Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Усовершенствованная очистка тканей на основе CLARITY для трехмерной организации фибробластов в здоровых и поврежденных сердцах мышей

doi: 10.3791/62023 Published: May 16, 2021

Summary

Усовершенствованный метод очистки тканей был разработан и применен к сердцу взрослой мыши. Этот метод был разработан для очистки плотной, аутофлуоресцентной сердечной ткани, сохраняя при этом меченую флуоресценцию фибробластов, приписываемую стратегии генетического репортера.

Abstract

Сердечно-сосудистые заболевания являются наиболее распространенной причиной смертности во всем мире и часто отмечаются повышенным сердечным фиброзом, который может привести к увеличению жесткости желудочков с измененной сердечной функцией. Это увеличение фиброза сердечных желудочков связано с активацией резидентных фибробластов, хотя то, как эти клетки работают в 3-мерном (3-D) сердце, на исходном уровне или после активации, не совсем понятно. Чтобы изучить, как фибробласты способствуют сердечным заболеваниям и их динамике в 3-D сердце, был разработан усовершенствованный метод очистки и визуализации тканей на основе CLARITY, который показывает флуоресцентно меченые сердечные фибробласты во всем сердце мыши. Тканевые резидентные фибробласты были генетически мечеными с использованием флуоресцентных мышей Rosa26-loxP-eGFP, скрещенным с сердечным фибробластом, экспрессирующим Tcf21-MerCreMer. Этот метод был использован для наблюдения динамики локализации фибробластов по всему левому желудочку взрослого человека у здоровых мышей и у фиброзных мышиных моделей сердечных заболеваний. Интересно, что в одной модели травмы уникальные паттерны сердечных фибробластов наблюдались в поврежденном сердце мыши, которые следовали за полосами обернутых волокон в сократительном направлении. В моделях ишемического повреждения произошла гибель фибробластов с последующей репопуляцией из пограничной зоны инфаркта. В совокупности этот усовершенствованный метод осветления сердечной ткани и оцифрованная система визуализации позволяют проводить 3-D визуализацию сердечных фибробластов в сердце без ограничений недостаточности проникновения антител или предыдущих проблем, связанных с потерей флуоресценции из-за обработки тканей.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Хотя кардиомиоциты составляют наибольшую объемную фракцию в сердце, сердечные фибробласты более многочисленны и критически участвуют в регулировании исходных структурных и репаративных особенностей этого органа. Сердечные фибробласты очень подвижны, механически чувствительны и фенотипически ранжируются в зависимости от степени их активации. Сердечные фибробласты необходимы для поддержания нормального уровня внеклеточного матрикса (ECM), и слишком мало или слишком много производства ECM этими клетками может привести к заболеванию1,2,3. Учитывая их важность в заболевании, сердечные фибробласты становятся все более важной темой исследований для выявления новых стратегий лечения, особенно в попытке ограничить чрезмерный фиброз4,5,6,7. При повреждении фибробласты активируются и дифференцируются в более синтетический тип клеток, известный как миофибробласт, который может быть пролиферативным и секретировать обильный ECM, а также иметь сократительную активность, которая помогает ремоделировать желудочки.

В то время как сердечные фибробласты были широко оценены на их свойства в 2-D культурах6,8,9,10,гораздо меньше понимаются их свойства и динамика в 3-D живом сердце, либо на исходном уровне, либо при стимуляции заболевания. Здесь был описан усовершенствованный метод очистки тканей сердца взрослой мыши при сохранении флуоресценции фибробластов, помеченных генетической репортерной системой Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. В сердце Tcf21 является относительно специфическим маркером покоя фибробластов4. После того, как тамоксифен дается для активации индуцируемого белка MerCreMer, по существу все покояющиеся фибробласты будут постоянно экспрессировать усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP) из локуса Rosa26, что позволяет отслеживать их in vivo.

Существует множество хорошо заясневших протоколов очистки тканей, некоторые из которых были применены к сердцу11,12,13,14,15,16,17. Однако было обнаружено, что многие из реагентов, используемых в различных протоколах очистки тканей, гасят эндогенные флуоресцентные сигналы18. Кроме того, сердце взрослого человека трудно очистить из-за обильных белков, содержащих гемовую группу, которые генерируют автофлуоресценцию19. Поэтому целью данного протокола было сохранение флуоресценции маркера фибробластов с одновременным ингибированием гемовой аутофлуоресценции в поврежденном сердце взрослого человека дляоптимальной 3-D визуализации in vivo12,13,14,16,17,20.

Предыдущие исследования, в которых предпринимались попытки изучить сердечный фибробласт in vivo, использовали перфузированные антитела для маркировки этих клеток, хотя такие исследования были ограничены проникновением антител и структурой сердечного сосуда14,16,17,20. Хотя Salamon et al. показали очистку тканей с поддержанием местной флуоресценции нейронов в сердце новорожденного, а Nehrhoff et al. показали поддержание флуоресценции, отмечающей миелоидные клетки, поддержание эндогенной флуоресценции через всю стенку желудочка еще не было продемонстрировано, включая визуализацию взрослых сердечных фибробластов на исходном уровне или после травмы13,20. Этот протокол очистки тканей уточняет смесь предыдущих протоколов, основанных на методе CLARITY (прозрачный липидообменный акриламид-гибридизированный жесткий imaging/immunostaining/in situ-гибридизация-совместимый тканевой гидрогель) и PEGASOS (полиэтиленгликоль(ПЭГ)-ассоциированная система растворителей). Этот усовершенствованный протокол позволил провести более надежное исследование сердечных фибробластов в сердце мыши на исходном уровне и того, как они реагируют на различные типы травм. Протокол прост и воспроизводим и поможет охарактеризовать поведение сердечных фибробластов in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все эксперименты с участием мышей были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинском центре детской больницы Цинциннати. Учреждение также сертифицировано AAALAC (Американская ассоциация по аккредитации по уходу за лабораторными животными). Мышей усыпляли через вывих шейки матки, а мышам, перенесшим хирургические процедуры выживания, давали облегчение боли (см. Ниже). Все методы, используемые для лечения боли и эвтаназии, основаны на рекомендациях Группы по эвтаназии Американской ветеринарной медицинской ассоциации. Все мыши были размещены в кукурузных початках с водой и пищей, доступными в любое время. Мышей размещали по 4 в клетке с тем же полом. Для операции или очистки неповреденных тканей использовалось равное количество 6-8-недельных самцов и самок мышей.

ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильные хирургические состояния поддерживались во всех операциях. Хирург переоделся в чистые скрабы и стерильный халат, а затем надел бахилы и сеть для волос. Затем хирург почистил руки хлоргексидином и надел стерильные хирургические перчатки. Хирургу помогал техник, который усыплял, брил и очищал место разреза 3 раза каждый, чередуя 2% хлоргексидина глюконата и 70% изопропанола. Затем мышей привезли к хирургу, и была проведена операция. Между животными инструменты стерилизовали в стерилизаторе из бисера.

1. Рекомбинация кре

  1. Скрещивает мыши Rosa26-loxP-eGFP (Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) с мышами Tcf21-MerCreMer(рисунок 1A)6,21.
  2. Когда потомство этого креста достигнет 6-недельного возраста, вводят внутрибрюшинную инъекцию 75 мг/кг тамоксифена, растворенного в кукурузном масле. 22 Вводят этот тамоксифен дважды, с расставленном 48 ч(рисунок 1B).
  3. После инъекций тамоксифена поместите мышей на диету из тамоксифена (~ 0,4 г / кг тамоксифена цитрата) в течение одной недели. После одной недели тамоксифен чау верните мышей к нормальной автоклавной диете чау в течение одной недели перед выполнением операции(рисунок 1B). Назначьте соответствующее количество мышей (3 на каждое хирургическое состояние), чтобы они не пострадали. Принесите в жертву этих мышей и приступайте к процессу очистки, описанному ниже, после одной недели нормальной диеты чау.
  4. Следуя режиму тамоксифена и рекомбинации, проводят хирургическое вмешательство.

2. Хирургические модели

  1. Ишемия/реперфузия (I/R)23,24
    1. Обезболивать мышей 1,5% газом изофлурана в воздухе помещения в вентилируемом боксе; побрить грудь и шею электрическими кусачками, а затем очистить бритые участки 2% мазком, пропитанным глюконатом хлоргексидина.
    2. Используйте искусственную слезную мазь для предотвращения сухости во время операции, помещая мазь на глаза у седалых мышей.
    3. Выполните разрез средней части шеи с помощью хирургических ножниц, чтобы обеспечить визуализацию трахеи. Интубировать катетером 20 г, поместив интубационную трубку в трахею и визуализируйте катетер трахеи через разрез средней шейки. Поместите мышей на вентилятор во время усыпления газом изофлураном (1,5%) в воздухе помещения.
    4. Сделайте разрез под левой передней конечностью хирургическими ножницами, а межреберные мышцы разрезают между ребрами 3 и 4. Разложите ребра открытыми с помощью втягиваятеля.
    5. Поместите небольшую губку, пропитанную физиологическим раствором, между легким и сердцем, чтобы предотвратить повреждение легкого.
    6. Используя иглу рыболовного крюка (6,5 мм, 3/8 c), обвяжите левую коронарную артерию с помощью съемного скользящего узла с помощью 8-0 пролен.
    7. Снимите губку с помощью щипцов.
    8. Зашивайте межребра, закрытые с помощью плетеного шелка 4-0 и непрерывного шва, а также экстериоризации конца 8-0 проленовый скользящий узел.
    9. Закройте разрезы кожи с помощью местного тканевого клея с торцевым торцевым выступом торцевого узла скольжения.
    10. После одного часа окклюзии потяните внешний конец скользящего узла, чтобы внутренне освободить окклюзию коронарной артерии, облегчив ишемию и вызвав реперфузию.
    11. Вводят 0,02 мл бупренорфина с пролоченным высвобождением 1 мг/мл через субдермальную инъекцию (высвобождение 72 ч) в качестве болеутоляющего средства и помещают мышей в насыщенную кислородом инкубационную камеру при 37 °C отдельно от других животных. Наблюдать за мышами, по крайней мере, каждые 15 минут, пока они не оправятся от анестезии и не смогут поддерживать стернальное или сидячее положение. Верните мышей в их обычное жилище.
    12. Оцените животных на боль и дистресс в течение 48 ч после операции и ежедневно контролируйте место разреза до полного заживления.
    13. Наблюдайте за мышами для гидратации, питания и общего самочувствия после операции до жертвоприношения.
  2. Инфаркт миокарда (ИМ)25,26,27
    1. Выполните шаги 2.1.1–2.1.7.
    2. Используйте непрерывный шов для закрытия межребра с помощью 4-0 плетеного шелка.
    3. Закройте разрез кожи с помощью местного тканевого клея.
    4. Выполните шаги 2.1.11–2.1.13.
  3. Ангиотензин II/фенилэфрин микроосмотическая инфузия насоса
    1. Приготовить приготовить 10 мкг/мкл рабочего раствора ангиотензина II и 500 мкг/мкл рабочего раствора фенилэфрина в стерильных условиях (т.е. в ламинарной проточной вытяжке) путем добавления 1 мг ангиотензина II к 100 мкл стерильного фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) и 250 мг гидрохлорида фенилэфрина в 500 мкл PBS.
    2. Рассчитайте разбавление каждого рабочего раствора и конечный объем для дозирования в микроосмотический насос на основе веса мыши.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для мыши размером 20 г требуется 20 г x 14 дней x 1,5 мкг/сут = 420 мкг ангиотензина или 42 мкл рабочего раствора, а также 20 г x 14 дней x 50 мкг/сут = 14000 мкг фенилэфрина гидрохлорида или 28 мкл рабочего раствора.
    3. Для веса каждой мыши разводят рабочий запас препарата в стерильном PBS и заполняют микроосмотические насосы (0,25 мкл/ч, 14 дней, примерно 100 мкл) с помощью иглы 27 г и шприца 1 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет генерировать скорость потока 1,5мкг∙г-1∙день-1 ангиотензина II и 50мкг∙г-1∙день-1 ∙день фенилэфрина гидрохлорида после размещения в мышах.
    4. Обезболивают мышей 1,5% вдыханием изофлурана (для эффекта) в вентилируемой камере, содержащей комнатный воздух.
    5. Поместите обезболенные мыши на стерильный хирургический стол в опиновом положении и поддерживайте анестезию с ингаляцией газообразного изофлурана (1,5%) через носовой конус.
    6. Используйте искусственную слезную мазь на глазах животного, чтобы предотвратить сухость во время операции.
    7. Сбрите мех над областью имплантации электрическими кусачками для волос и стерилизуйте область, которая будет подстрижена, используя этанол и стерильный тампон. Сделайте небольшой разрез (примерно 1 см) хирургическими ножницами в эпидермальном слое кожи мыши на правой боковой стороне спины, ниже лопатки. Используйте тусклые стороны пары хирургических ножниц, чтобы аккуратно растянуть кожу в области имплантации и вокруг нее, чтобы вставить мининасос.
    8. Поместите микроосмотический насос в разрез и физически маневрируйте слева от дорсальной средней линии мыши, вручную массируя насос под кожей.
    9. Закройте разрез непрерывным швом, используя шелк 4-0 с конусной точечной иглой.
    10. После имплантации насоса вводят бупренорфин с медленным высвобождением в дозе 0,1 мг/кг массы тела через поддермальную инъекцию для обезболивания (72-ч медленное высвобождение). Поместите мышей в инкубационную камеру с кислородом при 37 °C, отдельно от других животных. Контролируйте мышей, по крайней мере, каждые 15 минут, пока они не восстановятся после анестезии и не смогут поддерживать стернальное или сидячее положение.
    11. После восстановления после анестезии в согревающей камере при 37 °C поместите мышей обратно в их стандартные жилые блоки.
    12. Контролируйте мышей на боль и дистресс в течение 48 ч после операции и ежедневно контролируйте место разреза до полного заживления.
    13. Наблюдайте за мышами для гидратации, питания и общего самочувствия после операции до жертвоприношения.

3. Очистка сердец взрослых мышей с помощью модифицированного активного протокола CLARITY

  1. Подготовьте чистую хирургическую область, стерилизовав поверхность операции и все хирургические инструменты 70% этанолом. Готовят раствор из холодного 1x PBS и 4% параформальдегида (PFA) в PBS (по 100 мл каждый). Носите перчатки, лабораторное пальто, маску для лица и защиту глаз.
  2. Готовят гепариновый буфер путем разбавления 10 единиц гепарина в 0,9% мас./об.растворе натрия хлорида. Вводите каждой мыши внутрибрюшинно 60 мкл гепарина-NaCl с использованием шприца 1 мл и иглы 27 г.
  3. Через пять минут после инъекции раствора гепарина-NaCl обезболивают мышей, используя 1,5% ингаляцию изофлурана (для эффекта) в проветриваемой камере, содержащей комнатный воздух.
  4. Усыпляете мышей шейным вывихом, при котором затылок удерживается плоским, закрытым концом щипцов, в то время как позвоночный столб вывихивается путем вытягивания хвоста.
  5. Очистите вентральную поверхность мыши 70% этанолом на ватном тампоне. Сделайте поперечный разрез 3 см примерно на 3 см ниже кифоидного процесса с помощью хирургических ножниц.
  6. Отделите кожу от подлежащей ткани брюшной стенки, деглуцируя брюшную полость до кляпного отростка (держите кожу ближе всего к хвосту и тяните кожу, ближайшую к голове, вверх к грудной клетке). Сделайте поперечный разрез 2 см в подкожной ткани брюшной стенки на 3 см ниже кистевидного отростка с помощью хирургических ножниц. Сделайте вертикальный разрез из этого поперечного разреза, вверх по средней линии и через грудную клетку. Закрепить грудную клетку назад, обнажив сердце.
  7. Используйте иглу 27 г и шприц 10 мл для введения холодного PBS в верхнюю полую вену и аорту (любые позиционные манипуляции с сердцем следует делать осторожно тупыми щипцами, чтобы избежать прокола), чтобы очистить кровь от сердца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточная перфузия может быть отмечена по подергиванию хвоста и обесцвечиванию легких.
  8. Используйте иглу 27 г и шприц 10 мл для введения холодного 4% PFA в верхнюю полую вену и аорту, чтобы начать процесс фиксации.
  9. Высекаем сердца. Предсердия, правый желудочек и перегородка, а также левый желудочек должны быть разделены с помощью скальпеля с прямым лезвием. Поместите эту ткань в 15 мл центрифужную трубку, заполненную холодным 4% PFA, и поместите на нутритор при 4 °C на ночь.
  10. Промывайте сердце 3 раза в течение 1 ч каждый с холодным 1x PBS, чтобы удалить избыток PFA.
  11. Готовят гидрогель (названный A4P0 для относительной акриламидной/полиакриламидной композиции) путем смешивания следующих химических веществ в 15 мл центрифужной трубки: 10% 40% акриламида, 10% 1x PBS, 80% дистиллированной воды.
  12. Добавляют 0,25% раствор фотоинициатора (2,2-Азобис[2-(2-имидазолин-2ил)пропан)дигидрохлорид) в раствор гидрогеля непосредственно перед погружанием сердца в гидрогель.
  13. Поместите сердце в коническую трубку, содержащую гидрогель. Заверните коническую трубку в фольгу и высиживание в течение ночи при 4 °C без физического нарушения.
  14. Примерно через 14 ч при 4 °C переместите коническую трубку, содержащую сердце, в ванну с шариками 37 °C.
  15. Через 2,5 ч в бисероплетении аккуратно выньте сердце из гидрогеля щипцами.
  16. Промыть сердца 3 раза в течение 1 ч в конической трубке 15 мл, содержащей 1x PBS при 37 °C на нутаторе.
  17. Поместите сердечки в корзину активного аппарата электрофореза с помощью щипцов и поместите крышку на корзину. Убедитесь, что крышка надежно закреплена.
  18. Заполните резервуар активной камеры электрофореза раствором для электрофоретической очистки, налив раствор в камеру.
  19. Как только камера заполнена раствором для электрофоретической очистки, корзину, содержащую сердце, можно погрузить. Надежно поместите колпачок на аппарат для электрофореза.
  20. Запустите аппарат электрофореза при 1,5 А, 37 °C в течение 1,5 ч.
  21. После 1,5 ч электрофореза проверьте сердца визуально, чтобы убедиться, что не осталось непрозрачной ткани. Если области ткани все еще непрозрачны, повторно погружают сердце в раствор электрофореза в электрофоретическую камеру и продолжают электрофорез в течение 0,5 ч за раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Электрофорез следует прекратить при первых признаках повреждения тканей (таких как изнашивание тканей).
  22. Промыть сердца в конической пробирке по 15 мл, содержащей 1x PBS в течение 1 ч, 3 раза каждая, при 37 °C на нутаторе.
  23. Погрузите сердца в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую N,N,N', N'-тетракис(2-гидроксипропил)этилендиамин — обесцвечивающий агент, который уменьшает гемовуофлуоресценцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор следует менять каждые 24 ч, пока сердца не станут полностью чистыми (примерно 2 дня).
  24. Промыть сердца в конической трубке 15 мл с 1x PBS 3 раза по 1 ч каждая, чтобы удалить избыток обесцвечивающего агента.
  25. Готовят раствор для согласования показателей преломления (RIMS), комбинируя 30 мл 0,02 Мфосфатного буфера, 40 г 5-(N-2, 3-дигидроксипропилацетамидо)-2, 4, 6-три-йод-N,N'бис(2, 3 дигидроксипропил)изофталамида с перемешиванием (необходимо полностью растворить — это может занять до часа), 5 мг азида натрия, 50 мкл Tween20 и 1 г 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и отрегулируйте рН до 7,5.
  26. Уравновешиваем сердца в RIMS в течение 48 ч перед визуализацией.

4. Визуализация очищенных сердец с помощью вертикального однофотонного конфокального микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Аппарат для визуализации состоит из нижней половины стеклянной чашки Петри 10 см, 3D-печатного нижнего резервуара, круглого стеклянного покровного листа и 3D-печатного верхнего резервуара(рисунок 1C–E). 3D-печатные материалы были изготовлены на месте отделом клинической инженерии детской больницы Цинциннати.

  1. Используйте вакуумную смазку для герметизации 3D-печатного нижнего резервуара в стеклянную чашку Петри, положив тонкий слой вакуумной смазки на дно 3D-печатного куска(рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Резервуар должен иметь ту же высоту, что и образизуемый образец (т.е. образец не должен сжиматься стеклянным покровным слипом, помещенным поверх него, и образец также не должен иметь возможности плавать и перемещаться в резервуаре).
  2. Заполните резервуар RIMS и удалите все пузырьки наконечником пипетки. Поместите сердце в RIMS осторожно, повергнуть стенку левого желудочка вверх, следя за тем, чтобы в раствор не вводились пузырьки.
  3. Прикрепите стеклянную крышку к нижней поверхности 3D-печатного верхнего куска резервуара(дополнительный рисунок 1A)с использованием вакуумной смазки (опять же, путем размещения тонкого слоя вакуумной смазки на 3D-печатном куске и размещения его на крышке)(рисунок 1D).
  4. Поместите стеклянную крышку и верхний резервуар, закрывая стороной вниз, на нижний резервуар(Дополнительный рисунок 1B),без введения пузырьков. Адгезия между RIMS и скольжением крышки обеспечит уплотнение между верхней и нижней частями резервуара(рисунок 1E).
  5. Наполните верхний резервуар глицерином для использования с 10-кратным целью погружения глицерина.
  6. Используйте однофотонный микроскоп, оснащенный многофотонной конфокальной сканируемой головой, чтобы получить изображение очищенных сердец.
  7. Опустите ступень однофотонного микроскопа и поместите чашку Петри, содержащую образец, в центр сцены. Поднимите ступень и опустите 10-кратный цель погружения глицерина в глицерин в верхнем резервуаре аппарата для отбора проб. Убедитесь, что образец находится в фокусе, посмотрев на край образца с помощью окуляров.
  8. Переключитесь с вида окуляра на вид камеры на компьютере, нажав на кнопку live.
    1. Установите параметры X и Y, сначала расположив наиболее широкую часть образца ткани, которая должна находиться на дне чашки Петри.
    2. Нажмите на ND Acquisition и пользовательский многоточечный. Создайте многоточечные точки, сначала найдя середину образца ткани с помощью джойстика, чтобы провести слева направо и сверху вниз.
    3. Затем, основываясь на размере ткани, определите необходимый размер плитки (обычно 6 х 5 для сердца мыши 6-8-недельного ребенка). Сделайте это, запустив тестовую визуализацию, захватив только параметры X и Y (снимите флажок z на вкладке ND Acquisition),чтобы проверить, была ли захвачена вся длина и ширина ткани.
  9. Чтобы задать параметры z, откройте навигацию XYZи нажимайте на значки вверх и вниз, пока не найдите верхнюю и нижнюю части образца.
    1. Откройте панель коррекции интенсивности Z и отрегулируйте флуоресценцию в верхней, средней и нижней части ткани, чтобы скорректировать плотность ткани, увеличивая или уменьшая мощность лазера в каждой точке z. Установите их, щелкнув стрелку установки справа от панели коррекции интенсивности Z.
    2. Установите размер шага Z на панели ND Acquisition на 5 мкм.
  10. После того, как параметры X, Y и Z сердца очерчены и установлена коррекция z-интенсивности, используйте автоматизированный вертикальный микроскоп с 10-кратным глицериновым иммерсионным объективом с резонансным сканером и фотоумноживательными трубками из арсенида галлия (GaAsP PMT) для изображения очищенных сердец. Убедитесь, что вкладки XY и Z установлены в разделе Сбор ND,и нажмите кнопку Run Z correction.
  11. Сшивайте, размешивайте и обгружайте полученные изображения, открыв многоточечное изображение в программном обеспечении для обработки и нажав на кнопку стежка. Под изображениемнажмите на слепое размешивание, 2 канала,а затем найдите. и Под изображениемнажмите на denoise.ai,затем нажмите на флуоресцентный канал выбора (т. Е. GFP).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс приводит к 3D-изображению GFP-положительных фибробластов во всем левом желудочке.
  12. Используйте программное обеспечение для вторичного анализа для дальнейшего выявления закономерностей и тенденций дисперсии сердечных фибробластов. Используйте функцию Spots, запустив программу мастера spots.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Сердечные фибробласты необходимы для исходной функции сердца, а также для ответа на сердечную травму. Предыдущие попытки понять расположение и морфологию этих клеток проводились в основном в 2-D условиях. Тем не менее, была опубликована усовершенствованная техника очистки сердечнойткани (рисунок 2)и 3-D визуализации, которая позволяет проводить расширенную, более детальную визуализацию сердечных фибробластов. С помощью этого метода визуализации было обнаружено, что фибробласты плотно упакованы и имеют веретенообразный морфологию в неповрежденные сердца(рисунок 3, дополнительные видео S1-4).

После того, как очистка тканей левого желудочка была выполнена в неповрежденный сердце, протокол был применен к нескольким моделям травм, чтобы изучить, как этот протокол очистки будет работать при изучении поврежденной сердечной ткани. Мышей подвергали I/R повреждению путем временного закрытия левой коронарной артерии (LCA) в течение 1 ч с последующей реперфузией продолжительностью 3, 7, 14 или 28 дней. Эти эксперименты показали, что сразу после повреждения I/R произошла потеря сердечных фибробластов в ишемической области, но к 7-му и 14-му дню фибробласты мигрировали или размножились, чтобы повторно заселить эту область поврежденного сердца. К 28-му дню популяция сердечных фибробластов, окружающая поврежденные участки сердца, достигла наибольшей плотности(рисунок 4, дополнительные видео S5–8).

Травма ИМ является хирургической моделью, полученной в результате постоянной перевязки LCA (без реперфузии). Сердца, перенесшие операцию ИМ, были исечены через 1,5 и 3 дня после операции для фиксации, очистки и анализа. В поврежденном левом желудочке оставалось очень мало фибробластов через 1,5 дня после операции(рисунок 5A, дополнительное видео S9). Однако к 3-му дню фибробласты расширились и присутствовали в большей части левого желудочка, за исключением одной небольшой области, предположительно мигрировав и/или размножившись из популяции в пограничной зоне(рисунок 5B, дополнительное видео S10). Опять же, программное обеспечение для анализа было использовано для лучшей визуализации локализации фибробластов, а области потери сердечных фибробластов были выделены оранжевым цветом(рисунок 5). Этот анализ лучше показал первоначальную потерю клеток на 1,5-й день после ИМ и то, как фибробласты либо размножались, либо мигрировали в эту поврежденную область к 3-му дню, чтобы якобы восстановить область и сформировать рубец.

В дополнение к ишемическому повреждению, реакция сердечных фибробластов на высокое кровяное давление не совсем понятна. Чтобы обнаружить реакцию этих клеток на высокое кровяное давление, вводили ангиотензин II и фенилэфрин. Ангиотензин II и фенилэфрин (Ang /PE) являются препаратами, которые вызывают стойкое высокое кровяное давление и активацию фибробластов сердца с областями интерстициального фиброза, подтвержденные применением этого протокола очистки тканей к сердцам, обработанным ang / PE(Рисунок 6A)5,28. В отличие от ишемической хирургии, инфузия Ang/PE в течение нескольких недель не приводит к потере сердечной ткани и истончению стенки. Вместо этого наблюдался другой результат в поведении фибробластов после этой травмы.

По мере того, как сердце качается, миокард скручивается, следуя правосторонней схемеспирали 29,30,31. В модели повреждения Ang/PE фибробласты выровнены вдоль оси этой правосторонней схемы сокращения спирали с использованием усовершенствованной протокола очистки тканей(рисунок 6B). Гипотеза, объясняющая такое поведение, заключается в том, что сердечные фибробласты ощущали направление деформации стенки желудочков и выравнивались внутри миофиберов, чтобы обеспечить наибольшую поддержку в ECM, поскольку фиброзный ответ остро разворачивался во время инфузии агонистов(рисунок 7). Другим интересным открытием было то, что фибробласты казались маленькими и округлыми, в отличие от формы веретета, наблюдаемой в моделях повреждения I/R и MI(Рисунок 6, Дополнительное видео S11).

Figure 1
Рисунок 1: Мыши и материалы, используемые для очистки тканей сердца.
(A) Схема стратегии разведения для мышей Tcf21-MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP, используемых для очистки тканей. (B) Хронология лечения тамоксифеном и операции, выполняемой на мышах. Нераненые мыши приносили в жертву на 14-й день. (C) 3-D хорошо напечатано, чтобы удерживать сердечную ткань, запечатанный в стеклянную чашку Петри с вакуумной смазкой. (D) Добавление круглой обложекой вакуумной смазкой, герметичной к верхней части 3-D печатной скважины, установленной поверх нижнего колодца. (E)Ткань очищенного сердца в нижнем колодец тканевого удерживающего аппарата, заполненного раствором для сопоставления показателей преломления (RIMS). Обложка (как в D)и верхний 3-D печатный кусок колодца укладывают поверх нижнего 3-D печатного резервуарного компонента, содержащего очищенную сердечную ткань. Глицерин добавляют в верхний резервуар для глицериновой иммерсионной микроскопии. Шкала стержней = 1 см. Чертежи резервуаров можно найти на дополнительном рисунке 1. Аббревиатура: eGFP = усиленный зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Визуальный вид стадий очистки сердечной ткани.
(A) Слева направо: неочищенный левый желудочек, электрофорезированный левый желудочек, электрофорированный левый желудочек, обработанный сшиванием, электрофорированный левый желудочек, обработанный сшивателем и инкубированный в RIMS. (B) Неочищено и очищено все сердце мыши. (C) Слева: неповреденный, неочищенный левый желудочек. Справа: неповредимый, очищенный левый желудочек. (D) Слева: Неочищенный ИМ повредил левый желудочек. Справа: Очищен ИМ, поврежден левый желудочек. Шкала стержней = 0,5 см. Аббревиатура: MI = инфаркт миокарда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Эффективность нового метода очистки для неповредимых и фиктивных очищенных сердец.
Очищенные(A)непораненные (шкала = 400 мкм) и(B)фиктивные сердца (шкала bar = 500 мкм) с фибробластами Tcf21mcm x Rosa26eGFP (зеленый) и псевдоокрашенными участками повышенной флуоресценции (фиолетовый), показывающими локализацию фибробластов. Сопроводительные видео, показывающие видео фибробластов, можно найти в дополнительных видео S1–2. Неподвижные изображения показывают очистку фона и поддержание фибробластно-эндогенной флуоресценции (зеленый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Ослабление потери фибробластов при ишемии/реперфузии очищенных сердцах с течением времени.
Очищенная сердечная ткань от указанных временных точек I/R с помощью фибробластов Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP (зеленый), псевдоокрашенных участков повышенной флуоресценции (фиолетовый), показывающих локализацию фибробластов, и оранжевых очерчивающих областей, лишенных фибробластов. Верхний ряд: неподвижные изображения левых желудочков из очищенных I/R-поврежденных сердец. Нижний ряд: неподвижные изображения левых желудочков из очищенных I/R-поврежденных сердец с функцией пятен Имариса, используемые для более легкого просмотра паттернов фибробластов во всем левом желудочке. Видео очищенных сердец, поврежденных I/R, показывающие не только грубый рисунок фибробластов, но и четкие изображения отдельных фибробластов и их морфологии, можно найти в дополнительных видео S5–8. Шкала стержней = 500 мкм. Аббревиатура: I/R = ишемия/реперфузия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Ослабление потери сердечных фибробластов после травмы при инфаркте миокарда - поврежденное очищенное сердце с течением времени.
Очищенная сердечная ткань от сердца ИМ с помощью фибробластов Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP (зеленый), псевдоцветные участки повышенной флуоресценции (фиолетовый), показывающие локализацию фибробластов, и оранжевые очерчивающие области, лишенные фибробластов. Верхний ряд: неподвижные изображения тканей, очищенных левыми желудочками от ИМ-поврежденных сердец (зеленый). Нижний ряд: неподвижные изображения тканей, очищенных левых желудочков от ИМ-поврежденных сердец (зеленый) с функцией пятен Имариса (фиолетовый), наложенных, чтобы показать грубое распределение фибробластов. Видео очищенных тканей левого желудочка от ИМ-поврежденных сердец показывают грубое расположение фибробластов в сердце, а также позиционирование и морфологию отдельных фибробластов в этой 3D-модели in vivo(Дополнительные видео S7-8). Шкала: 1,5 дня = 1000 мкм, 3 дня = 700 мкм. Аббревиатура: MI = инфаркт миокарда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Очищенные ткани от сердец, обработанных ангиотензином/фенилэфрином.
Схема,показывающая, как насосы ангиотензина/фенилэфрина используются для введения лекарств в течение двухнедельного периода после активации тамоксифена Tcf21MCM x eGFP. (B) Неподвижное изображение, неподвижное изображение + пятна Imaris и видео, показывающее организацию и морфологию фибробластов в сердцах, обработанных Ang / PE (Дополнительное видео S11) Шкала баров = 500 мкм. Сокращения: Ang/PE = ангиотензин II/фенилэфрин; eGFP = улучшенный зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Репрезентативные изображения наблюдаемого паттерна фибробластов в сердцах, обработанных ангиотензином/фенилэфрином.
(A, Cи D):Изображения правостороннего рисунка скручивания спирали фибробластов с точки зрения внешней стороны желудочка. (B) Изображение паттерна фибробластов с точки зрения внутренней части желудочка. Стрелки выделяют линейные группы фибробластов, которые составляют рисунок скручивания. Шкала стержней = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: 2D-визуализация резервуарного аппарата. (A) 2D рендеринг нижней половины резервуара для визуализации. Этот резервуар герметизируется к чашке Петри вакуумной смазкой. Сердце помещается в центральное отверстие и погружается в RIMS. (B) 2D рендеринг верхней половины резервуара визуализации. Стеклянная крышка приклеивается к плоскому дну этого куска вакуумной смазкой. Это аккуратно помещается поверх нижнего резервуара. Верхний резервуар затем может быть заполнен глицерином для визуализации. Единицы измерения в мм. Сокращения: 2D = двумерный; RIMS: Решение для согласования показателей преломления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.

Видео S1: Неповреденные ткани очищенного сердца. Сердечные фибробласты (зеленые) в неповредимом левом желудочке были небольшими, и многие из них были округлыми с не более чем двумя клеточными проекциями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео S2: Фиктивная ткань очищенного сердца. Сердечные фибробласты (зеленые) в левом желудочке фиктивного сердца мыши были маленькими и в основном круглыми с небольшим количеством выступов, похожих на то, что было замечено в неповредимых сердцах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео S3: Детальный обзор фибробластов через стенку желудочка неповредимого сердца. Это видео начинается на внутренней стенке желудочка и приближается к внешней стороне сердца. Сердечные фибробласты (зеленый) были показаны подробно и имели округлые или слегка вытянутые клеточные тела с не более чем двумя клеточными проекциями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео S4: Детальный вид участка стенки левого желудочка непомеченного сердца. Этот ~ 300-мкм широкий участок очищенного неповрежденным сердца мыши показывает 3-D расположение сердечных фибробластов (зеленый) и их морфологию в деталях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео S5: Очищен левый желудочек от 3 дней I/R. Детальный вид левого желудочка показал, что после повреждения I/R возникает область потери фибробластов сердца. Также было очевидно, что фибробласты (зеленые) развили гораздо более вытянутую форму в этом поврежденном состоянии по сравнению с более округлыми морфологиями, наблюдаемыми в неповрежденных и фиктивных сердцах. Аббревиатура: I/R = ишемия/реперфузия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео S6: Очищен левый желудочек на 7 день I/R. Детальный вид левого желудочка показывает, что через 7 дней после повреждения I/R площадь, отсутствующая в фибробластах, была меньше, чем на 3-й день после повреждения I/R. Присутствовало больше фибробластов (зеленых), и, что интересно, присутствовали новые клеточные морфологии. В частности, некоторые фибробласты имели округлые клеточные тела с множественными протрузиями, что потенциально указывает на новую или развитую роль фибробластов в этой среде. Аббревиатура: I/R = ишемия/реперфузия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео S7: Очищен левый желудочек на 14 дней ввода/отр. Детальный вид левого желудочка показал, что все еще была область, центральная к стенке желудочка, которая имела очень мало фибробластов, но фибробласты (зеленые) на периферии этой пустоты поддерживали сильно вытянутую морфологию, наблюдаемую в образцах после I/R 7-го дня. Интересно, что несколько фибробластов, которые присутствовали в поврежденной области, имели морфологию, подобную той, что была в неповрежденные сердцах — маленькие и округлые. Аббревиатура: I/R = ишемия/реперфузия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео S8: Очищен левый желудочек 28 дней I/R. Детальный вид сердечных фибробластов (зеленый) на 28-й день после повреждения I/R показал, что в поврежденной области была небольшая область, в которой отсутствовали фибробласты. Было также отмечено, что вокруг этой области была область с высокой плотностью фибробластов, и что морфологии в этой плотной области были сильно вытянутыми. Аббревиатура: I/R = ишемия/реперфузия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео S9: Очищен левый желудочек на 1,5 день ИМ. Было очень мало сердечных фибробластов (зеленых), оставшихся в поврежденном левом желудочке через 1,5 дня после ИМ, смерти сердечных фибробластов во всей этой области желудочка. Аббревиатура: MI = инфаркт миокарда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео S10: Очищен левый желудочек на 3 день ИМ. Была большая область, лишенная сердечных фибробластов через 3 дня после ИМ, но некоторые сердечные фибробласты (зеленые) вновь появились в желудочке, в отличие от результатов, обнаруженных после 1,5 дней ИМ. Кроме того, профили морфологии сердечных фибробластов отличались от тех, которые наблюдались в I/R поврежденных сердцах. Здесь фибробласты были удлинены, но были и другие, которые имели округлые клеточные тела (больше, чем те, которые наблюдаются в непоранеженных сердцах), и субпопуляция их имела много клеточных проекций. Сокращения: ИМ = инфаркт миокарда; I/R = ишемия/реперфузия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео S11: Очищен левый желудочек мышей, обработанных Ang/PE. Не было явной потери сердечных фибробластов (зеленый) после лечения Ang / PE. Тем не менее, сердечные фибробласты были в основном маленькими и округлыми или маленькими и вытянутыми и, казалось, соответствовали сократительным паттернам сердца. Аббревиатура: Ang/PE = ангиотензин II/фенилэфрин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В этой статье представлен усовершенствованный метод очистки тканей, который позволяет визуализировать сердечные фибробласты in vivo, как на исходном уровне, так и после травмы, чтобы охарактеризовать и лучше понять фибробласты в сердце мыши. Этот расширенный протокол устраняет ограничения в существующих протоколах очистки тканей, которые пытались идентифицировать конкретные типы клеток во взрослом или неонатальном сердце12,13,14,16,17,20. В первоначальных попытках очистить сердце мыши использовалась пассивная техника CLARITY, в которой сердце оставляли в очищающий буфер на нутаторе примерно на 1 неделю, чтобы обеспечить пассивное распределение буфера по всейткани 15,18. Этот процесс привел только к очистке примерно 80 мкм глубины в ткани (данные не показаны), что согласуется с предыдущими наблюдениями, в результате которых потребовалось несколько недель, чтобы очистить 1-дневное сердце неонатальной мыши13. Активная ЯСНОСТЬ с использованием активной системы электрофореза позволила пролезть глубже через всю стенку желудочка, глубиной примерно 700 мкм–1 мм, в течение более короткого периодавремени 12,18.

Однако использование этого ранее опубликованного активного протокола CLARITY привело к потере флуоресценции фибробластов с высокими уровнями аутофлуоресценции тканей, что ранее было отмечено как возникающей в активной CLARITY Колесовой и др.12. Для поддержания флуоресценции фибробластов было установлено, что соответствующий протокол фиксации имеет первостепенное значение. Слишком короткий процесс фиксации вызывал потерю флуоресценции во время электрофореза. Слишком длительный процесс фиксации приводил к потере самой флуоресценции. Поэтому ночная фиксация при 4 °C в 4% PFA была признана оптимальной. Чтобы улучшить проблему фоновой флуоресценции, был использован обесцвечивающий впитывание (принцип, заимствованный из метода очистки CUBIC) для уменьшения связывания гема в миоглобине и, следовательно, уменьшения автофлуоресценции, вызванной этим хромофором18. Обесцвечивание привело к более надежной очистке фоновой флуоресценции с поддержанием репортерной флуоресценции, чтобы меченые фибробласты были более выраженными(рисунок 2A).

Наконец, чтобы обеспечить полную оптическую прозрачность, ткань была уравновешиваема в растворе для согласования показателей преломления (RIMS)(рисунок 2B–D). Сопоставляя показатель преломления ткани с ее окружением, это увеличивалось оптическая прозрачность ткани, что позволяло проводить более глубокую визуализацию. Высокоскоростное резонансное сканирование затем использовалось для изображения тканей, поскольку оно быстрее, чем гальванометрическое сканирование. Поскольку сердца мышей немного отличаются по размерам, были установлены индивидуальные параметры изображения XY и коррекция интенсивности Z. С помощью этих параметров можно было получить изображение через непораненные сердца для визуализации флуоресцентных фибробластов примерно через 4 ч(рисунок 3). Качество изображения было улучшено при поствизуализационной обработке за счет использования программного обеспечения для анализа размешивания и шумоподавления для уменьшения фона и уточнения флуоресценции, присутствующей на изображении. Кроме того, программное обеспечение вторичного анализа использовалось для выделения локализации флуоресцентных фибробластов. Этот поствизуальный анализ был использован для четкого аннотирования сердечных фибробластов путем устранения фонового вокселя по вокселу(Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6).

Этот оптимизированный протокол CLARITY был применен для оптического очищения как поврежденных, так и неповрежденных сердец. Это позволяет лучше понять реакцию сердечных фибробластов на травму. Эти травмы включали временной курс ИМ и В/Р, а также дозирование Ang/PE. Поскольку ишемическое повреждение ослабляет сердечную ткань, крайне важно, чтобы во время электрофореза соблюдали большую осторожность для поддержания целостности тканей. Действительно, как для повреждения I/R, так и для повреждения ИМ требуется более короткий период электрофореза (≤1,5 ч)32. Предыдущие исследования не рассматривали влияние травмы на процесс очистки тканей. Недавно оптимизированный протокол, представленный здесь, учитывает травмы, позволяя очищать без дальнейшего разрушения ткани.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют раскрытий, связанных с содержанием данной рукописи.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить CCHMC Confocal Imaging Core за их помощь и руководство в разработке этой модели, а также Мэтта Бати из Clinical Engineering за дизайн всех 3D-печатных деталей. Деметрия Фишер была поддержана грантом на обучение от Национального института здравоохранения (NHLBI, T32 HL125204), а Джеффри Д. Молкентин был поддержан Медицинским институтом Говарда Хьюза.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 braided silk Ethicon K871H
8-0 prolene Ethicon 8730H
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140
Angiotensin II Sigma A9525-50G
Artificial Tear Ointment Covetrus 048272
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) Millipore Sigma D27802-25G
GLUture topical tissue adhesive World Precision Instruments 503763
Heparin Sigma H0777
Imaris Start Analysis Software Oxford Instruments N/A
Micro-osmotic pumps Alzet Model 1002
Nikon Elements Analysis Software Nikon N/A
Nikon A1R HD upright microscope Nikon N/A
Normal autoclaved chow Labdiet 5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,
N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide
CosmoBio AXS-1002424
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Phenylephrine Hydrochloride Sigma P6126-10G
Photoinitiator Wako Chemicals VA-044
Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] Jackson Laboratories Jax Stock No:012429
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002-5G
Sodium Chloride solution Hospira, Inc. NDC 0409-4888-10
Tamoxifen Sigma Aldrich T5648
Tamoxifen food Envigo TD.130860
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent Millipore Sigma 122262-1L
X-Clarity electrophoretic clearing chamber Logos Biosystems C30001
X-Clarity electrophoretic clearing solution Logos Biosystems C13001
X-Clarity electrophoresis tissue basket Logos Biosystems C12001
X-Clarity electrophoresis tissue basket holder Logos Biosystems C12002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73, (18), 2267-2282 (2019).
  2. Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51, (12), 1-9 (2019).
  3. Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
  4. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80, (11), 2269-2276 (2016).
  5. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128, (5), 2127-2143 (2018).
  6. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  7. Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6, (11), 1601434 (2017).
  8. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, (22), 4267-4278 (2014).
  9. Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14, (8), 0220573 (2019).
  10. Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3, (10), 00406 (2017).
  11. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  12. Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146, (2), 141-152 (2016).
  13. Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
  14. Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9, (2), 423-436 (2018).
  15. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, (4), 945-958 (2014).
  16. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, (7), 0182072 (2017).
  17. Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188 (2017).
  18. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  19. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  20. Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7, (9), 3716-3720 (2016).
  21. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47, (2), 107-114 (2009).
  22. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50, (5), 600-613 (2011).
  23. Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292, (6), 2944-2951 (2007).
  24. Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269, (6), 2147-2154 (1995).
  25. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286, (3), 1201-1207 (2004).
  26. Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274, (5), 1812-1820 (1998).
  27. Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45, (2), 330-338 (2000).
  28. Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
  29. Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1, (3), 366-376 (2008).
  30. Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
  31. Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145, (4), 868-875 (1994).
  32. Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).
Усовершенствованная очистка тканей на основе CLARITY для трехмерной организации фибробластов в здоровых и поврежденных сердцах мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).More

Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter