Summary
Målet med detta protokoll är att isolera intakt pacemaker regioner i mus njurlymfknutor bäcken med vibratome sektionering. Dessa sektioner kan sedan användas för in situ Ca2 + avbildning för att klargöra Ca2 + övergående egenskaper hos pacemakerceller och andra interstitiella celler i vibratome skivor.
Abstract
Njur bäckenet (RP) är en trattformad, smidig muskelstruktur som underlättar normal urintransport från njuren till urineter genom regelbundna, framstötande sammandragningar. Regelbundna RP-sammandragningar förlitar sig på pacemakeraktivitet, som härrör från den mest proximala regionen i RP vid bäcken-njurkorsningen (PKJ). På grund av svårigheten att komma åt och bevara intakta preparat av PKJ, de flesta undersökningar på RP pacemaking har fokuserat på encellig elektrofysiologi och Ca2 + bildframställning experiment. Även om viktiga avslöjanden om RP-pacemaking har uppstått från sådant arbete, har dessa experiment flera inneboende begränsningar, inklusive oförmågan att exakt bestämma cellulär identitet i blandade suspensioner och bristen på in situ-avbildning av RP pacemaker-aktivitet. Dessa faktorer har resulterat i en begränsad förståelse av de mekanismer som ligger till grund för normala rytmiska RP-sammandragningar. I det här dokumentet beskrivs ett protokoll för att förbereda intakta segment av mus PKJ med hjälp av en vibratome sektionering teknik. Genom att kombinera detta tillvägagångssätt med möss som uttrycker cellspecifika reportrar och genetiskt kodade Ca2 + -indikatorer, kan utredare mer exakt studera de specifika celltyper och mekanismer som ansvarar för peristaltiska RP-sammandragningar som är avgörande för normal urintransport.
Introduction
Njurskinn (RP) är en trattformad, smidig muskelstruktur som transporterar urin från njuren till urinröret. RP transporterar urin genom att generera regelbundna rytmiska sammandragningar (peristalsis)1,2,3,4,5, som driver en bolus av urin från njuren distally till urinröret och slutligen till urinblåsan, där den lagras tills micturitionuppstår 6,7. Förlust av denna regelbundna verksamhet har allvarliga konsekvenser, inklusive hydronefen och njursvikt1,3,8; Därför finns det ett kritiskt behov av att studera mekanismerna bakom regelbundna, rytmiska RP-sammandragningar. Peristaltiska sammandragningar härrör från den mest proximala regionen i RP-in bäcken-njurkorsningen (PKJ)9,10,11,12,13,14,15 (Figur 1A-C) och förökar sig distally för att trycka urin från papillan in i RP (Figur 1B). Elektrisk pacemaker aktivitet registreras i PKJ som spontana övergående depolarizations10,11,12,13,15,16,17, som tros uppstå från specialiserade pacemaker celler. Dessa pacemakerceller, tidigare kallade atypiska släta muskelceller (ASMCs), tros generera eller samordna pacemakeraktivitet och driva sammandragningarna av "typiska" släta muskelceller (SMCs)9,10,11,18,19,20,21,22,23.
ASMCs är mest rikliga i den proximala RP, vid PKJ (Figur 1A-C), där peristaltic sammandragningar och elektrisk pacemaker verksamhet har sitt ursprung5,7,8,9,12,13,14,16,17,18,19,20,21 ,22. En nyligen publicerad studie av denna grupp identifierade trombocyt-härledd tillväxtfaktor receptor-alfa (PDGFRα), i kombination med glatt muskel myosin tung kedja (smMHC), som en unik biomarkör för dessa interstitiella celler (ICs)24, ett fynd som har bekräftats av andra grupper25. Baserat på deras morfologi och proteinuttrycksmönster kallades dessa celler PDGFRα+ IC typ 1 (PIC1)24,26. PIC1s ligger i muskelskiktet i PKJ där de visar högfrekventa, kortvariga Ca2 + transienter, som tros ligga till grund för generationens pacemakerpotentialer24. Det finns dock andra celltyper i PKJ, inklusive icke-smMHC-uttryck PDGFRα+ ICs (PIC2s) i det adventitiala skiktet. Tidigare rapporter har föreslagit att icke-SMMHC ICs får delta i regleringen av pacemakeraktivitet19. Ytterligare studier av icke-smMHC ICs hindras dock av dålig skillnad under Ca2 + imaging studier. Vanligtvis är heterogena celltyper inom RP-preparaten urskillningslöst laddade med Ca2 +-känsliga färgämnen (t.ex. Fluo-4). För att övervinna dessa utmaningar och för att studera en mängd olika celltyper i RP, kan genetiskt kodade Ca2 + indikatorer (GECIs) användas för att selektivt uttrycka Ca2 +-känsliga fluorforer i celltyper av intresse.
Majoriteten av studier som belyser Ca2 + övergående egenskaper i PIC1s / ASMCs uppnåddes genom bildbehandling platt-sheet RP vävnadspreparat19,21,27. Eftersom PIC1s är den enda celltypen i PKJ som uttrycker smMHC, är villkorligt uttryck för GECI, GCaMP, i smMHC+ celler lämpligt att studera PIC1s i denna konfiguration. Men som PIC1s och PIC2s båda uttrycker PDGFRα, villkorligt uttryck för GCaMP varianter i PDGFRα+ celler förbjuder cellskillnad i flat-sheet preparat. För att kringgå denna fråga användes en vibratome sektionering tillvägagångssätt för att skilja PIC1s och PIC2s över PKJ vävnad vägg24. För att avslöja dessa diskreta cellulära populationer, RP var sektionerade coronally, vilket gör det möjligt att identifiera PIC2s i adventitia och PIC1s i muskelväggen baserat på kända immunohistochemical märkning och GECI uttryck mönster. Som ett resultat av denna nya PKJ-bildbehandlingsmetod visade sig PIC1s och PIC2s visa distinkta Ca2 + signalegenskaper24. Genom att isolera de mest proximala delarna av PKJ-regionen (figur 2) bevarades dessutom pacemakerregionen i RP på ett sätt som inte hade uppnåtts tidigare. Här beskrivs ett protokoll för att visa hur man isolerar PKJ-preparat från mus njuren med hjälp av vibratome sektionering, hur man ställer in dessa preparat för Ca2 + bildframställning experiment och hur man skiljer de olika celltyperna över PKJ väggen.
Protocol
Alla möss som användes och de protokoll som beskrivs i denna studie var i enlighet med National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och Institutional Animal Use and Care Committee vid University of Nevada, Reno, NV. Försök och djuranvändning överensstämde också med de principer och föreskrifter som beskrivs i Grundy28.
1. Generera PDGFRα-GCaMP6f och SMCGCaMP3 möss
- Korsa GCaMP6flox/+ möss (B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/J) med PDGFRαCre möss (C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J) för att generera PDGFRα-GCaMP6f möss.
- Korsa GCaMP3lox/+ möss (B6.129S-Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J) med manliga smMHCCreERT2 möss (B6. FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J) för att generera SMC-GCaMP3 möss.
OBS: Endast hanmöss av korset(GCaMP3lox/+ möss och smMHCCreERT2 möss) kan användas eftersom Cre uttryck drivs från Y-kromosomen. smMHCCreERT2 möss kan också korsas med GCaMP6flox/+ möss för förbättrad Ca2 + signal-till-brusförhållande och snabbare Ca2 + signal temporala egenskaper.
2. Förbered och injicera transgena möss med tamoxifen för att inducera villkorligt uttryck av GCaMP
- Aktivera inducible Cre rekombinas för cellspecifik gcamp-uttryck i specifika celltyper, som tidigare beskrivits29.
3. Förbered lösningar
- Bered 1 L Krebs-Ringer bikarbonatlösning (KRB) som innehåller 120,35 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 15,5 mM NaHCO3,1,2 mM Na2HPO4,1,2 mM MgCl2,11,5 mM glukos och 2,5 mM CaCl2. På användningsdagen, behåll KRB-lösningen på is.
OBS: KRB kan förvaras vid 4 °C i upp till en vecka och bör förbubblas med en blandning av 97% O2 och 3% CO2 i minst 10 minuter före användning.
4. Förbered silikon elastomerbelagd dissekering och mikroskopavbildningsfat
- Blanda silikon elastomerkomponenter enligt tillverkarens instruktioner. Fyll en petriskål på 35 mm x 10 mm och en petriskål på 60 mm x 15 mm som är ungefär en fjärdedel full av flytande silikon elastomer för bildexperiment respektive dissekering. Polymerisera silikon elastomer vid 37 °C i 1 dag före användning.
OBS: För att förbättra kontrasten mellan tunna njursektioner, applicera en liten svart cirkel av papper på basen av avbildning petriskålen innan du fyller med silikon elastomer.
5. Njure dissekering
- Söv möss genom inandning av 3-4% isofluran i en ventilerad huva. Bekräfta induktion av djup anestesi genom förlust av tå och/eller svans nypa reflex, och sedan avliva mössen genom massundersökning förskjutning.
- Applicera 70% etanol på bröstet för att dämpa pälsen. Använd extern dissekeringssax, öppna bukhålan via ett längsgående snitt, med saxblad vinklade bort från djuret för att förhindra skador på de inre organen.
- Använd inre vävnadstångar och inre dissekeringssaxar, nyp tarmarna och lyft dem bort från bukväggen. Medan du lyfter tarmarna, skär undersidan av tarmarna fria från kroppen vid det proximala årondenumet och distala tjocktarmen för att få tillgång till det retroperitoneala utrymmet som innehåller njurarna.
- När njurarna är exponerade, extrahera dem individuellt. Nyp försiktigt och lyft ureterns distala ände (~ 4 mm från njuren) med vävnadstångor. Använd dissekeringssaxen, skär under den klämda uretern mot njuren. Fortsätt att skära under njuren tills den har lossnat från den omgivande bindväven.
OBS: För att maximera vävnadens integritet och skärkonsistens under vibratome sektionering måste njuren vara så intakt som möjligt. För att säkerställa detta, undvik att klämma eller skära av njuren med tång och dissekeringssax. - Placera njuren med fastsatt urinrör i iskall KRB-lösning. Upprepa steg 5.4 och 5.5 med kontralateral njure. Håll njurarna i KRB-lösning på is.
OBS: Fortsätt omedelbart till nästa avsnitt i protokollet för att bevara PKJ-vävnadens livskraft. På grund av dess anatomiska läge djupt i njurparenkymen berövas PKJ kontakt med KRB-lösning.
6. Förbered njuren för vibratome sektionering
- Överför njuren till en silikon elastomerbelagd dissekeringsform (60 mm x 15 mm) och fyll den med iskall KRB-lösning tills njuren är helt nedsänkt.
- Under ett dissekerande mikroskop förankrar du njuren i skålens botten genom att föra in minutienstift i den proximala uretern och genom den tunna främre njurkapseln eller omgivande fettvävnad.
OBS: Var försiktig så att du inte punkterar njurparenkymvävnaden. - Använd finfjädersax och inre tång för att avlägsna fettvävnad från njurens botten för att exponera den distala RP och proximala uretern.
- Ta bort den proximala uretern och en del av den distala RP från basen av RP med hjälp av finfjädersax.
OBS: Var försiktig så att du inte skär den omgivande njurparenkymen. Den svarta streckade linjen i figur 1A anger den ungefärliga positionen för denna skärning. Detta snitt skapar en platt bas på njuren för mer enhetlig vävnadssektionering. Vid dissekering av njuren måste man vara medveten om PKJ-regionens anatomiska position. Figur 1B visar att den intakta njuren kan skäras längs ett sagittalplan för att exponera medulla, papilla (distala medulla där uppsamlingskanaler konvergerar) och proximal och distal RP. Om papillan skulle exponeras helt, som i figur 1C, kan PKJ och proximal RP (prox RP) visualiseras. Detta bör dock inte göras för vibratome-tekniken; Denna beskrivning är att orientera läsaren till PKJ-platsen i allmänhet, betonas i den anatomiska skillnaden som visas i de överförda ljusbilderna i PKJ-regionen och mitten av RP-regionen i figur 1D, E. - Genomborra den yttre njurkapseln med finspetstångar och mete spetsarna bort från njurkroppen. Använd tång med varje hand, nyp ihop kapselens lösa ändar och skala isär dem. Fortsätt att skala tillbaka det återstående njurkapselmembranet tills det tas bort helt.
OBS: Njurkapseln är ett tufft, fibröst lager som omger njuren. Den måste tas bort före vibratome sektionering för optimal skärning.
7. Förbered och kalibrera vibratomeinstrumentet
- Sätt in ett rakblad i vibratomeinstrumentets bladhållare och justera bladavståndsvinkeln till ~18°.
OBS: Som ett valfritt steg för sektionering av högre kvalitet bör ett kalibreringsblock (som är försett med vissa vibratomeinstrument) användas för att justera bladpositionen för varje nytt blad som används enligt tillverkarens instruktioner. Detta säkerställer optimal positionering av bladet och minimerar vertikal vibrationer. - Justera bladets förflyttningshastighet till 0,2 mm/s, bladets horisontella vibration/utbredning till en amplitud på 2,00 mm och bladets Z-stegstorlek till ~100-150 μm. Se till att njursektionens tjocklek inte överstiger 150 μm eftersom detta kommer att påverka Ca2 + avbildningsexperiment negativt (eftersom PKJ-väggen ofta rullar och viker sig på sig själv om den är för tjock).
OBS: Användaren bör finjustera dessa skärparametrar eftersom inställningarna varierar mellan enskilda njurpreparat och vibratominstrument. Finjustering bör ske under sektionering när användaren visuellt kan inspektera sektioner under ett mikroskop, enligt beskrivningen i steg 7.2. - Montera ett isbad och en buffertbricka på vibratomeinstrumentet. Fyll isbadet med krossad is och fyll det inre scenområdet med iskall KRB-lösning (fyll till ungefär halvfull). Under vibratome sektionering, övervaka och ersätta den krossade isen som har smält.
8. Vibratome som delar upp njuren
- Använd trubbiga tångar för att försiktigt greppa och ta bort den beredda njuren från iskall KRB-lösning. Placera omedelbart njuren på absorberande papper i ~ 2-4 s för att avlägsna överskott av yttre fukt. Rulla försiktigt njuren över det absorberande papperet för att säkerställa att alla sidor av parenkymen har torkat så att det finns optimal vidhäftning av njuren till vibratomestadiet.
OBS: Eftersom RP är placerad inuti njuren och därför skyddas av den yttre parenkymen, skulle denna korta torkperiod inte vara skadlig för vävnadens integritet. - Applicera omedelbart ett tunt lager cyanoakrylatlim (~ 1 cm2) på basen av vibratomeprovplattan och använd trubbiga tångar för att placera njuren, uretersidan nedåt, på det område som är täckt av lim. Tryck försiktigt nedåt på njurens överkant med den plana kanten av tången i ca 10-20 s för att torka limet.
OBS: För att stabilisera njuren under denna procedur, använd ytterligare ett par tångar för att hålla njuren upprätt när limet torkar. Det är viktigt att njuren klibbar vid provplattan i upprätt läge så att sektionerna skärs rakt. För att säkerställa att njuren framgångsrikt har klibbat vid provplattan, tryck försiktigt på sidan av njuren. Om njuren framgångsrikt har klibbat vid plattan, bör njurens botten förbli fastsatt på plattan. - Fäst provplattan ordentligt på botten av buffertfacket. Justera nivån på KRB-lösningen så att njurens över topp är helt nedsänkt. Under sektioneringssteg, när vibratomebladet rör sig djupare in i buffertfacket, ta bort KRB-lösningen så att bladhållaren inte blir nedsänkt i lösningen.
OBS: Om limet inte har torkat helt innan du fortsätter med detta steg, kommer limet ofta att röra sig upp från basen och vidare till njurparenkymen. Detta överflödiga lim gör sektionering mer variabel. Om detta händer, ta bort njuren från plattan och fortsätt med en ny njurpreparat. - För automatisk vibratome sektionering, välj start- och slutlägen för vibratome bladskärningscykeln. Kontrollera att dessa positioner är ~ 0,5-1 cm från njuren för att säkerställa att hela njurplanet är sektionerat med varje bladframsteg.
- Förbered en flerbrunnig platta (24- eller 48-brunn) genom att fylla brunnar med KRB-lösning och placera plattan på is.
OBS: När de genereras bör enskilda sektioner placeras i separata brunnar för att hålla reda på sektionsdjupet. - Starta den automatiska skärprocessen. Under bladets första passering, se till att bladet kommer i kontakt med toppen av njuren. Om kontakt inte görs, justera bladets startläge Z-position.
- Använd tång, samla sektioner som är befriade från njuren. Överför omedelbart sektionerna till enskilda brunnar och notera sektionens Z-djup för att mäta den ungefärliga PKJ-platsen inom njursektioner.
OBS: Beroende på skärparametrarna får vissa sektioner inte skäras loss från njurblocket. Om detta inträffar, använd försiktigt finfjädersax för att skära sektioner från njurblocket. Användare uppmuntras också att aktivt visualisera sektioner under ett ljusmikroskop medan de flyter fritt i enskilda brunnar för att säkerställa optimala skärinställningar och vävnadsplats. Sektioner som innehåller PKJ kommer vanligtvis att härledas ~ 1000-1500 μm från toppen av njuren. - Fortsätt sektionsprotokollet tills PKJ-regionerna blir tydligare. Se avsnittet representativa resultat för beskrivning av PKJ-regionerna när avsnitten fortskrider.
- Optimera vid denna tidpunkt sektionsparametrarna för att säkerställa att sektionerna frigörs från njurblocket jämnt och är intakta. Se dessutom till att PKJ-regionerna är kontinuerliga och obrutna eftersom trasiga PKJ-väggar inte tillåter adekvat avbildning av celler i väggen på grund av kollaps. Om väggar bryts, minska sektionshastigheten och öka sektionstjockleken och fortsätt att observera sektioner under ett ljusmikroskop för att finjustera skärparametrarna.
- Förvara sektionerna vid 4°C i KRB-lösning tills experimentet påbörjas.
9. Njurskiva Ca2+ bildförvärv
- Överför en enskild njurskiva till en silikon elastomerbelagd bildform (35 mm x 10 mm) och fyll omedelbart skålen med en fräsch, iskall KRB-lösning.
- Sätt in minutienstift runt periferin på en njurskiva för att fästa sektionen vid basen av bildbehandlingsskålen.
OBS: Detta steg är avgörande för att förhindra att sektionen rör sig när fysiologiska lösningar perfunderas över skivan under avbildning. - Placera bildfatet på scenen i ett upprätt spinndiskens konfokala mikroskop och börja omedelbart perfusera med KRB-lösning.
OBS: I detta protokoll användes ett upprätt mikroskop utrustat med en höghastighets Nipkow spinning disk confocal scanner enhet. - Håll perfusionshastigheten vid 3 ml/min och krb lösningstemperatur vid 36 ± 1 °C. Låt skivan jämvikta i 1 timme före avbildning.
- Välj lämplig dichroic imaging kub och lasrar. Skaffa bilder med en elektron-multiplicerande laddningsankparad enhet (EMCCD) eller vetenskaplig kompletterande metalloxid-halvledarkamera.
OBS: Det konfokala systemet i detta protokoll är utrustat med en 488 nm laser för att excitera GCaMP6f eller GCaMP3. Bilder förvärvades med en EMCCD-kamera med 512 bildpunkter x 512 pixlar. - Använd en objektivlins med låg förstoring, vattensänkning (4x eller 10x) för att hitta njurskivan. Centrera bildfältet på områden i segmentet där PKJ finns. Identifiera landmärken, som avbildas i figur 2D, för att lokalisera PKJ (dvs. halvcirklar av muskelvävnader upphängda mellan parenkymal vävnad).
- När PKJ är placerad, använd en högre förstoring vatten-nedsänkning mållins (20x, 40x eller 60x) för att förstora intresseområdet.
OBS: I detta protokoll var 20x mål numerisk bländare (NA) 1,0, 40x mål NA var 0,8 och 60x mål NA var 1,0. - Särskilj olika celler av intresse i PKJ-väggen med hjälp av transgena möss som uttrycker GCaMP6f eller GCaMP3 i PDGFRα+ celler respektive SMC. Observera de olika typerna av Ca2+ övergående varaktigheter i PDGFRα+ celler i PKJ-väggen i PDGFRα+ GCaMP6f+ njurskivor(figur 3C, se representativa resultat för beskrivning) och i GCaMP3+ SMC i SMC GCaMP3+ njurskivor(figur 3D, se representativa resultat för beskrivning).
- När celler av intresse för PKJ-väggen har identifierats justerar du laserintensiteten så att den ger ett bra signal-till-brusförhållande. Spela in bilder med en temporal samplingsfrekvens mellan 16 Hz och 32 Hz med hjälp av lämplig förvärvsprogramvara.
OBS: Beroende på laserintensitet som används vid avbildning rekommenderas att antalet inspelningar på grund av blekningseffekterna på Ca2+ fluorforer minskas. Användaren bör välja inspelningslängd baserat på de specifika experimentella målen.
10. Ca2+ bildanalys
- Utför Ca2+ avbildningsanalys av olika celltyper i PKJ pacemaker regioner genom spatiotemporal mappning som tidigare beskrivits för andra intakt pacemaker preparat i mag-tarmkanalen29,30.
Representative Results
In situ Ca2+ avbildning av PKJ kan avslöja viktig cellulär aktivitet av RP pacemaker celler. Genom att använda möss som uttrycker genetiskt kodade Ca2+ indikatorer (t.ex. GCaMP), drivna av cellspecifika promotorer, kan information om RP-pacemaking erhållas med noggrannhet och detaljer som inte är möjliga från Ca2 + bildexperiment från plattark RP-preparat. Början av PKJ kännetecknas av det plötsliga utseendet på halvcirklar av muskler upphängda mellan njurparenkymal vävnad (Figur 2C; proximal PKJ innesluten i streckad låda). Under efterföljande omgångar av sektionering blir den inre medulla särskiljbar från den omgivande närvävnaden. Under ett ljust mikroskop verkar den inre medullan strimmig i regioner, ljusare i färg jämfört med närvävnad och diskontinuerlig på sin långa axel med resten av njuren (Figur 2B,D). I det här läget kommer fler PKJ-regioner att börja dyka upp. Exempel på detta visas i figur 2D (streckade rektanglar, H och G) där 3 halvcirklar av muskler suspenderas av parenkymal vävnad. Dessa muskelband kommer att vara nära apposed till den inre papilla och kommer vanligtvis granne en njurlymfknutor arteriole (Figur 2D, streckade rektanglar; Bild 2F-H, svarta pilspetsar). I och med att mer distala sektioner härleds kommer dessa muskelband att integreras för att bilda en mer komplett, enhetlig struktur, vilket indikerar slutet på PKJ-regionen (figur 2E).
