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Biology

आइसोलेशन और इमेजिंग लाइव, वाइब्रेटम सेक्शनिंग द्वारा माउस एंल श्रोणि के बरकरार पेसमेकर क्षेत्र

Published: April 30, 2021 doi: 10.3791/62040
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3
1Department of Physiology & Cell Biology, University of Nevada, Reno School of Medicine, 2Department of Physiology & Membrane Biology, University of California School of Medicine, 3Department of Life & Health Sciences, Dundalk Institute of Technology

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य वाइब्रेम सेक्शनिंग का उपयोग करके माउस गुर्दे की श्रोणि के अक्षुण्ण पेसमेकर क्षेत्रों को अलग करना है। इन वर्गों का उपयोग सीटू सीए2 + इमेजिंग में पेसमेकर कोशिकाओं और वाइब्रेटोम स्लाइस में अन्य इंटरस्टिशियल कोशिकाओं के सीए2 + क्षणिक गुणों को स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

गुर्दे की श्रोणि (आरपी) एक कीप के आकार का, चिकनी मांसपेशियों की संरचना है जो नियमित, प्रणोदक संकुचन द्वारा गुर्दे से मूत्र तक सामान्य मूत्र परिवहन की सुविधा प्रदान करती है। नियमित आरपी संकुचन पेसमेकर गतिविधि पर भरोसा करते हैं, जो श्रोणि-गुर्दे जंक्शन (पीकेजे) में आरपी के सबसे समीपस्थ क्षेत्र से निकलती है। पीकेजे की अक्षुण्ण तैयारी तक पहुंचने और संरक्षित करने में कठिनाई के कारण, आरपी पेसमेकिंग पर अधिकांश जांचों ने एकल-कोशिका इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और सीए2 + इमेजिंग प्रयोगों पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि आरपी पेसमेकिंग पर महत्वपूर्ण खुलासे इस तरह के काम से उभरे हैं, इन प्रयोगों में कई आंतरिक सीमाएं हैं, जिनमें मिश्रित निलंबन में सेलुलर पहचान को सही ढंग से निर्धारित करने में असमर्थता और आरपी पेसमेकर गतिविधि के सीटू इमेजिंग में कमी शामिल है । इन कारकों के परिणामस्वरूप सामान्य लयबद्ध आरपी संकुचन को कम करने वाले तंत्रों की सीमित समझ हुई है। इस पेपर में वाइब्रेटम सेक्शनिंग तकनीक का इस्तेमाल करते हुए माउस पीकेजे के अक्षुण्ण खंडों को तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। सेल-विशिष्ट संवाददाताओं और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + संकेतकों को व्यक्त करने वाले चूहों के साथ इस दृष्टिकोण को जोड़कर, जांचकर्ता सामान्य मूत्र परिवहन के लिए महत्वपूर्ण परिस्त आरपी संकुचन के लिए जिम्मेदार विशिष्ट सेल प्रकारों और तंत्रों का अधिक सटीक अध्ययन करने में सक्षम हो सकते हैं।

Introduction

गुर्दे की श्रोणि (आरपी) एक कीप के आकार का, चिकनी मांसपेशियों की संरचना है जो मूत्र को गुर्दे से मूत्र तक पहुंचाती है। आरपी नियमितलयबद्ध संकुचन (पेरिस्टलसिस)1,2,3,4,5उत्पन्न करके मूत्र का परिवहन करता है, जो गुर्दे से मूत्राशय तक और अंततः मूत्राशय तक मूत्राशय तक मूत्र का एक बोलस को प्रेरित करता है, जहां इसे तब तक संग्रहीत किया जाता है जब तक कि यह6, 7होता है। इस नियमित गतिविधि के नुकसान के गंभीर परिणाम होते हैं, जिनमें हाइड्रोनेफ्रोसिस और गुर्दे की विफलता1,3,8शामिल हैं। इसलिए, नियमित, लयबद्ध आरपी संकुचन अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। पेरिस्टाल्टिक संकुचन आरपी-इन श्रोणि-गुर्देजंक्शन (पीकेजे)9,10, 11, 12, 13,14,15(चित्रा 1A-सी)के सबसे समीपस्थ क्षेत्र से उत्पन्न होते हैं और पिपिला से आरपी(चित्रा 1B)में मूत्र को पुश करने के लिए अलग-अलग प्रचारित करते हैं। पीकेजे मेंविद्युत पेसमेकर गतिविधि10, 11, 12, 13,15,16,17के रूप में पीकेजे में दर्ज की जाती है, जो विशेष पेसमेकर कोशिकाओं से उत्पन्न होती है। इन पेसमेकर कोशिकाओं, जिन्हें पहले असामान्य चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं (एएसएमसी) कहा जाता है, को पेसमेकर गतिविधि उत्पन्न या समन्वित करने और "विशिष्ट" चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (एसएमसी) 9,10, 11, 18, 19,20,21,22,23के संकुचन को चलाने के लिए सोचाजाताहै।

एएसएमसी को पीकेजे(चित्रा 1ए-सी)में समीपस्थ आरपी में सबसे अधिक प्रचुर मात्रा में होता है, जहां पेरिस्टाल्टिक संकुचन और विद्युत पेसमेकर गतिविधि5,7,8,9,12,13,14,16,17,18,19,20, 21 से निकलती है ,22. इस समूह द्वारा हाल ही में प्रकाशित एक अध्ययन प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर-अल्फा (PDGFRα), चिकनी मांसपेशी मायोसिन भारी श्रृंखला (smMHC) के संयोजन में, इन इंटरस्टिशियल कोशिकाओं (आईसीएस)24के लिए एक अद्वितीय बायोमार्कर के रूप में, एक खोज है कि अंय समूहों द्वारा पुष्ट किया गया है की पहचानकी 25। उनके आकृति विज्ञान और प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न के आधार पर, इन कोशिकाओं को PDGFRα+ आईसी टाइप 1 (PIC1)24, 26कहाजाताथा । PIC1s पीकेजे की मांसपेशियों की परत में रहते हैं, जहां वे उच्च आवृत्ति, अल्पकालिक सीए2 + यात्रियों को प्रदर्शित करते हैं, जो पेसमेकर क्षमता24की पीढ़ी को रेखांकित करने के लिए सोचा था। हालांकि, अन्य सेल प्रकार पीकेजे में मौजूद हैं, जिनमें एडवेंटियल लेयर में गैर-एसएमएमएचसी-एक्सप्रेसिंग पीडीजीएफआरवाई+ आईसी (PIC2s) शामिल हैं। पिछली रिपोर्टों में सुझाव दिया गया है कि गैर-एसएमएमएचसी आईसीएस पेसमेकर गतिविधि19के नियमन में भाग ले सकते हैं । हालांकि, गैर-एसएमएमएचसी आईसीएस का आगे का अध्ययन सीए 2 + इमेजिंग अध्ययनके दौरान खराब अंतर से बाधित होता है। आमतौर पर, आरपी तैयारी के भीतर विषम कोशिका प्रकार को सीए2 + -संवेदनशीलरंगों (जैसे, फ्लू-4) से अंधाधुंध लोड किया जाता है। इन चुनौतियों से उबरने और आरपी में विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों का अध्ययन करने के लिए, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + संकेतक (जीईसीआई) का उपयोग सेल प्रकार के हित में सीए2 + --संवेदनशीलफ्लोरोफोरस को चुनिंदा रूप से व्यक्त करने के लिए किया जा सकता है।

PIC1s/ASMCsमें सीए2 + क्षणिक गुणों को स्पष्ट करने वाले अधिकांश अध्ययनों को फ्लैट-शीट आरपी ऊतक तैयारी19, 21,27इमेजिंग द्वारा प्राप्त किया गया था । चूंकि पीआईसी 1एस एसएमएमएचसी को व्यक्त करने के लिए पीकेजे में एकमात्र सेल प्रकार है, एसएमएमएचसी+ कोशिकाओं में जीईसीआई, जीसीएएमपी की सशर्त अभिव्यक्ति इस विन्यास में PIC1s का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है। हालांकि, जैसा कि PIC1s और PIC2s दोनों व्यक्त करते हैं PDGFRα, PDGFRα+ कोशिकाओं में GCaMP वेरिएंट की सशर्त अभिव्यक्ति फ्लैट शीट तैयारी में सेल भेद निषेध। इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, पीकेजे ऊतक दीवार24में PIC1s और PIC2s को अलग करने के लिए एक वाइब्रेटोम सेक्शनिंग दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था। इन असतत सेलुलर आबादी को प्रकट करने के लिए, आरपी कोरोनली को खंडित किया गया था, जिससे ज्ञात इम्यूनोहिस्टोकेमिकल लेबलिंग और जीईसीआई अभिव्यक्ति पैटर्न के आधार पर मांसपेशियों की दीवार में एडवेंटिया और PIC1s में PIC2s की पहचान करना संभव हो गया था। इस उपन्यास पीकेजे इमेजिंग दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप, PIC1s और PIC2s अलग सीए2 + सिग्नलिंग गुण24प्रदर्शित करने के लिए पाए गए। इसके अलावा, पीकेजे क्षेत्र(चित्रा 2)के सबसे समीपस्थ वर्गों को अलग करके, आरपी के पेसमेकर क्षेत्र को इस तरह से संरक्षित किया गया था जो पहले पूरा नहीं किया गया था। यहां, एक प्रोटोकॉल को यह दिखाने के लिए वर्णित किया गया है कि वाइब्रेटम सेक्शनिंग का उपयोग करके माउस किडनी से पीकेजे की तैयारी को कैसे अलग किया जाए, सीए2 + इमेजिंग प्रयोगों के लिए इन तैयारियों को कैसे स्थापित किया जाए, और पीकेजे दीवार में विभिन्न सेल प्रकारों को कैसे अलग किया जाए।

Protocol

इस अध्ययन में वर्णित सभी चूहों और इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों और नेवादा, रेनो, एनवी विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु उपयोग और देखभाल समिति के अनुसार थे। प्रयोग और पशुओं का उपयोग भी 28 के सिद्धांतों और विनियमों के अनुरूप है जैसा कि ग्रुंडी28द्वारा वर्णित है .

1. PDGFRα-GCaMP6f और SMCGCaMP3 चूहों उत्पन्न

  1. क्रॉस GCaMP6flox/+ चूहों (B6; 129S-Gt (ROSA) 26Sortm95.1 (CAG-GCaMP6f) Hze/J)PDGFRαcre चूहों के साथ (C57BL/6-Tg (Pdgfra-cre) 1Clc/j) PDGFRα-GCaMPf चूहों को उत्पन्न करने के लिए ।
  2. क्रॉस GCaMP3lox/+ चूहों (B6.129S-Gt(ROSA) 26Sortm38 (CAG-GCaMP3) Hze/j)पुरुष smMHCCreERT2 चूहों (B6) के साथ । एसएमसी-GCaMP3 चूहों को उत्पन्नकरने के लिए FVB-Tg (Myh11-cre/ER T2)1Soff/J) ।
    नोट: क्रॉस के केवल पुरुष चूहों(GCaMP3lox/+ चूहों और smMHCCreERT2 चूहों) के रूप में सीआरई अभिव्यक्ति वाई गुणसूत्र से प्रेरित है इस्तेमाल किया जा सकता है । SMMHCCreERT2 चूहों को बेहतर सीए2 + सिग्नल-टू-शोर अनुपात और तेजी से सीए 2+ सिग्नल अस्थायी गुणों के लिए GCaMP6flox/+ चूहों के साथ भी पार किया जा सकता है।

2. GCaMP की सशर्त अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए टैमोक्सिफेन के साथ ट्रांसजेनिक चूहों को तैयार करें और इंजेक्ट करें

  1. विशिष्ट सेल प्रकारों में सेल-विशिष्ट GCaMP अभिव्यक्ति के लिए अकांक्षित क्रे रिकॉम्बेडिनाज को सक्रिय करें, जैसा कि पहले29वर्णित है।

3.   समाधान तैयार करें

  1. 120.35 m M NaCl युक्त क्रेब्स-रिंगर बाइकार्बोनेट (केआरबी) समाधान के 1 एल तैयार करें, 5.9 MM KCl, 15.5 m M NaHCO3,1.2 mMNa 2HPO4,1.2 mMg MgCl2,11.5 mM ग्लूकोज, और 2.5 mM CaCl2. उपयोग के दिन, बर्फ पर केआरबी समाधान बनाए रखें।
    नोट: केआरबी को एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और उपयोग से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए 97% O2 और 3% सीओ2 के मिश्रण के साथ पूर्व-बुलबुला होना चाहिए।

4. सिलिकॉन इलास्टोमर-लेपित विच्छेदन और माइक्रोस्कोप इमेजिंग व्यंजन तैयार करें

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार सिलिकॉन इलास्टोमर घटकों को मिलाएं। इमेजिंग प्रयोगों और विच्छेदन के लिए क्रमशः एक 35 मिमी x 10 मिमी पेट्री डिश और 60 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश लगभग एक चौथाई तरल सिलिकॉन इलास्टोमर से भरा भरें। उपयोग से पहले 1 दिन के लिए सिलिकॉन इलास्टोमर को 37 डिग्री सेल्सियस पर पॉलीमराइज करें।
    नोट: पतली गुर्दे के वर्गों के विपरीत बढ़ाने के लिए, सिलिकॉन इलास्टोमर से भरने से पहले इमेजिंग पेट्री डिश के आधार पर कागज का एक छोटा, काला चक्र लागू करें।

5. गुर्दा विच्छेदन

  1. हवादार हुड में 3-4% आइसोफ्लारेन के साँस लेने से चूहों को एनेस्थेटाइज करें। अंगुली और/या पूंछ चुटकी पलटा के नुकसान से गहरी संज्ञाहरण के प्रेरण की पुष्टि करें, और फिर गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों इच्छामृत्यु ।
  2. फर को गीला करने के लिए छाती पर 70% इथेनॉल लागू करें। बाहरी विच्छेदन कैंची का उपयोग करना, आंतरिक अंगों को नुकसान को रोकने के लिए जानवर से दूर कैंची ब्लेड के साथ, एक देशांतर चीरा के माध्यम से पेट की गुहा खोलें।
  3. आंतरिक ऊतक संदंश और आंतरिक विच्छेदन कैंची का उपयोग करना, आंतों को चुटकी और उन्हें पेट की दीवार से दूर उठा। आंतों को उठाते समय, गुर्दे वाले रेट्रोपेरिटोनियल अंतरिक्ष तक पहुंच प्राप्त करने के लिए समीपस्थ डुओडेनम और डिस्टल कोलन पर शरीर से मुक्त आंतों के नीचे काटें।
  4. एक बार गुर्दे उजागर हो जाने के बाद, उन्हें व्यक्तिगत रूप से निकालें। धीरे-धीरे चुटकी लें और ऊतक संदंश के साथ मूत्रवर्धक (गुर्दे से ~ 4 मिमी दूर) के डिस्टल एंड को उठाएं। विच्छेदन कैंची का उपयोग करना, गुर्दे की ओर चुटकी मूत्रवर्धक के नीचे काटा। गुर्दे के नीचे कटौती करने के लिए जारी रखें जब तक यह आसपास के संयोजी ऊतक से मुक्त हो गया है ।
    नोट: कंपन अनुभागिंग के दौरान ऊतक अखंडता और स्थिरता को अधिकतम करने के लिए, गुर्दे के रूप में संभव के रूप में बरकरार होना चाहिए । यह सुनिश्चित करने के लिए, संदंश और विच्छेदन कैंची के साथ गुर्दे को चुटकी लेने या काटने से बचें।
  5. किडनी को आइस-कोल्ड केआरबी सॉल्यूशन में अटैच यूरेटर के साथ रखें। कॉन्ट्रालेटरल किडनी के साथ 5.4 और 5.5 कदम दोहराएं। बर्फ पर केआरबी समाधान में गुर्दे बनाए रखें।
    नोट: पीकेजे ऊतक व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए तुरंत प्रोटोकॉल के अगले खंड पर आगे बढ़ें। गुर्दे के परेंचिमा में गहरी अपनी शारीरिक स्थिति के कारण, पीकेजे केआरबी समाधान के साथ संपर्क से वंचित है।

6. कंपन अनुभाग के लिए गुर्दे तैयार

  1. गुर्दे को सिलिकॉन इलास्टोमर-लेपित विच्छेदन डिश (60 मिमी x 15 मिमी) में स्थानांतरित करें, और इसे बर्फ-ठंडे केआरबी समाधान से भरें जब तक कि गुर्दे पूरी तरह से जलमग्न न हो जाएं।
  2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, समीपस्थ मूत्रालय में मिन्यूटियन पिन डालने और पतले पूर्वकाल गुर्दे कैप्सूल या आसपास के एडीपोज ऊतक के माध्यम से पकवान के आधार पर गुर्दे को लंगर डालें।
    नोट: ध्यान रखें कि किडनी पैरेचिमा टिश्यू को पंचर न करें।
  3. डिस्टल आरपी और समीपस्थ मूत्रवर्धक को बेनकाब करने के लिए गुर्दे के आधार से एडीपोज ऊतक को हटाने के लिए ठीक वसंत कैंची और आंतरिक संदंश का उपयोग करें।
  4. बारीक स्प्रिंग कैंची का उपयोग करके आरपी के आधार से समीपस्थ मूत्रवर्धक और डिस्टल आरपी के एक हिस्से को हटा दें।
    नोट: ध्यान रखें कि आसपास की किडनी पैरेन्चिमा न काटें। चित्रा 1A में काले धराशायी लाइन इस कटौती की अनुमानित स्थिति को इंगित करता है । यह कटौती अधिक समान ऊतक अनुभागन के लिए गुर्दे पर एक फ्लैट आधार बनाती है। गुर्दे को विच्छेदन करते समय, किसी को पीकेजे क्षेत्र की शारीरिक स्थिति के बारे में पता होना चाहिए। चित्रा 1B से पता चलता है कि बरकरार गुर्दे को मेडुला, पैपिला (डिस्टल मेडुला जहां इकट्ठा करने वाली नलिकाएं एकाग्र होती हैं) और समीपस्थ और डिस्टल आरपी को बेनकाब करने के लिए एक धनुलाल विमान के साथ काटा जा सकता है। यदि पैपिला को पूरी तरह से उजागर किया जाना था, जैसा कि चित्रा 1Cमें, पीकेजे और समीपस्थ आरपी (प्रॉक्सी आरपी) की कल्पना की जा सकती है। हालांकि, यह वाइब्रेकोम तकनीक के लिए नहीं किया जाना चाहिए; यह विवरण आम तौर पर पीकेजे स्थान पर पाठक को उन्मुख करना है, जो पीकेजे क्षेत्र और फिगर 1डी,ईमें मध्य-आरपी क्षेत्र के संचारित प्रकाश छवियों में दिखाए गए शारीरिक अंतर में जोर दिया गया है।
  5. बाहरी गुर्दे कैप्सूल को ठीक-टिप संदंश के साथ छेदें, गुर्दे के शरीर से दूर सुझावों को एंगलिंग करें। प्रत्येक हाथ के साथ संदंश का उपयोग करना, कैप्सूल के ढीले सिरों को चुटकी लें और उन्हें छील दें। शेष गुर्दे कैप्सूल झिल्ली को वापस छीलना जारी रखें जब तक कि इसे पूरी तरह से हटा न दिया जाए।
    नोट: गुर्दे कैप्सूल एक कठिन, रेशेदार परत है कि गुर्दे के चारों ओर से घेरे है । इसे इष्टतम काटने के लिए वाइब्रेकरम सेक्शनिंग से पहले हटाया जाना चाहिए।

7. वाइब्रेकोम इंस्ट्रूमेंट तैयार करें और कैलिब्रेट करें

  1. वाइब्रेकोम इंस्ट्रूमेंट के ब्लेड होल्डर में रेजर ब्लेड डालें, और ब्लेड क्लीयरेंस एंगल को ~ 18 डिग्री तक एडजस्ट करें।
    नोट: उच्च गुणवत्ता वाले खंड के लिए एक वैकल्पिक कदम के रूप में, निर्माता के निर्देशों के अनुसार उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक नए ब्लेड के लिए ब्लेड की स्थिति को समायोजित करने के लिए एक अंशांकन ब्लॉक (कुछ वाइब्रेकोम उपकरणों के साथ प्रदान किया जाना चाहिए) । यह ब्लेड की इष्टतम स्थिति सुनिश्चित करेगा और ऊर्ध्वाधर कंपन को कम करेगा।
  2. ब्लेड उन्नति की गति को 0.2 मिमी/s तक समायोजित करें, ब्लेड के क्षैतिज कंपन/शीरिंग को 2.00 मिमी के आयाम में, और ब्लेड के जेड-स्टेप आकार को ~ 100-150 माइक्रोन करें। सुनिश्चित करें कि गुर्दे अनुभाग की मोटाई 150 माइक्रोन से अधिक नहीं है क्योंकि यह सीए2 + इमेजिंग प्रयोगों को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेगा (क्योंकि पीकेजे दीवार अक्सर रोल और खुद पर गुना होगा यदि यह बहुत मोटी है)।
    नोट: उपयोगकर्ता को इन कटिंग मापदंडों को ठीक करना चाहिए क्योंकि सेटिंग्स व्यक्तिगत गुर्दे की तैयारी और वाइब्रेकोम उपकरणों के बीच भिन्न होंगी। जब उपयोगकर्ता माइक्रोस्कोप के तहत अनुभागों का निरीक्षण कर सकता है, जैसा कि चरण 7.2 में वर्णित है, तो सेक्शनिंग के दौरान फाइन ट्यूनिंग होनी चाहिए।
  3. वाइब्रेकरोम इंस्ट्रूमेंट पर आइस बाथ और बफर ट्रे स्थापित करें। कुचल बर्फ के साथ बर्फ स्नान भरें, और बर्फ के साथ भीतरी चरण क्षेत्र को भरने-ठंडा KRB समाधान (लगभग आधा भरा करने के लिए भरें) । वाइब्रेशनम सेक्शनिंग के दौरान, पिघल गई कुचल बर्फ की निगरानी और प्रतिस्थापित करें।

8. कंपन गुर्दे अनुभागित

  1. बर्फ-ठंडे केआरबी समाधान से तैयार किडनी को धीरे-धीरे समझने और हटाने के लिए कुंद-एंडेड संदंश का उपयोग करें। अतिरिक्त बाहरी नमी को दूर करने के लिए तुरंत ~ 2-4 एस के लिए शोषक कागज पर गुर्दे रखें। धीरे-धीरे शोषक कागज के पार गुर्दे को रोल करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि परेंचिमा के सभी पक्ष सूख गए हैं ताकि वाइब्रेटम चरण में गुर्दे का इष्टतम आसंजन हो।
    नोट: के रूप में आरपी गुर्दे के अंदर स्थित है और इसलिए बाहरी parenchyma द्वारा संरक्षित है, इस छोटे सुखाने की अवधि ऊतक अखंडता के लिए हानिकारक नहीं होगा ।
  2. तुरंत कंपन नमूना प्लेट के आधार पर साइनोएक्रिलेट गोंद (~ 1 सेमी2)की एक पतली परत लागू करें, और गोंद में कवर किए गए क्षेत्र पर गुर्दे, मूत्रवर्धक पक्ष को नीचे रखने के लिए कुंद-समाप्त संदंश का उपयोग करें। धीरे-धीरे गोंद को सुखाने के लिए लगभग 10-20 एस के लिए संदंश के फ्लैट किनारे के साथ गुर्दे के शीर्ष पर नीचे दबाव लागू करें।
    नोट: इस प्रक्रिया के दौरान गुर्दे को स्थिर करने के लिए, गोंद सूखने के रूप में गुर्दे को सीधा रखने के लिए संदंश की एक अतिरिक्त जोड़ी का उपयोग करें। यह महत्वपूर्ण है कि गुर्दे एक ईमानदार स्थिति में नमूना प्लेट का पालन करता है ताकि वर्गों को सीधे काट दिया जाए। यह सुनिश्चित करने के लिए कि गुर्दे ने नमूना प्लेट का सफलतापूर्वक पालन किया है, धीरे-धीरे गुर्दे के किनारे को धक्का दें। यदि गुर्दे ने सफलतापूर्वक प्लेट का पालन किया है, तो गुर्दे का आधार प्लेट तक सुरक्षित रहना चाहिए।
  3. बफर ट्रे के नीचे नमूना प्लेट को मजबूती से सुरक्षित करें। केआरबी समाधान के स्तर को समायोजित करें ताकि गुर्दे का शीर्ष पूरी तरह से डूब जाए। सेक्शनिंग चरणों के दौरान, जैसे ही वाइब्रेकोम ब्लेड बफर ट्रे में गहराई से चलता है, केआरबी समाधान को हटा दें ताकि ब्लेड धारक समाधान में डूब न जाए।
    नोट: यदि गोंद इस कदम के साथ आगे बढ़ने से पहले पूरी तरह से सूख नहीं गया है, गोंद अक्सर आधार से ऊपर और गुर्दे parenchyma पर ले जाएगा । यह अतिरिक्त गोंद खंडित अधिक चर कर देगा। यदि ऐसा होता है, तो प्लेट से गुर्दे को हटा दें और एक ताजा गुर्दे की तैयारी के साथ आगे बढ़ें।
  4. स्वचालित वाइब्रेटम सेक्शनिंग के लिए, वाइब्रेटम ब्लेड-कटिंग चक्र की शुरुआत और अंत की स्थिति का चयन करें। सत्यापित करें कि इन पदों को किडनी से ~0.5-1 सेमी स्पष्ट किया गया है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रत्येक ब्लेड उन्नति के साथ, पूरे गुर्दे के विमान को खंडित किया जाता है।
  5. केआरबी समाधान के साथ कुओं को भरकर एक बहु-वेल प्लेट (24 या 48-वेल) तैयार करें और प्लेट को बर्फ पर रखें।
    नोट: उत्पन्न होने पर, अनुभाग गहराई का ट्रैक रखने के लिए अलग-अलग खंडों को अलग-अलग कुओं में रखा जाना चाहिए।
  6. ऑटोमेटिक कटिंग प्रोसेस शुरू करें। ब्लेड के प्रारंभिक पास के दौरान, यह सुनिश्चित करें कि ब्लेड गुर्दे के बहुत ऊपर से संपर्क करता है। यदि संपर्क नहीं किया जाता है, तो ब्लेड की शुरुआती जेड-स्थिति को समायोजित करें।
  7. संदंश का उपयोग करना, गुर्दे से मुक्त किए गए वर्गों को इकट्ठा करें। तुरंत अलग-अलग कुओं में अनुभागों को स्थानांतरित करें, और गुर्दे के वर्गों के भीतर अनुमानित पीकेजे स्थान को मापने के लिए अनुभागों की जेड-गहराई पर ध्यान दें।
    नोट: कटौती मापदंडों के आधार पर, कुछ वर्गों को गुर्दे के ब्लॉक से मुक्त नहीं काटा जा सकता है। यदि ऐसा होता है, तो ध्यान से गुर्दे के ब्लॉक से वर्गों को काटने के लिए ठीक वसंत कैंची का उपयोग करें। उपयोगकर्ताओं को इष्टतम कट सेटिंग्स और ऊतक स्थान सुनिश्चित करने के लिए व्यक्तिगत कुओं में मुक्त-फ्लोटिंग के दौरान हल्के माइक्रोस्कोप के तहत अनुभागों को सक्रिय रूप से कल्पना करने के लिए भी प्रोत्साहित किया जाता है। पीकेजे युक्त अनुभाग आमतौर पर गुर्दे के ऊपर से ~ 1000-1500 माइक्रोन प्राप्त किए जाएंगे।
  8. जब तक पीकेजे क्षेत्र अधिक स्पष्ट नहीं हो जाते तब तक खंडिंग प्रोटोकॉल जारी रखें। पीकेजे क्षेत्रों के विवरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग को अनुभागीय आय के रूप में देखें।
  9. इस बिंदु पर, यह सुनिश्चित करने के लिए खंडीय मापदंडों का अनुकूलन करें कि अनुभाग समान रूप से गुर्दे के ब्लॉक से मुक्त हों और बरकरार हों। इसके अतिरिक्त, सुनिश्चित करें कि पीकेजे क्षेत्र निरंतर और अटूट हैं क्योंकि टूटी हुई पीकेजे दीवारें पतन के कारण दीवार के भीतर कोशिकाओं की पर्याप्त इमेजिंग की अनुमति नहीं देंगी। यदि दीवारें टूटी हुई हैं, तो खंडीय गति को कम करें और अनुभाग की मोटाई बढ़ाएं, और काटने के मापदंडों को ठीक करने के लिए हल्के माइक्रोस्कोप के तहत अनुभागों का निरीक्षण करना जारी रखें।
  10. प्रयोग शुरू होने तक केआरबी समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस पर अनुभाग स्टोर करें।

9. किडनी स्लाइस Ca2 + छवि अधिग्रहण

  1. एक सिलिकॉन इलास्टोमर-कोटेड इमेजिंग डिश (35 मिमी x 10 मिमी) में एक व्यक्तिगत गुर्दे का टुकड़ा स्थानांतरित करें, और तुरंत ताजा, बर्फ-ठंडे केआरबी समाधान के साथ पकवान भरें।
  2. इमेजिंग डिश के आधार पर अनुभाग को सुरक्षित करने के लिए गुर्दे के टुकड़े की परिधि के चारों ओर मिन्यूटियन पिन डालें।
    नोट: यह कदम अनुभाग को चारों ओर जाने से रोकने के लिए महत्वपूर्ण है जब इमेजिंग के दौरान स्लाइस पर शारीरिक समाधान ों को छिद्रित किया जाता है।
  3. इमेजिंग डिश को एक ईमानदार कताई-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के मंच पर रखें और तुरंत केआरबी समाधान के साथ परफ्यूसिंग शुरू करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, एक उच्च गति निपको कताई डिस्क कॉन्फोकल स्कैनर इकाई से लैस एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था।
  4. परफ्यूजन रेट को 3 एमएल/मिन और केआरबी सॉल्यूशन टेम्परेचर तापमान 36 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। इमेजिंग से पहले, स्लाइस को 1 घंटे के लिए बराबर करने की अनुमति दें।
  5. उपयुक्त डिक्रोइक इमेजिंग क्यूब और लेजर का चयन करें। इलेक्ट्रॉन-गुणा चार्ज-युग्मित डिवाइस (ईएमसीसीडी) या वैज्ञानिक पूरक धातु-ऑक्साइड-सेमीकंडक्टर कैमरे के साथ छवियों को प्राप्त करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में कॉन्फोकल सिस्टम GCaMP6f या GCaMP3 को उत्तेजित करने के लिए 488 एनएम लेजर से लैस है। छवियों को 512 पिक्सेल x 512 पिक्सल ईएमसीसीडी कैमरे का उपयोग करके प्राप्त किया गया था।
  6. गुर्दे के टुकड़े का पता लगाने के लिए कम आवर्धन, जल-विसर्जन उद्देश्य लेंस (4x या 10x) का उपयोग करें। स्लाइस के क्षेत्रों पर इमेजिंग फ़ील्ड को केंद्र करें जहां पीकेजे मौजूद है। पीकेजे (यानी, पैरेन्किमल ऊतकों के बीच निलंबित मांसपेशियों के ऊतकों के अर्धवृत्त) का पता लगाने के लिए चित्र 2 डीमें दर्शाए गए स्थलों की पहचान करें।
  7. एक बार पीकेजे स्थित होने के बाद, ब्याज के क्षेत्र को बढ़ाने के लिए उच्च आवर्धन जल-विसर्जन उद्देश्य लेंस (20x, 40x, या 60x) का उपयोग करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, 20x उद्देश्य संख्यात्मक एपर्चर (एनए) 1.0 था, 40x उद्देश्य एनए 0.8 था, और 60x उद्देश्य एनए 1.0 था।
  8. पीकेजे दीवार में रुचि की विभिन्न कोशिकाओं को क्रमशः PDGFRα+ कोशिकाओं या एसएमसी में GCaMP6f या GCaMP3 व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके अलग करें। PDGFRα + में पीकेजे दीवार में PDGFRα+ कोशिकाओं में सीए2 + क्षणिक अवधि के विभिन्न प्रकार का निरीक्षण करें + GCaMP6f+ गुर्दे के स्लाइस(चित्रा 3C,विवरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें) और GCaMP3+ SMCs में एसएमसी GCaMP3+ गुर्दे के स्लाइस(चित्रा 3 डी,विवरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
  9. एक बार पीकेजे दीवार में रुचि की कोशिकाओं की पहचान की गई है, लेजर तीव्रता को समायोजित करने के लिए एक अच्छा संकेत से शोर अनुपात उपज । उचित अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 16 हर्ट्ज और 32 हर्ट्ज के बीच एक अस्थायी नमूना आवृत्ति पर छवियों को रिकॉर्ड करें।
    नोट: इमेजिंग के दौरान उपयोग की जाने वाली लेजर तीव्रता के आधार पर, सीए2 + फ्लोरोफोरस पर ब्लीचिंग प्रभावों के कारण रिकॉर्डिंग की संख्या को सीमित करने की सिफारिश की जाती है। उपयोगकर्ता को विशिष्ट प्रयोगात्मक उद्देश्यों के आधार पर रिकॉर्डिंग लंबाई चुननी चाहिए।

10. Ca2 + इमेजिंग विश्लेषण

  1. पीकेजे पेसमेकर क्षेत्रों में विभिन्न सेल प्रकारों का सीए2 + इमेजिंग विश्लेषण करें, जैसा कि पहले गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट29,30में अन्य अक्षुण्ण पेसमेकर तैयारी के लिए वर्णित है।

Representative Results

पीकेजे की सीटू सीए2 + इमेजिंग में आरपी पेसमेकर कोशिकाओं की महत्वपूर्ण सेलुलर गतिविधि प्रकट कर सकते हैं। कोशिका-विशिष्ट प्रमोटरों द्वारा संचालित आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + संकेतकों (जैसे जीसीएएमपी) को व्यक्त करने वाले चूहों का उपयोग करके, आरपी पेसमेकिंग के बारे में जानकारी सटीकता और विस्तार के साथ प्राप्त की जा सकती है जो फ्लैट-शीट आरपी तैयारी से सीए2 + इमेजिंग प्रयोगों से संभव नहीं है। पीकेजे की शुरुआत गुर्दे के पैरान्चिमल ऊतक(चित्रा 2C;डैश बॉक्स में संलग्न समीपस्थ पीकेजे) के बीच निलंबित मांसपेशियों के अर्ध-हलकों की अचानक उपस्थिति से प्रतिष्ठित है। खंड के बाद के दौर के दौरान, आंतरिक मेडुला आसपास के कॉर्टिकल ऊतक से अलग हो जाता है। एक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत, आंतरिक मेडुला क्षेत्रों में स्ट्रेटेड दिखाई देता है, कॉर्टिकल ऊतक की तुलना में रंग में हल्का और गुर्दे के बाकी हिस्सों(चित्रा 2B,D) के साथ अपनी लंबी धुरी पर असतत होताहै। इस बिंदु पर, अधिक पीकेजे क्षेत्र दिखाई देने लगेंगे। इसके उदाहरण चित्रा 2D (धराशायी आयत, एच और जी) में दिखाए जाते हैं जहां मांसपेशियों के 3 अर्ध-मंडलियों को पैरान्चिमल ऊतक द्वारा निलंबित कर दिया जाता है। इन मांसपेशी बैंड को आंतरिक पैपिला के लिए बारीकी से ऐप किया जाएगा और आम तौर पर एक गुर्दे की धमनियों(चित्रा 2D,धराशायी आयत) पड़ोसी होंगे; चित्रा 2F-एच,काले तीर सिर)। जैसा कि अधिक डिस्टल सेक्शन प्राप्त होते हैं, मांसपेशियों के ये बैंड पीकेजे क्षेत्र(चित्रा 2E)के अंत का संकेत देते हुए अधिक पूर्ण, एकीकृत संरचना बनाने के लिए एकीकृत होंगे।
चित्रा 3A,बी पीडीजीएफआरα+ कोशिकाओं में GCaMP व्यक्त माउस से कम शक्ति (4-10x) पर एक पीकेजे अनुभाग दिखाता है (GCaMP6f Pdgfraद्वारा संचालित निष्क्रिय क्रे-रिकॉम्बिनेंट द्वारा व्यक्त) । गुर्दे की धमनियों(चित्रा 3 ए; तारांकन)जैसे स्थलों का उपयोग करके, प्रयोगकर्ताओं को पैरान्चिमल ऊतक(चित्रा 3 बी,तारक) के बीच निलंबित पतली पीकेजे दीवार को आसानी से अलग करने में सक्षम होना चाहिए। इस विशिष्ट ट्रांसजेनिक ऊतक में GCaMP6f की अभिव्यक्ति पीकेजे की पूरी चौड़ाई में फैली हुई है, दोनों मांसपेशियों और साहसिक परतों(चित्रा 3C)में ।

PDGFRα+ GCaMP6f+ गुर्दे के स्लाइस में, कोशिकाओं का एक नेटवर्क जो आमतौर पर पीकेजे दीवार की चौड़ाई पर फैली हुई है, फ्लोरोसेंट(चित्रा 3 सी)होगा और विभिन्न अवधियों और आवृत्तियों के सीए2 + यात्रियों को प्रदर्शित करेगा। पीकेजे दीवार में PDGFRα+ कोशिकाएं दो अलग-अलग प्रकार की सीए2 + क्षणिक अवधि प्रदर्शित करती हैं। एडवेंटियल लेयर (कॉर्टेक्स के करीब केंद्रित) में, कोशिकाओं और उनकी प्रक्रियाओं के नेटवर्क के रूप में मौजूद पीडीजीएफआरα+ कोशिकाओं को परिभाषित किया जाता है। एडवेंटियल पीडीजीएफआरα+ कोशिकाएं कम आवृत्ति (4 ± 2.7 हर्ट्ज) और लंबी अवधि (1 ± 0.67 एस) सीए2 + यात्रियों का प्रदर्शन करती हैं। मांसपेशियों की परत (मेडुल्ला के करीब केंद्रित) में मौजूद पीडीजीएफआरα+ कोशिकाओं की दूसरी परत, इसी तरह की सीए2 + क्षणिक आवृत्तियों और अवधिओं को एसएमसी जीसीएएमपी 3+ कोशिकाओं (नीचे वर्णित) के रूप में प्रदर्शित करती है क्योंकि वे एक ही सेल प्रकार हैं।

एसएमसी GCaMP3+ गुर्दे के स्लाइस में, GCaMP3+ कोशिकाओं की एक परत मांसपेशियों की परत(चित्रा 3 डी)में मौजूद है । एडवेंटियल लेयर(चित्र 3 डी;एस्टेरिस्क) में फ्लोरोसेंट सिग्नल नहीं होगा। पेशी परत में GCaMP3+ SMCs आम तौर पर उच्च आवृत्ति (10 ± 4 हर्ट्ज) और कम अवधि (632 ± 74 एस) Ca2 + यात्रियों का प्रदर्शन करते हैं। पीकेजे एडवेंटिया में स्थित PDGFRα+ कोशिकाएं लंबी अवधि, कम आवृत्ति वाले सीए2 + यात्रियों(चित्रा 3E,वीडियो 1)को प्रकाश में लाना । हालांकि, Myh11 प्रमोटर द्वारा संचालित GCaMP3 व्यक्त करने वाले ऊतक से सीए2 + इमेजिंग प्रयोग पीकेजे(चित्रा 3 डी)के पेशी पहलू तक ही सीमित है। एडवेंटिया में PDGFRα+ कोशिकाओं की तुलना में, SMCs कम अवधि Ca2 + यात्रियों को अधिक बार निकाल दिया(चित्रा 3F,वीडियो 2)।

पीकेजे पीडीजीएफआरएफआरα+ आईसीएस में सिग्नलिंग गुणों को समझने के अलावा, वाइब्रेटरोम-सेक्शन्ड किडनी में अन्य सेल प्रकारों का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक के आवेदन को इस पेपर में प्रदर्शित किया गया है। गुर्दे की मेडुला (पीडीजीएफआरα+ कोशिकाओं में GCaMP6f व्यक्त चूहों में) की बारीकी से जांच करने पर, फ्लोरोसेंट सीए2 + संकेतों की एक सरणी के भीतर और आसपास के संग्रह नलिकाओं(वीडियो 3)देखा गया था। मेडुलरी पीडीजीएफआरα+ कोशिकाओं ने परिवर्तनीय आवृत्ति और अवधि के सहज सीए2 + यात्रियों को निकाल दिया। गुर्दे के वाइब्रेकोम वर्गों के इन सीए2 + इमेजिंग अध्ययनों को गुर्दे की धमनियों (~ 50-80 मिमी व्यास) का अध्ययन करने के लिए भी विस्तारित किया जा सकता है जो अक्सर पड़ोसी पीकेजे मांसपेशी खंडों(चित्रा 2F,जी; सफेद तीर) का अध्ययन करते हैं। गुर्दे की धमनियों की सीए2 + इमेजिंग (चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में GCaMP व्यक्त ऊतक से) एसएमसीएस(वीडियो 4)में सीए2 + यात्रियों को दोलन दर्शाता है।

Figure 1
चित्र 1:बुनियादी गुर्दे की शारीरिक रचना और पीकेजे पेसमेकर क्षेत्र का स्थान। (ए)अक्षुण्ण गुर्दे का आरेख आरपी और मूत्रवर्धक के अभिविन्यास को दिखाता है । गुर्दे की धमनी और गुर्दे की नस क्रमशः लाल और नीले रंग में प्रदर्शित होती है। (ख)अक्षुण्ण गुर्दे को एक सगितताल विमान के साथ काटा जा सकता है, जिसमें मेडुला, पैपिला (डिस्टल मेडुला जहां एकत्र करने वाली नलिकाएं एकाग्र होती हैं), और समीपस्थ और डिस्टल आरपी शामिल हैं। (ग)पीकेजे और प्रॉक्सी आरपी को पूरी तरह बेनकाब करने के लिए मेडुला और पैपिला को एक्साइज किया जा सकता है । (डी और ई)क्रमशः पीकेजे पेसमेकर क्षेत्र और डिस्टल आरपी से संचारित प्रकाश छवियों का प्रतिनिधित्व करते हैं । श्रोणि के डिस्टल एंड की ओर अनुक्रमिक खंड पीकेजे क्षेत्र(डीआई)में मांसपेशियों के अर्धवृत्त में परिणाम देताहै जो पूरे पैपिला को समाहित करता है। Di और Ei में काले, धराशायी आयतों कोरोनल गुर्दे वर्गों में अनुमानित क्षेत्रों जहां संचारित प्रकाश छवियों का अधिग्रहण किया गया दिखा । छवियों का अभिविन्यास डी और ई संबंधित इनसेट(Di और Ei)के लिए 90° एंटी-क्लॉकवाइज हैं। डी और ई = 20 माइक्रोन में स्केल बार। संक्षिप्त रूप: आरपी = गुर्दे की श्रोणि; प्रॉक्सी आरपी = समीपस्थ गुर्दे श्रोणि; पीकेजे = पेल्विक-किडनी जंक्शन; PICs = प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर-अल्फा-सकारात्मक इंटरस्टिशियल कोशिकाएं; एसएमसी = चिकनी मांसपेशी सेल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:पतली धाराओं को उत्पन्न करने के लिए पूरे गुर्दे की कंपन खंड। (ए)गुर्दे को कंपन उपकरण के आधार पर नीचे मूत्रवर्धक किया जाता है, और एक मानक ब्लेड (वाइब्रेकोम सिर से जुड़ा हुआ) का उपयोग गुर्दे के समीपस्थ से डिस्टल एंड तक अनुक्रमिक वर्गों को काटने के लिए किया जाता है। (ख)एनोटेटेड लैंडमार्क के साथ पूरी किडनी से काटे गए पतले खंड का आरेखीय प्रतिनिधित्व। पीकेजे मांसपेशी खंड (काले धराशायी आयत) अक्सर पैरान्चिमल ऊतक के बीच निलंबित पाए जाते हैं। (ग)एक समीपस्थ गुर्दे के खंड की हल्की सूक्ष्म छवि। संकीर्ण ऊतक के बीच निलंबित मांसपेशियों के बैंड की उपस्थिति समीपस्थ पीकेजे अनुमानों (सफेद धराशायी आयत के अंदर इंगित) की शुरुआत को इंगित करती है। (घ)इष्टतम क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करने वाली हल्की सूक्ष्म छवि जहां कई (2-3) पीकेजे सेगमेंट पाए जा सकते हैं (सफेद धराशायी आयत के भीतर के क्षेत्र)। पतली पीकेजे मांसपेशी स्ट्रिप्स गुर्दे के पैरेंचिमा के बीच निलंबित कर दी जाती हैं और गुर्दे की धमनियों और मेडुला के साथ मिलकर संरेखित करती हैं। (ई)डिस्टल किडनी सेक्शन की हल्की माइक्रोस्कोपिक इमेज। व्यक्तिगत मांसपेशी खंडों को एक एकल, निरंतर मांसपेशी बैंड (सफेद धराशायी आयत) बनाने के लिए विलय कर दिया गया है जो आंतरिक पैपिला (इस छवि में मौजूद नहीं) को घेरे हुए है। स्केल बार सी-ई = 500 माइक्रोन एफ-एच ज़ूम (20x) पैनल डी से क्षेत्र पीकेजे (काले एरोहेड), गुर्दे की धमनियों (सफेद एरोहेड) के स्थान को इंगित करते हैं, और पीकेजे (धराशायी सफेद रेखाओं) को अलग करने के लिए साइटों को काटते हैं। स्केल बार एफ-एच = 100 माइक्रोन। संक्षिप्त नाम: पीकेजे = पेल्विक-किडनी जंक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:वाइब्रेकम वर्गों की सीए2 + इमेजिंग। (ए) गुर्देके धमनी (तारक) के स्थान को दर्शाने वाले वाइब्रेटम सेक्शन की प्रतिनिधि कम शक्ति वाली छवि (4x) । स्केल बार = 200 माइक्रोन.(बी)ज़ूम (20x) पीकेजे (लेबल) की प्रतिनिधि छवि पीकेजे मांसपेशी (सफेद एरोहेड), गुर्दे की धमनियों (तारक) के स्थानों को दर्शाती किडनी पैरान्चिमल ऊतक के बीच निलंबित कर दिया गया है। स्केल बार = 50 माइक्रोन(सी)पीडीजीएफआरα+ कोशिकाओं में GCaMP व्यक्त पीकेजे की उच्च शक्ति (40x) छवि। स्केल बार = 20 माइक्रोन(डी)पीकेजे की उच्च शक्ति (20x) छवि चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में GCaMP व्यक्त करती है। स्केल बार = 20 माइक्रोन.(ई)सीए2 + यात्रियों के स्थानिक मानचित्र को पैनल सीमें दर्शाए गए जीसीएएमपी+ पीडीजीएफआरएफवाई+ सेल से नमूना दिया गया है । एफ/एफ0के लिए कोडित टेबल देखें । (1)सीए2 + यात्रियों का स्थानिक मानचित्र पैनल डीमें दर्शाए गए जीसीएएमपी+ पीडीजीएफआरएफवाई+ सेल से नमूना लिया गया है । एफ/एफ0के लिए कोडित टेबल देखें । (जी)जीसीएएमपी + पीडीजीएफआरवाई + कोशिकाओं और जीसीएएमपी + एसएमएमएचसी कोशिकाओं के लिए सीए2 + क्षणिक आवृत्ति (हर्ट्ज) के लिए प्रतिनिधि डेटा। (एच)जीसीएएमपी + पीडीजीएफआरα + कोशिकाओं और जीसीएएमपी + एसएमएमएचसी कोशिकाओं के लिए सीए2 + क्षणिक अवधि (एस) के लिए प्रतिनिधि डेटा। संक्षिप्त रूप: पीकेजे = पेल्विक-किडनी जंक्शन; PDGFRα+ = प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर-अल्फा-सकारात्मक; smMHC = चिकनी मांसपेशी मायोसिन भारी श्रृंखला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: पीकेजे वाइब्रेटम सेक्शन में जीसीएएमपी+ पीडीजीएफआरα + कोशिकाओं में सहज सीए2 + यात्रियों। संक्षिप्त रूप: पीकेजे = पेल्विक-किडनी जंक्शन; PDGFRα+ = प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर-अल्फा-सकारात्मक। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

वीडियो 2: पेल्विक-किडनी जंक्शन वाइब्रेटम सेक्शन में जीसीएएमपी+ चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में सहज सीए2 + यात्रियों। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

वीडियो 3: सहज Ca2 + गुर्दे medullary कंपन वर्गों में GCaMP+ PDGFRα+ कोशिकाओं में यात्रियों । संक्षिप्त नाम: PDGFRα+ = प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर-अल्फा-सकारात्मक। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

वीडियो 4: गुर्दे की धमनियों के वाइब्रेटम वर्गों में कम आयाम Ca2 + क्षणिक गतिविधि। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

Discussion

आरपी विभिन्न आरपी क्षेत्रों में मनाया अंतर कोशिका घनत्व के साथ कोशिकाओं की एक विषम आबादी के होते हैं । PIC1s (पहले ASMCs के रूप में संदर्भित) पीकेजे में सबसे प्रचुर मात्रा में हैं, जहां पेसमेकर गतिविधि24निकलती है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल, जांचकर्ताओं को माउस गुर्दे के बाकी हिस्सों से पेसमेकर क्षेत्र को अलग करने की अनुमति देता है । एक वाइब्रेटोम का उपयोग करके पीकेजे के वर्गों को काटकर, आरपी के पेसमेकर क्षेत्रों (परेन्चिमा से जुड़े मांसपेशी बैंड के रूप में पहचाने जाते हैं) को बरकरार रखा जाता है, इस प्रकार सेल-विशिष्ट फ्लोरेसेंस रिपोर्टर्स के साथ संयुक्त होने पर आरपी पेसमेकर कोशिकाओं का सही अध्ययन करने के लिए सीटू इमेजिंग में उपयोग करना।

हालांकि यह दृष्टिकोण आरपी पेसमेकिंग में नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है, कुछ विचार हैं जो प्रयोगकर्ताओं को इमेजिंग परिणामों और अनुभागिंग दक्षता में सुधार करने के लिए परिचित होना चाहिए। एक अप्रशिक्षित उपयोगकर्ता के लिए, पीकेजे अलगाव और इमेजिंग की यह विधि फ्लैट-शीट आरपी तैयारी के विशिष्ट तेज विच्छेदन की तुलना में सीखना आसान है। पूरे गुर्दे से आरपी के तेज विच्छेदन को शरीर विज्ञान प्रयोगों के लिए व्यवहार्य ऊतकों को सफलतापूर्वक अलग करने के लिए सप्ताह के लगातार अभ्यास की आवश्यकता होती है। चूंकि इस कंपन खंड प्रोटोकॉल के लिए थोड़ा तेज विच्छेदन ज्ञान की आवश्यकता होती है, यह उन उपयोगकर्ताओं के लिए सुलभ है जिनके पास अन्य चिकनी मांसपेशियों की संरचनाओं को विच्छेदन करने का अनुभव नहीं है।

हालांकि, इस प्रोटोकॉल के लिए ध्यान देने के लिए कुछ महत्वपूर्ण बिंदु हैं। कंपन नमूना प्लेट के लिए गुर्दे का सफलतापूर्वक पालन करने के लिए निपुणता और धैर्य की आवश्यकता होती है। यदि गुर्दे को गलत तरीके से केंद्रित किया जाता है और एक तरफ झुक जाता है, तो सीधे वर्गों के बजाय तिरछा काट दिया जाएगा। पीकेजे की नाजुक प्रकृति के कारण, तिरछा कोण अक्सर पेसमेकर क्षेत्र के मांसपेशियों के बैंड को नष्ट कर सकता है। इसके अलावा, तिरछे वर्गों की इमेजिंग के परिणामस्वरूप खराब इमेजिंग अधिग्रहण होता है क्योंकि सेल नेटवर्क आमतौर पर एक ही फोकल प्लेन में नहीं होते हैं। प्रक्रिया भी समय लेने वाली है, एक गुर्दे की खंडिंग के साथ अक्सर पूरा करने के लिए एक घंटे तक ले, जिसके दौरान सेटअप निगरानी की आवश्यकता है ।

जबकि वाइब्रेटम के आंदोलन को उड़ सकता है, यदि गति बहुत अधिक बढ़ जाती है (प्रोटोकॉल में अनुशंसित की तुलना में >20%), ब्लेड गुर्दे को सफाई से काटने के बजाय कटा होगा, जिसके परिणामस्वरूप नाजुक पीकेजे संरचनाओं का नुकसान होगा। इसी तरह, एक काटने की गति जो बहुत कम है, धारा दांतेदार हो सकती है। गति और ब्लेड आयाम काटने का अनुकूलन आवश्यक है। कंपन वर्गों को संभालने में भी सावधानी बरती जानी चाहिए। उनकी नाजुक प्रकृति के कारण, पीकेजे मांसपेशियों को संभालने के दौरान आसानी से बाधित किया जाता है और आंसू आ सकते हैं। एक अच्छी तरह से प्रशिक्षित उपयोगकर्ता लगभग 1-2 पीकेजे क्षेत्रों प्रति 4 गुर्दे के स्लाइस को काटने में सक्षम होगा जो सीए2 + इमेजिंग प्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं। आमतौर पर, पीकेजे अनुभाग जो सीए2 + इमेजिंग मानदंडों को पूरा नहीं करते हैं: 1) गरीब GCaMP अभिव्यक्ति, 2) एक contorted PKJ दीवार, या 3) एक टूटी हुई पीकेजे दीवार। डेटा विश्लेषण के लिए, देखने के क्षेत्र प्रति लगभग 3-4 कोशिकाओं (FOV) नमूना जा सकता है ।

जबकि पीडीजीएफआरα-GCaMP6f और एसएमसी-जीसीएएमपी 3 पीकेजे वर्गों के एफओवी में कई कोशिकाएं हैं, छोटे ऊतक आंदोलन अक्सर विश्लेषण से कोशिकाओं को बाहर करते हैं। यह आमतौर पर छवियों के लिए एक स्थिरीकरण प्रोटोकॉल लागू करके हल किया जा सकता है। उन परिस्थितियों में जहां तैयारी नहीं होती है, कम से कम 3-5 कोशिकाओं का नमूना PDGFRα-GCaMP6f वर्गों और एसएमसी-जीसीएएमपी 3 वर्गों से 5-6 कोशिकाओं से लिया जा सकता है। आमतौर पर, पशु बलि से लिया गया समय (चूहों के लिए इष्टतम आयु 8-16 सप्ताह है) सीए2 + इमेजिंग प्रयोगों को करने के लिए 2-3 घंटे है, जो ऊतक अखंडता सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है, अगर आवश्यकता पड़ने पर प्रक्रिया के दौरान ऊतकों को बर्फ-ठंडे समाधानों में इनक्यूबेटेड किया जाता है। संक्षेप में, माउस किडनी से आरपी पीकेजे क्षेत्रों की अक्षुण्ण तैयारी उत्पन्न करने के लिए यहां एक वाइब्रेटोम कटिंग प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। यह तकनीक आरपी पेसमेकर तंत्र की जांच करने के लिए सीटू सीए2 + इमेजिंग अध्ययनों में आरपी पेसमेकर क्षेत्रों के संरक्षण की अनुमति देती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना को एनआईडीडीके से R01 DK124509 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well culture plate ThermoFisher Scientific 142485 To store kidney slices in
35 mm x 10 mm Petri dishes Sigma Aldrich CLS430165 Kidney slice calcium imaging dish
48-well culture plate ThermoFisher Scientific 152640 To store kidney slices in
60 mm x 15 mm Petri dish Sigma Aldrich P5481 Kidney sharp dissection dish
Absorbent paper Fisher Scientific 06-666A To dry the kidney before applying glue
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J The Jackson Laboratory 13148 GCaMP3 Mice
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J The Jackson Laboratory 24105 GCaMP6f Mice
B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J The Jackson Laboratory 19079 smMHC-CRE Mice
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J The Jackson Laboratory 13148 PDGFRa-CRE Mice
Cyanoacrylate glue Amazon B001PILFVY For adhering the kidney to the specimen plate
Ethanol Phamco-Aaper SDA 2B-6 For dissection
Extra-Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14083-08 Used for internal dissecting scissors
Fine scissors Fine Science Tools 14060-09 Used for external dissecting scissors
Fine-tip forceps Fine Science Tools 11254-20 Used for fine dissection of kidney
Gillette Silver Blue double-edge blades Amazon B009XHQGYO For insertion into blade holder of vibratome
ImageJ NIH For calcium imaging analysis
Isoflurane Baxter NDC 1001936060 For anesthesia
Minutien pins Fisher Scientific NC9677548 Pins were cut in half to reduce their length
Silicon elastomer Fisher Scientific NC9285739 Sylgard 184
Student Adson Forceps Fine Science Tools 91106-12 For gently holding and moving the kidney
Student Dumont Forceps Fine Science Tools 91150-20 Used for internal dissecting forceps
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-03 For sharp dissection and cleanup of isolated kidney
Vibrocheck Leica 14048142075 Optional component for calibrating blade movement during cutting
VT1200 S Vibrating Blade Microtome Leica 14912000001 Configuration 1 is used in our protocol

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References

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Grainger, N., Sanders, K. M., Drumm, B. T. Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning. J. Vis. Exp. (170), e62040, doi:10.3791/62040 (2021).

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