تم تطوير طريقة مكررة لإزالة الأنسجة وتطبيقها على قلب الماوس البالغ. تم تصميم هذه الطريقة لمسح كثيفة، والأنسجة القلبية autofluorescent، مع الحفاظ على مضان الخلايا الليفية المسمى يعزى إلى استراتيجية مراسل الجينية.
أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الأكثر انتشارا للوفيات في جميع أنحاء العالم وغالبا ما تتميز بزيادة تليف القلب التي يمكن أن تؤدي إلى زيادة تصلب البطين مع تغيير وظيفة القلب. هذه الزيادة في التليف البطيني القلبي يرجع إلى تنشيط الخلايا الليفية المقيمة ، على الرغم من أن كيفية عمل هذه الخلايا داخل القلب ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) ، عند خط الأساس أو بعد التنشيط ، ليست مفهومة جيدا. لدراسة كيفية مساهمة الخلايا الليفية في أمراض القلب وديناميكياتها في القلب ثلاثي الأبعاد ، تم تطوير طريقة منقحة لإزالة الأنسجة والتصوير المستندة إلى CLARITY تظهر الخلايا الليفية القلبية المسماة بالفلورسنت داخل قلب الماوس بأكمله. تم تسمية الخلايا الليفية المقيمة في الأنسجة وراثيا باستخدام فئران المراسلة الفلورية Rosa26-loxP-eGFP المتقاطعة مع الأرومة الليفية القلبية التي تعبر عن خط طرق Tcf21-MerCreMer. وقد استخدمت هذه التقنية لمراقبة ديناميات توطين الخلايا الليفية في جميع أنحاء البطين الأيسر البالغ بأكمله في الفئران السليمة وفي نماذج الماوس الليفي لأمراض القلب. ومن المثير للاهتمام، في نموذج إصابة واحدة، لوحظت أنماط فريدة من الخلايا الليفية القلبية في قلب الفأر المصاب الذي تبع عصابات من الألياف الملفوفة في اتجاه الانكماش. وفي نماذج الإصابات الإقفارية، حدثت وفاة في الخلايا الليفية، أعقبها إعادة السكان من المنطقة الحدودية المحتشدة. بشكل جماعي ، تسمح تقنية توضيح الأنسجة القلبية المكررة ونظام التصوير الرقمي بالتصور ثلاثي الأبعاد للخلايا الليفية القلبية في القلب دون قيود فشل اختراق الأجسام المضادة أو القضايا السابقة المحيطة بالفلورسينس المفقود بسبب معالجة الأنسجة.
على الرغم من أن خلايا القلب تشكل أكبر جزء حجم في القلب ، إلا أن الخلايا الليفية القلبية أكثر وفرة وتشارك بشكل حاسم في تنظيم السمات الهيكلية والتجزية الأساسية لهذا الجهاز. الخلايا الليفية القلبية هي متحركة للغاية، واستجابة ميكانيكيا، وتتراوح phenotypically اعتمادا على مدى تفعيلها. الخلايا الليفية القلبية ضرورية للحفاظ على المستويات الطبيعية للمصفوفة خارج الخلية (ECM)، وإنتاج ECM قليل جدا أو أكثر من اللازم من قبل هذه الخلايا يمكن أن يؤدي إلى المرض1،2،3. ونظرا لأهميتها في المرض ، أصبحت الخلايا الليفية القلبية موضوعا متزايد الأهمية للتحقيق نحو تحديد استراتيجيات العلاج الجديدة ، خاصة في محاولة للحد من التليف المفرط4و5و6و7. عند الإصابة ، تنشط الخلايا الليفية وتفرق إلى نوع خلية اصطناعية أكثر تعرف باسم الورم العضلي ، والتي يمكن أن تكون منتشرة وتفرز ECM وفيرة ، وكذلك نشاط انقباش يساعد على إعادة تشكيل البطينين.
في حين تم تقييم الخلايا الليفية القلبية على نطاق واسع لخصائصها في الثقافات ثنائية الأبعاد6و8و9و10، إلا أنه أقل بكثير من فهم خصائصها وديناميكياتها في القلب الحي ثلاثي الأبعاد ، إما عند خط الأساس أو مع تحفيز المرض. هنا ، وقد وصفت طريقة المكرر لمسح الأنسجة قلب الماوس الكبار مع الحفاظ على مضان الخلايا الليفية وصفت مع Rosa26 – loxP – eGFP x Tcf21 – MerCreMer نظام المراسل الجيني. داخل القلب، Tcf21 هو علامة محددة نسبيا من الخلايا الليفية هادئة4. بعد إعطاء تاموكسيفين لتنشيط بروتين MerCreMer غير القابل للانزدواج ، فإن جميع الخلايا الليفية هادئة ستعبر بشكل دائم عن البروتين الفلوري الأخضر المعزز (eGFP) من مكان Rosa26 ، والذي يسمح بتتبعها في الجسم الحي.
توجد العديد من بروتوكولات تطهير الأنسجة الراسخة ، وبعضها تم تطبيقه على القلب11،12،13،14،15،16،17. ومع ذلك، تم العثور على العديد من الكواشف المستخدمة في بروتوكولات مختلفة لإزالة الأنسجة لإرواء إشارات الفلورة الذاتية18. بالإضافة إلى ذلك ، من الصعب مسح قلب البالغين بسبب البروتينات الوفيرة التي تحتوي على مجموعة الهيم التي تولد autofluorescence19. لذلك ، كان الهدف من هذا البروتوكول هو الحفاظ على مضان علامة الورم الليفي مع تثبيط متزامن للفلورة الذاتية للهيم في قلب البالغين المصابين للحصول على التصور الأمثل ثلاثي الأبعاد في الجسم الحي12و13و14و16و17و20.
الدراسات السابقة في محاولة لفحص الورم الليفي القلب في الجسم الحي تستخدم الأجسام المضادة التي غرست لتسمية هذه الخلايا، على الرغم من أن هذه الدراسات كانت محدودة من قبل اختراق الأجسام المضادة وهيكل الأوعية الدمويةالقلبية 14،16،17،20. على الرغم من أن Salamon وآخرون قد أظهرت تطهير الأنسجة مع الحفاظ على مضان الخلايا العصبية الموضعية في قلب الوليد، وNehrhoff وآخرون أظهرت الحفاظ على الفلورية بمناسبة الخلايا النخاعية، والحفاظ على الفلورية الذاتية من خلال الجدار البطيني بأكمله لم يثبت بعد، بما في ذلك تصور الخلايا الليفية القلب الكبار في خط الأساس أو بعدالإصابة 13،20. هذا البروتوكول تطهير الأنسجة يصقل خليط من البروتوكولات السابقة على أساس طريقة وضوح (واضح تبادل الدهون الأكريلاميد الهجين التصوير جامدة / المناعة / في الموقع التهجين الأنسجة المتوافقة مع الهيدروجيل) وPEGASOS (البولي ايثيلين غليكول (PEG) المرتبطة نظام المذيبات). سمح هذا البروتوكول المكرر بفحص أقوى للخلايا الليفية القلبية في قلب الماوس عند خط الأساس وكيفية استجابتها لأنواع مختلفة من الإصابات. البروتوكول واضح وقابل للاستنساخ وسيساعد على توصيف سلوك الخلايا الليفية القلبية في الجسم الحي.
تقدم هذه المقالة طريقة مكررة لتطهير الأنسجة التي تسمح بتصور الخلايا الليفية القلبية في الجسم الحي ، سواء عند خط الأساس أو بعد الإصابة ، لتوصيف وفهم الخلايا الليفية بشكل أفضل في قلب الماوس. يعالج هذا البروتوكول المعزز القيود في بروتوكولات إزالة الأنسجة الموجودة التي حاولت تحديد أنواع خلا?…
The authors have nothing to disclose.
ويود المؤلفون أن يعترفوا بجوهر التصوير Confocal CCHMC لمساعدتهم وتوجيههم في تطوير هذا النموذج ، وكذلك مات باتي من الهندسة السريرية لتصميم جميع الأجزاء المطبوعة ثلاثية الأبعاد. تم دعم ديميتريا فيشيسر بمنحة تدريبية من المعاهد الوطنية للصحة ، (NHLBI ، T32 HL125204) وجيفري د. مولكينتين بدعم من معهد هوارد هيوز الطبي.
4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
Heparin | Sigma | H0777 | |
Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |