En raffineret metode til væv clearing blev udviklet og anvendt på den voksne mus hjerte. Denne metode blev designet til at rydde tæt, autofluorescerende hjertevæv, samtidig med at mærket fibroblast fluorescens tilskrives en genetisk reporter strategi.
Hjerte-kar-sygdomme er den mest udbredte årsag til dødelighed på verdensplan og er ofte præget af øget hjertefibrose, der kan føre til øget ventrikelstivhed med ændret hjertefunktion. Denne stigning i hjerte ventrikulær fibrose skyldes aktivering af residente fibroblaster, selv om hvordan disse celler fungerer inden for 3-dimensionelle (3-D) hjerte, ved baseline eller efter aktivering, er ikke godt forstået. For at undersøge, hvordan fibroblaster bidrager til hjertesygdomme og deres dynamik i 3D-hjertet, blev der udviklet en raffineret KLARHED-baseret vævsclearing- og billeddannelsesmetode, der viser fluorescerende mærkede hjertefibroblaster i hele musehjertet. Væv bosiddende fibroblaster blev genetisk mærket ved hjælp af Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mus krydset med hjerte fibroblast udtrykke Tcf21-MerCreMer knock-in linje. Denne teknik blev brugt til at observere fibroblast lokalisering dynamik i hele voksne venstre hjertekammer i raske mus og i fibrotiske mus modeller af hjertesygdomme. Interessant, i en skade model, unikke mønstre af hjerte fibroblaster blev observeret i den skadede mus hjerte, der fulgte bands af indpakkede fibre i kontraktile retning. I iskæmiske skadesmodeller indtraf fibroblastdøden efterfulgt af en genopfyldning fra den infarkte grænsezone. Samlet set giver denne raffinerede hjertevævskonderingsteknik og digitaliserede billeddannelsessystem mulighed for 3D-visualisering af hjertefibroblaster i hjertet uden begrænsninger af antistofindtrængningssvigt eller tidligere problemer omkring tabt fluorescens på grund af vævsbehandling.
Selvom kardiomyocytter udgør den største volumenfraktion i hjertet, er hjertefibroblaster mere rigelige og er kritisk involveret i reguleringen af dette organs grundlæggende strukturelle og reparative træk. Hjertefibroblaster er meget mobile, mekanisk lydhøre og fænotypisk spænder afhængigt af omfanget af deres aktivering. Hjertefibroblaster er nødvendige for at opretholde normale niveauer af ekstracellulær matrix (ECM), og for lidt eller for meget ECM-produktion af disse celler kan føre til sygdom1,2,3. I betragtning af deres betydning i sygdom er hjertefibroblaster blevet et stadig vigtigere undersøgelsesemne til at identificere nye behandlingsstrategier, især i forsøget på at begrænse overdreven fibrose4,5,6,7. Ved skade aktiverer og differentierer fibroblaster sig til en mere syntetisk celletype kendt som en myofibroblast, som kan være proliferativ og udskille rigelig ECM, samt have kontraktil aktivitet, der hjælper med at ombygge ventriklerne.
Mens hjertefibroblaster er blevet grundigt evalueret for deres egenskaber i 2-D kulturer6,8,9,10, forstås meget mindre af deres egenskaber og dynamik i 3D levende hjerte, enten ved baseline eller med sygdomsstimulering. Her er en raffineret metode blevet beskrevet til væv rydde voksen mus hjertet og samtidig opretholde fluorescens af fibroblaster mærket med en Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer genetisk reporter system. I hjertet er Tcf21 en relativt specifik markør for hvilende fibroblaster4. Efter tamoxifen er givet for at aktivere det inducible MerCreMer protein, vil stort set alle hvilende fibroblaster permanent udtrykke forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) fra Rosa26 locus, som giver mulighed for deres sporing in vivo.
Talrige veletablerede væv clearing protokoller findes, hvoraf nogle er blevet anvendt til hjertet11,12,13,14,15,16,17. Mange af de reagenser, der anvendes i forskellige vævsrydningsprotokoller, har imidlertid vist sig at slukke endogene fluorescenssignaler18. Derudover er det voksne hjerte svært at rydde på grund af rigelige heme gruppeholdige proteiner, der genererer autofluorescens19. Derfor var målet med denne protokol at bevare fibroblast markør fluorescens med samtidig hæmning af heme autofluorescens i det skadede voksne hjerte for optimal 3-D visualisering in vivo12,13,14,16,17,20.
Tidligere undersøgelser, der forsøgte at undersøge den anvendte hjertefibroblast in vivo perfunderede antistoffer til mærkning af disse celler, selv om sådanne undersøgelser var begrænset af antistofindtrængning og hjertevaskulær struktur14,16,17,20. Selv salamon et al. har vist væv clearing med vedligeholdelse af aktuelle neuronale fluorescens i neonatal hjerte, og Nehrhoff et al. har vist vedligeholdelse af fluorescens mærkning myeloid celler, vedligeholdelse af endogene fluorescens gennem hele ventrikelvæggen er endnu ikke blevet påvist, herunder visualisering af voksne hjerte fibroblaster ved baseline eller efter skade13,20. Denne vævsclearingprotokol forfiner en blanding af tidligere protokoller baseret på CLARITY-metoden (klar lipidbytteret acrylamid-hybridiseret stiv Imaging/immunostaining/in situ-hybridization-compatible tissue hydrogel) og PEGASOS (polyethylen glycol (PEG)-associeret opløsningsmiddelsystem). Denne raffinerede protokol tillod en mere robust undersøgelse af hjertefibroblaster i musehjertet ved baseline og af, hvordan de reagerer på forskellige typer skader. Protokollen er ligetil og reproducerbar og vil hjælpe med at karakterisere adfærden af hjertefibroblaster in vivo.
Denne artikel præsenterer en raffineret metode til vævsrydning, der giver mulighed for visualisering af hjertefibroblaster in vivo, både ved baseline og efter skade, for at karakterisere og bedre forstå fibroblaster i musehjertet. Denne udvidede protokol omhandler begrænsninger i eksisterende vævsrydningsprotokoller , der har forsøgt at identificere bestemte celletyper i voksent eller neonatalt hjerte12,13,14,<…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende CCHMC Confocal Imaging Core for deres hjælp og vejledning i udviklingen af denne model, samt Matt Batie fra Clinical Engineering for udformningen af alle 3D-trykte dele. Demetria Fischesser blev støttet af et uddannelsestilskud fra National Institutes of Health (NHLBI, T32 HL125204) og Jeffery D. Molkentin blev støttet af Howard Hughes Medical Institute.
4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
Heparin | Sigma | H0777 | |
Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |