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Medicine

Clareza refinada baseada em clareza para organização de fibroblasto tridimensional em corações de rato saudáveis e feridos

doi: 10.3791/62023 Published: May 16, 2021

Summary

Um método refinado de limpeza tecidual foi desenvolvido e aplicado ao coração do rato adulto. Este método foi projetado para limpar tecido cardíaco denso e autofluorescente, mantendo a fluorescência do fibroblasto rotulada atribuída a uma estratégia de repórter genético.

Abstract

A doença cardiovascular é a causa mais prevalente de mortalidade em todo o mundo e é frequentemente marcada pelo aumento da fibrose cardíaca que pode levar ao aumento da rigidez ventricular com função cardíaca alterada. Esse aumento da fibrose ventricular cardíaca deve-se à ativação de fibroblastos residentes, embora a forma como essas células operam dentro do coração tridimensional (3D), na linha de base ou após a ativação, não seja bem compreendida. Para examinar como os fibroblastos contribuem para doenças cardíacas e sua dinâmica no coração 3D, foi desenvolvido um refinado método de limpeza e imagem de tecido baseado em CLARITY que mostra fibroblastos cardíacos fluorescentes rotulados dentro de todo o coração do camundongo. Os fibroblastos residentes em tecidos foram geneticamente rotulados usando ratos repórteres florescentes Rosa26-loxP-eGFP cruzados com o fibroblasto cardíaco expressando linha de knock-in Tcf21-MerCreMer. Esta técnica foi utilizada para observar a dinâmica de localização do fibroblasto em todo o ventrículo esquerdo adulto em camundongos saudáveis e em modelos de camundongos fibrosos de doenças cardíacas. Curiosamente, em um modelo de lesão, foram observados padrões únicos de fibroblastos cardíacos no coração do rato ferido que se seguiu a faixas de fibras embrulhadas na direção contraltil. Nos modelos de lesão isquêmica, ocorreu a morte do fibroblasto, seguida de repopulação da zona de fronteira infarto. Coletivamente, esta técnica de esclarecimento de tecido cardíaco refinado e sistema de imagem digitalizada permite a visualização 3D de fibroblastos cardíacos no coração sem as limitações da falha de penetração de anticorpos ou questões anteriores em torno da fluorescência perdida devido ao processamento tecidual.

Introduction

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Embora os cardiomiócitos compõem a maior fração de volume do coração, os fibroblastos cardíacos são mais abundantes e estão criticamente envolvidos na regulação das características estruturais e reparadoras da linha de base deste órgão. Os fibroblastos cardíacos são altamente móveis, mecanicamente responsivos e fenotipicamente variando dependendo da extensão de sua ativação. Os fibroblastos cardíacos são necessários para manter os níveis normais de matriz extracelular (ECM), e a produção muito pequena ou muito de ECM por essas células pode levar à doença1,2,3. Dada a sua importância na doença, os fibroblastos cardíacos tornaram-se um tema de investigação cada vez mais importante para identificar novas estratégias de tratamento, especialmente na tentativa de limitar a fibrose excessiva4,5,6,7. Após a lesão, os fibroblastos ativam e diferenciam-se em um tipo de célula mais sintética conhecida como myofibroblast, que pode ser proliferativa e segregar eCM abundante, bem como ter atividade contraível que ajuda a remodelar os ventrículos.

Enquanto os fibroblastos cardíacos têm sido amplamente avaliados por suas propriedades nas culturas 2D6,8,9,10, muito menos se entende de suas propriedades e dinâmicas no coração vivo 3D, seja na linha de base ou com estimulação da doença. Aqui, um método refinado foi descrito para limpar o coração do camundongo adulto, mantendo a fluorescência de fibroblastos rotulados com um sistema de repórter genético Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. Dentro do coração, Tcf21 é um marcador relativamente específico de fibroblastos quiescentes4. Depois que o tamoxifen é dado para ativar a proteína MerCreMer indutível, essencialmente todos os fibroblastos quiescentes expressarão permanentemente proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP) do lócus Rosa26, o que permite seu rastreamento in vivo.

Existem inúmeros protocolos de limpeza tecidual bem estabelecidos, alguns dos quais foram aplicados ao coração11,12,13,14,15,16,17. No entanto, muitos dos reagentes usados em diferentes protocolos de limpeza de tecidos foram encontrados para saciar sinais de fluorescência endógena18. Além disso, o coração adulto é difícil de limpar devido às abundantes proteínas contendo grupo de heme que geram autofluorescência19. Portanto, o objetivo deste protocolo foi preservar a fluorescência do marcador fibroblasto com a inibição simultânea da autofluorescência de heme no coração adulto ferido para visualização 3D ideal in vivo12,13,14,16,17,20.

Estudos anteriores que tentavam examinar o fibroblasto cardíaco in vivo empregavam anticorpos perfumados para rotular essas células, embora tais estudos tenham sido limitados pela penetração de anticorpos e estrutura vascular cardíaca14,16,17,20. Embora Salamon et al. tenham mostrado clareamento tecidual com manutenção de fluorescência neuronal tópica no coração neonatal, e Nehrhoff et al. mostraram manutenção da fluorescência marcando células mielóides, a manutenção da fluorescência endógena por toda a parede ventricular ainda não foi demonstrada, incluindo a visualização de fibroblastos cardíacos adultos na linha de base ou após lesão13,20. Este protocolo de limpeza tecidual refina uma mistura de protocolos anteriores com base no método CLARITY (sistema de solvente rígido híbridoizado por lipídida-lipídida (PEG) e sistema solvente associado ao PEGASOS (sistema solvente associado ao FIL). Este protocolo refinado permitiu um exame mais robusto de fibroblastos cardíacos no coração do camundongo na linha de base e de como eles respondem a diferentes tipos de lesões. O protocolo é simples e reproduzível e ajudará a caracterizar o comportamento dos fibroblastos cardíacos in vivo.

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Protocol

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Todos os experimentos envolvendo camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro Médico Hospitalar Infantil de Cincinnati. A instituição também é certificada pela AAALAC (Associação Americana de Acreditação de Cuidados Com Animais laboratoriais). Os camundongos foram eutanizados por luxação cervical, e os camundongos submetidos a procedimentos cirúrgicos de sobrevivência receberam alívio da dor (veja abaixo). Todos os métodos utilizados para o tratamento da dor e eutanásia baseiam-se em recomendações do Painel de Eutanásia da Associação Médica Veterinária Americana. Todos os ratos estavam alojados em unidades de cama de espigas de milho com água e alimentos disponíveis o tempo todo. Os ratos foram alojados 4 em uma gaiola com o mesmo sexo. Para cirurgia ou limpeza de tecido não ferido, foram utilizados números iguais de camundongos machos e fêmeas de 6 a 8 semanas de idade.

NOTA: As condições cirúrgicas estéreis foram mantidas em todas as cirurgias. O cirurgião se transformou em esfregões limpos e um vestido estéril e, em seguida, vestiu capas de sapato e uma rede de cabelo. O cirurgião então esfregou as mãos com clorexidina e vestiu luvas cirúrgicas estéreis. O cirurgião foi auxiliado por um técnico que sedou, raspou e limpou o local da incisão 3 vezes cada, alternando entre 2% de clorohexino gluconato e 70% isopropanol. Os camundongos foram então levados ao cirurgião, e a cirurgia foi realizada. Entre os animais, os instrumentos foram esterilizados em um esterilizador de contas.

1. Recombinação de Cre

  1. Cross Rosa26-loxP-eGFP (Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) com ratos Tcf21-MerCreMer(Figura 1A)6,21.
  2. Quando a prole desta cruz atingir 6 semanas de idade, administre uma injeção intraperitoneal de 75 mg/kg de tamoxifen dissolvido em óleo de milho. 22 Administre este tamoxifeno duas vezes, 48 h de distância(Figura 1B).
  3. Após injeções de tamoxifen, coloque os camundongos em uma dieta de alimentos tamoxifen (~0,4 g/kg de citrato de tamoxifen) por uma semana. Após uma semana de tamoxifen chow, devolva os camundongos a uma dieta normal de chow autoclaved por uma semana antes de realizar a cirurgia(Figura 1B). Designe um número apropriado de camundongos (3 por condição cirúrgica) para serem controles ilesos. Sacrifique esses camundongos, e prossiga para o processo de compensação delineado abaixo após uma semana de dieta normal de comida.
  4. Seguindo o regime de tamoxifeno e recombinação, realize a cirurgia.

2. Modelos cirúrgicos

  1. Isquemia/reperfusão (I/R)23,24
    1. Anesthetize ratos com 1,5% de gás isoflurane no ar da sala em uma caixa ventilada; raspar seus peitos e pescoços com cortadores elétricos, e depois esfregar as áreas raspadas com um cotonete gluconato de 2% de clorhexidina.
    2. Use pomada lacrimal artificial para evitar o ressecamento durante a cirurgia, colocando pomada nos olhos dos camundongos sedados.
    3. Realize um corte no meio do pescoço usando uma tesoura cirúrgica para permitir a visualização da traqueia. Entubar com um cateter de 20 G colocando o tubo de intubação na traqueia e visualizar o cateter traqueal através da incisão do pescoço médio. Coloque os ratos em um ventilador enquanto sedado com gás isoflurane (1,5%) no ar da sala.
    4. Faça uma incisão sob o membro dianteiro esquerdo com uma tesoura cirúrgica, e corte os músculos intercostais entre as costelas 3 e 4. Espalhe as costelas abertas usando um retrátil.
    5. Coloque uma pequena esponja encharcada em soro fisiológico entre o pulmão e o coração para evitar danos ao pulmão.
    6. Usando uma agulha de anzol (6,5 mm, 3/8 c), amarre a artéria coronária esquerda com um nó de deslizamento liberado usando 8-0 Prolene, prolene.
    7. Remova a esponja usando fórceps.
    8. Sutura os músculos intercostais fechados usando seda trançada 4-0 e uma sutura contínua, ao mesmo tempo que exterioriza a extremidade do 8-0 nó de deslizamento prolene.
    9. Feche as incisões da pele usando adesivo de tecido tópico com a extremidade do nó de deslizamento de oclusão saliente.
    10. Após uma hora de oclusão, puxe a extremidade externa do nó de deslizamento para liberar internamente a oclusão da artéria coronária, aliviando a isquemia e causando reperfusão.
    11. Administre 0,02 mL de uma buprenorfina de liberação estendida de 1 mg/mL através de injeção subdérmica (liberação de 72 h) como analgésico, e coloque os camundongos em uma câmara de incubação oxigenada a 37 °C, separada de outros animais. Monitore os camundongos pelo menos a cada 15 minutos até que eles tenham se recuperado da anestesia e sejam capazes de manter uma posição severa ou sentada. Devolva os ratos para suas casas regulares.
    12. Avalie os animais para dor e angústia por 48 horas após a cirurgia, e monitore o local de incisão diariamente até que esteja totalmente curado.
    13. Observe os camundongos para hidratação, nutrição e bem-estar geral após a cirurgia até o sacrifício.
  2. Infarto do miocárdio (MI)25,26,27
    1. Realize as etapas 2.1.1-2.1.7.
    2. Use uma sutura contínua para fechar os músculos intercostais usando seda trançada 4-0.
    3. Feche a incisão da pele usando adesivo de tecido tópico.
    4. Realize as etapas 2.1.11-2.1.13.
  3. Infusão de bomba micro-osmótica angiotensina II/fenilefrina
    1. Prepare Preparar uma solução de trabalho de 10 μg/μL de angiotensina II e 500 μg/μL solução de trabalho de fenilefrina em condições estéreis (ou seja, em uma capa de fluxo laminar) adicionando 1 mg de angiotensina II a 100 μL de salina tamponada de fosfato estéril (PBS) e 250 mg de cloridrato de fenilefrina em 500 μL de PBS.
    2. Calcule a diluição de cada solução de trabalho e o volume final para dispensar à bomba micro-osmótica com base no peso do mouse.
      NOTA: Por exemplo, um mouse de 20 g requer 20 g x 14 dias x 1,5 μg/dia = 420 μg angiotensin, ou 42 μL de solução de trabalho, bem como 20 g x 14 dias x 50 μg/dia = 14000 μg cloridrato de fenilefrina, ou 28 μL de solução de trabalho.
    3. Para o peso de cada rato, dilua o estoque de trabalho da droga em PBS estéril e encha as bombas micro-osmóticas (0,25 μL/h, 14 dias, aproximadamente 100 μL) usando uma agulha de 27 G e uma seringa de 1 mL.
      NOTA: Isso gerará uma taxa de fluxo de 1,5 μg∙g-1∙dia-1 de angiotensina II e 50 μg∙g-1∙dia-1 de cloridrato de fenilefrina uma vez colocado nos camundongos.
    4. Anestesiar os camundongos com 1,5% de inalação de isoflurane (para efeito) em uma câmara ventilada contendo ar da sala.
    5. Coloque os camundongos anestesiados em uma mesa cirúrgica estéril na posição opina e mantenha anestesia com inalação de gás isoflurane (1,5%) através de um cone de nariz.
    6. Use pomada artificial nos olhos do animal para evitar o ressecamento durante a cirurgia.
    7. Raspe a pele sobre a área de implantação com cortadores de cabelo elétricos, e esterilize a área a ser cortada usando etanol e um cotonete estéril. Faça uma pequena incisão (aproximadamente 1 cm) com uma tesoura cirúrgica na camada epidérmica da pele do rato no lado lateral direito das costas, abaixo da omoplata. Use os lados maçante de um par de tesouras cirúrgicas para esticar suavemente a pele dentro e ao redor da área de implantação para inserir a minibomba.
    8. Coloque a bomba micro-osmótica dentro da incisão, e manobrá-la fisicamente à esquerda da linha média dorsal do mouse massageando manualmente a bomba sob a pele.
    9. Feche a incisão através de sutura contínua usando seda 4-0 com uma agulha de ponto de fita.
    10. Após a implantação da bomba, administre a liberação lenta de buprenorfina a uma dose de 0,1 mg/kg de peso corporal através de injeção subdérmica para analgesia (liberação lenta de 72 horas). Coloque os camundongos em uma câmara de incubação oxigenada a 37 °C, separados de outros animais. Monitore os camundongos pelo menos a cada 15 minutos até que se recuperem da anestesia e possam manter uma posição severa ou sentada.
    11. Após a recuperação da anestesia na câmara de aquecimento de 37 °C, coloque os ratos de volta em suas unidades habitacionais padrão.
    12. Monitore os camundongos para dor e angústia por 48 horas após a cirurgia, e monitore o local de incisão diariamente até que esteja totalmente curado.
    13. Observe os camundongos para hidratação, nutrição e bem-estar geral após a cirurgia até o sacrifício.

3. Limpar corações de ratos adultos usando um protocolo clarity ativo modificado

  1. Prepare uma área cirúrgica limpa esterilizando a superfície cirúrgica e todas as ferramentas cirúrgicas com 70% de etanol. Prepare uma solução de PBS frio 1x e 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS (100 mL cada). Use luvas, jaleco, máscara facial e proteção ocular.
  2. Prepare o tampão de heparina diluindo 10 unidades de heparina em solução de cloreto de sódio de 0,9% w/v. Injete cada rato intraperitonealmente com 60 μL de heparina-NaCl usando uma seringa de 1 mL e agulha de 27 G.
  3. Cinco minutos após a injeção da solução heparina-NaCl, anestesia os camundongos usando inalação de isoflurane de 1,5% (para efeito) em uma câmara ventilada contendo ar da sala.
  4. Eutanize os camundongos por luxação cervical, onde a parte de trás da cabeça é mantida com a extremidade plana e fechada dos fórceps, enquanto a coluna vertebral é deslocada puxando a cauda.
  5. Limpe a superfície ventral do mouse com 70% de etanol em um cotonete. Faça uma incisão transversal de 3 cm aproximadamente 3 cm abaixo do processo xifoide usando uma tesoura cirúrgica.
  6. Separe a pele do tecido da parede abdominal subjacente, desgolhando o abdômen até o processo xifoide (mantenha a pele mais próxima da cauda e puxe a pele mais próxima da cabeça em direção à caixa torácica). Faça uma incisão transversal de 2 cm no tecido da parede abdominal subcutânea 3 cm abaixo do processo xifoide usando uma tesoura cirúrgica. Faça um corte vertical a partir desta incisão transversal, até a linha média e através da caixa torácica. Fixe a caixa torácica de volta, expondo o coração.
  7. Use uma agulha de 27 G e uma seringa de 10 mL para injetar PBS frio na veia cava e aorta superior (qualquer manipulação posicional do coração deve ser feita cuidadosamente com fórceps contundentes para evitar perfurações) para limpar o sangue do coração.
    NOTA: A perfusão suficiente pode ser notada por contração da cauda e descoloração dos pulmões.
  8. Use uma agulha de 27 G e uma seringa de 10 mL para injetar PFA de 4% no ar e aorta superiores para iniciar o processo de fixação.
  9. Extir suas imundo os corações. O atria, o ventrículo direito e o septo e o ventrículo esquerdo devem ser separados usando um bisturi de lâmina reta. Coloque este tecido em um tubo de centrífuga de 15 mL cheio de PFA frio de 4%, e coloque em um nutador a 4 °C durante a noite.
  10. Lave o coração 3 vezes por 1h cada um com PBS frio de 1x para remover o excesso de PFA.
  11. Prepare o hidrogel (denominado A4P0 para composição relativa de acrilamida/poliacrilamida) misturando os seguintes produtos químicos em um tubo de centrífuga de 15 mL: 10% de 40% de acrilamida, 10% 1x PBS, 80% água destilada.
  12. Adicione a solução de 0,25% do fotoinitiador (2,2-Azobis[2-(2-imidazolina-2yl)propano)dihidrocloide) à solução de hidrogel pouco antes de submergir o coração no hidrogel.
  13. Coloque o coração em um tubo cônico contendo o hidrogel. Enrole o tubo cônico em papel alumínio e incubar durante a noite a 4 °C sem perturbação física.
  14. Depois de aproximadamente 14 horas a 4 °C, mova o tubo cônico contendo o coração para um banho de contas de 37 °C.
  15. Após 2,5 h no banho de contas, remova o coração do hidrogel cuidadosamente com fórceps.
  16. Lave os corações 3 vezes por 1h cada em um tubo cônico de 15 mL contendo 1x PBS a 37 °C em um nutador.
  17. Coloque os corações na cesta da máquina de eletroforese ativa usando fórceps e coloque a tampa na cesta. Certifique-se de que a tampa está bem colocada.
  18. Encha o reservatório ativo da câmara de eletroforese com solução de limpeza eletroforética despejando solução na câmara.
  19. Uma vez que a câmara esteja cheia de solução de limpeza eletroforética, a cesta contendo o coração pode ser submersa. Coloque a tampa na máquina de eletroforese com segurança.
  20. Execute a máquina de eletroforese a 1,5 A, 37 °C por 1,5 h.
  21. Após 1,5 h de eletroforese, verifique os corações visualmente para garantir que nenhum tecido opaco permaneça. Se as regiões do tecido ainda estiverem opacas, reins submergir o coração em solução de eletroforese na câmara eletroforética, e continuar a eletroforese por 0,5 h de cada vez.
    NOTA: A eletroforese deve ser descontinuada a princípio dos sinais de danos teciduais (como a desgastação tecidual).
  22. Lave os corações em tubo cônico de 15 mL contendo 1x PBS por 1h, 3 vezes cada, a 37 °C em um nutador.
  23. Submergir os corações em um tubo cônico de 15 mL contendo N,N,N',N'-Tetrakis(2-Hydroxipropyl)etilenodiamina — um agente descolorante que reduz a autofluorescência da heme.
    NOTA: Esta solução deve ser alterada a cada 24 horas até que os corações estejam completamente claros (aproximadamente 2 dias).
  24. Lave os corações em um tubo cônico de 15 mL com 1x PBS 3 vezes por 1h cada para remover o excesso de descoloração do agente.
  25. Prepare a Solução de Correspondência de Índices Refrativos (RIMS) combinando 30 mL de tampão fosfato de 0,02 M, 40 g de 5-(N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,N'-bis (2, 3 dihidroxipropyl) isophthalamida com agitação (deve ser completamente dissolvido — isso pode levar até uma hora), 5 mg de azida de sódio, 50 μL de Tween20 e 1 g de 1,4-diazabicicclo[2.2.2]octano, e ajustar o pH para 7,5.
  26. Equilibre os corações em RIMS por 48 h antes da imagem.

4. Imagem limpou corações usando um microscópio confocal de fóton único ereto

NOTA: O aparelho de imagem consiste na metade inferior de uma placa de vidro de 10 cm, um reservatório de fundo impresso em 3D, um deslizamento de vidro redondo e um reservatório superior impresso em 3D(Figura 1C-E). Os materiais impressos em 3D foram feitos internamente pelo Departamento de Engenharia Clínica do Hospital Infantil de Cincinnati.

  1. Use graxa de vácuo para selar o reservatório de fundo impresso em 3D em uma placa de petri de vidro, colocando uma fina camada de graxa de vácuo na parte inferior da peça impressa 3D(Figura 1C).
    NOTA: O reservatório deve ter a mesma altura da amostra que está sendo imageada (ou seja, a amostra não deve ser compactada pelo deslizamento de vidro colocado em cima dele, e a amostra também não deve ser capaz de flutuar e se mover dentro do reservatório).
  2. Encha o reservatório com RIMS e remova todas as bolhas com uma ponta de tubulação. Coloque o coração nas RIMS cuidadosamente com a parede ventricular esquerda voltada para cima, garantindo que nenhuma bolha seja introduzida na solução.
  3. Adere a uma mancha de vidro à superfície inferior da peça superior impressa em 3D(Figura Suplementar 1A) usando graxa a vácuo (novamente colocando uma fina camada de graxa de vácuo na peça impressa em 3D, e colocando-a no deslizamento da tampa)(Figura 1D).
  4. Coloque a tampa de vidro e o reservatório superior, cubra o lado para baixo, sobre o reservatório inferior(Figura Suplementar 1B), sem a introdução de bolhas. A adesão entre as RIMS e o deslizamento da tampa fornecerá um selo entre as peças do reservatório superior e inferior(Figura 1E).
  5. Encha o reservatório superior com glicerol para uso com um objetivo de imersão de glicerol de 10x.
  6. Use um microscópio de fótons equipado com uma cabeça de varredura confocal multifoton para imagem dos corações limpos.
  7. Abaixe o estágio do microscópio de fóton único e coloque a placa de Petri contendo a amostra no centro do palco. Levante o estágio e baixe o objetivo de imersão de glicerol de 10x no glicerol no reservatório superior do aparelho amostral. Certifique-se de que a amostra está em foco olhando para a borda da amostra usando as oculares.
  8. Mude da visão da ocular para a visão da câmera no computador clicando no botão ao vivo.
    1. Defina os parâmetros X e Y localizando primeiro a parte mais larga da amostra de tecido, que deve estar na parte inferior da placa de Petri.
    2. Clique em ND Aquisição e multiponto personalizado. Crie vários pontos encontrando primeiro o meio da amostra de tecido usando o joystick para varrer da esquerda para a direita e de cima para baixo.
    3. Em seguida, com base no tamanho do tecido, determine o tamanho do revestimento necessário (tipicamente 6 x 5 para um coração de rato de 6 a 8 semanas). Faça isso executando imagens de teste capturando apenas parâmetros X e Y (desmarcar z sob a guia ND Acquisition) para verificar se todo o comprimento e largura do tecido foram capturados.
  9. Para definir os parâmetros z, abra a navegação XYZe clique nos ícones para cima e para baixo até encontrar a parte superior e inferior da amostra.
    1. Abra o painel de correção de intensidade Z e ajuste a fluorescência na parte superior, média e inferior do tecido para corrigir a densidade tecidual aumentando ou diminuindo a potência do laser em cada ponto z. Defina-os clicando na seta definida à direita do painel de correção de intensidade Z.
    2. Defina o tamanho da etapa Z no painel ND Acquisition para 5 μm.
  10. Depois que os parâmetros X, Y e Z do coração forem delineados e a correção de intensidade z for definida, use o microscópio vertical automatizado com um objetivo de imersão de 10x glicerol com um scanner ressonante e tubos de fosfato de arsifídeo de gálio (PMTs GaAsP) para imagem dos corações limpos. Certifique-se de que as guias XY e Z sejam verificadas sob aquisição de NDe pressione a correção do Run Z.
  11. Costurar, desmixar e denoizar as imagens resultantes abrindo a imagem de vários pontos no software de processamento e clicando no botão de ponto. Na imagem,clique em blind unmixing, 2 canal, e depois encontre. e Na imagem, clique em denoise.ai, em seguida, clique no canal fluorescente de escolha (ou seja, GFP).
    NOTA: Este processo resulta em uma imagem 3D de fibroblastos GFP positivos em todo o ventrículo esquerdo.
  12. Use software de análise secundária para identificar ainda mais padrões e tendências na dispersão de fibroblastos cardíacos. Use a função Spots executando o programa de assistente de pontos.

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Representative Results

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Os fibroblastos cardíacos são essenciais para a função de base do coração, bem como para a resposta à lesão cardíaca. Tentativas anteriores de entender o arranjo e a morfologia dessas células foram conduzidas em grande parte em configurações 2D. No entanto, foi publicada uma técnica de limpeza de tecido cardíaco refinado(Figura 2) e 3D, que permite a visualização avançada e mais detalhada de fibroblastos cardíacos. Com esta técnica de imagem, os fibroblastos foram encontrados densamente embalados e com uma morfologia espinhosa em corações ilesos(Figura 3, Vídeos Suplementares S1-4).

Após a limpeza do tecido ventricular esquerdo ter sido realizada em um coração ileso, o protocolo foi aplicado a vários modelos de lesões para examinar como este protocolo de limpeza se sairia ao estudar tecido cardíaco ferido. Os camundongos foram submetidos à lesão de I/R por fechamento temporário da artéria coronária esquerda (LCA) por 1h seguido de reperfusão com duração de 3, 7, 14 ou 28 dias. Esses experimentos mostraram que houve perda de fibroblastos cardíacos na região isquêmica logo após a lesão de I/R, mas que no dia 7 e dia 14, os fibroblastos migraram ou proliferaram para repovoar essa área do coração ferido. Até o dia 28, a população de fibroblasto cardíaco em torno das áreas feridas do coração estava em sua maior densidade(Figura 4, Vídeos Suplementares S5-8).

Lesão mi é um modelo cirúrgico resultante da ligadura LCA permanente (sem reperfusão). Os corações submetidos à cirurgia de MI foram extirpados em 1,5 e 3 dias após a cirurgia para fixação, compensação e análise. Havia pouquíssimos fibroblastos remanescentes no ventrículo esquerdo lesionado em 1,5 dias após a cirurgia(Figura 5A, Vídeo Suplementar S9). No entanto, até o dia 3, os fibroblastos se expandiram e estiveram presentes na maior parte do ventrículo esquerdo, exceto em uma pequena região, presumivelmente tendo migrado e/ou proliferado de uma população na zona de fronteira(Figura 5B, Vídeo Suplementar S10). Mais uma vez, o software de análise foi utilizado para melhor visualizar a localização do fibroblasto, e áreas de perda de fibroblastos cardíacos foram delineadas em laranja(Figura 5). Esta análise mostrou melhor a perda inicial de células no dia 1,5 após o MI e como os fibroblastos proliferaram ou migraram para aquela área danificada até o dia 3 para reparar ostensivamente a área e formar uma cicatriz.

Além da lesão isquêmica, a reação de fibroblastos cardíacos à pressão alta não é bem compreendida. Para descobrir a resposta dessas células à pressão alta, angiotensina II e fenilefrina foram administradas. Angiotensina II e fenilefrina (Ang/PE) são drogas que causam pressão alta persistente e ativação de fibroblasto cardíaco com áreas de fibrose intersticiais, confirmadas através da aplicação deste protocolo de limpeza tecidual aos corações tratados ang/PE(Figura 6A)5,28. Em contraste com a cirurgia isquêmica, a infusão de Ang/PE ao longo de várias semanas não resulta na perda de tecido cardíaco e afinamento da parede. Em vez disso, observou-se um resultado diferente no comportamento do fibroblasto após esta lesão.

À medida que o coração bombeia, o miocárdio gira, seguindo um padrão de hélice destro29,30,31. No modelo de lesão ang/pe, os fibroblastos alinhados ao longo do eixo deste padrão de contração de hélice destro utilizando o protocolo de limpeza de tecido refinado(Figura 6B). A hipótese para explicar esse comportamento é que os fibroblastos cardíacos estavam sentindo a direção da tensão da parede ventricular e alinhando-se dentro dos miofibers para fornecer o maior suporte dentro do ECM à medida que a resposta fibrosa se desenrolava agudamente durante a infusão agonista(Figura 7). Outro achado interessante foi que os fibroblastos pareciam pequenos e arredondados, ao contrário da forma de fuso vista em modelos de lesão de I/R e MI(Figura 6, Vídeo Suplementar S11).

Figure 1
Figura 1: Ratos e materiais usados para limpar corações.
(A) Esquema de estratégia de reprodução para camundongos Tcf21-MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP utilizados para limpeza de tecidos. (B) Linha do tempo do tratamento de tamoxifen e cirurgia realizada em camundongos. Ratos ilesos sacrificados no dia 14. (C) 3-D impresso bem para segurar o tecido cardíaco selado a uma placa de petri de vidro com graxa de vácuo. (D) Adição de uma graxa de vácuo de deslizamento redondo selada na parte superior do poço impresso em 3D bem definido na parte superior do poço inferior. (E) Tecido limpou o coração no poço inferior do aparelho de retenção de tecido, preenchido com solução de correspondência de índice refrativo (RIMS). Deslizamento de cobertura (como em D) e peça de poço impresso 3D superior colocada sobre o componente inferior do reservatório impresso em 3D, contendo tecido cardíaco limpo. Glicerol é adicionado ao reservatório superior para microscopia de imersão de glicerol. Barras de escala = 1 cm. As plantas do reservatório podem ser encontradas na Figura Suplementar 1. Abreviação: eGFP = proteína fluorescente verde aprimorada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Aparência visual dos estágios de limpeza do tecido cardíaco.
(A) Da esquerda para a direita: ventrículo esquerdo não claro, ventrículo esquerdo eletroforeseado, ventrículo esquerdo eletroforosado tratado com crosslinker, ventrículo esquerdo eletroforosado tratado com crosslinker e incubado em RIMS. (B) Não clareou e limpou o coração inteiro do rato. (C) Esquerda: sem ferimentos, ventrículo esquerdo não descoberto. Ileso, liberado ventrículo esquerdo. (D) Esquerda: MI não claramente ferido ventrículo esquerdo. Direito: I.I ferido ferido ventrículo esquerdo. Barras de escala = 0,5 cm. Abreviação: MI = infarto do miocárdio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Eficácia do novo método de compensação para corações limpos ilesos e operados por vergonha.
Desmatado (A) uninjured (barra de escala = 400 μm) e (B) corações operados por sham (barra de escala = 500 μm) com fibroblastos Tcf21mcm x Rosa26eGFP (verde) e áreas pseudocoloridas de fluorescência aumentada (roxo) mostrando localização de fibroblastos. Vídeos que mostram vídeos de fibroblasto podem ser encontrados em Vídeos Suplementares S1-2. Imagens está quietas mostram limpeza de fundo e manutenção de fluorescência fibroblasto-endógena (verde). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Atenuação da perda de fibroblastos em isquemia/reperfusão-lesionados esvaziou corações ao longo do tempo.
Tecido cardíaco limpo dos pontos de tempo indicados de I/R com fibroblastos Tcf21MerMer (mcm) x Rosa26eGFP (verde), áreas pseudocoloridas de fluorescência aumentada (roxo) mostrando localização de fibroblastos, e áreas de delineamento laranja desprovidas de fibroblastos. Primeira fila: imagens de ventrículos esquerdos de I/R-lesionados esvaziaram corações. Linha inferior: imagens paradas de ventrículos esquerdos de I/R-lesionados esvaziaram corações com manchas de Imaris funcionadas para ver padrões de fibroblasto mais facilmente em todo o ventrículo esquerdo. Vídeos de corações limpos com lesões de I/R mostrando não apenas a padronização bruta de fibroblastos, mas também imagens claras de fibroblastos individuais e suas morfologias podem ser encontradas em Vídeos Suplementares S5-8. Barras de escala = 500 μm. Abreviação: I/R = isquemia/reperfusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Atenuação da perda de fibroblastos cardíacos após lesão no infarto do miocárdio lesionados esvaziou corações ao longo do tempo.
Tecido cardíaco limpo de corações MI com fibroblastos Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP (verde), áreas pseudocoloridas de fluorescência aumentada (roxo) mostrando localização de fibroblastos, e áreas de delineamento laranja desprovidas de fibroblastos. Linha superior: Imagens de tecido limpo ventrículos esquerdos de corações mi-lesionados (verde). Linha inferior: imagens paradas de ventrículos esquerdos limpos de corações mi-lesionados (verde) com manchas de Imaris função (roxo) sobrepostos para mostrar distribuição grosseira de fibroblasto. Vídeos de ventrículos esquerdos limpos de tecido de corações lesados pelo MI mostram arranjo de fibroblasto bruto no coração, bem como o posicionamento e morfologia de fibroblastos individuais neste modelo in vivo 3D(vídeos suplementares S7-8). Barras de escala: 1,5 dia = 1000 μm, 3 dias = 700 μm. Abreviação: MI = infarto do miocárdio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Tecido limpo dos corações tratados com Angiotensin/Fenilefrina.
(A) Esquema mostrando como as bombas de Angiotensina/Fenilefrina são usadas para administrar medicamentos durante um período de duas semanas após a ativação do tamoxifen de Tcf21MCM x eGFP. (B) Imagem parada, imagem parada + manchas de Imaris, e vídeo mostrando organização do fibroblasto e morfologia em corações tratados com Ang/PE(Vídeo Suplementar S11) Barras de escala = 500 μm. Abreviaturas: Ang/PE = angiotensina II/fenilefrina; eGFP = proteína fluorescente verde aprimorada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Imagens representativas do padrão de fibroblasto observado em corações tratados com Angiotensin/Fenilefrina.
(A, C, e D): Imagens do padrão de torção de hélice destro dos fibroblastos a partir da perspectiva do exterior do ventrículo. (B) Imagem de padronização do fibroblasto a partir da perspectiva do interior do ventrículo. Setas destacam grupos lineares de fibroblastos que compõem o padrão de torção. Barras de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: renderizações 2D de aparelhos de reservatório de imagem. (A) Renderização 2D da metade inferior do reservatório de imagem. Este reservatório está selado na placa de Petri com graxa de vácuo. O coração é colocado na abertura central e submerso em RIMS. (B) Renderização 2D da metade superior do reservatório de imagem. A mancha de vidro é aderida ao fundo plano desta peça com graxa de vácuo. Isto é gentilmente colocado em cima do reservatório inferior. O reservatório superior pode então ser preenchido com glicerol para imagem. Unidades em mm. Abreviaturas: 2D = bidimensional; RIMS: Solução de correspondência de índices refrativos. Clique aqui para baixar este número.

Vídeo S1: Tecido ileso limpou o coração. Os fibroblastos cardíacos (verdes) em um ventrículo esquerdo ileso eram pequenos, e muitos foram arredondados com não mais do que duas projeções celulares. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo S2: Tecido falso limpou o coração. Os fibroblastos cardíacos (verdes) no ventrículo esquerdo de um coração de rato operado por farsa eram pequenos e, principalmente, redondos com poucas projeções, semelhante ao que era visto em corações ilesos. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo S3: Visão detalhada do fibroblasto através da parede ventricular de um coração ileso. Este vídeo começa na parede ventricular interior e se aproxima do exterior do coração. Os fibroblastos cardíacos (verdes) foram mostrados em detalhes e foram observados corpos celulares arredondados ou ligeiramente alongados com não mais do que duas projeções celulares. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo S4: Vista detalhada da seção da parede ventricular esquerda do coração ileso. Esta seção ~300-μm-wide do coração do rato não ferido limpo mostra o arranjo 3D de fibroblastos cardíacos (verde) e suas morfologias em detalhes. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo S5: Liberado ventrículo esquerdo de 3 dias I/R. A visão detalhada do ventrículo esquerdo mostrou que após a lesão de I/R, há uma área de perda de fibroblasto cardíaco. Também foi evidente que os fibroblastos (verde) desenvolveram uma forma muito mais alongada nesta condição ferida em comparação com as morfologias mais arredondadas vistas em corações não feridos e falsos. Abreviação: I/R = isquemia/reperfusão. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo S6: Liberado ventrículo esquerdo de 7 dias I/R. A visão detalhada do ventrículo esquerdo mostra que, 7 dias após a lesão de I/R, a área sem fibroblastos era menor do que a vista no dia 3 após a lesão de I/R. Havia mais fibroblastos (verdes) presentes, e curiosamente, novas morfologias celulares estavam presentes. Especificamente, alguns fibroblastos tinham corpos celulares arredondados com múltiplas saliências, potencialmente indicando um novo ou desenvolvido papel de fibroblastos neste ambiente. Abreviação: I/R = isquemia/reperfusão. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo S7: Limpo ventrículo esquerdo de 14 dias I/R. A visão detalhada do ventrículo esquerdo mostrou que ainda havia uma área central para a parede ventricular que tinha muito poucos fibroblastos, mas fibroblastos (verdes) na periferia deste vazio mantiveram a morfologia altamente alongada vista no dia 7 amostras pós-I/R. Curiosamente, os poucos fibroblastos que estavam presentes na região ferida tinham uma morfologia como essa em corações ilesos — pequenos e arredondados. Abreviação: I/R = isquemia/reperfusão. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo S8: Limpo ventrículo esquerdo de 28 dias I/R. A visão detalhada dos fibroblastos cardíacos (verde) no dia 28 após a lesão de I/R mostrou que havia uma pequena área na região ferida que não tinha fibroblastos. Observou-se também que havia uma região de alta densidade de fibroblasto em torno desta região, e que as morfologias nesta área densa eram altamente alongadas. Abreviação: I/R = isquemia/reperfusão. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo S9: Liberado ventrículo esquerdo de 1,5 dia MI. Havia muito poucos fibroblastos cardíacos (verdes) remanescentes no ventrículo esquerdo ferido em 1,5 dias após o MI, morte por fibroblasto cardíaco em toda esta região do ventrículo. Abreviação: MI = infarto do miocárdio. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo S10: Liberado ventrículo esquerdo de 3 dias MI. Havia uma grande área desprovida de fibroblastos cardíacos 3 dias após o MI, mas alguns fibroblastos cardíacos (verdes) re-apareceram no ventrículo, ao contrário dos resultados encontrados após 1,5 dias de MI. Além disso, os perfis de morfologia do fibroblasto cardíaco foram diferentes dos observados em corações lesionados de I/R. Aqui os fibroblastos foram alongados, mas havia outros que tinham corpos celulares arredondados (maiores do que aqueles vistos em corações ilesos) e uma subpopulação destes tinha muitas projeções celulares. Abreviaturas: MI = infarto do miocárdio; I/R = isquemia/reperfusão. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo S11: Ventrículo esquerdo limpo de ratos tratados com Ang/PE. Não houve perda aparente de fibroblastos cardíacos (verdes) após o tratamento de Ang/PE. No entanto, os fibroblastos cardíacos eram em sua maioria pequenos e arredondados ou pequenos e alongados e pareciam estar alinhados com os padrões conjunturais do coração. Abreviação: Ang/PE = angiotensina II/fenilefrina. Clique aqui para baixar este vídeo.

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Discussion

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Este artigo apresenta um método refinado de limpeza tecidual que permite a visualização de fibroblastos cardíacos in vivo, tanto na linha de base quanto na lesão seguinte, para caracterizar e entender melhor os fibroblastos no coração do camundongo. Este protocolo aprimorado aborda limitações nos protocolos de limpeza de tecidos existentes que tentaram identificar tipos de células específicas no coração adulto ou neonatal12,13,14,16,17,20. Nas tentativas iniciais de limpar o coração do camundongo, utilizou-se a técnica de CLARI ESCLARECIMENTO passivo, na qual o coração foi deixado em um tampão de compensação em um nutador por aproximadamente 1 semana para permitir a distribuição passiva do tampão em todo o tecido15,18. Este processo só produziu uma compensação de aproximadamente 80 μm de profundidade no tecido (dados não mostrados), o que é consistente com observações anteriores pelas quais várias semanas foram necessárias para limpar um coração de camundongo neonatal de 1 dia de idade13. A CLARIDADE ativa usando um sistema de eletroforese ativa permitiu uma limpeza mais profunda através de toda a parede ventricular, aproximadamente de 700 μm-1 mm de profundidade, em um período de tempo mais curto12,18.

No entanto, o uso deste protocolo de CLARITY ativo publicado anteriormente levou à perda de fluorescência fibroblasto com altos níveis de autofluorescência tecidual, que haviam sido previamente observados como tendo ocorrido na CLARIDADE ativa por Kolesova et al.12. Para permitir a manutenção da fluorescência do fibroblasto, o protocolo de fixação adequado foi considerado de extrema importância. Muito aquém de um processo de fixação causou perda de fluorescência durante a eletroforese. Muito tempo de um processo de fixação causou perda de fluorescência em si. Portanto, a fixação noturna a 4 °C em 4% de PFA foi considerada ótima. Para amenizar a questão da fluorescência de fundo, foi empregado um mergulho de descoloração (princípio emprestado do método CUBIC de compensação) para reduzir a vinculação de hema dentro da mioglobina e, portanto, reduzir a autofluorescência causada por este cromoforohore18. O tratamento de descolorização resultou em uma limpeza mais robusta da fluorescência de fundo, com manutenção da fluorescência repórter para que os fibroblastos rotulados fossem mais pronunciados(Figura 2A).

Finalmente, para permitir a transparência óptica total, o tecido foi equilibrado na Solução de Correspondência de Índices Refrativos (RIMS) (Figura 2B-D). Ao combinar o índice refrativo do tecido com seu entorno, isso aumentou a transparência óptica do tecido, permitindo imagens mais profundas. A varredura ressonante de alta velocidade foi então usada para o tecido de imagem, pois é mais rápido do que a varredura galvanométrica. Como os corações do mouse são tamanhos ligeiramente diferentes, parâmetros individuais de imagem XY e correções de intensidade Z foram definidos. Com esses parâmetros, foi possível visualizar através do coração ileso visualizar fibroblastos fluorescentes em aproximadamente 4 h(Figura 3). A qualidade da imagem foi melhorada no processamento pós-imagem usando o software de análise descomprida e denoizante para reduzir o fundo e esclarecer a fluorescência presente na imagem. Além disso, foi utilizado software de análise secundária para destacar a localização de fibroblastos fluorescentes. Esta análise pós-imagem foi utilizada para anotar claramente os fibroblastos cardíacos, eliminando voxel-by-voxel de fundo(Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6).

Este protocolo de CLARIDADE otimizado foi aplicado para limpar opticamente corações feridos e ilesos. Isso permite uma melhor compreensão da reação dos fibroblastos cardíacos à lesão. Essas lesões incluíram um curso de tempo de MI e I/R, bem como dosagem de Ang/PE. Como a lesão isquêmica enfraquece o tecido cardíaco, é fundamental que seja tomado maior cuidado durante a eletroforese para manter a integridade tecidual. De fato, tanto para lesão de I/R quanto para MI, é necessário um período mais curto de eletroforese (≤1,5 h)32. Estudos anteriores não consideraram os efeitos da lesão no processo de limpeza tecidual. O protocolo recém-otimizado apresentado aqui acomoda-se para lesões, permitindo a limpeza sem maior destruição do tecido.

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Disclosures

Os autores não têm nenhuma divulgação relacionada ao conteúdo deste manuscrito.

Acknowledgments

Os autores gostariam de reconhecer o CCHMC Confocal Imaging Core por sua assistência e orientação no desenvolvimento deste modelo, bem como Matt Batie da Clinical Engineering para o projeto de todas as peças impressas em 3D. Demetria Fischesser foi apoiada por uma bolsa de treinamento dos Institutos Nacionais de Saúde, (NHLBI, T32 HL125204) e Jeffery D. Molkentin foi apoiado pelo Howard Hughes Medical Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 braided silk Ethicon K871H
8-0 prolene Ethicon 8730H
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140
Angiotensin II Sigma A9525-50G
Artificial Tear Ointment Covetrus 048272
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) Millipore Sigma D27802-25G
GLUture topical tissue adhesive World Precision Instruments 503763
Heparin Sigma H0777
Imaris Start Analysis Software Oxford Instruments N/A
Micro-osmotic pumps Alzet Model 1002
Nikon Elements Analysis Software Nikon N/A
Nikon A1R HD upright microscope Nikon N/A
Normal autoclaved chow Labdiet 5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,
N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide
CosmoBio AXS-1002424
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Phenylephrine Hydrochloride Sigma P6126-10G
Photoinitiator Wako Chemicals VA-044
Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] Jackson Laboratories Jax Stock No:012429
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002-5G
Sodium Chloride solution Hospira, Inc. NDC 0409-4888-10
Tamoxifen Sigma Aldrich T5648
Tamoxifen food Envigo TD.130860
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent Millipore Sigma 122262-1L
X-Clarity electrophoretic clearing chamber Logos Biosystems C30001
X-Clarity electrophoretic clearing solution Logos Biosystems C13001
X-Clarity electrophoresis tissue basket Logos Biosystems C12001
X-Clarity electrophoresis tissue basket holder Logos Biosystems C12002

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References

  1. Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73, (18), 2267-2282 (2019).
  2. Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51, (12), 1-9 (2019).
  3. Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
  4. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80, (11), 2269-2276 (2016).
  5. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128, (5), 2127-2143 (2018).
  6. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  7. Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6, (11), 1601434 (2017).
  8. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, (22), 4267-4278 (2014).
  9. Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14, (8), 0220573 (2019).
  10. Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3, (10), 00406 (2017).
  11. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  12. Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146, (2), 141-152 (2016).
  13. Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
  14. Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9, (2), 423-436 (2018).
  15. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, (4), 945-958 (2014).
  16. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, (7), 0182072 (2017).
  17. Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188 (2017).
  18. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  19. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  20. Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7, (9), 3716-3720 (2016).
  21. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47, (2), 107-114 (2009).
  22. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50, (5), 600-613 (2011).
  23. Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292, (6), 2944-2951 (2007).
  24. Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269, (6), 2147-2154 (1995).
  25. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286, (3), 1201-1207 (2004).
  26. Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274, (5), 1812-1820 (1998).
  27. Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45, (2), 330-338 (2000).
  28. Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
  29. Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1, (3), 366-376 (2008).
  30. Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
  31. Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145, (4), 868-875 (1994).
  32. Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).
Clareza refinada baseada em clareza para organização de fibroblasto tridimensional em corações de rato saudáveis e feridos
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Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).More

Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).

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