En raffinert metode for vevsrydding ble utviklet og brukt på det voksne musehjertet. Denne metoden ble designet for å fjerne tett, autofluorescerende hjertevev, samtidig som den opprettholder merket fibroblastfluorescens tilskrevet en genetisk reporterstrategi.
Kardiovaskulær sykdom er den mest utbredte årsaken til dødelighet over hele verden og er ofte preget av økt hjertefibrose som kan føre til økt ventrikulær stivhet med endret hjertefunksjon. Denne økningen i hjerte ventrikulær fibrose skyldes aktivering av bosatte fibroblaster, selv om hvordan disse cellene opererer i det 3-dimensjonale (3D) hjertet, ved baseline eller etter aktivering, ikke er godt forstått. For å undersøke hvordan fibroblaster bidrar til hjertesykdom og deres dynamikk i 3D-hjertet, ble det utviklet en raffinert CLARITY-basert vevsryddings- og avbildningsmetode som viser fluorescerende merkede hjertefibroblaster i hele musehjertet. Vevsboende fibroblaster ble genetisk merket ved hjelp av Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mus krysset med hjertefibroblast som uttrykker Tcf21-MerCreMer knock-in linje. Denne teknikken ble brukt til å observere fibroblast lokaliseringsdynamikk gjennom hele voksen venstre ventrikel hos friske mus og i fibrotiske musemodeller av hjertesykdom. Interessant, i en skademodell, ble unike mønstre av hjertefibroblaster observert i det skadede musehjertet som fulgte bånd av innpakkede fibre i kontraktilretningen. I iskemiske skademodeller oppstod fibroblastdød, etterfulgt av repopulering fra den infarkte grensesonen. Samlet gir denne raffinerte hjertevevsklargjøringsteknikken og digitalisert bildebehandlingssystem mulighet for 3D-visualisering av hjertefibroblaster i hjertet uten begrensningene av antistoffinntrengningssvikt eller tidligere problemer rundt tapt fluorescens på grunn av vevsbehandling.
Selv om kardiomyocytter utgjør den største volumfraksjonen i hjertet, er hjertefibroblaster mer rikelig og er kritisk involvert i å regulere de grunnleggende strukturelle og reparative egenskapene til dette organet. Hjertefibroblaster er svært mobile, mekanisk responsive og fenotypiske, avhengig av omfanget av aktiveringen. Hjertefibroblaster er nødvendige for å opprettholde normale nivåer av ekstracellulær matrise (ECM), og for lite eller for mye ECM-produksjon av disse cellene kan føre til sykdom1,2,3. Gitt deres betydning i sykdom, har hjertefibroblaster blitt et stadig viktigere tema for undersøkelse mot å identifisere nye behandlingsstrategier, spesielt i forsøk på å begrense overdreven fibrose4,5,6,7. Ved skade aktiverer og differensierer fibroblaster til en mer syntetisk celletype kjent som en myofibroblast, som kan være proliferativ og utskiller rikelig ECM, samt har kontraktil aktivitet som bidrar til å ombygge ventriklene.
Mens hjertefibroblaster har blitt grundig evaluert for sine egenskaper i 2D-kulturer6,8,9,10, er mye mindre forstått av deres egenskaper og dynamikk i 3D levende hjerte, enten ved baseline eller med sykdomstimulering. Her har en raffinert metode blitt beskrevet for å vev fjerne det voksne musehjertet mens du opprettholder fluorescensen til fibroblaster merket med et Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer genetisk reportersystem. I hjertet er Tcf21 en relativt spesifikk markør for passiv fibroblaster4. Etter at tamoxifen er gitt for å aktivere det induserbare MerCreMer-proteinet, vil i hovedsak alle quiescent fibroblaster permanent uttrykke forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) fra Rosa26-locus, noe som gjør det mulig for deres sporing in vivo.
Det finnes mange veletablerte vevsryddingsprotokoller, hvorav noen er brukt på hjertet11,12,13,14,15,16,17. Imidlertid har mange av reagensene som brukes i forskjellige vevsryddingsprotokoller blitt funnet å slukke endogene fluorescenssignaler18. I tillegg er voksenhjertet vanskelig å fjerne på grunn av rikelig heme gruppeholdige proteiner som genererer autofluorescence19. Derfor var målet med denne protokollen å bevare fibroblastmarkørfluorescens med samtidig hemming av heme autofluorescence i det skadede voksne hjertet for optimal 3D-visualisering in vivo12,13,14,16,17,20.
Tidligere studier som forsøkte å undersøke hjertefibroblast in vivo brukte perfused antistoffer for å merke disse cellene, selv om slike studier var begrenset av antistoff penetrasjon og hjertevaskulær struktur14,16,17,20. Selv om Salamon et al. har vist vevsrydding med vedlikehold av aktuell nevronal fluorescens i neonatalhjertet, og Nehrhoff et al. har vist vedlikehold av fluorescens som markerer myeloide celler, er vedlikehold av endogen fluorescens gjennom hele ventrikkelveggen ennå ikke demonstrert, inkludert visualisering av voksne hjertefibroblaster ved baseline eller etter skade13,20. Denne vevsryddingsprotokollen foredler en blanding av tidligere protokoller basert på CLARITY-metoden (klar lipid-utvekslet akrylamid-hybridisert stiv imaging / immunostaining / in situ-hybridiseringskompatibel vevshydrgel) og PEGASOS (polyetylenglykol (PEG)-assosiert løsningsmiddelsystem). Denne raffinerte protokollen tillot en mer robust undersøkelse av hjertefibroblaster i musehjertet ved baseline og hvordan de reagerer på ulike typer skader. Protokollen er grei og reproduserbar og vil bidra til å karakterisere oppførselen til hjertefibroblaster in vivo.
Denne artikkelen presenterer en raffinert metode for vevsrydding som gjør det mulig å visualisere hjertefibroblaster in vivo, både ved baseline og etter skade, for å karakterisere og bedre forstå fibroblaster i musehjertet. Denne forbedrede protokollen tar for seg begrensninger i eksisterende vevsklareringsprotokoller som har forsøkt å identifisere bestemte celletyper i voksen- eller nyfødthjertet12,13,14,<sup…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å anerkjenne CCHMC Confocal Imaging Core for deres hjelp og veiledning i utviklingen av denne modellen, samt Matt Batie fra Clinical Engineering for utformingen av alle 3D-trykte deler. Demetria Fischesser ble støttet av et opplæringsstipend fra National Institutes of Health, (NHLBI, T32 HL125204) og Jeffery D. Molkentin ble støttet av Howard Hughes Medical Institute.
4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
Heparin | Sigma | H0777 | |
Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |