Raffineret KLARHED-baseret væv Clearing for tre-dimensionelle Fibroblast Organisation i sunde og sårede Mouse Hearts
Summary
En raffineret metode til væv clearing blev udviklet og anvendt på den voksne mus hjerte. Denne metode blev designet til at rydde tæt, autofluorescerende hjertevæv, samtidig med at mærket fibroblast fluorescens tilskrives en genetisk reporter strategi.
Abstract
Hjerte-kar-sygdomme er den mest udbredte årsag til dødelighed på verdensplan og er ofte præget af øget hjertefibrose, der kan føre til øget ventrikelstivhed med ændret hjertefunktion. Denne stigning i hjerte ventrikulær fibrose skyldes aktivering af residente fibroblaster, selv om hvordan disse celler fungerer inden for 3-dimensionelle (3-D) hjerte, ved baseline eller efter aktivering, er ikke godt forstået. For at undersøge, hvordan fibroblaster bidrager til hjertesygdomme og deres dynamik i 3D-hjertet, blev der udviklet en raffineret KLARHED-baseret vævsclearing- og billeddannelsesmetode, der viser fluorescerende mærkede hjertefibroblaster i hele musehjertet. Væv bosiddende fibroblaster blev genetisk mærket ved hjælp af Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mus krydset med hjerte fibroblast udtrykke Tcf21-MerCreMer knock-in linje. Denne teknik blev brugt til at observere fibroblast lokalisering dynamik i hele voksne venstre hjertekammer i raske mus og i fibrotiske mus modeller af hjertesygdomme. Interessant, i en skade model, unikke mønstre af hjerte fibroblaster blev observeret i den skadede mus hjerte, der fulgte bands af indpakkede fibre i kontraktile retning. I iskæmiske skadesmodeller indtraf fibroblastdøden efterfulgt af en genopfyldning fra den infarkte grænsezone. Samlet set giver denne raffinerede hjertevævskonderingsteknik og digitaliserede billeddannelsessystem mulighed for 3D-visualisering af hjertefibroblaster i hjertet uden begrænsninger af antistofindtrængningssvigt eller tidligere problemer omkring tabt fluorescens på grund af vævsbehandling.
Introduction
Selvom kardiomyocytter udgør den største volumenfraktion i hjertet, er hjertefibroblaster mere rigelige og er kritisk involveret i reguleringen af dette organs grundlæggende strukturelle og reparative træk. Hjertefibroblaster er meget mobile, mekanisk lydhøre og fænotypisk spænder afhængigt af omfanget af deres aktivering. Hjertefibroblaster er nødvendige for at opretholde normale niveauer af ekstracellulær matrix (ECM), og for lidt eller for meget ECM-produktion af disse celler kan føre til sygdom1,2,3. I betragtning af deres betydning i sygdom er hjertefibroblaster blevet et stadig vigtigere undersøgelsesemne til at identificere nye behandlingsstrategier, især i forsøget på at begrænse overdreven fibrose4,5,6,7. Ved skade aktiverer og differentierer fibroblaster sig til en mere syntetisk celletype kendt som en myofibroblast, som kan være proliferativ og udskille rigelig ECM, samt have kontraktil aktivitet, der hjælper med at ombygge ventriklerne.
Mens hjertefibroblaster er blevet grundigt evalueret for deres egenskaber i 2-D kulturer6,8,9,10, forstås meget mindre af deres egenskaber og dynamik i 3D levende hjerte, enten ved baseline eller med sygdomsstimulering. Her er en raffineret metode blevet beskrevet til væv rydde voksen mus hjertet og samtidig opretholde fluorescens af fibroblaster mærket med en Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer genetisk reporter system. I hjertet er Tcf21 en relativt specifik markør for hvilende fibroblaster4. Efter tamoxifen er givet for at aktivere det inducible MerCreMer protein, vil stort set alle hvilende fibroblaster permanent udtrykke forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) fra Rosa26 locus, som giver mulighed for deres sporing in vivo.
Talrige veletablerede væv clearing protokoller findes, hvoraf nogle er blevet anvendt til hjertet11,12,13,14,15,16,17. Mange af de reagenser, der anvendes i forskellige vævsrydningsprotokoller, har imidlertid vist sig at slukke endogene fluorescenssignaler18. Derudover er det voksne hjerte svært at rydde på grund af rigelige heme gruppeholdige proteiner, der genererer autofluorescens19. Derfor var målet med denne protokol at bevare fibroblast markør fluorescens med samtidig hæmning af heme autofluorescens i det skadede voksne hjerte for optimal 3-D visualisering in vivo12,13,14,16,17,20.
Tidligere undersøgelser, der forsøgte at undersøge den anvendte hjertefibroblast in vivo perfunderede antistoffer til mærkning af disse celler, selv om sådanne undersøgelser var begrænset af antistofindtrængning og hjertevaskulær struktur14,16,17,20. Selv salamon et al. har vist væv clearing med vedligeholdelse af aktuelle neuronale fluorescens i neonatal hjerte, og Nehrhoff et al. har vist vedligeholdelse af fluorescens mærkning myeloid celler, vedligeholdelse af endogene fluorescens gennem hele ventrikelvæggen er endnu ikke blevet påvist, herunder visualisering af voksne hjerte fibroblaster ved baseline eller efter skade13,20. Denne vævsclearingprotokol forfiner en blanding af tidligere protokoller baseret på CLARITY-metoden (klar lipidbytteret acrylamid-hybridiseret stiv Imaging/immunostaining/in situ-hybridization-compatible tissue hydrogel) og PEGASOS (polyethylen glycol (PEG)-associeret opløsningsmiddelsystem). Denne raffinerede protokol tillod en mere robust undersøgelse af hjertefibroblaster i musehjertet ved baseline og af, hvordan de reagerer på forskellige typer skader. Protokollen er ligetil og reproducerbar og vil hjælpe med at karakterisere adfærden af hjertefibroblaster in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikel præsenterer en raffineret metode til vævsrydning, der giver mulighed for visualisering af hjertefibroblaster in vivo, både ved baseline og efter skade, for at karakterisere og bedre forstå fibroblaster i musehjertet. Denne udvidede protokol omhandler begrænsninger i eksisterende vævsrydningsprotokoller , der har forsøgt at identificere bestemte celletyper i voksent eller neonatalt hjerte12,13,14,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende CCHMC Confocal Imaging Core for deres hjælp og vejledning i udviklingen af denne model, samt Matt Batie fra Clinical Engineering for udformningen af alle 3D-trykte dele. Demetria Fischesser blev støttet af et uddannelsestilskud fra National Institutes of Health (NHLBI, T32 HL125204) og Jeffery D. Molkentin blev støttet af Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| 4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
| 8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
| Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
| Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
| DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
| GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
| Heparin | Sigma | H0777 | |
| Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
| Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
| Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
| Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
| Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
| Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
| Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
| Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
| X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
| X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |
References
- Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).
- Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).
- Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434 (2017).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14 (8), 0220573 (2019).
- Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3 (10), 00406 (2017).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
- Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
- Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12 (7), 0182072 (2017).
- Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188 (2017).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).
- Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology – Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).
- Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology – Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology – Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).
- Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).
- Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
- Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).
- Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
- Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).
- Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).
