Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Verfijnde op HELDERHEID gebaseerde weefselopruiming voor driedimensionale fibroblastorganisatie in gezonde en gewonde muizenharten

doi: 10.3791/62023 Published: May 16, 2021

Summary

Een verfijnde methode van weefselopruiming werd ontwikkeld en toegepast op het volwassen muizenhart. Deze methode is ontworpen om dicht, autofluorescent hartweefsel te zuiveren, met behoud van gelabelde fibroblastfluorescentie toegeschreven aan een genetische reporterstrategie.

Abstract

Hart- en vaatziekten zijn wereldwijd de meest voorkomende oorzaak van mortaliteit en worden vaak gekenmerkt door verhoogde hartfibrose die kan leiden tot verhoogde ventriculaire stijfheid met veranderde hartfunctie. Deze toename van cardiale ventriculaire fibrose is te wijten aan activering van ingezeten fibroblasten, hoewel hoe deze cellen werken binnen het 3-dimensionale (3D) hart, bij aanvang of na activering, niet goed wordt begrepen. Om te onderzoeken hoe fibroblasten bijdragen aan hartaandoeningen en hun dynamiek in het 3D-hart, is een verfijnde op CLARITY gebaseerde weefselophelderings- en beeldvormingsmethode ontwikkeld die fluorescerend gelabelde hartfibroblasten in het hele muishart laat zien. Weefsel ingezeten fibroblasten werden genetisch gelabeld met behulp van Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter muizen gekruist met de cardiale fibroblast uitdrukken Tcf21-MerCreMer knock-in lijn. Deze techniek werd gebruikt om fibroblastlokalisatiedynamiek in de hele volwassen linkerventrikel te observeren bij gezonde muizen en bij fibrotische muismodellen van hartaandoeningen. Interessant is dat in één verwondingsmodel unieke patronen van hartfibroblasten werden waargenomen in het gewonde muizenhart dat banden van verpakte vezels in de contractiele richting volgde. In ischemische letselmodellen trad fibroblastdood op, gevolgd door herbevolking uit het grensgebied van het infarct. Gezamenlijk maakt deze verfijnde hartweefselverhelderingstechniek en gedigitaliseerd beeldvormingssysteem 3D-visualisatie van hartfibrose in het hart mogelijk zonder de beperkingen van antilichaampenetratiefalen of eerdere problemen rond verloren fluorescentie als gevolg van weefselverwerking.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hoewel cardiomyocyten de grootste volumefractie in het hart vormen, zijn hartfibroblasten overvloediger en zijn ze kritisch betrokken bij het reguleren van de structurele en herstellende basiskenmerken van dit orgaan. Cardiale fibroblasten zijn zeer mobiel, mechanisch responsief en fenotypisch variërend afhankelijk van de mate van activering. Cardiale fibroblasten zijn nodig om normale niveaus van extracellulaire matrix (ECM) te handhaven, en te weinig of te veel ECM-productie door deze cellen kan leiden tot ziekte1,2,3. Gezien hun belang bij ziekten zijn hartfibroses een steeds belangrijker onderwerp van onderzoek geworden om nieuwe behandelingsstrategieën te identificeren, vooral in een poging om overmatige fibrose te beperken4,5,6,7. Bij letsel activeren en differentiëren fibroblasten in een meer synthetisch celtype dat bekend staat als een myofibroblast, die proliferatie kan zijn en overvloedig ECM kan afscheiden, evenals contractiele activiteit heeft die helpt bij het remodelleren van de ventrikels.

Terwijl hartfibroblasten uitgebreid zijn geëvalueerd op hun eigenschappen in 2D-culturen6,8,9,10, wordt veel minder begrepen van hun eigenschappen en dynamiek in het 3D-levende hart, hetzij bij aanvang of met ziektestimulatie. Hier is een verfijnde methode beschreven om het volwassen muishart te zuiveren met behoud van de fluorescentie van fibroblasten gelabeld met een Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer genetisch verslaggeversysteem. In het hart is Tcf21 een relatief specifieke marker van rustgevende fibroblasten4. Nadat tamoxifen is gegeven om het induceerbare MerCreMer-eiwit te activeren, zullen in wezen alle rustgevende fibroblasten permanent versterkt groen fluorescerend eiwit (eGFP) uitdrukken van de Rosa26-locus, waardoor ze in vivo kunnen worden gevolgd.

Er bestaan talrijke gevestigde weefselophelderingsprotocollen, waarvan sommige zijn toegepast op het hart11,12,13,14,15,16,17. Veel van de reagentia die in verschillende weefselontruimingsprotocollen worden gebruikt, blijken echter endogene fluorescentiesignalen te onderdrukken18. Bovendien is het volwassen hart moeilijk te wissen vanwege overvloedige heemgroephoudende eiwitten die autofluorescentie genereren19. Daarom was het doel van dit protocol om fibroblastmarkerfluorescentie te behouden met de gelijktijdige remming van heemautofluorescentie in het gewonde volwassen hart voor optimale 3D-visualisatie in vivo12,13,14,16,17,20.

Eerdere studies die probeerden de cardiale fibroblast in vivo te onderzoeken, gebruikten geperfuseerde antilichamen om deze cellen te labelen, hoewel dergelijke studies beperkt waren door antilichaampenetratie en cardiale vasculaire structuur14,16,17,20. Hoewel Salamon et al. weefselontruiming hebben aangetoond met behoud van topische neuronale fluorescentie in het neonatale hart, en Nehrhoff et al. hebben aangetoond dat fluorescentie myeloïde cellen markeert, is het behoud van endogene fluorescentie door de gehele ventriculaire wand nog niet aangetoond, inclusief de visualisatie van volwassen cardiale fibroblasten bij aanvang of na letsel13,20. Dit weefselontruimingsprotocol verfijnt een mengsel van eerdere protocollen op basis van de CLARITY-methode (clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid Imaging/immunostaining/in situ-hybridization-compatible tissue hydrogel) en PEGASOS (polyethyleenglycol (PEG)-geassocieerd oplosmiddelsysteem). Dit verfijnde protocol maakte een robuuster onderzoek van hartfibrose in het muizenhart bij aanvang mogelijk en van hoe ze reageren op verschillende soorten letsel. Het protocol is eenvoudig en reproduceerbaar en zal helpen het gedrag van hartfibrose in vivo te karakteriseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle experimenten met muizen werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Cincinnati Children's Hospital Medical Center. De instelling is ook AAALAC (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care) gecertificeerd. Muizen werden geëuthanaseerd via cervicale dislocatie en muizen die overlevingschirurgische ingrepen ondergingen, kregen pijnverlichting (zie hieronder). Alle methoden die worden gebruikt voor pijnbestrijding en euthanasie zijn gebaseerd op aanbevelingen van het Panel on Euthanasia van de American Veterinary Medical Association. Alle muizen waren gehuisvest in maïskolfbedden met water en voedsel te allen tijde beschikbaar. Muizen werden 4 ondergebracht in een kooi met hetzelfde geslacht. Voor chirurgie of ongewonde weefselopruiming werden gelijke aantallen 6-8 weken oude mannelijke en vrouwelijke muizen gebruikt.

OPMERKING: Steriele chirurgische aandoeningen werden gehandhaafd in alle operaties. De chirurg veranderde in schone scrubs en een steriele jurk en trok vervolgens schoenhoezen en een haarnetje aan. De chirurg schrobde vervolgens zijn handen met chloorhexidine en trok steriele chirurgische handschoenen aan. De chirurg werd bijgestaan door een technicus die de incisieplaats 3 keer elk verdoofde, scheerde en schrobde, afwisselend tussen 2% chlorohexidinegluconaat en 70% isopropanol. De muizen werden vervolgens naar de chirurg gebracht en er werd een operatie uitgevoerd. Tussen de dieren werden de instrumenten gesteriliseerd in een kralensterilisator.

1. Cre recombinatie

  1. Kruis Rosa26-loxP-eGFP muizen (Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) met Tcf21-MerCreMer muizen (Figuur 1A)6,21.
  2. Wanneer de nakomelingen van dit kruis de leeftijd van 6 weken bereiken, dient u een intraperitoneale injectie van 75 mg/kg tamoxifen, opgelost in maïsolie, toe te dienen. Toedien deze tamoxifen tweemaal, met een tussenuits opzichte van 48 uur (figuur 1B).
  3. Na tamoxifen injecties, zet de muizen op een dieet van tamoxifen voedsel (~ 0,4 g/kg tamoxifen citraat) gedurende een week. Na een week tamoxifen chow, breng de muizen terug naar een normaal autoclaaf chow dieet gedurende een week voordat ze een operatie uitvoeren (Figuur 1B). Wijs een geschikt aantal muizen aan (3 per chirurgische aandoening) om niet-gewonde controles te zijn. Offer deze muizen op en ga verder met het ophelderingsproces dat hieronder wordt afgebakend na de ene week van het normale chow-dieet.
  4. Voer na het tamoxifen-regime en recombinatie een operatie uit.

2. Chirurgische modellen

  1. Ischemie/reperfusie (I/R)23,24
    1. Verdoof muizen met 1,5% isofluraangas in de kamerlucht in een geventileerde doos; scheer hun borst en nek met elektrische tondeuses en schrob vervolgens de geschoren gebieden met een met chloorhexidine gluconaat doordrenkt wattenstaafje.
    2. Gebruik kunstmatige traanzalf om uitdroging tijdens de operatie te voorkomen door zalf op de ogen van de verdoofde muizen te plaatsen.
    3. Voer een middenhalssnede uit met behulp van een chirurgische schaar om visualisatie van de luchtpijp mogelijk te maken. Intubeer met een katheter van 20 G door de intubatiebuis in de luchtpijp te plaatsen en visualiseer de luchtpijpkatheter door de middenhalsincisie. Plaats de muizen op een beademingsapparaat terwijl ze verdoofd zijn met isofluraangas (1,5%) in de lucht van de kamer.
    4. Maak een incisie onder de linker voorste ledemaat met een chirurgische schaar en snijd de intercostale spieren tussen ribben 3 en 4. Spreid de ribben open met een oprolmechanisme.
    5. Plaats een kleine spons gedrenkt in zoutoplossing tussen de long en het hart om schade aan de long te voorkomen.
    6. Bind met een vishaaknaald (6,5 mm, 3/8 c) de linker kransslagader vast met een los te laten slipknoop met 8-0 proleen.
    7. Verwijder de spons met een tang.
    8. Hecht de intercostale spieren gesloten met behulp van 4-0 gevlochten zijde en een continue hechting terwijl ook het einde van de 8-0 proleen slipknoop.
    9. Sluit de huidincisies met behulp van topische weefsellijm met het uiteinde van de afsluitende slipknoop die uitsteekt.
    10. Trek na een uur occlusie aan het uiteinde van de slipknoop om de kransslagader occlusie intern vrij te geven, waardoor de ischemie wordt verlicht en reperfusie wordt veroorzaakt.
    11. Dien 0,02 ml van een buprenorfine met verlengde afgifte van 1 mg/ml toe via subdermale injectie (72 h afgifte) als pijnstiller en plaats de muizen in een zuurstofrijke incubatiekamer bij 37 °C, gescheiden van andere dieren. Bewaak de muizen ten minste om de 15 minuten totdat ze zijn hersteld van anesthesie en in staat zijn om een sternale of zittende positie te behouden. Breng de muizen terug naar hun reguliere huisvesting.
    12. Beoordeel de dieren gedurende 48 uur na de operatie op pijn en angst en controleer de incisieplaats dagelijks totdat ze volledig genezen zijn.
    13. Observeer de muizen voor hydratatie, voeding en algehele welzijn na een operatie tot het offer.
  2. Myocardinfarct (MI)25,26,27
    1. Voer stap 2.1.1–2.1.7 uit.
    2. Gebruik een continue hechting om intercostale spieren te sluiten met 4-0 gevlochten zijde.
    3. Sluit de huidincisie met behulp van topische weefsellijm.
    4. Voer stap 2.1.11–2.1.13 uit.
  3. Angiotensine II/fenylephrine micro-osmotische pompinfusie
    1. Bereid bereid een 10 μg/μL werkoplossing van angiotensine II en 500 μg/μL werkoplossing van fenylephrine onder steriele omstandigheden (d.w.z. in een laminaire stroomkap) door 1 mg angiotensine II toe te voegen aan 100 μL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 250 mg fenylephrinehydrochloride in 50 μL.
    2. Bereken de verdunning van elke werkoplossing en het uiteindelijke volume dat aan de micro-osmotische pomp moet worden toegediend op basis van het gewicht van de muis.
      OPMERKING: Een muis van 20 g vereist bijvoorbeeld 20 g x 14 dagen x 1,5 μg/dag = 420 μg angiotensine, of 42 μL werkoplossing, evenals 20 g x 14 dagen x 50 μg/dag = 14000 μg fenylephrinehydrochloride of 28 μL werkoplossing.
    3. Verdun voor het gewicht van elke muis de werkvoorraad van het geneesmiddel in steriel PBS en vul de micro-osmotische pompen (0,25 μL/h, 14 dagen, ongeveer 100 μL) met een naald van 27 G en een spuit van 1 ml.
      OPMERKING: Dit genereert een debiet van 1,5 μg∙g-1∙dag-1 angiotensine II en 50 μg∙g-1∙dag-1 fenylephrinehydrochloride eenmaal in de muizen geplaatst.
    4. Verdoof de muizen met 1,5% isofluraaninhalatie (in werking) in een geventileerde kamer met ruimtelucht.
    5. Plaats de verdoofde muizen op een steriele operatietafel in de opinestand en zorg voor anesthesie met isofluraangasinhalatie (1,5%) door een neuskegel.
    6. Gebruik kunstmatige traanzalf op de ogen van het dier om uitdroging tijdens de operatie te voorkomen.
    7. Scheer de vacht over het implantatiegebied met elektrische tondeuses en steriliseer het te snijden gebied met ethanol en een steriel wattenstaafje. Maak een kleine incisie (ongeveer 1 cm) met een chirurgische schaar in de epidermale laag van de muishuid aan de rechterkant van de rug, onder het schouderblad. Gebruik de doffe zijkanten van een chirurgische schaar om de huid voorzichtig in en rond het gebied van implantatie uit te rekken om de minipomp in te brengen.
    8. Plaats de micro-osmotische pomp in de incisie en manoeuvreer deze fysiek links van de dorsale middellijn van de muis door de pomp handmatig onder de huid te masseren.
    9. Sluit de incisie via continue hechting met 4-0 zijde met een spitspuntnaald.
    10. Na pompimplantatie, dosis buprenorfine met langzame afgifte toedienen in een dosis van 0,1 mg/kg lichaamsgewicht via subdermale injectie voor analgesie (72 uur langzame afgifte). Plaats de muizen in een zuurstofrijke incubatiekamer bij 37 °C, gescheiden van andere dieren. Bewaak de muizen ten minste om de 15 minuten totdat ze herstellen van anesthesie en een sternale of zittende positie kunnen behouden.
    11. Bij herstel van anesthesie in de 37 °C opwarmingskamer, plaatst u de muizen terug in hun standaard wooneenheden.
    12. Controleer de muizen gedurende 48 uur na de operatie op pijn en angst en bewaak de incisieplaats dagelijks totdat ze volledig genezen zijn.
    13. Observeer de muizen voor hydratatie, voeding en algehele welzijn na een operatie tot het offer.

3. Volwassen muisharten wissen met behulp van een aangepast actief CLARITY-protocol

  1. Bereid een schoon chirurgisch gebied voor door het operatieoppervlak en alle chirurgische hulpmiddelen te steriliseren met 70% ethanol. Bereid een oplossing van koude 1x PBS en 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS (elk 100 ml). Draag handschoenen, labjas, gezichtsmasker en oogbescherming.
  2. Bereid de heparinebuffer voor door 10 eenheden heparine te verdunnen in 0,9% m/v natriumchlorideoplossing. Injecteer elke muis intraperitoneaal met 60 μL heparine-NaCl met behulp van een spuit van 1 ml en een naald van 27 G.
  3. Vijf minuten na de injectie van heparine-NaCl-oplossing verdooft u de muizen met 1,5% isofluraaninhalatie (in werking) in een geventileerde kamer met ruimtelucht.
  4. Euthanaseer de muizen door cervicale dislocatie, waarbij de achterkant van het hoofd wordt vastgehouden met het platte, gesloten uiteinde van de tang, terwijl de wervelkolom ontwricht is door aan de staart te trekken.
  5. Reinig het ventrale oppervlak van de muis met 70% ethanol op een wattenstaafje. Maak een transversale incisie van 3 cm ongeveer 3 cm onder het xiphoid-proces met behulp van een chirurgische schaar.
  6. Scheid de huid van het onderliggende buikwandweefsel door de buik te ontgloeden tot aan het xiphoid-proces (houd de huid het dichtst bij de staart en trek de huid het dichtst bij het hoofd naar de ribbenkast). Maak een transversale incisie van 2 cm in het onderhuidse buikwandweefsel 3 cm onder het xiphoid-proces met behulp van een chirurgische schaar. Maak een verticale snede van deze dwarsincisie, tot aan de middellijn en door de ribbenkast. Speld de ribbenkast terug en stel het hart bloot.
  7. Gebruik een 27 G naald en 10 ml spuit om koude PBS te injecteren in de superieure vena cava en aorta (elke positionele manipulatie van het hart moet zorgvuldig worden gedaan met een stompe tang om punctie te voorkomen) om bloed uit het hart te verwijderen.
    OPMERKING: Voldoende perfusie kan worden opgemerkt door staarttrekkingen en verkleuring van de longen.
  8. Gebruik een 27 G naald en 10 ml spuit om koude 4% PFA in de superieure vena cava en aorta te injecteren om het fixatieproces te starten.
  9. Accijns de harten. De atria, rechterventrikel en septum, en linkerventrikel moeten worden gescheiden met behulp van een straight-blade scalpel. Plaats dit weefsel in een centrifugebuis van 15 ml gevuld met koude 4% PFA en plaats het 's nachts op een nutator bij 4 °C.
  10. Was het hart 3 keer gedurende 1 uur elk met koude 1x PBS om overtollige PFA te verwijderen.
  11. Bereid de hydrogel (A4P0 genoemd voor de relatieve samenstelling van acrylamide/polyacrylamide) door de volgende chemicaliën te mengen in een centrifugebuis van 15 ml: 10% van 40% acrylamide, 10% 1x PBS, 80% gedestilleerd water.
  12. Voeg de 0,25% oplossing van de foto-initiator (2,2-Azobis[2-(2-imidazolin-2yl)propaan)dihydrochloride) toe aan de hydrogeloplossing vlak voordat u het hart in de hydrogel onderdompelt.
  13. Plaats het hart in een conische buis met de hydrogel. Wikkel de conische buis in folie en incubeer 's nachts bij 4 °C zonder fysieke verstoring.
  14. Na ongeveer 14 uur bij 4 °C, verplaats de conische buis met het hart naar een kraalbad van 37 °C.
  15. Verwijder na 2,5 uur in het kralenbad het hart voorzichtig met een tang uit de hydrogel.
  16. Was de harten 3 keer gedurende 1 uur elk in een conische buis van 15 ml met 1x PBS bij 37 °C op een nutator.
  17. Plaats de harten in de mand van de actieve elektroforesemachine met behulp van een tang en plaats het deksel op de mand. Zorg ervoor dat het deksel goed op zijn plaats zit.
  18. Vul het actieve elektroforesekamerreservoir met elektroforetische ontruimingsoplossing door de oplossing in de kamer te gieten.
  19. Zodra de kamer vol zit met elektroforetische clearingoplossing, kan de mand met het hart worden ondergedompeld. Plaats de dop stevig op de elektroforesemachine.
  20. Voer de elektroforesemachine gedurende 1,5 uur uit op 1,5 A, 37 °C.
  21. Controleer na 1,5 uur elektroforese de harten visueel om er zeker van te zijn dat er geen ondoorzichtig weefsel achter blijft. Als delen van het weefsel nog ondoorzichtig zijn, dompelt u het hart opnieuw onder in elektroforeseoplossing in de elektroforetische kamer en blijft u 0,5 uur per keer elektroforese.
    OPMERKING: Elektroforese dient te worden gestaakt bij eerste tekenen van weefselbeschadiging (zoals weefsel rafelen).
  22. Was de harten in 15 ml conische buis met 1x PBS gedurende 1 uur, 3 keer elk, bij 37 °C op een nutator.
  23. Dompel de harten onder in een conische buis van 15 ml met N,N,N′,N′-Tetrakis (2-Hydroxypropyl)ethyleendiamine - een ontkleuringsmiddel dat heemautofluorescentie vermindert.
    OPMERKING: Deze oplossing moet om de 24 uur worden vervangen totdat de harten volledig helder zijn (ongeveer 2 dagen).
  24. Was de harten in een conische buis van 15 ml met 1x PBS 3 keer gedurende elk 1 uur om overtollig ontkleuringsmiddel te verwijderen.
  25. Bereid refractieve indexmatchingoplossing (RIMS) voor door 30 ml 0,02 m fosfaatbuffer te combineren, 40 g 5-(N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide met roeren (moet volledig worden opgelost-dit kan tot een uur duren), 5 mg natrium azide, 50 μL Tween20 en 1 g van 1,4
  26. Equilibreert de harten in RIMS gedurende 48 uur voorafgaand aan de beeldvorming.

4. Beeldvorming ontruimde harten met behulp van een rechtopstaande confocale microscoop met één foton

OPMERKING: Het beeldvormingsapparaat bestaat uit de onderste helft van een petrischaal van 10 cm, een 3D-geprint bodemreservoir, een ronde glazen afdeklip en een 3D-geprint bovenreservoir (afbeelding 1C–E). 3D-geprinte materialen werden in eigen huis gemaakt door de Cincinnati Children's Hospital Clinical Engineering Department.

  1. Gebruik vacuümvet om het 3D-geprinte bodemreservoir af te dichten in een glazen Petrischaal door een dun laagje vacuümvet op de bodem van het 3D-geprinte stuk te leggen (Afbeelding 1C).
    OPMERKING: Het reservoir moet even hoog zijn als het monster dat wordt afgebeeld (d.w.z. het monster mag niet worden samengeperst door de glazen afdeklip die erop is geplaatst, en het monster mag ook niet kunnen drijven en bewegen in het reservoir).
  2. Vul het reservoir met RIMS en verwijder alle bubbels met een pipetpunt. Plaats het hart voorzichtig in de RIMS met de linker ventriculaire wand naar boven gericht, zodat er geen bellen in de oplossing worden gebracht.
  3. Bevestig een glazen afdeklip aan het onderoppervlak van het 3D-geprinte bovenste reservoirstuk (Aanvullende figuur 1A) met vacuümvet (opnieuw door een dunne laag vacuümvet op het 3D-geprinte stuk te plaatsen en op de afdekstrook te plaatsen) (Afbeelding 1D).
  4. Plaats de glazen afdeklip en het bovenste reservoir, de afdeklipzijde naar beneden, op het onderste reservoir(aanvullende figuur 1B),zonder de introductie van bellen. De hechting tussen de VELGEN en de afdekslip zorgt voor een afdichting tussen de bovenste en onderste reservoirstukken (afbeelding 1E).
  5. Vul het bovenste reservoir met glycerol voor gebruik met een 10x glycerol onderdompelingsdoelstelling.
  6. Gebruik een enkele fotonmicroscoop uitgerust met een confocale scankop met meerdere foto's om de gewiste harten in beeld te krijgen.
  7. Laat het stadium van de enkele fotonmicroscoop zakken en plaats de petrischaal met het monster in het midden van het podium. Verhoog het stadium en verlaag de 10x glycerolonderdompelingsdoelstelling in de glycerol in het bovenste reservoir van het monsterapparaat. Zorg ervoor dat het monster scherp is door met behulp van de oculairs naar de rand van het monster te kijken.
  8. Schakel over van oculairweergave naar cameraweergave op de computer door op de liveknop te klikken.
    1. Stel de X- en Y-parameters in door eerst het breedste deel van het weefselmonster te lokaliseren, dat zich op de bodem van de petrischaal moet bevindt.
    2. Klik op ND Acquisitie en aangepaste multipoint. Maak multipunten door eerst het midden van het weefselmonster te vinden met behulp van de joystick om van links naar rechts en van boven naar beneden te vegen.
    3. Bepaal vervolgens op basis van de grootte van het weefsel de benodigde tegelgrootte (meestal 6 x 5 voor een muishart van 6-8 weken oud). Doe dit door testbeeldvorming uit te voeren door alleen X- en Y-parameters vast te leggen (schakel z uit onder het tabblad ND-acquisitie) om te controleren of de volledige lengte en breedte van het weefsel zijn vastgelegd.
  9. Als u z-parameters wilt instellen, opent u de XYZ-navigatieen klikt u op de pictogrammen omhoog en omlaag totdat u de boven- en onderkant van het voorbeeld vindt.
    1. Open het Z-intensiteitscorrectiepaneel en pas de fluorescentie aan de bovenkant, het midden en de onderkant van het weefsel aan om te corrigeren voor weefseldichtheid door het laservermogen op elk z-punt te verhogen of te verlagen. Stel deze in door op de ingestelde pijl rechts van het deelvenster Z-intensiteitscorrectie te klikken.
    2. Stel de Z-stapgrootte in het ND Acquisition-paneel in op 5 μm.
  10. Nadat de X-, Y- en Z-parameters van het hart zijn afgebakend en de z-intensiteitscorrectie is ingesteld, gebruikt u de geautomatiseerde rechtopstaande microscoop met een 10x glycerol-onderdompelingsdoelstelling met een resonante scanner en gallium arsenide fosfide fotomultiplicatorbuizen (GaAsP PMTs) om de gewiste harten in beeld te brengen. Zorg ervoor dat de tabbladen XY en Z worden gecontroleerd onder ND-acquisitieen druk op Voer Z-correctie uit.
  11. Naai, meng en denoise de resulterende afbeeldingen door de meerpuntsafbeelding in de verwerkingssoftware te openen en op de steekknop te klikken. Klik onder afbeeldingop blind unmixing, 2 kanaals, en zoekvervolgens . en Klik onder afbeeldingop denoise.aien klik vervolgens op het fluorescerende kanaal naar keuze (d.w.z. GFP).
    OPMERKING: Dit proces resulteert in een 3D-beeld van GFP-positieve fibroblasten in de gehele linkerventrikel.
  12. Gebruik secundaire analysesoftware om patronen en trends in de dispersie van hartfibrose verder te identificeren. Gebruik de functie Spots door het wizardprogramma Spots uit te voeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hartfibrose is essentieel voor de uitgangsfunctie van het hart en voor de respons op hartletsel. Eerdere pogingen om de rangschikking en morfologie van deze cellen te begrijpen, zijn grotendeels uitgevoerd in 2D-instellingen. Er is echter een verfijnde hartweefselopheldering (figuur 2) en 3D-beeldvormingstechniek gepubliceerd, die de geavanceerde, meer gedetailleerde visualisatie van hartfibrose mogelijk maakt. Met deze beeldvormingstechniek bleken fibroblasten dicht opeengepakt te zijn en een spindelmorfologie te hebben in niet-gewonde harten (Figuur 3, Aanvullende video's S1–4).

Nadat de linker ventriculaire weefselopruiming in een niet-gewond hart was bereikt, werd het protocol toegepast op verschillende letselmodellen om te onderzoeken hoe dit clearingprotocol zou presteren bij het bestuderen van gewond hartweefsel. Muizen werden blootgesteld aan I/R-letsel door tijdelijke sluiting van de linker kransslagader (LCA) gedurende 1 uur, gevolgd door een reperfusie van 3, 7, 14 of 28 dagen. Deze experimenten toonden aan dat er een verlies van hartfibroblasten in het ischemische gebied was direct na I/R-letsel, maar dat op dag 7 en dag 14 fibroblasten migreerden of zich verspreidden om dit gebied van het gewonde hart opnieuw te bevolken. Op dag 28 was de populatie hartfibrose rond de gewonde delen van het hart op hun grootste dichtheid (Figuur 4, Aanvullende video's S5–8).

MI-letsel is een chirurgisch model dat het gevolg is van permanente LCA-ligatie (geen reperfusie). Harten die een MI-operatie hadden ondergaan, werden 1,5 en 3 dagen na de operatie verwijderd voor fixatie, clearing en analyse. Er waren zeer weinig fibroblasten over in de gewonde linkerventrikel na 1,5 dagen na de operatie (Figuur 5A, Aanvullende Video S9). Op dag 3 breidden fibroblasten zich echter uit en waren aanwezig in het grootste deel van de linkerventrikel, op één klein gebied na, vermoedelijk gemigreerd in en/of verspreid vanuit een populatie in het grensgebied (Figuur 5B, Aanvullende video S10). Nogmaals, analysesoftware werd gebruikt om fibroblastlokalisatie beter te visualiseren, en gebieden met verlies van hartfibrose werden in oranje beschreven (figuur 5). Deze analyse toonde beter het aanvankelijke verlies van cellen op dag 1,5 na MI en hoe fibroblasten zich verspreidden of migreerden naar dat beschadigde gebied op dag 3 om het gebied ogenschijnlijk te herstellen en een litteken te vormen.

Naast ischemisch letsel is de reactie van hartfibrose op hoge bloeddruk niet goed begrepen. Om de reactie van deze cellen op hoge bloeddruk te ontdekken, werden angiotensine II en fenylephrine toegediend. Angiotensine II en fenylephrine (Ang/PE) zijn geneesmiddelen die aanhoudende hoge bloeddruk en cardiale fibroblastactivatie veroorzaken met gebieden van interstitiële fibrose, bevestigd door toepassing van dit weefselontruimingsprotocol op met ang/PE behandelde harten (Figuur 6A)5,28. In tegenstelling tot ischemische chirurgie leidt infusie van Ang/PE gedurende meerdere weken niet tot verlies van hartweefsel en wandverdunning. In plaats daarvan werd een ander resultaat waargenomen in fibroblastgedrag na deze verwonding.

Terwijl het hart pompt, draait het myocardium, volgens een rechtshandig helixpatroon29,30,31. In het Ang/PE-letselmodel zijn de fibroblasten uitgelijnd langs de as van dit rechtshandige helixcontractiepatroon met behulp van het verfijnde weefselontruimingsprotocol (figuur 6B). De hypothese om dit gedrag te verklaren is dat hartfibroseblasten de richting van ventriculaire wandspanning waarvoeren en zich binnen de myofiberen uitlijnden om de grootste ondersteuning binnen het ECM te bieden terwijl de fibrotische respons zich acuut ontvouwde tijdens agonisteninfusie (Figuur 7). Een andere interessante bevinding was dat de fibroblasten klein en afgerond leken, in tegenstelling tot de spindelvorm die te zien was in modellen van I/R- en MI-letsel(figuur 6, aanvullende video S11).

Figure 1
Figuur 1: Muizen en materialen die worden gebruikt voor het opruimen van harten.
(A) Schematische fokstrategie voor Tcf21-MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP muizen gebruikt voor weefsel clearing. (B) Tijdlijn van tamoxifen behandeling en chirurgie uitgevoerd bij muizen. Ongewonde muizen opgeofferd op dag 14. (C) 3D goed afgedrukt om hartweefsel verzegeld te houden tot een glazen petrischaal met vacuümvet. (D) Toevoeging van een ronde afdeklip vacuümvet verzegeld aan de bovenkant van de 3D-geprinte put die bovenop de onderste put is geplaatst. (E) Weefsel ontruimd hart in de onderste put van het weefsel holding apparaat, gevuld met Refractive Index Matching Solution (RIMS). Coverslip (zoals in D) en bovenste 3D-geprinte putstuk gelegd over de onderste 3D-geprinte reservoircomponent, met gewist hartweefsel. Glycerol wordt toegevoegd aan het bovenste reservoir voor glycerol-onderdompelingsmicroscopie. Schaalbalken = 1 cm. Reservoir blauwdrukken zijn te vinden in aanvullende figuur 1. Afkorting: eGFP = enhanced green fluorescent protein. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Visuele verschijning van stadiums van het opruimen van hartweefsel.
(A) Van links naar rechts: onduidelijke linkerventrikel, elektrofoor linkerventrikel, geëlektrofeerde linkerventrikel behandeld met crosslinker, geëlektrofeerde linkerventrikel behandeld met crosslinker en geïncubeerd in VELGEN. (B) Onduidelijk en ontruimd hele muishart. (C) Links: ongedeerd, onduidelijke linker hartkamer. Rechts: ongedeerd, vrijgesproken linker hartkamer. (D) Links: Onduidelijke MI verwonde linkerventrikel. Rechts: Vrijgesproken MI gewonde linker hartkamer. Schaalbalken = 0,5 cm. Afkorting: MI = myocardinfarct. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Werkzaamheid van nieuwe clearingmethode voor ongewonde en schijnbediende gewiste harten.
Ontruimd (A) ongedeerd (schaalbalk = 400 μm) en (B) schijnharten (schaalbalk = 500 μm) met Tcf21mcm x Rosa26eGFP fibroblasten (groen) en pseudokleurde gebieden met verhoogde fluorescentie (paars) met fibroblastlokalisatie. Begeleidende video's met fibroblastvideo's zijn te vinden in aanvullende video's S1-2. Stilstaande beelden tonen achtergrondopruiming en onderhoud van fibroblast-endogene fluorescentie (groen). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Verzwakking van het verlies van fibroblasten in ischemie/reperfusie-geblesseerde ontruimde harten na verloop van tijd.
Ontruimd hartweefsel van de aangegeven I/R-tijdpunten met Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP fibroblasten (groen), pseudokleurde gebieden met verhoogde fluorescentie (paars) met fibroblastlokalisatie en oranje uitspoelde gebieden zonder fibroblasten. Bovenste rij: stilstaande beelden van linker ventrikels van I/R-geblesseerde ontruimde harten. Onderste rij: stilstaande beelden van linker ventrikels van I/R-geblesseerde gewiste harten met Imaris vlekken functie gebruikt om fibroblast patronen gemakkelijker te zien in de hele linker ventrikel. Video's van I/R-gewonde gewiste harten tonen niet alleen grove patronen van fibroblasten, maar ook duidelijke beelden van individuele fibroblasten en hun morfologieën zijn te vinden in aanvullende video's S5-8. Schaalbalken = 500 μm. Afkorting: I/R = ischemia/reperfusion. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Verzwakking van het verlies van hartfibroblasten na letsel bij myocardinfarct-gewonde ontruimde harten na verloop van tijd.
Ontruimd hartweefsel uit MI-harten met Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP fibroblasten (groen), pseudokleurde gebieden met verhoogde fluorescentie (paars) met fibroblastlokalisatie en oranje uitspoeldingsgebieden zonder fibroblasten. Bovenste rij: Stilstaande beelden van weefsel gewiste linker ventrikels uit MI-geblesseerde harten (groen). Onderste rij: stilstaande beelden van weefsel gewiste linker ventrikels uit MI-geblesseerde harten (groen) met Imaris vlekken functie (paars) bedekt om bruto fibroblast distributie te tonen. Video's van weefsel gewiste linker ventrikels van MI-geblesseerde harten tonen grove fibroblast opstelling in het hart, evenals de positionering en morfologie van individuele fibroblasten in dit 3D in vivo model (Aanvullende video's S7–8). Schaalbalken: 1,5 dag = 1000 μm, 3 dagen = 700 μm. Afkorting: MI = myocardinfarct. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Ontruimd weefsel van met angiotensine/fenylephrine behandelde harten.
(A) Schematisch dat laat zien hoe Angiotensine/Fenylephrine pompen worden gebruikt om geneesmiddelen toe te dienen gedurende een periode van twee weken na tamoxifen activering van Tcf21MCM x eGFP. (B) Stilstaand beeld, stilstaand beeld + Imaris vlekken, en video die fibroblastorganisatie en morfologie in Ang/PE-behandelde harten toont (Aanvullende Video S11) Schaalstaven = 500 μm. Afkortingen: Ang/PE = angiotensine II/fenylephrine; eGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Representatieve beelden van waargenomen fibroblastpatroon in met angiotensine/fenylephrine behandelde harten.
(A, C, en D): Afbeeldingen van rechtshandig helix draaiend patroon van fibroblasten vanuit het perspectief van de buitenkant van de ventrikel. (B) Afbeelding van fibroblast patroon vanuit het perspectief van de binnenkant van de ventrikel. Pijlen markeren lineaire groepen fibroblasten die deel uitmaken van het draaipatroon. Schaalbalken = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Aanvullende figuur 1: 2D-renderings van beeldvormingsreservoirapparatuur. (A) 2D-weergave van de onderste helft van het beeldvormingsreservoir. Dit reservoir is afgedicht op de Petrischaal met vacuümvet. Het hart wordt in de middelste opening geplaatst en ondergedompeld in RIMS. (B) 2D-weergave van de bovenste helft van het beeldreservoir. Glazen afdeklip wordt met vacuümvet aan de vlakke bodem van dit stuk vastecht. Dit wordt voorzichtig op het onderste reservoir geplaatst. Het bovenste reservoir kan vervolgens worden gevuld met glycerol voor beeldvorming. Eenheden in mm. Afkortingen: 2D = tweedimensionaal; RIMS: Refractieve Index Matching Oplossing. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.

Video S1: Ongedeerd weefsel ontruimd hart. Cardiale fibroblasten (groen) in een niet-gewonde linkerventrikel waren klein en velen werden afgerond met niet meer dan twee cellulaire projecties. Klik hier om deze video te downloaden.

Video S2: Schijnweefsel ontruimd hart. Hartfibroseblasten (groen) in de linkerventrikel van een schijnmuishart waren klein en meestal rond met weinig projecties, vergelijkbaar met wat werd gezien in niet-gewonde harten. Klik hier om deze video te downloaden.

Video S3: Gedetailleerde fibroblastweergave door de ventriculaire wand van een niet-gewond hart. Deze video begint op de binnenluchtingswand en zoomt in op de buitenkant van het hart. Cardiale fibroblasten (groen) werden in detail getoond en werden waargenomen met afgeronde of enigszins langwerpige cellichamen met niet meer dan twee cellulaire projecties. Klik hier om deze video te downloaden.

Video S4: Gedetailleerde weergave van sectie van linker ventriculaire muur van ongewond hart. Dit ~300-μm-brede deel van het gewiste ongeïmponeerde muizenhart toont de 3D-opstelling van hartfibroblasten (groen) en hun morfologieën in detail. Klik hier om deze video te downloaden.

Video S5: Ontruimde linkerventrikel van 3 dagen I/R. Gedetailleerde weergave van de linkerventrikel toonde aan dat er na I/R-letsel een gebied van cardiale fibroblastverlies is. Het was ook duidelijk dat fibroblasten (groen) een veel langwerpigere vorm ontwikkelden in deze geblesseerde aandoening in vergelijking met de meer afgeronde morfologieën die worden gezien in niet-gewonde en schijnharten. Afkorting: I/R = ischemia/reperfusion. Klik hier om deze video te downloaden.

Video S6: Ontruimde linkerventrikel van 7 dagen I/R. Gedetailleerde weergave van de linkerventrikel toont aan dat het gebied zonder fibroblasten na I/R-letsel 7 dagen na I/R-letsel kleiner was dan op dag 3 na I/R-letsel. Er waren meer fibroblasten (groen) aanwezig, en interessant is dat er nieuwe celmorfologieën aanwezig waren. In het bijzonder hadden sommige fibroblasten afgeronde cellichamen met meerdere uitsteeksels, wat mogelijk wijst op een nieuwe of ontwikkelde rol van fibroblasten in deze omgeving. Afkorting: I/R = ischemia/reperfusion. Klik hier om deze video te downloaden.

Video S7: Ontruimde linkerventrikel van 14 dagen I/R. Gedetailleerde weergave van de linkerventrikel toonde aan dat er nog steeds een gebied centraal in de ventriculaire muur was dat zeer weinig fibroblasten had, maar fibroblasten (groen) aan de rand van deze leegte handhaafden de zeer langwerpige morfologie gezien in dag 7 post-I / R monsters. Interessant is dat de weinige fibroblasten die aanwezig waren in het gewonde gebied een morfologie hadden zoals die in niet-gewonde harten - klein en afgerond. Afkorting: I/R = ischemia/reperfusion. Klik hier om deze video te downloaden.

Video S8: Ontruimde linkerventrikel van 28 dagen I/R. Gedetailleerde weergave van hartfibroblasten (groen) op dag 28 na I/R-letsel toonde aan dat er een klein gebied in het gewonde gebied was dat fibroblasten miste. Er werd ook waargenomen dat er een gebied met een hoge fibroblastdichtheid rond dit gebied was en dat de morfologieën in dit dichte gebied zeer langwerpig waren. Afkorting: I/R = ischemia/reperfusion. Klik hier om deze video te downloaden.

Video S9: Ontruimde linkerventrikel van 1,5 dag MI. Er waren zeer weinig cardiale fibroblasten (groen) over in de gewonde linkerventrikel na 1,5 dagen na MI, hartfibblastdood in dit gebied van de ventrikel. Afkorting: MI = myocardinfarct. Klik hier om deze video te downloaden.

Video S10: Ontruimde linkerventrikel van 3 dagen MI. Er was een groot gebied verstoken van cardiale fibroblasten 3 dagen na MI, maar sommige cardiale fibroblasten (groen) verschenen opnieuw in de ventrikel, in tegenstelling tot de resultaten die werden gevonden na 1,5 dagen MI. Ook waren de morfologieprofielen van de hartfibrose anders dan die in I/R-geblesseerde harten. Hier waren fibroblasten langwerpig, maar er waren anderen die afgeronde cellichamen hadden (groter dan die in niet-gewonde harten) en een subpopulatie hiervan had veel celprojecties. Afkortingen: MI = myocardinfarct; I/R = ischemie/reperfusie. Klik hier om deze video te downloaden.

Video S11: Ontruimde linkerventrikel van met Ang/PE behandelde muizen. Er was geen duidelijk verlies van hartfibroblasten (groen) na behandeling met Ang/PE. Hartfibroblasten waren echter meestal klein en afgerond of klein en langwerpig en leken overeen te komen met de contractiele patronen van het hart. Afkorting: Ang/PE = angiotensine II/fenylephrine. Klik hier om deze video te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit artikel presenteert een verfijnde methode voor weefselopruiming die visualisatie van hartfibroblasten in vivo mogelijk maakt, zowel bij aanvang als na letsel, om fibroblasten in het muizenhart te karakteriseren en beter te begrijpen. Dit verbeterde protocol pakt beperkingen aan in bestaande weefselontruimingsprotocollen die hebben geprobeerd specifieke celtypen in het volwassen of neonatale hart te identificeren12,13,14,16,17,20. Bij de eerste pogingen om het muishart te zuiveren werd de passieve CLARITY-techniek gebruikt, waarbij het hart ongeveer 1 week in een clearingbuffer op een nutator werd achtergelaten om een passieve verdeling van de buffer door het weefsel15,18mogelijk te maken . Dit proces produceerde slechts een opheldering van ongeveer 80 μm diepte in het weefsel (gegevens niet getoond), wat consistent is met eerdere waarnemingen waarbij enkele weken nodig waren om een 1-daags neonatale muishart te verwijderen13. Actieve HELDERHEID met behulp van een actief elektroforesesysteem maakt een diepere ontruiming door de gehele ventriculaire wand mogelijk, ongeveer 700 μm-1 mm diep, over een korter tijdsbestek12,18.

Echter, met behulp van dit eerder gepubliceerde actieve CLARITY protocol leidde tot een verlies van fibroblast fluorescentie met hoge niveaus van weefsel autofluorescentie, die eerder was opgemerkt te voorkomen in actieve CLARITY door Kolesova et al.12. Om het behoud van fibroblastfluorescentie mogelijk te maken, bleek het juiste fixatieprotocol van het grootste belang te zijn. Te kort van een fixatieproces veroorzaakte verlies van fluorescentie tijdens elektroforese. Te lang fixatieproces veroorzaakte verlies van fluorescentie zelf. Daarom bleek de nachtelijke fixatie bij 4 °C in 4% PFA optimaal te zijn. Om het probleem van de achtergrondfluorescentie te verbeteren, werd een ontkleuringsweek (een principe dat is ontleend aan de CUBIC-methode van clearing) gebruikt om heembinding in myoglobine te verminderen en daarom autofluorescentie veroorzaakt door deze chromofoor te verminderen18. Ontkleuringsbehandeling resulteerde in een robuustere opheldering van achtergrondfluorescentie, met behoud van fluorescentie van verslaggevers, zodat de gelabelde fibroblasten meer uitgesproken waren (figuur 2A).

Ten slotte werd het weefsel, om volledige optische transparantie mogelijk te maken, geëquilibreerd in Refractive Index Matching Solution (RIMS) (figuur 2B–D). Door de brekingsindex van het weefsel af te matchen met de omgeving, verhoogde dit de optische transparantie van het weefsel, waardoor diepere beeldvorming mogelijk werd. Hoge snelheid resonante scanning werd vervolgens gebruikt om weefsel in beeld te brengen, omdat het sneller is dan galvanisometrische scanning. Omdat muisharten enigszins verschillende groottes hebben, werden individuele XY-beeldparameters en Z-intensiteitscorrecties ingesteld. Met deze parameters was het mogelijk om door het ongewonde hart te beelden om fluorescerende fibroblasten in ongeveer 4 uur te visualiseren (figuur 3). De beeldkwaliteit werd verbeterd in de post-imaging verwerking door gebruik te maken van de unmixing en denoising analyse software om de achtergrond te verminderen en de fluorescentie aanwezig in het beeld te verduidelijken. Bovendien werd secundaire analysesoftware gebruikt om de lokalisatie van fluorescerende fibroblasten te benadrukken. Deze post-imaging analyse werd gebruikt om hartfibrose duidelijk te annoteren door achtergrond voxel-by-voxel te elimineren (Figuur 3, Figuur 4, Figuur 5, Figuur 6).

Dit geoptimaliseerde CLARITY-protocol is toegepast om zowel gewonde als niet-gewonde harten optisch te zuiveren. Dit zorgt voor een beter begrip van de reactie van hartfibrose op letsel. Deze verwondingen omvatten een tijdsverloop van MI en I/R, evenals Ang/PE dosering. Aangezien ischemisch letsel hartweefsel verzwakt, is het van cruciaal belang dat er tijdens elektroforese meer zorg wordt betracht om de weefselintegriteit te behouden. Voor zowel I/R- als MI-letsel is een kortere periode van elektroforese (≤1,5 uur) vereist32. Eerdere studies hebben geen rekening gehouden met de effecten van letsel op het weefselontruimingsproces. Het hier gepresenteerde nieuw geoptimaliseerde protocol is geschikt voor letsel, waardoor het weefsel kan worden gewist zonder verdere vernietiging van het weefsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen onthullingen met betrekking tot de inhoud van dit manuscript.

Acknowledgments

De auteurs willen de CCHMC Confocal Imaging Core erkennen voor hun hulp en begeleiding bij de ontwikkeling van dit model, evenals Matt Batie van Clinical Engineering voor het ontwerp van alle 3D-geprinte onderdelen. Demetria Fischesser werd ondersteund door een opleidingsbeurs van de National Institutes of Health (NHLBI, T32 HL125204) en Jeffery D. Molkentin werd ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 braided silk Ethicon K871H
8-0 prolene Ethicon 8730H
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140
Angiotensin II Sigma A9525-50G
Artificial Tear Ointment Covetrus 048272
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) Millipore Sigma D27802-25G
GLUture topical tissue adhesive World Precision Instruments 503763
Heparin Sigma H0777
Imaris Start Analysis Software Oxford Instruments N/A
Micro-osmotic pumps Alzet Model 1002
Nikon Elements Analysis Software Nikon N/A
Nikon A1R HD upright microscope Nikon N/A
Normal autoclaved chow Labdiet 5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,
N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide
CosmoBio AXS-1002424
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Phenylephrine Hydrochloride Sigma P6126-10G
Photoinitiator Wako Chemicals VA-044
Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] Jackson Laboratories Jax Stock No:012429
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002-5G
Sodium Chloride solution Hospira, Inc. NDC 0409-4888-10
Tamoxifen Sigma Aldrich T5648
Tamoxifen food Envigo TD.130860
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent Millipore Sigma 122262-1L
X-Clarity electrophoretic clearing chamber Logos Biosystems C30001
X-Clarity electrophoretic clearing solution Logos Biosystems C13001
X-Clarity electrophoresis tissue basket Logos Biosystems C12001
X-Clarity electrophoresis tissue basket holder Logos Biosystems C12002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73, (18), 2267-2282 (2019).
  2. Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51, (12), 1-9 (2019).
  3. Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
  4. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80, (11), 2269-2276 (2016).
  5. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128, (5), 2127-2143 (2018).
  6. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  7. Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6, (11), 1601434 (2017).
  8. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, (22), 4267-4278 (2014).
  9. Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14, (8), 0220573 (2019).
  10. Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3, (10), 00406 (2017).
  11. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  12. Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146, (2), 141-152 (2016).
  13. Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
  14. Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9, (2), 423-436 (2018).
  15. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, (4), 945-958 (2014).
  16. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, (7), 0182072 (2017).
  17. Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188 (2017).
  18. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  19. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  20. Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7, (9), 3716-3720 (2016).
  21. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47, (2), 107-114 (2009).
  22. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50, (5), 600-613 (2011).
  23. Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292, (6), 2944-2951 (2007).
  24. Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269, (6), 2147-2154 (1995).
  25. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286, (3), 1201-1207 (2004).
  26. Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274, (5), 1812-1820 (1998).
  27. Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45, (2), 330-338 (2000).
  28. Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
  29. Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1, (3), 366-376 (2008).
  30. Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
  31. Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145, (4), 868-875 (1994).
  32. Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).
Verfijnde op HELDERHEID gebaseerde weefselopruiming voor driedimensionale fibroblastorganisatie in gezonde en gewonde muizenharten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).More

Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter