ng/mL GM-CSF (granülosit-makrofaj kolonisi uyarıcı faktör). 6. günde, yapışmayan BMDC'ler dikkatlice hasat edildi ve bağlama analizleri için kullanıldı. (A,B) İn vitro olarak üretilen BMDC'ler 10 μg/mL αDEC-205/Core, αDEC-205 veya orta (kontrol) ile 4 °C'de 1 saat boyunca inkübe edildi ve ardından APC etiketli αCD11c [klon HL3] ile boyandı. BMDC'lerin yüzeyinde bağlı αDEC-205/Core'un tespiti, ek olarak hücrelerin PE etiketli keçi αrat (A) veya fare αHCV Çekirdeği [klon C7-50] ve ardından ikincil αmouse-IgG1-PE boyama (B)ile boyanması ile gerçekleştirildi. Temsili histogramlar, kapılı CD11c+ hücrelerinin PE sinyalini ve % PE pozitif hücrelerini gösterir. (C) Naif Balb/c farelerinden in vitro üretilen BMDC'ler MHC-II+ ve CD11c+ hücreler için sıralandı ve 4 °C'de 1 saat boyunca 10 μg/mL αDEC-205/Core ile inkübe edildi. Hücreye bağlı αDEC-205/Core, yıkandıktan sonra 4 °C'de 30 dakika boyunca Alexa 594-coupled αrat-IgG veya fare αHCV Core [klon C7-50] ve Alexa 488-coupled αmouse-IgG ile boyandı. Hücreler immünofluoresans mikroskopisi (ölçek çubuğu = 20 μm) ile görselleştirildi. αDEC-205/Core'un BMDC'lere bağlanma kapasitesi, her iki lekenin de (çift pozitif = turuncu) yer paylaşımı ile doğrulandı. Kısaltmalar: kemik iliği türevi dendritik hücreler (BMDC); floresanla aktive edilmiş hücre sıralama (FACS); granülosit-makrofaj kolonisi uyarıcı faktör (GM-CSF); hepatit C virüsü (HCV). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: αDEC-205/OVA ile bağışıklama sonrasında OVA'ya özgü humoral ve hücresel immün yanıtlar. αDEC-205/OVA'nın DC in vivo'yu hedefleme işlevselliği, daha önce Volckmar veark. Kısaca, dişi 6-8 haftalık C57BL/ 6 fareler (n =5) 0 günlerinde deri altı aşılandı, 30 μg αDEC-205/OVA ile 14 ve 28, hayvan başına toplam 50 μL PBS hacminde tek başına 50 μg Poly(I:C)/50 μg CpG, 30 μg αDEC-205 veya 7 μg OVA proteini ile birlikte konjuge eder. Diğer kontroller sadece PBS ile tedavi edildi. (A,B) Humoral immün yanıtı izlemek için, aşılanmış fareler izofluran soluma yoluyla hafifçe uyuşturuldu ve retro-orbital sinüsten 0, 13 ve 27. Sera, ELISA12tarafından OVA'ya özgü IgG varlığı için açıklandığı ve test edildiği gibi hazırlandı. Uç nokta titreleri, negatif kontrol değerlerinin iki kat üzerinde bir absorbans sağlayan son serum seyreltmenin karşılıklı değeri olarak ifade edildi. Sonuçlar üç bağımsız deneyden derlenmiştir. (A) Grup ortalaması olarak gösterilen OVA spesifik total serum IgG titrelerinin kinetiği. (B) OVA'ya özgü IgG titresi 27. İstatistikler: eşleşmeyen iki taraflı t testi. (C,D) Hücresel immün yanıtların indüksiyonu, daha önce yayınlanan12gün boyunca murine IFNφ tespit kiti kullanılarak enzime bağlı immünorbent nokta (ELISPOT) tahlilleri ile analiz edildi. Bağışıklanmış farelerden izole edilmiş splenositler, deneysel gruplar ve 5 mg/mL CD4+ (C) veya CD ile uyarıldıktan sonra IFNφ nokta şekillendirme birimlerinin /10 6 hücrenin sayısı için birleştirildi. 8+ OVA peptit (D) analiz edildi (OVA peptitleri: CD4323–339 (ISQAVHAAHAEINEAGR) ve CD8257–264 (SIINFEKL)). Çubuklar ortalama ± SEM'i temsil eder (n=5, havuza alınan örneklerden üç taraflı). İstatistikler: Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Kısaltmalar: sitozin-fosfat-guanin oligonükleotid dizileri (CpG), enzime bağlı immünosorbent test (ELISA), enzime bağlı immünosorbent nokta (ELISPOT), ovalbumin (OVA), fosfat tamponlu salin (PBS), poliinosinic-polisitikidlik asit (Poli(I:C)). Bu rakam Volckmar ve ark.12 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endositoz reseptörüne özgü antikor ve protein antijeninin kimyasal konjugasyonu, klinik öncesi fare modellerinde in vivo DC hedeflemesi için verimli ve daha da önemlisi esnek bir yaklaşım sağlar. Protokolümüzle, model antijen OVA'nın DEC-205'e özgü bir IgG antikoru için başarılı bir şekilde konjugasyonu için verimli bir yaklaşım sağlıyoruz.
Protokolümüze göre, αDEC-205 bir hibridoma hücre hattından arındırıldır ve geçmişte, tanımlandığı gibi G sepharose proteinini kullanarak antikorun saflaştırılmasını sağladırdık. Ayrıca, daha sonraki çalışmalarda αDEC-205'i saflaştırmak için FPLC'yi kullandık ve daha sonraki kimyasal konjugasyon da aynı şekilde verimliydi. Verimli kimyasal konjugasyon için kritik adımlar hem antikorun hem de proteinin astarlanmasıdır. Bu adımları, antikorun crosslinker sulfo-SMCC ile inkübasyonunu ve TCEP-HCl aracılığıyla proteinin azaltılmasını gerçekleştirmek için mevcut farklı protokollerden optimize ettik. Özellikle, bu noktada kritik adımlar TCEP-HCl'nin (adım 3.1.) taze hazırlanması ve TCEP-HCl'nin proteinle inkübasyon süresidir, bu da uzatılmaması gerekir (adım 3.1.2.). Ayrıca, TCEP-HCl aracılığıyla disülfid bağların azaltılması için kullanılan protein tamponu, TCEP-HCl ile azalmayı olumsuz etkileyebileceğinden kritik öneme sahiptir. Ayrıca, konjugasyon için en uygun reaksiyon koşullarını sağlamak için aktif antikor ve azaltılmış proteini (adım 3.3.6.) hemen karıştırmak önemlidir. Elimizde bu yaklaşım, konjugasyonla ilgili en verimli ve güvenilir sonuçları verdi. Sonraki in vivo yaklaşımlar için bir diğer kritik adım, ilişkisiz OVA'nın αDEC-205/OVA konjugesinden çıkarılmasıdır. Bu adımı doğrulamak için batı leke analizlerini optimize ettik ve hem konjuge αDEC-205 hem de konjuge OVA proteininin(Şekil 2A ve B)tespit edilmesini öneririz. Son konjuge çözeltisinde ilişkisiz OVA bulunması durumunda, bilinen OVA konsantrasyonlarının (Şekil 2A'daolduğu gibi) şişirilmesi ve tespit etmesi, SDS-PAGE için yüklenen toplam protein miktarı ile ilgili olarak ilişkisiz OVA miktarını tahmin etmeye yardımcı olacaktır. Konjugasyon verimsizse, sorun giderme konjugasyon için kullanılan antijen/antikor oranını ele almalıdır. Konjugasyonun ELISA tarafından tespit edildiği gibi etkili olması, ancak batı blot analizi ile tespit edilememesi durumunda, en kritik faktör olan batı leke analizlerinde antikor konsantrasyonlarını (adım 4.6., 4.8., 4.14.) deneyimledik.
Yaklaşımımızın ana sınırlaması, antikor moleküllerinin sayısı ile birleştirilmiş protein miktarı arasında sabit bir korelasyon olmadığı zaman zaman değişen bir konjugasyon verimliliğidir. Bununla birlikte, gösterilen protokolün, tekrarlanabilir sonuçlar veren DC hedeflemesinin sonraki in vivo çalışmalarına güvenilir bir şekilde izin verdiğine inanıyoruz ve deneyimledik. Ayrıca, protokolümüze prensip olarak hem αDEC-205 hem de OVA proteini çeşitli ilgi alanlarına sahip in vivo çalışmalar için alternatif antikorlar ve antijenlerle değiştirilebilirken, kimyasal konjugasyonun bireysel adımlarının yeni bileşenler için yeni optimize edilmesi gerekecektir. Bu esas olarak optimal antikor/antijen oranı için geçerlidir ve örneğin indirgenebilir Cys kalıntılarının erişilebilirliğine bağlı olabilir. Yaklaşımlarımızda, başarılı konjugasyon reaksiyonları ile sonuçlanan optimal oranlar OVA için αDEC-205 için 1:5 ve HCV proteinleri NS3 (yapısal olmayan protein 3) ve Çekirdek için αDEC-205 için 1.35:1'dir. Her konjuge için, çapraz bağlantının veya konjugasyonun antikorun antijen bağlama kapasitesi üzerindeki olumsuz etkilerinin hariç tutulması gerekir. Not olarak, tam boy proteinler yerine immünojenik peptitlerin konjugasyonu bu konuda daha az sorunludur. Bununla birlikte, proteinler sonraki bağışıklamada daha yüksek antijen çeşitliliği sağlar. Genetik füzyon yaklaşımları kimyasal konjugasyona bir alternatif gösterir ve ayrıca açık avantajlara sahiptir1. Sonuç olarak, DC hedeflemesi için antikorları ve antijenleri birbirine bağlama stratejisinin seçimi kaynaklara, araştırma odağına ve konjugelerin beklenen uygulamalarına bağlı olacaktır. Antikorlar ve antijenlerle ilgili göreceli esnekliğin kimyasal konjugasyonun büyük bir avantajını gösterdiğine inanıyoruz ve gerçekten de burada açıklanan protokolü αDEC-205'in hepatit C virüsünün (HCV) farklı proteinlerine verimli kimyasal konjugasyonu için kullandık(Şekil 3 ve veriler gösterilmedi).
Genel olarak, endositoz-reseptör spesifik antikorlarının αDEC-205/OVA'daki gibi protein antijenlerine karşı kimyasal konjugasyonunun, özellikle preklinik hayvan modellerinde antitümör bağışıklığı teşvik etmeyi amaçlayanlar da dahil olmak üzere DC hedefleme yaklaşımlarını çalışmada olağanüstü değerde antikor / antijen konjugeleri üretmek için esnek ve güvenilir bir araç sergilediğine inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar uzman teknik yardımı için S. Prettin'e teşekkür eder. Bu çalışma Helmholtz Alman Araştırma Merkezleri Birliği'nin (HGF) Helmholtz İttifakı ''Kanserlerin İmmünoterapisi' (HCC_WP2b) kapsamında sağlanan bir hibe ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| antibody buffer 2 % | 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| antibody buffer 5 % | 5 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| blocking buffer (ELISA) | 10 % FBS in PBS | ||
| blocking buffer 4 % | 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T | ||
| blocking buffer 10 % | 10 % milk powder (w/v) in TBS-T | ||
| cell culture flask T25 | Greiner Bio-One | 690175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 ) |
| cell culture flask T75 | Greiner Bio-One | 658175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) |
| cell culture flask T175 | Greiner Bio-One | 661175 | we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195) |
| centrifugal concentrator MWCO 10 kDa | Sartorius | VS2001 | Vivaspin 20 centrifugal concentrator |
| centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml | Thermo Fisher Scientific | 88532 | Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available |
| centrifuge bottles | Nalgene | 525-2314 | PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany |
| coating buffer (ELISA) | 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6) | ||
| desalting columns MWCO 7 kDa | Thermo Fisher Scientific | 89891 | Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL |
| detection reagent ELISA (HRPO substrate) | Sigma-Aldrich/Merck | T8665-100ML | 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system |
| detection reagent western blot (HRPO substrate) | Roche/Merck | 12 015 200 01 | Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) |
| dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa | SERVA Electrophoresis | 44110 | Visking dialysis tubing, 16 mm diameter |
| ELISA 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 442404 | MaxiSorp Nunc-Immuno Plate |
| fetal calf serum | PAN-BIOtech | P40-47500 | FBS Good forte |
| ISF-1 medium | Biochrom/bioswisstec | F 9061-01 | |
| milk powder | Carl Roth | T145.2 | powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket |
| NLDC-145 hybridoma | ATCC | HB-290 | if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC |
| non-reducing SDS sample buffer 4 x | for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue | ||
| ovalbumin | Hyglos (via BioVendor) | 321000 | EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used |
| PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles | Nunc In Vitro | 734-2394 | standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany |
| pH indicator strips | Merck | 109535 | pH indicator strips 0-14 |
| polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-062 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot |
| polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody (ELISA) | Jackson ImmunoResearch | 112-035-068 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA |
| polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-045 | obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot |
| polyclonal rabbit αOVA (ELISA) | Abcam | ab181688 | used at 3 ng/µl |
| polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) | OriGene | R1101 | used at 1:3,000 for western blot |
| Protein G Sepharose column | Merck/Millipore | P3296 | 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01) |
| protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26616 | PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa |
| PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane | Merck/Millipore | IPVH00010 | immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane |
| rubber plug | Omnilab | 5230217 | DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm) |
| silicone tube | Omnilab | 5430925 | DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm) |
| Slim-Fast | we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder | ||
| stopping solution (ELISA) | 1M H2SO4 | ||
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | 22322 | Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg) |
| syringe filter unit 0.22 µm | Merck/Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| syringe 10 ml | Omnilab | Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun | |
| Sterican® cannulas | B. Braun | Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow | |
| TBS-T | Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20 | ||
| TCEP-HCl | Thermo Fisher Scientific | A35349 | |
| tubing connector | Omnilab | Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube |
References
- Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy. Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).
- Banchereau, J., et al.
- Wculek, S. K., et al. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).
- Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype. Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).
- Bonifaz, L. C., et al. In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination. Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).
- Boscardin, S. B., et al. Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).
- Hossain, M. K., Wall, K. A. Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses. Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).
- Johnson, T. S., et al. Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule. Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).
- Trumpfheller, C., et al. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).
- Idoyaga, J., et al. Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).
- Sancho, D., et al. Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).
- Volckmar, J., et al. Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver. Scientific Reports. 7, 43985 (2017).
- Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody. Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).
- Volckmar, J., et al. The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells. Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).
