שיטה מעודנת של ניקוי רקמות פותחה והוחלה על לב העכבר הבוגר. שיטה זו נועדה לנקות רקמת לב צפופה ו autofluorescent, תוך שמירה על פלואורסצנטיות פיברובלסט שכותרתו המיוחסת לאסטרטגיה כתב גנטי.
מחלות לב וכלי דם הן הגורם השכיח ביותר לתמותה ברחבי העולם, והוא מסומן לעתים קרובות על ידי פיברוזיס לב מוגבר שיכול להוביל נוקשות חדרית מוגברת עם תפקוד לב שונה. עלייה זו פיברוזיס חדרית לב נובעת הפעלה של פיברובלסטים תושב, אם כי איך תאים אלה פועלים בתוך הלב 3 מימדי (3-D), בבסיס או לאחר ההפעלה, אינו מובן היטב. כדי לבחון כיצד פיברובלסטים תורמים למחלות לב ולדינמיקה שלהם בלב תלת-ממדי, פותחה שיטת ניקוי והדמיה מעודנת המבוססת על CLARITY המציגה פיברובלסטים לבביים בעלי תווית פלואורסצנטית בתוך לב העכבר כולו. פיברובלסטים תושבי רקמות תויגו גנטית באמצעות רוזה26-loxP-eGFP עכברים כתב פלורסנט חצה עם פיברובלסט הלב המבטא Tcf21-MerCreMer לדפוק בקו. טכניקה זו שימשה כדי לבחון דינמיקה לוקליזציה fibroblast לאורך כל החדר השמאלי הבוגר בעכברים בריאים במודלים עכבר סיבי של מחלות לב. מעניין, במודל פציעה אחד, דפוסים ייחודיים של פיברובלסטים לב נצפו בלב העכבר הפצוע שעקב אחר רצועות של סיבים עטופים בכיוון הכווץ. במודלים של פגיעה איסכמית, התרחש מוות פיברובלסטי, ואחריו אכלוס מחדש מאזור הגבול האוטם. באופן קולקטיבי, טכניקת הבהרה זו של רקמת לב מעודנת ומערכת הדמיה דיגיטלית מאפשרת הדמיה תלת-ממדית של פיברובלסטים לבביים בלב ללא מגבלות של כשל חדירת נוגדנים או בעיות קודמות סביב פלואורסצנטיות אבודה עקב עיבוד רקמות.
למרות cardiomyocytes מהווים את שבר הנפח הגדול ביותר בלב, fibroblasts לב הם בשפע יותר והם מעורבים באופן קריטי בוויסות התכונות המבניות הבסיסיות של איבר זה. פיברובלסטים לבביים הם ניידים מאוד, מגיבים מכנית, ופנוטיפיים הנעים בהתאם למידת ההפעלה שלהם. פיברובלסטים לב נחוצים כדי לשמור על רמות נורמליות של מטריצה חוץ תאית (ECM), וייצור ECM מעט מדי או יותר מדי על ידי תאים אלה יכול להוביל למחלה1,2,3. בהתחשב בחשיבותם במחלות, פיברובלסטים לב הפכו לנושא חשוב יותר ויותר של חקירה לקראת זיהוי אסטרטגיות טיפול חדשניות, במיוחד בניסיון להגביל פיברוזיס מוגזם4,5,6,7. לאחר פציעה, fibroblasts להפעיל ולהבדיל לתוך סוג תא סינתטי יותר המכונה myofibroblast, אשר יכול להיות שגשוג להפריש ECM בשפע, כמו גם יש פעילות התכווצות המסייעת לשפץ את החדרים.
בעוד פיברובלסטים לב הוערכו בהרחבה עבור המאפיינים שלהם בתרבויות 2-D6,8,9,10, הרבה פחות מובן של המאפיינים שלהם ואת הדינמיקה בלב חי 3-D, או בבסיס או עם גירוי המחלה. כאן, שיטה מעודנת תוארה רקמה לנקות את לב העכבר הבוגר תוך שמירה על פלואורסצנטיות של fibroblasts שכותרתו עם Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer מערכת כתב גנטי. בתוך הלב, Tcf21 הוא סמן ספציפי יחסית של פיברובלסטים שקטים4. לאחר טמוקסיפן ניתנת כדי להפעיל את החלבון MerCreMer בלתי ניתן להסבר, למעשה כל fibroblasts רגיעה לצמיתות להביע חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) מן הלוקוס Rosa26, אשר מאפשר המעקב שלהם vivo.
קיימים פרוטוקולים רבים לניקוי רקמות מבוססים, שחלקם הוחלו על הלב11,12,13,14,15,16,17. עם זאת, רבים של ריאגנטים המשמשים פרוטוקולים ניקוי רקמות שונים נמצאו להרוות אותות פלואורסצנטיים אנדוגני18. בנוסף, הלב הבוגר קשה לנקות בשל שפע של חלבונים המכילים קבוצת heme המייצרים שפעת אוטומטית19. לכן, מטרת פרוטוקול זה הייתה לשמר פלואורסצנטיות סמן פיברובלסט עם עיכוב בו זמנית של שפעת אוטומטית heme בלב הבוגר הפצוע להדמיה אופטימלית 3-D ב vivo12,13,14,16,17,20.
מחקרים קודמים שניסו לבחון את פיברובלסט הלב ב vivo השתמשו נוגדנים perfused לתייג תאים אלה, אם כי מחקרים כאלה היו מוגבלים על ידי חדירת נוגדנים ומבנה כלי דם לב14,16,17,20. למרות סלמון ואח ‘הראו ניקוי רקמות עם שמירה על פלואורסצנטיות עצבית אקטואלי בלב יילודים, ו Nehrhoff et al. הראו תחזוקה של פלואורסצנטיות סימון תאים מיאלואידיים, שמירה על פלואורסצנטיות אנדוגני דרך כל הקיר החדרי עדיין לא הוכח, כולל הדמיה של fibroblasts לב למבוגרים בבסיס או בעקבות פציעה13,20. פרוטוקול ניקוי רקמות זה מזקק תערובת של פרוטוקולים קודמים המבוססים על שיטת CLARITY (מערכת ממסים נוקשה אקרילאמיד-היברידית-היברידית/חיסונית/בהידרוגל רקמה תואמת איטו-הכלאה) ו- PEGASOS (מערכת ממס הקשורה לפוליאתילן גליקול (PEG). פרוטוקול מעודן זה התיר בדיקה חזקה יותר של פיברובלסטים לב בלב העכבר בבסיס וכיצד הם מגיבים לסוגים שונים של פציעה. הפרוטוקול הוא פשוט לשחזור יעזור לאפיין את ההתנהגות של פיברובלסטים לב vivo.
מאמר זה מציג שיטה מעודנת לניקוי רקמות המאפשרת הדמיה של פיברובלסטים לבביים ב vivo, הן בבסיס הפציעה והן בעקבותיה, כדי לאפיין ולהבין טוב יותר פיברובלסטים בלב העכבר. פרוטוקול משופר זה מטפל במגבלות בפרוטוקולים קיימים לניקוי רקמות שניסו לזהות סוגי תאים ספציפיים בלב הבוגר או בילודים12</sup…
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להכיר את CCHMC Confocal הדמיה ליבה על הסיוע וההדרכה שלהם בפיתוח של מודל זה, כמו גם מאט באטי מהנדסה קלינית עבור העיצוב של כל החלקים המודפסים 3D. דמטריה פישר נתמכה על ידי מענק הכשרה מהמכונים הלאומיים לבריאות (NHLBI, T32 HL125204) וג’פרי ד. מולקנטין נתמך על ידי המכון הרפואי הווארד יוז.
4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
Heparin | Sigma | H0777 | |
Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |