Clareza refinada baseada em clareza para organização de fibroblasto tridimensional em corações de rato saudáveis e feridos
Summary
Um método refinado de limpeza tecidual foi desenvolvido e aplicado ao coração do rato adulto. Este método foi projetado para limpar tecido cardíaco denso e autofluorescente, mantendo a fluorescência do fibroblasto rotulada atribuída a uma estratégia de repórter genético.
Abstract
A doença cardiovascular é a causa mais prevalente de mortalidade em todo o mundo e é frequentemente marcada pelo aumento da fibrose cardíaca que pode levar ao aumento da rigidez ventricular com função cardíaca alterada. Esse aumento da fibrose ventricular cardíaca deve-se à ativação de fibroblastos residentes, embora a forma como essas células operam dentro do coração tridimensional (3D), na linha de base ou após a ativação, não seja bem compreendida. Para examinar como os fibroblastos contribuem para doenças cardíacas e sua dinâmica no coração 3D, foi desenvolvido um refinado método de limpeza e imagem de tecido baseado em CLARITY que mostra fibroblastos cardíacos fluorescentes rotulados dentro de todo o coração do camundongo. Os fibroblastos residentes em tecidos foram geneticamente rotulados usando ratos repórteres florescentes Rosa26-loxP-eGFP cruzados com o fibroblasto cardíaco expressando linha de knock-in Tcf21-MerCreMer. Esta técnica foi utilizada para observar a dinâmica de localização do fibroblasto em todo o ventrículo esquerdo adulto em camundongos saudáveis e em modelos de camundongos fibrosos de doenças cardíacas. Curiosamente, em um modelo de lesão, foram observados padrões únicos de fibroblastos cardíacos no coração do rato ferido que se seguiu a faixas de fibras embrulhadas na direção contraltil. Nos modelos de lesão isquêmica, ocorreu a morte do fibroblasto, seguida de repopulação da zona de fronteira infarto. Coletivamente, esta técnica de esclarecimento de tecido cardíaco refinado e sistema de imagem digitalizada permite a visualização 3D de fibroblastos cardíacos no coração sem as limitações da falha de penetração de anticorpos ou questões anteriores em torno da fluorescência perdida devido ao processamento tecidual.
Introduction
Embora os cardiomiócitos compõem a maior fração de volume do coração, os fibroblastos cardíacos são mais abundantes e estão criticamente envolvidos na regulação das características estruturais e reparadoras da linha de base deste órgão. Os fibroblastos cardíacos são altamente móveis, mecanicamente responsivos e fenotipicamente variando dependendo da extensão de sua ativação. Os fibroblastos cardíacos são necessários para manter os níveis normais de matriz extracelular (ECM), e a produção muito pequena ou muito de ECM por essas células pode levar à doença1,2,3. Dada a sua importância na doença, os fibroblastos cardíacos tornaram-se um tema de investigação cada vez mais importante para identificar novas estratégias de tratamento, especialmente na tentativa de limitar a fibrose excessiva4,5,6,7. Após a lesão, os fibroblastos ativam e diferenciam-se em um tipo de célula mais sintética conhecida como myofibroblast, que pode ser proliferativa e segregar eCM abundante, bem como ter atividade contraível que ajuda a remodelar os ventrículos.
Enquanto os fibroblastos cardíacos têm sido amplamente avaliados por suas propriedades nas culturas 2D6,8,9,10, muito menos se entende de suas propriedades e dinâmicas no coração vivo 3D, seja na linha de base ou com estimulação da doença. Aqui, um método refinado foi descrito para limpar o coração do camundongo adulto, mantendo a fluorescência de fibroblastos rotulados com um sistema de repórter genético Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. Dentro do coração, Tcf21 é um marcador relativamente específico de fibroblastos quiescentes4. Depois que o tamoxifen é dado para ativar a proteína MerCreMer indutível, essencialmente todos os fibroblastos quiescentes expressarão permanentemente proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP) do lócus Rosa26, o que permite seu rastreamento in vivo.
Existem inúmeros protocolos de limpeza tecidual bem estabelecidos, alguns dos quais foram aplicados ao coração11,12,13,14,15,16,17. No entanto, muitos dos reagentes usados em diferentes protocolos de limpeza de tecidos foram encontrados para saciar sinais de fluorescência endógena18. Além disso, o coração adulto é difícil de limpar devido às abundantes proteínas contendo grupo de heme que geram autofluorescência19. Portanto, o objetivo deste protocolo foi preservar a fluorescência do marcador fibroblasto com a inibição simultânea da autofluorescência de heme no coração adulto ferido para visualização 3D ideal in vivo12,13,14,16,17,20.
Estudos anteriores que tentavam examinar o fibroblasto cardíaco in vivo empregavam anticorpos perfumados para rotular essas células, embora tais estudos tenham sido limitados pela penetração de anticorpos e estrutura vascular cardíaca14,16,17,20. Embora Salamon et al. tenham mostrado clareamento tecidual com manutenção de fluorescência neuronal tópica no coração neonatal, e Nehrhoff et al. mostraram manutenção da fluorescência marcando células mielóides, a manutenção da fluorescência endógena por toda a parede ventricular ainda não foi demonstrada, incluindo a visualização de fibroblastos cardíacos adultos na linha de base ou após lesão13,20. Este protocolo de limpeza tecidual refina uma mistura de protocolos anteriores com base no método CLARITY (sistema de solvente rígido híbridoizado por lipídida-lipídida (PEG) e sistema solvente associado ao PEGASOS (sistema solvente associado ao FIL). Este protocolo refinado permitiu um exame mais robusto de fibroblastos cardíacos no coração do camundongo na linha de base e de como eles respondem a diferentes tipos de lesões. O protocolo é simples e reproduzível e ajudará a caracterizar o comportamento dos fibroblastos cardíacos in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo apresenta um método refinado de limpeza tecidual que permite a visualização de fibroblastos cardíacos in vivo, tanto na linha de base quanto na lesão seguinte, para caracterizar e entender melhor os fibroblastos no coração do camundongo. Este protocolo aprimorado aborda limitações nos protocolos de limpeza de tecidos existentes que tentaram identificar tipos de células específicas no coração adulto ou neonatal12,13,<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de reconhecer o CCHMC Confocal Imaging Core por sua assistência e orientação no desenvolvimento deste modelo, bem como Matt Batie da Clinical Engineering para o projeto de todas as peças impressas em 3D. Demetria Fischesser foi apoiada por uma bolsa de treinamento dos Institutos Nacionais de Saúde, (NHLBI, T32 HL125204) e Jeffery D. Molkentin foi apoiado pelo Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| 4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
| 8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
| Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
| Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
| DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
| GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
| Heparin | Sigma | H0777 | |
| Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
| Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
| Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
| Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
| Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
| Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
| Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
| Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
| X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
| X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |
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