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Medicine

健康で負傷したマウス心臓における三次元線維芽細胞組織のための精製されたCLARITYベースの組織クリアリング

doi: 10.3791/62023 Published: May 16, 2021

Summary

組織のクリアの精製方法が開発され、成体マウスの心臓に適用された。この方法は、遺伝的レポーター戦略に起因する標識された線維芽細胞蛍光を維持しながら、緻密な自己蛍光心臓組織をクリアするように設計された。

Abstract

心血管疾患は、世界中で最も一般的な死亡率の原因であり、しばしば心臓機能の変化と心室の剛性の増加につながる可能性がある高められた心臓線維症によってマークされています。心室線維症のこの増加は、常駐線維芽細胞の活性化によるもので、これらの細胞が3次元(3-D)心臓内でどのように動作するかは、ベースラインまたは活性化後に、よく理解されていない。線維芽細胞が3D心臓における心臓病とそのダイナミクスにどのように寄与するかを調べるために、マウス心臓全体の蛍光標識心臓線維芽細胞を示す洗練されたCLARITYベースの組織クリアリングおよびイメージング法が開発されました。組織常駐線維芽細胞は、Tcf21-MerCreMerノックインラインを発現する心臓線維芽細胞と交差するRosa26-loxP-eGFPフローレストレポーターマウスを使用して遺伝的に標識した。この技術は、健康なマウスおよび心臓病の線維化マウスモデルにおける成人左心室全体にわたる線維芽細胞局在化ダイナミクスを観察するために使用された。興味深いことに、1つの傷害モデルでは、収縮方向に包まれた繊維のバンドに続く損傷したマウス心臓で心臓線維芽細胞のユニークなパターンが観察された。虚血性傷害モデルでは、線維芽細胞死が起こり、続いて梗塞境界領域からの再集団化が起こった。総称して、この精製された心臓組織の明確化技術およびデジタル化された画像化システムは、抗体の侵入の失敗または組織処理による失われた蛍光を取り巻く以前の問題の制限なしに心臓の心臓線維芽細胞を3D視覚化することを可能にする。

Introduction

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心筋細胞は心臓の最大の体積分率を含むが、心臓線維芽細胞はより豊富であり、この器官のベースライン構造および修復特徴の調節に重大に関与する。心臓線維芽細胞は、移動性が高く、機械的に応答性が高く、その活性化の程度に応じて典型的に範囲が広がっています。心臓線維芽細胞は、細胞外マトリックス(ECM)の正常なレベルを維持するために必要であり、これらの細胞によるあまりにも少ないまたは多すぎるECM産生は、疾患1、2、3につながる可能性がある。心臓病における彼らの重要性を考えると、心臓線維芽細胞は、特に過剰な線維症4、5、6、7を制限しようとする新しい治療戦略を特定するための調査のますます重要なトピックとなっている。傷害時に、線維芽細胞は活性化し、筋線維芽細胞として知られているより合成細胞タイプに分化し、増殖し、豊富なECMを分泌し、心室を改造するのに役立つ収縮活性を有する。

心臓線維芽細胞は、2次元培養6、8、9、10においてその特性について広範囲に評価されてきたが、ベースラインまたは疾患刺激で、3次元の生きている心臓におけるその特性およびダイナミクスについてはるかに少なく理解されている。ここで、細胞の線維芽細胞の蛍光を維持しつつ、成人マウス心臓を組織クリアする精製方法が記載されている。心臓の中で、Tcf21は静止線維芽細胞4の比較的特異的なマーカーである。タモキシフェンが誘導可能なMerCreMerタンパク質を活性化するために与えられた後、本質的にすべての静止線維芽細胞は永久に生体内での追跡を可能にするRosa26遺伝子座から強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現するであろう。

多数の確立された組織クリアプロトコルが存在し、そのうちのいくつかは心臓11、12、13、14、15、16、17に適用されている。しかし、異なる組織クリアプロトコルで使用される試薬の多くは、内因性蛍光信号18をクエンチすることが発見されている。さらに、成人心臓は、自己蛍光19を生成する豊富なヘム群含有タンパク質のためにクリアすることが困難である。したがって、このプロトコルの目標は、ビボ12、13、14、16、17、20における最適な3D可視化のために、負傷した成人心臓におけるヘム自己蛍光の同時阻害と共に線維芽細胞マーカー蛍光を維持することであった。

インビボで心臓線維芽細胞を調べようとする以前の研究は、これらの細胞を標識するために浸透抗体を採用したが、そのような研究は抗体の浸透および心血管構造14、16、17、20によって制限された。サラモンらは、新生児心臓における局所神経蛍光の維持と組織のクリアを示しているが、Nehrhoffらは骨髄細胞をマーキングする蛍光の維持を示しているが、心室壁全体を通る内因性蛍光の維持は、ベースラインまたは傷害の成人心臓線維芽細胞の視覚化を含めて、まだ実証されていない。この組織クリアリングプロトコルは、CLARITY法(透明脂質交換アクリルアミドハイブリダイドリジジッドイメージング/イムノステイン/イン・シチュハイブリダイゼーション適合組織ヒドロゲル)およびPEGASOS(ポリエチレングリコール(PEG)関連溶媒システム)に基づいて、以前のプロトコルの混合物を精製します。この洗練されたプロトコルは、ベースラインでマウス心臓の心臓線維芽細胞のより堅牢な検査を可能にし、それらが異なるタイプの傷害にどのように反応するかの。プロトコルは簡単で再現可能であり、生体内の心臓線維芽細胞の挙動を特徴付けるのに役立ちます。

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Protocol

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マウスを含むすべての実験は、シンシナティ小児病院医療センターの施設動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。機関はまた、AAALAC (米国ラボラトリーアニマルケア認定協会) 認定されています.マウスは頸部脱臼を介して安楽死させ、生存手術を受けているマウスには痛みの軽減が与えられた(下記参照)。疼痛管理および安楽死のために使用されるすべての方法は、米国獣医医師会の安楽死に関するパネルの勧告に基づいています。すべてのマウスは、常に利用可能な水と食べ物とトウモロコシのコブ寝具ユニットに収容されました。マウスは、同性を有するケージに4を収容した。手術や怪我をしていない組織のクリアのために、6-8週齢の雄と雌のマウスの同数が使用されました。

注:無菌手術の状態は、すべての手術で維持されました。外科医は清潔なスクラブと無菌のガウンに着替え、靴カバーとヘアネットを寄付しました。外科医はその後、クロルヘキシジンで手をこすり、無菌外科用手袋を寄贈した。外科医は、切開部位をそれぞれ3回鎮静、剃剃、スクラブした技術者によって支援され、2%クロロエクキシジングルコン酸塩と70%イソプロパノールの間で交互に行われた。その後、マウスを外科医に持ち込み、手術を行った。動物間、器具はビード滅菌器で滅菌した。

1. 遺伝子組換え

  1. クロスローザ26-ロックスP-eGFPマウス(Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J])とTcf21-MerCreMerマウス(1A)6,21.
  2. この十字架の子孫が6週齢に達すると、トウモロコシ油に溶解した75mg/kgのタモキシフェンの腹腔内注射を投与する。22このタモキシフェンを2回、48時間離して投与する(図1B)。
  3. タモキシフェン注射後、1週間タモキシフェン食品(約0.4g/kgタモキシフェンクエン酸塩)の食事にマウスを入れます。タモキシフェンチャウの1週間後、手術を行う前に1週間、マウスを通常のオートクレーブチャウ食に戻す(図1B)。適切な数のマウス(外科的状態あたり3匹)を、怪我をしていないコントロールに指定する。これらのマウスを犠牲にして、通常のチャウダイエットの1週間後に以下に記載したクリアリングプロセスに進む。
  4. タモキシフェンレジメンおよび組換えに続いて、手術を行う。

2. 外科モデル

  1. 虚血/再灌流(I/R)23,24
    1. 換気箱の室内空気の中に1.5%のイソフルランガスを用いてマウスを麻酔する;電気バリカンで胸と首を剃り、2%クロルヘキシジングルコン酸浸した綿棒で剃った領域をこすります。
    2. 人工涙軟膏を使用して、鎮静したマウスの目に軟膏を置くことによって手術中の乾燥を防ぎます。
    3. 手術用ハサミを使用して中首カットを行い、気管を視覚化します。20Gカテーテルを用いてチューブを気管に入れ、中頸部切開を通して気管カテーテルを可視化します。イソフルランガスで鎮静しながら人工呼吸器にマウスを置く(1.5%)室内の空気の中で。
    4. 手術用ハサミで左前肢の下に切開し、肋骨3と4の間の肋間筋を切断する。リトラクタを使用してリブを開きます。
    5. 肺と心臓の間の生理的なスポンジに浸した小さなスポンジを置き、肺の損傷を防ぎます。
    6. フィッシュフック針(6.5mm、3/8c)を使用して、左冠動脈を8-0で剥離可能なスリップノットで結びます。プロレン。
    7. 鉗子を使用してスポンジを取り外します。
    8. 4-0編組シルクと連続縫合糸を使用して閉じた肋間筋を縫合し、8-0の終わりを外装プロレンスリップノット。
    9. 閉塞したスリップ結び目の突出の端を有する局所組織接着剤を使用して皮膚切開を閉じる。
    10. 1時間の閉塞の後、スリップ結び目の外側端を引っ張って冠状動脈閉塞を内部に放出し、虚血を緩和し、再灌流を引き起こす。
    11. 1mg/mL拡張放出ブプレノルフィンの0.02mLを下皮注射(72時間放出)を鎮痛剤として投与し、他の動物とは別の37°Cの酸素化インキュベーションチャンバーにマウスを入れる。麻酔から回復し、胸骨または座っている位置を維持できるようになるまで、少なくとも15分ごとにマウスを監視します。マウスを通常のハウジングに戻します。
    12. 手術後48時間の痛みや苦痛を動物に評価し、完全に治癒するまで切開部位を毎日監視する。
    13. 犠牲になるまで、水分補給、栄養、および全体的な幸福のためにマウスを観察し、手術後に。
  2. 心筋梗塞(MI)25,26,27
    1. ステップ 2.1.1 ~ 2.1.7 を実行します。
    2. 4-0編組シルクを使用して肋間筋肉を閉じるには、連続縫合糸を使用します。
    3. 局所組織接着剤を使用して皮膚切開を閉じます。
    4. ステップ 2.1.11 ~ 2.1.13 を実行します。
  3. アンギオテンシンII/フェニレフリンマイクロ浸透圧ポンプ
    1. 準備 無菌条件下でのアンジオテンシンIIおよび500 μg/μL作動溶液の10 μg/μLの作業溶液を調製する(すなわち、 ラミナルフローフード)では、1mgのアンジオテンシンIIを100μLの無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)と250mgのフェニレフリン塩酸塩を500μLのPBSに加えた。
    2. 各作業溶液の希釈と最終的な体積を計算し、マウスの重量に基づいてマイクロ浸透圧ポンプに分配します。
      注:例えば、20 gマウスは20g x 14日x 1.5 μg/日=420μgのアンジオテンシン、または42μLの作動溶液、ならびに20g x 14日x 50μg/日= 1400μgのフェニレフリン水塩水塩化物、または28μLの働く溶液を必要とする。
    3. 各マウスの重量については、滅菌PBSで薬剤の作業ストックを希釈し、27G針と1mLシリンジを使用してマイクロ浸透圧ポンプ(0.25 μL/h、14日、約100μL)を充填します。
      注:これは、アンジオテンシンIIの1日-1の流量を生成し、50 μg∙g-1日のフェニレフリン塩酸塩の1日-1をマウスに配置します。
    4. 室内の空気を含む換気チャンバーで1.5%のイオブルラン吸入(効果を得る)でマウスを麻酔する。
    5. 麻酔したマウスをオピン位置の無菌手術台に置き、イソフルランガス吸入で麻酔を維持する(1.5%)ノーズコーンを通して。
    6. 手術中の乾燥を防ぐために、動物の目に人工涙軟膏を使用してください。
    7. 電気毛バリクで埋め込み領域の上に毛皮を剃り、エタノールと滅菌綿棒を使用して切断する領域を殺菌します。背中の右側の肩甲骨の下にあるマウス皮膚の表皮層に外科用ハサミを入れた小さな切開(約1cm)を作ります。手術用ハサミの鈍い側面を使用して、移植の領域とその周辺の皮膚を優しく伸ばしてミニポンプを挿入します。
    8. マイクロ浸透圧ポンプを切開内に置き、皮膚の下で手動でポンプをマッサージしてマウスの下の内側の内側に物理的に操縦します。
    9. テーパーポイント針で4-0シルクを使用して連続縫合を介して切開を閉じます。
    10. ポンプ注入後、鎮痛薬の皮下注射(72-時間の遅い放出)を介して0.1mg /kg体重の用量で遅い放出ブプレノルフィンを投与する。他の動物とは別の37°Cの酸素化インキュベーションチャンバーにマウスを入れます。麻酔から回復し、胸骨または座っている位置を維持できるまで、少なくとも15分ごとにマウスを監視します。
    11. 37°Cの温室で麻酔から回復すると、マウスを標準のハウジングユニットに戻します。
    12. 手術後48時間の痛みや苦痛をマウスで監視し、完全に治癒するまで切開部位を毎日監視する。
    13. 犠牲になるまで、水分補給、栄養、および全体的な幸福のためにマウスを観察し、手術後に。

3. 変更されたアクティブなCLARITYプロトコルを使用して大人のマウスの心臓をクリア

  1. 手術表面と70%エタノールですべての手術ツールを殺菌することによって、きれいな外科区域を準備しなさい。PBS(100mL)で冷たい1x PBSおよび4%パラホルムアルデヒド(PFA)の溶液を調製する。手袋、ラボコート、フェイスマスク、目の保護を着用してください。
  2. 10単位のヘパリンを0.9%w/v塩化ナトリウム溶液に希釈してヘパリンバッファーを調製します。1 mLシリンジと27G針を用いて、各マウスを60μLのヘパリン-NaClで腹腔内に注入します。
  3. ヘパリン-NaCl溶液の注入の5分後、室温の空気を含む換気された部屋の1.5%イオブルラン吸入(効果に)を使用してマウスを麻酔する。
  4. 頸部脱臼によりマウスを安楽死させ、頭部の後部は平らで閉じた鉗子で保持され、脊柱は尾部を引っ張って脱臼する。
  5. 綿棒に70%エタノールでマウスの腹側表面をきれいにします。外科用はさみを使用してxiphoidプロセスの約3cm下に3cmの横切り切開を行います。
  6. 腹筋をxiphoidプロセスまでデググラビングして下層腹壁組織から皮膚を分離します(尾に最も近い皮膚を保持し、胸部に向かって頭に最も近い皮膚を引っ張ります)。外科用はさみを使用して、xiphoidプロセスの下3cm下の皮下腹壁組織に2cmの横切り切開を行う。この横切り切りから垂直に切り取り、正中線を上にして胸部を通して作ります。胸部を後ろに固定し、心臓を露出します。
  7. 27G針と10 mLの注射器を使用して、優れた静脈と大オルタに冷たいPBSを注入してください(心臓の任意の位置操作は、穿刺を避けるために鈍い鉗子で慎重に行う必要があります)心臓から血液をクリアします。
    注:十分な灌流は、尾のけいれんおよび肺の変色によって注意することができる。
  8. 27G針と10 mLの注射器を使用して、上の静脈と大オルタに冷たい4%PFAを注入し、固定プロセスを開始します。
  9. 心を物品物化する。心房、右心室、中隔、左心室は、まっすぐな刃のメスを使用して分離する必要があります。このティッシュを冷たい4%PFAで満たされた15 mL遠心分離管に入れ、一晩4°Cでヌテーターに置きます。
  10. 余分なPFAを除去するために冷たい1x PBSでそれぞれ1時間心臓を3回洗浄します。
  11. 15 mL遠心分離管に以下の化学物質を混合してヒドロゲル(A4P0と呼ぶ相対的アクリルアミド組成物のA4P0と呼ぶ)を調製します:40%アクリルアミドの10%、10%1x PBS、80%蒸留水。
  12. ヒドロゲルに心臓を浸す直前に、光導入剤(2,2-Azobis[2-2-イミダゾリン-2イル)プロパン)二塩酸塩)の0.25%溶液をヒドロゲル溶液に加えます。
  13. ハイドロゲルを含む円錐形のチューブに心臓を置きます。円錐形のチューブをホイルで包み、物理的な乱れなしに4°Cで一晩インキュベートします。
  14. 4°Cで約14時間後、心臓を含む円錐管を37°Cビーズ浴に移動します。
  15. ビーズバスで2.5時間後、鉗子で慎重にヒドロゲルから心臓を取り出します。
  16. 1x PBSを含む15 mLの円錐管に、37°Cのヌテターでそれぞれ1時間3回、心を洗浄します。
  17. 鉗子を使用してアクティブな電気泳動機のバスケットに心臓を置き、ふたをバスケットに置きます。蓋がしっかりと取り付けられるようにします。
  18. 溶液をチャンバに注ぎ込んで、活性電気泳動チャンバーの貯蔵所に電気泳動クリア液を充填します。
  19. チャンバーが電気泳動クリア液でいっぱいになると、心臓を含むバスケットを沈めることができます。電気泳動機にキャップをしっかりと置きます。
  20. 電気泳動機を1.5 A、37°Cで1.5時間実行します。
  21. 1.5時間の電気泳動の後、不透明な組織が残らないように心を視覚的にチェックしてください。組織の領域がまだ不透明である場合は、電気泳動室の電気泳動溶液中の心臓を再び沈下し、一度に0.5時間の電気泳動を継続する。
    注:電気泳動は、組織損傷(組織のほつれなど)の最初の兆候で中止する必要があります。
  22. 1x PBSを含む15 mLの円錐管で1時間、3回、37°Cでヌテタで洗浄します。
  23. ム自家蛍光を低減する脱色剤であるN,N,N',N'-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミンを含む15mL円錐管に心臓を沈める。
    注:このソリューションは、心臓が完全にクリアされるまで24時間ごとに変更する必要があります(約2日)。
  24. 15 mLの円錐管で1x PBSを3回1時間洗浄し、過剰な脱色剤を除去します。
  25. 0.02 Mリン酸バッファーの30 mL、5-(N-2、3-ジヒドロキシプロフィラセタミド)-2の40 gを組み合わせることにより屈折率一致溶液(RIMS)を準備し、 4,6-トリイオド-N,N'-ビス(2,3ジヒドロキシプロピル)イソフタルアミド(完全に溶解しなければならない-これは1時間までかかる必要がある)、アジドナトリウム5mg、Tween20の50 μL、1,4-ジアザビシクロラ[2.2.2]オクタンの1g、およびpHに調整する。
  26. 撮像前に48時間、RIMSの心臓を平衡化します。

4.画像化は直立単一光子顕微鏡を使用して心臓をクリア

注:イメージング装置は、10 cmガラスペトリ皿の下半分、3Dプリントされた底部のリザーバ、丸いガラスカバースリップ、および3Dプリントされた上部の貯水池(図1C-E)で構成されています。3Dプリント材料は、シンシナティ小児病院臨床工学部によって社内で作られました。

  1. 真空グリースを使用して、3Dプリントされた底部のリザーバをガラスペトリ皿に密封し、3Dプリントされた部分の底部に真空グリースの薄い層を置きます(図1C)。
    注:リザーバは、画像化されるサンプルと同じ高さでなければなりません(つまり、サンプルは、その上に置かれたガラスカバースリップによって圧縮されるべきではなく、サンプルも浮遊して貯水池内で移動することはできません)。
  2. 貯留層にRIMSを充填し、パイプチップですべての気泡を取り除きます。左心室壁を上に向けてRIMSに心を入れ、溶液に泡が入らないようにします。
  3. 真空グリースを使用して、3Dプリントされたトップリザーバーピースの底面にガラスカバースリップを付着させます(再び真空グリースの薄い層を3Dプリントされた部分に置き、カバースリップに置きます)。
  4. ガラスカバースリップと上部のリザーバを下に置き、下部のリザーバー(補足図1B)に、気泡を導入せずに置きます。RIMS とカバースリップの間の接着は、上部と下部のリザーバピースの間にシールを提供します (図 1E)。
  5. 10xグリセロール浸漬目的で使用するためにグリセロールで上部の貯蔵所を充填します。
  6. クリアされた心臓を画像化するために、多光子共焦点スキャンヘッドを装備した単一の光子顕微鏡を使用してください。
  7. 単一光子顕微鏡の段を下げ、サンプルを含むペトリ皿をステージの中央に置きます。サンプル装置の上部貯留部のグリセロールに10xグリセロール浸漬目的を下げてステージを上げる。接眼レンズを使用してサンプルの端を見て、サンプルが焦点を合っていることを確認します。
  8. ライブボタンをクリックして、コンピュータ上の接眼レフからカメラビューに切り替えます。
    1. 最初にペトリ皿の底にあるはずの組織サンプルの最も広い部分を見つけることによって 、X および Yパラメータ を設定します。
    2. ND取得カスタムマルチポイントをクリックします。ジョイスティックを使用して左から右、上から下にスイープすることで、最初に組織サンプルの中央を見つけることでマルチポイントを作成します。
    3. 次に、組織のサイズに基づいて、必要なタイリングサイズを決定します(通常、6-8週齢のマウス心臓の場合は6 x 5)。XおよびYパラメータ(ND取得タブの下のzをオフにして)をキャプチャして、組織の全長と幅がキャプチャされたかどうかを確認するだけで、テストイメージングを実行します。
  9. zパラメータを設定するには、XYZ ナビゲーションを開き、きと下向きのアイコンをクリックして、サンプルの上部と下部を見つけるまでクリックします。
    1. Z強度補正パネルを開き、各Zポイントでレーザーパワーを増減させることで組織密度を補正するために、組織の上部、中央、底部の蛍光を調整します。Z強度補正パネルの右側にある設定矢印をクリックして設定します。
    2. ND取得パネルZステップサイズを5μmに設定します。
  10. 心臓のX、Y、Zパラメータを線引きし、Z強度補正が設定された後、共振スキャナとガリウムヒ素ホスホニド感光増倍管(GaAsP PMT)を用いた10xグリセロール浸漬目的を有する自動直立顕微鏡を使用して、クリアされた心臓を画像化する。ND取得でXYおよびZ タブがチェックされていることを確認し、Z 補正を実行を押します。
  11. 処理ソフトウェアで マルチポイント画像 を開き、 ステッチ ボタンをクリックして、得られた画像をステッチ、アンミックス、ノイズ除去します。[ イメージ] で、[ ブラインド アンミックス]、[ 2 チャンネル] をクリックし、 を 見つけます。をクリックし、[ イメージ] で [denoise.ai]をクリックし、選択した蛍光チャネル (GFPなど) をクリックします。
    注:このプロセスは、左心室全体でGFP陽性線維芽細胞の3D画像になります。
  12. 二次解析ソフトウェアを使用して、心臓線維芽細胞の分散のパターンと傾向をさらに特定します。 スポット ウィザード プログラムを実行して 、スポット 関数を使用します。

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Representative Results

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心臓線維芽細胞は、心臓のベースライン機能および心臓損傷への応答に不可欠です。これらの細胞の配置と形態を理解するための以前の試みは、主に2D設定で行われてきました。しかし、洗練された心臓組織クリアリング(図2)および3Dイメージング技術が発表されており、心臓線維芽細胞の高度で詳細な視覚化が可能です。このイメージング技術により、線維芽細胞は密に詰め込まれ、傷つけていない心臓に紡錘状の形態を有することが判明した(図3、補足ビデオS1-4)。

左心室組織のクリアリングが損傷していない心臓で達成された後、このプロトコルは、傷害した心臓組織を研究する際にこのクリアリングプロトコルがどのように実行するかを調べるために、いくつかの傷害モデルに適用された。マウスは左冠動脈(LCA)を1時間一時的に閉鎖し、続いて3、7、14、または28日間続く再灌流によってI/R傷害を受けた。これらの実験は、I/R損傷直後に虚血領域で心臓線維芽細胞が失われたが、7日目と14日目までに、線維芽細胞が移動または増殖して負傷した心臓のこの領域を再建することを示した。28日目までに、心臓の傷ついた領域を取り巻く心臓線維芽細胞集団は最大の密度であった(図4、補足ビデオS5-8)。

MI傷害は、永久的なLCA結紮(再灌流なし)に起因する外科モデルである。MI手術を受けた心臓は、固定、クリアリング、および分析のために手術後1.5日と3日で切除された。手術後1.5日で負傷した左心室に残っている線維芽細胞は非常に少なかった(図5A、補足ビデオS9)。しかし、3日目までに、線維芽細胞は、1つの小さな領域を除いて大部分の左心室に拡大して存在していたが、おそらく国境地帯の集団に移行および/または増殖した(図5B、補足ビデオS10)。再び、解析ソフトウェアを用いて線維芽細胞の局在化を可視化し、心臓線維芽細胞の消失領域をオレンジ色で概説した(図5)。この分析は、MIに続く1.5日目の細胞の最初の損失と、表向きは領域を修復し、傷跡を形成するために3日目までに線維芽細胞がどのように増殖または損傷した領域に移行するかを示した。

虚血性傷害に加えて、心筋線維芽細胞の高血圧への反応はよく理解されていない。高血圧に対するこれらの細胞の応答を発見するために、アンジオテンシンIIおよびフェニレフリンを投与した。アンジオテンシンIIおよびフェニレフリン(Ang/PE)は、間質線維症の領域を有する持続的な高血圧および心線維芽細胞活性化を引き起こす薬剤であり、この組織クリアリングプロトコルをang/PE処置心臓に適用して確認した(図6A)5、28。虚血性手術とは対照的に、数週間にわたってAng /PEを注入しても心臓組織の喪失や壁の薄化は起こらない。代わりに、この傷害に続く線維芽細胞行動において異なる結果が認められた。

心臓がポンプとして、心筋は、右利きのらせんパターン29、30、31に従って、ねじれる。損傷のAng/PEモデルでは、線維芽細胞は、精製された組織クリアリングプロトコルを使用して、この右利きのらせん収縮パターンの軸に沿って整列した(図6B)。この挙動を説明する仮説は、心臓線維芽細胞が心室壁緊張の方向を感知し、アゴニスト注入中に急性に展開された線維応答としてECM内で最大の支持を提供するために筋線維線維の中で整列していたということです(図7)。もう一つの興味深い発見は、線維芽細胞がI / RおよびMI傷害のモデルに見られるスピンドル形状とは対照的に、小さく丸みを帯びた姿に見えた(図6、補足ビデオS11)。

Figure 1
図1:心臓をクリアする組織に使用されるマウスおよび材料。
(A) Tcf21-MerCreMer(mcm)x Rosa26eGFPマウスの繁殖戦略の概略は、組織のクリアに使用される。(B)マウスで行われたタモキシフェン治療と手術のタイムライン。負傷していないマウスは14日目に犠牲にした。(C)3Dは、真空グリースでガラスペトリ皿に密封された心臓組織を保持するためによく印刷しました。(D)下部ウェルの上部にセットされた3Dプリントウェルの上部に密封された丸いカバースリップ真空グリースの追加。(E)組織保持装置の底部ウェルで心臓をクリアし、屈折率整合溶液(RIMS)で満たされた。カバースリップ(Dのように)と上3Dプリントウェルピースは、クリアされた心臓組織を含む下部3Dプリントされた貯水池成分の上に置かれました。グリセロールは、グリセロール浸漬顕微鏡のために上部の貯蔵所に添加される。スケールバー= 1 cm貯水池の設計図は補足図 1に示されています。略語: eGFP = 強化された緑色蛍光タンパク質。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:心臓組織クリアリング段階の視覚的な外観。
(A)左から右へ:不明な左心室、電気泳動左心室、架橋器で処理された電気泳動左心室、架橋器で処理された電気泳動左心室、RIMSでインキュベートした電気泳動左心室。(B) マウスの心臓全体が不明でクリアされた。(C)左:けがはなく、左心室が不明である。右:怪我をしていない、左心室をクリア。(D)左:不明なMIが左心室を負傷した。右:MIが左心室を負傷した。スケールバー= 0.5 cm略語: MI = 心筋梗塞.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:傷つかずの心や恥ずかしがったクリアハートに対する新規クリアリング法の有効性
クリア(A)無傷(スケールバー=400μm)および(B)シャム作動心(スケールバー=500μm)をTcf21mcm x Rosa26eGFP線維芽細胞(緑色)と、線維芽細胞局在化を示す蛍光(紫色)の増加の疑似色領域を有する。線維芽細胞のビデオを示す付随する ビデオは補足ビデオ S1–2にあります。静止画像は、線維芽細胞内因性蛍光(緑色)の背景のクリアと維持を示しています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:虚血/再灌流での線維芽細胞の喪失の減少は、時間の経過とともに心臓をクリアした。
示されたI/Rタイムポイントから示されたI/Rタイムポイントから心臓組織をクリアし、Tcf21MerCreMer(mcm)x Rosa26eGFP線維芽細胞(緑色)、線維芽細胞局在化を示す蛍光増加(紫色)の疑似色領域、および繊維芽細胞を欠いたオレンジ色のアウトライン領域を用いた。上段:I/R負傷したクリアハートからの左心室の静止画。下段:I/R負傷したクリアハートからの左心室の静止画は、左心室全体でより簡単に線維芽細胞パターンを見るために使用されるイマリススポット機能を有する。I/Rの負傷したクリアハートのビデオは、線維芽細胞のグロスパターニングだけでなく、個々の線維芽細胞とその形態の鮮明な画像も 補足ビデオS5-8で見つけることができます。 スケールバー= 500 μm。略語: I/R = 虚血/再灌流。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:心筋梗塞傷害の後の心線維芽細胞の喪失の減少- 心筋損傷は、時間の経過とともに心臓をクリアした。
Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP線維芽細胞(緑色)、線維芽細胞局在化を示す蛍光増加(紫色)の疑似色領域、および線維芽細胞を欠いたオレンジ色のアウトライン領域を用いて、MI心臓から心臓組織をクリアした。上段:MI負傷した心臓(緑色)から左心室をクリアした組織の静止画。下段:MI負傷した心臓(緑色)から左心室をクリアした組織の静止画の静止画は、総線維芽細胞分布を示すために重ね合わされたイマリス斑点機能(紫色)を有する。MI負傷した心臓から左心室を取り除いた組織のビデオは、心臓における総線維芽細胞の配置だけでなく、この3D in vivoモデルにおける個々の線維芽細胞の位置および形態を示す(補足ビデオS7-8)。スケールバー:1.5日=1000 μm、3日=700μm。略語: MI = 心筋梗塞. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:アンジオテンシン/フェニレフリン処理心臓から組織を取り除いた。
(A) Tcf21MCM x eGFP のタモキシフェン活性化後 2 週間にわたってアンジオテンシン/フェニレフリン ポンプを使用して薬剤を投与する方法を示す図表.(B)静止画、静止画+イマリススポット、およびAng/PE処理された心臓における線維芽細胞組織および形態を示すビデオ(補足ビデオS11)スケールバー=500μm。略語: アン/PE = アンジオテンシン II/フェニレフリン;eGFP = 強化された緑色蛍光タンパク質。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:アンジオテンシン/フェニレフリン処理心臓における観察された線維芽細胞パターンの代表的な画像。
(A、C、およびD):心室の外側の視点から線維芽細胞の右手の螺旋ねじれパターンの画像。(B)心室内部の視点から線維芽細胞のパターニングの画像。矢印は、ツイストパターンを構成する線維芽細胞の線形グループを強調します。スケールバー= 500 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:画像貯留装置の2Dレンダリング。 (A)イメージング貯留層の下半分の2Dレンダリング。この貯蔵所は真空グリースでペトリ皿に密封される。心臓は中央の開口部に置かれ、RIMSに沈む。(B)イメージング貯留層の上半分の2Dレンダリング。ガラスカバースリップは真空グリースとこの部分の平らな底に付着する。これは穏やかに底の貯蔵所の上に置かれる。トップ貯留層は、その後、イメージング用グリセロールで満たすことができます。単位 (mm 単位)。略語: 2D = 2 次元;RIMS: 屈折インデックスマッチングソリューション。 こちらをダウンロードしてください。

ビデオS1:傷つけていない組織が心臓をクリアした。 無傷の左心室の心臓線維芽細胞(緑色)は小さく、多くは2つ以下の細胞投影で丸められた。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。

ビデオS2:シャム組織は心臓をクリアしました。 シャム操作マウス心臓の左心室の心臓線維芽細胞(緑色)は小さく、ほとんどが小さく、無傷の心臓に見られたものと同様に、投影がほとんどなかった。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。

ビデオS3:傷つけていない心臓の心室壁を通る詳細な線維芽細胞図。 このビデオは、心室壁の内側から始まり、心臓の外側に向かってズームします。心臓線維芽細胞(緑色)を詳細に示し、2つ以下の細胞投影を有する丸みを帯びたまたはわずかに細長い細胞体を有することが観察された。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。

ビデオS4:傷つけていない心臓の左心室壁のセクションの詳細図。 クリアされた傷つけていないマウス心臓のこの〜300μm幅のセクションは、心臓線維芽細胞(緑色)とその形態の3D配置を詳細に示しています。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。

ビデオS5:3日間I / Rの左心室をクリア。 左心室の詳細なビューは、I/R傷害後、心線維芽細胞喪失の領域があることを示した。また、線維芽細胞(緑色)は、傷つかずの恥の心に見られるより丸みを帯びた形態と比較して、この負傷した状態ではるかに細長い形状を発達させたことも明らかになった。略語: I/R = 虚血/再灌流。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。

ビデオS6:7日間I / Rの左心室をクリア。 左心室の詳細なビューは、I/R損傷後7日までに、線維芽細胞に欠けている領域がI/R傷害の後の3日目に見られた領域よりも小さかいことを示している。より多くの線維芽細胞(緑色)が存在し、興味深いことに、新しい細胞形態が存在した。具体的には、いくつかの線維芽細胞は、複数の突起を有する丸みを帯びた細胞体を有し、この環境における線維芽細胞の新たなまたは発達した役割を示す可能性がある。略語: I/R = 虚血/再灌流。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。

ビデオS7:14日I/Rの左心室をクリア。 左心室の詳細なビューは、線維芽細胞が非常に少ない心室壁の中央にまだあるが、この空隙の周囲に線維芽細胞(緑色)が7日目のポストI/Rサンプルで見られる非常に細長い形態を維持していることを示した。興味深いことに、傷ついた地域に存在していた少数の線維芽細胞は、傷つけていない心にそのような形態を持っていました - 小さくて丸みを帯びていました。略語: I/R = 虚血/再灌流。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。

ビデオS8:28日I /Rの左心室をクリア。 I/R損傷後の28日目の心臓線維芽細胞(緑色)の詳細なビューは、線維芽細胞を欠いた傷害領域に小さな領域があることを示した。また、この領域を取り巻く高い線維芽細胞密度の領域があり、この密集した領域の形態が非常に細長いことも観察されました。略語: I/R = 虚血/再灌流。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。

ビデオS9:1.5日MIの左心室をクリアしました。 MIの1.5日後に負傷した左心室に残っている心臓線維芽細胞(緑色)は非常に少なく、心室のこの領域全体で心臓線維芽細胞が死んだ。略語: MI = 心筋梗塞. こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。

ビデオS10:3日MIの左心室をクリアしました。 MIの3日後に心臓線維芽細胞を欠いた大きな領域があったが、一部の心臓線維芽細胞(緑色)は、MIの1.5日後に見つかった結果とは異なり、心室に再び現れた。また、心筋線維芽細胞の形態プロファイルは、I/R負傷した心臓に見られるものとは異なっていた。ここでは線維芽細胞は細長かったが、丸みを帯びた細胞体(傷つけていない心臓に見られるものよりも大きい)を有する他のものがあり、これらの亜集団は多くの細胞予測を有していた。略語: MI = 心筋梗塞;I/R = 虚血/再灌流。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。

ビデオS11:アン/PE処理マウスの左心室をクリア。 Ang/PE治療後の心臓線維芽細胞(緑色)の明らかな損失はなかった。しかし、心臓線維芽細胞は、主に小さく、丸みを帯びたか、または細長く、心臓の収縮パターンと一致するように見えた。略語: アンギオテンシン II/フェニレフリン こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。

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Discussion

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この記事では、ベースラインと次の傷害の両方で生体内の心臓線維芽細胞を視覚化し、マウス心臓の線維芽細胞を特徴付け、よりよく理解することを可能にする組織クリアリングのための洗練された方法を提示する。この強化されたプロトコルは、成人または新生児心臓12、13、14、16、17、20の特定の細胞タイプを同定しようとした既存の組織清算プロトコルの制限対処する。マウス心臓をクリアする最初の試みにおいて、受動的なCLARITY技術を使用し、そこで心臓は、組織15、18全体の緩衝液の受動的な分布を可能にするために約1週間、ヌテットのクリアリングバッファに残された。このプロセスは、組織に約80μmの深さのクリアリングを生成した(データは示されていない)だけで、これは1日齢の新生児マウス心臓13をクリアするために数週間が必要であった以前の観察と一致している。アクティブな電気泳動システムを使用したアクティブクラリティにより、心室壁全体を通してより深くクリアできる、およそ700 μm-1 mmの深さ、短い時間枠12、18。

しかし、この以前に公開された活性なCLARITYプロトコルを用いて、高レベルの組織自己蛍光を伴う線維芽細胞蛍光の喪失を引き起こし、これは以前Kolesovaららによって活性CLARITYで起こることが以前に指摘されていた。繊維芽細胞蛍光の維持を可能にするために、適切な固定プロトコルが最も重要であることが判明した。固定プロセスが不足し過ぎると、電気泳動中に蛍光が失われた。固定プロセスが長すぎると、蛍光自体の損失を引き起こした。従って、4%PFA中4°Cでの夜間固定が最適であることが判明した。背景蛍光問題を改善するために、除色浸漬(CUBICクリア法から借りた原理)を用いてミオグロビン内のヘム結合を低減し、このクロモフォア18に起因する自家蛍光を低減した。脱色処理は、標識線維芽細胞がより顕著になるようにレポーター蛍光の維持と、バックグラウンド蛍光のより堅牢なクリアをもたらした(図2A)。

最後に、完全な光学透過性を可能にするために、組織は屈折率マッチングソリューション(RIMS)で平衡化された(図2B-D)。組織の屈折率を周囲と一致させることで、組織の視透過性が高まり、より深いイメージングが可能となった。高速共振スキャンは、ガルバノメトリックスキャンよりも速いため、組織を画像化するために使用されました。マウスの心臓はサイズが若干異なるため、個々のXYイメージングパラメータとZ強度補正が設定されました。これらのパラメータを用いて、約4時間で蛍光線維芽細胞を可視化するために、傷つけていない心臓を通して画像化することが可能であった(図3)。画像の画質は、非混合および非ノイズ解析ソフトウェアを使用して背景を低減し、画像に存在する蛍光を明らかにすることで、画像処理後の処理で向上しました。さらに、二次分析ソフトウェアを使用して、蛍光線維芽細胞の局在を強調しました。このポストイメージング分析は、バックグラウンドボクセルバイボクセルを排除することによって心臓線維芽細胞に明確にアポイントニングするために使用されました(図3、図4、図5、図6)。

この最適化されたCLARITYプロトコルは、負傷した心臓と怪我のない心臓の両方を光学的にクリアするために適用されています。これは、傷害に心臓線維芽細胞の反応のより良い理解を可能にする。これらの傷害には、MIとI / Rのタイムコース、アン/PEのドージングが含まれていました。虚血性傷害は心臓組織を弱めるので、組織の完全性を維持するために電気泳動の間に、より大きな注意を払うことは重要である。実際、I/RとMIの両方の損傷に対して、より短い電気泳動期間(≤1.5時間)が必要です32.これまでの研究では、組織のクリアプロセスに対する傷害の影響は考慮されていません。ここで提示される新しく最適化された議定書は傷害のために収容し、ティッシュのそれ以上の破壊なしでクリアすることを可能にする。

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Disclosures

著者らは、この原稿の内容に関連する開示を持っていません。

Acknowledgments

著者らは、CCHMC共焦点イメージングコアが、このモデルの開発における支援と指導を認め、臨床工学のマット・ベイティがすべての3Dプリント部品の設計を行うことを認めたいと考えています。デメトリア・フィシェッサーは国立衛生研究所(NHLBI、T32 HL125204)からの訓練助成金によって支えられ、ジェフリー・D・モルケンティンはハワード・ヒューズ医学研究所の支援を受けました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 braided silk Ethicon K871H
8-0 prolene Ethicon 8730H
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140
Angiotensin II Sigma A9525-50G
Artificial Tear Ointment Covetrus 048272
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) Millipore Sigma D27802-25G
GLUture topical tissue adhesive World Precision Instruments 503763
Heparin Sigma H0777
Imaris Start Analysis Software Oxford Instruments N/A
Micro-osmotic pumps Alzet Model 1002
Nikon Elements Analysis Software Nikon N/A
Nikon A1R HD upright microscope Nikon N/A
Normal autoclaved chow Labdiet 5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,
N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide
CosmoBio AXS-1002424
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Phenylephrine Hydrochloride Sigma P6126-10G
Photoinitiator Wako Chemicals VA-044
Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] Jackson Laboratories Jax Stock No:012429
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002-5G
Sodium Chloride solution Hospira, Inc. NDC 0409-4888-10
Tamoxifen Sigma Aldrich T5648
Tamoxifen food Envigo TD.130860
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent Millipore Sigma 122262-1L
X-Clarity electrophoretic clearing chamber Logos Biosystems C30001
X-Clarity electrophoretic clearing solution Logos Biosystems C13001
X-Clarity electrophoresis tissue basket Logos Biosystems C12001
X-Clarity electrophoresis tissue basket holder Logos Biosystems C12002

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References

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健康で負傷したマウス心臓における三次元線維芽細胞組織のための精製されたCLARITYベースの組織クリアリング
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Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).More

Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).

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