Figur 3A, B visar en PKJ-sektion med låg effekt (4-10x) från en mus som uttrycker GCaMP i PDGFRα+ celler (GCaMP6f uttryckt av inducerbar veckrekombinas driven av Pdgfra). Med hjälp av landmärken som njurartären(figur 3A, asterisk) bör försökspersonerna lätt kunna skilja den tunna PKJ-väggen mellan parenkymal vävnad (Figur 3B; asterisker). Uttrycket av GCaMP6f i denna specifika transgena vävnad sprids över PKJ: s hela bredd, över både muskel- och adventitialskikten (Figur 3C).
I PDGFRα+ GCaMP6f+ njurskivor kommer ett nätverk av celler som vanligtvis sträcker sig över bredden på PKJ-väggen att vara fluorescerande (Figur 3C) och visa oscillerande Ca2 + övergående av olika varaktigheter och frekvenser. PDGFRα+ celler i PKJ-väggen visar två olika typer av Ca2 + övergående varaktigheter. I det adventitiala skiktet (orienterat närmare cortex) definieras PDGFRα+ celler som finns som ett nätverk av celler och deras processer. Adventitial PDGFRα+ celler uppvisar lågfrekventa (4 ± 2,7 Hz) och lång varaktighet (1 ± 0,67 s) Ca2 + transienter. Det andra lagret av PDGFRα+ celler, närvarande i muskelskiktet (orienterat närmare medulla), uppvisar liknande Ca2 + övergående frekvenser och varaktigheter som SMC GCaMP3+ celler (beskrivs nedan) eftersom de är samma celltyp.
I SMC GCaMP3+ njurskivor finns ett lager av GCaMP3+ celler i muskelskiktet ( Figur3D). Det kommer inte att finnas någon fluorescerande signal i det äventyrliga skiktet(Figur 3D; asterisk). GCaMP3+ SMCs i muskelskiktet uppvisar vanligtvis högfrekventa (10 ± 4 Hz) och kort varaktighet (632 ± 74 s) Ca2 + transienter. PDGFRα+ celler belägna i PKJ adventitia framkallar långvariga, lågfrekventa Ca2 + transienter ( Figur3E, Video 1). Ca2+ bildexperiment från vävnad som uttrycker GCaMP3 som drivs av Myh11-promotorn är dock begränsade till den muskulösa aspekten av PKJ (Figur 3D). Jämfört med PDGFRα+ celler i adventiten avfyrade små och medelstora företag kortare varaktighet Ca2+ transienter oftare(figur 3F, Video 2).
Förutom att förstå signalegenskaper i PKJ PDGFRα+ ICs, har tillämpningen av denna teknik för att studera andra celltyper i den vibratome-sektionerade njuren visats i detta papper. Vid noggrann undersökning av njurmedicinska medulla (hos möss som uttrycker GCaMP6f i PDGFRα+ celler) observerades en rad fluorescerande Ca2 + signaler inom och kring samlande kanaler (Video 3). Medullary PDGFRα+ celler avfyrade spontana Ca2 + transienter av variabel frekvens och varaktighet. Dessa Ca2 + imaging studier av njure vibratome avsnitt kan också utvidgas till att studera njurlymfknutor arterioler (~ 50-80 mm diameter) som ofta granne PKJ muskelsegment (Figur 2F, G; vita pilar). Ca2+ avbildning av njurartärer (från vävnad som uttrycker GCaMP i glatta muskelceller) visar oscillerande Ca2 + transienter i SMC (Video 4).
Figur 1:Grundläggande njuranatomi och placering av PKJ pacemaker-regionen. (A) Diagram över den intakta njuren som visar ORIENTERINGen hos RP och ureter. Njurartären och njurlymfknutan ven visas i rött respektive blått. B)Den intakta njuren kan skäras längs ett sagittalplan för att exponera den inre aspekten av njuren, inklusive medulla, papilla (distala medulla där uppsamlingskanaler konvergerar) och proximal och distala RP. (C) Medulla och papilla kan strukits för att helt exponera PKJ och prox RP. (D och E) representerar överförda ljusbilder från PKJ pacemaker-regionen respektive distala RP. Sekventiell sektionering mot bäckenets distala ände resulterar i halvcirkeln av muskler i PKJ-regionen (Di) som kombineras till en, tjockare muskelring (Ei) som kapslar in hela papilla. Svarta, streckade rektanglar i Di och Ei visar ungefärliga områden i koronar njursektioner där överförda ljusbilder förvärvades. Orienteringen av bilderna D och E är 90° moturs till respektive insets (Di och Ei). Skalstänger i D och E = 20 μm. Förkortningar: RP = njurskinn; prox RP = proximalt njurs bäcken; PKJ = bäcken-njure korsning; PICs = trombocyt-härledda tillväxtfaktor receptor-alfa-positiva interstitiella celler; SMC = smidig muskelcell. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Vibratomesektionering av hela njurar för att generera tunna sektioner. (A) Njurar monteras ureter sida ner till basen av vibratome instrumentet, och ett standardblad (fäst vid vibratome huvudet) används för att skära sekventiella sektioner från den proximala till distala änden av njuren. B)Diagrammatisk representation av en tunn sektion som är skuren från hela njuren med kommenterade landmärken. PKJ muskelsegment (svart streckad rektangel) finns ofta upphängda mellan parenchymal vävnad. C)Ljus mikroskopisk bild av en proximal njursektion. Utseendet på muskelband upphängda mellan parenkymal vävnad indikerar början på de proximala PKJ-projektionerna (anges inuti vit streckad rektangel). (D) Ljus mikroskopisk bild som representerar den optimala regionen där flera (2-3) PKJ-segment kan hittas (områden inom vita streckade rektanglar). Tunna PKJ muskelremsor är upphängda mellan njurparenkym och överensstämmer nära njurlymfknutor arterioler och medulla. (E) Ljus mikroskopisk bild av en distala njure avsnitt. Enskilda muskelsegment har slagits samman för att bilda ett enda, kontinuerligt muskelband (vit streckad rektangel) som omger den inre papillan (inte närvarande i den här bilden). Skalstänger C-E = 500 μm. F-H Zoomade (20x) regioner från panel D anger platsen för PKJ (svarta pilspetsar), njurartärer (vita pilspetsar) och skärplatser för att isolera PKJ (streckade vita linjer). Skalstänger F-H = 100 μm. Förkortning: PKJ = bäcken-njure korsning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3:Ca2+ avbildning av vibratomesektioner. (A) Representativ lågeffektsbild (4x) av en vibratomesektion som betecknar platsen för njurartären (asterisk). Skala bommar för = 200 μm. (B) Zoomed (20x) representativ bild av PKJ (märkt) suspenderad mellan njurparenchymal vävnad betecknande platser för PKJ muskel (vit pilspets), njurlymfknutor arteriole (asterisk). Skalstång = 50 μm. (C) Hög effekt (40x) bild av PKJ uttrycker GCaMP i PDGFRα+ celler. Skalstång = 20 μm. (D) Hög effekt (20x) bild av PKJ uttrycker GCaMP i släta muskelceller. Skalstång = 20 μm. (E) Spatiotemporal karta över Ca2 + transienter som provtagits från en GCaMP+ PDGFRα+ cell som anges i panel C. Slå upp tabell kodad för F/F0. (F) Spatiotemporal karta över Ca2+ transienter som provtagits från en GCaMP+ PDGFRα+ cell som anges i panel D. Slå upp tabell kodad för F/F0. (G) Representativa data för Ca2+ övergående frekvens (Hz) för GCaMP+ PDGFRα+ celler och GCaMP+ smMHC-celler. (H) Representativa data för Ca2+ övergående varaktighet (er) för GCaMP+ PDGFRα+ celler och GCaMP+ smMHC-celler. Förkortningar: PKJ = bäcken-njure korsning; PDGFRα+ = trombocyt-härledd tillväxtfaktor receptor-alfa-positiv; smMHC = glatt muskel myosin tung kedja. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Video 1: Spontana Ca2+ transienter i GCaMP+ PDGFRα+ celler i PKJ vibratome avsnitt. Förkortningar: PKJ = bäcken-njure korsning; PDGFRα+ = trombocyt-härledd tillväxtfaktor receptor-alfa-positiv. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att hämta.)
Video 2: Spontana Ca2 + transienter i GCaMP+ glatt muskelceller i bäcken-njure korsning vibratome avsnitt. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att hämta.)
Video 3: Spontana Ca2+ transienter i GCaMP+ PDGFRα+ celler i njurmedicinska vibratome avsnitt. Förkortning: PDGFRα + = trombocyt-härledd tillväxtfaktor receptor-alfa-positiv. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att hämta.)
Video 4: Låg amplitud Ca2+ övergående aktivitet i vibratome delar av njurlymfknutor arteriole. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att hämta.)
Discussion
RP består av en heterogen population av celler med differentiella celltätheter observerade i olika RP-regioner. PIC1s (tidigare kallade ASMCs) är de vanligaste i PKJ, där pacemakeraktiviteten har sitt ursprungi 24. Protokollet, som beskrivs här, tillåter utredare att isolera pacemakerregionen från resten av mus njuren. Genom att skära delar av PKJ med hjälp av en vibratome hålls pacemakerregionerna i RP (identifierade som muskelband kopplade till parenkym) intakta, vilket ger användning av in situ-avbildning för att noggrant studera RP pacemakerceller i kombination med cellspecifika fluorescensreportrar.
Även om den här metoden kan ge nya insikter om RP-tempo, finns det vissa överväganden som experimenterare bör känna till för att förbättra bildresultaten och sektionseffektiviteten. För en otränad användare är denna metod för PKJ-isolering och avbildning lättare att lära sig än typisk skarp dissekering av plattplåts RP-preparat. Skarp dissekering av RP från hela njurar kräver veckor av konsekvent praxis för att framgångsrikt isolera livskraftiga vävnader för fysiologiska experiment. Eftersom detta vibratome sektionering protokoll kräver lite skarp dissekering kunskap, Det är tillgängligt för användare som inte har erfarenhet av att dissekera andra smidiga muskelstrukturer.
Det finns dock några kritiska punkter att notera för detta protokoll. Framgångsrikt vidhäftande njurar till vibratome exemplar plattan kräver fingerfärdighet och tålamod. Om njuren är felaktigt orienterad och lutar åt ena sidan, kommer sneda snarare än raka sektioner att skäras. På grund av PKJ: s känsliga natur kan den sneda vinkeln ofta förstöra pacemakerregionens muskelband. Dessutom resulterar avbildning av sneda sektioner i dålig bildförvärv eftersom cellnätverk vanligtvis inte finns i samma fokalplan. Förfarandet är också tidskrävande, med sektionering av en enda njure som ofta tar upp till en timme att slutföra, under vilken tid installationen kräver övervakning.
Medan vibratomens rörelse kan påskyndas, om hastigheten ökas för mycket (>20% än vad som rekommenderas i protokollet), kommer bladet att strimla snarare än att rent skära njuren, vilket resulterar i förlust av känsliga PKJ-strukturer. På samma sätt kan en skärhastighet som är för låg orsaka att sektionen blir ojämn. Optimering av skärhastighet och bladamlitud är viktigt. Försiktighet måste också vidtas vid hantering av vibratomesektioner. På grund av deras känsliga natur störs PKJ-muskler lätt under hanteringen och kan riva. En välutbildad användare kommer att kunna skörda cirka 1-2 PKJ-regioner per 4 njurskivor som är lämpliga för Ca2 + bildexperiment. Vanligtvis har PKJ-sektioner som inte uppfyller Ca2 + avbildningskriterier: 1) dåligt GCaMP-uttryck, 2) en förkonterad PKJ-vägg eller 3) en trasig PKJ-vägg. För dataanalys kan cirka 3-4 celler per synfält (FOV) provtas.
Medan det finns många celler i FOV av PDGFRα-GCaMP6f och SMC-GCaMP3 PKJ avsnitt, små vävnad rörelser utesluter ofta celler från analys. Detta kan vanligtvis lösas genom att tillämpa ett stabiliseringsprotokoll på bilder. Under förhållanden där preparat inte rör sig kan minst 3-5 celler provtas från PDGFRα-GCaMP6f-sektioner och 5-6 celler från SMC-GCaMP3-sektioner. Vanligtvis är den tid det tar från djuroffer (optimal ålder för möss är 8-16 veckor) till att utföra Ca2 + bildframställningsexperiment 2-3 h, vilket är tillräckligt för att säkerställa vävnadsintegritet, om vävnader inkuberas i iskalla lösningar under hela proceduren vid behov. Sammanfattningsvis har en vibratome skärprotokoll beskrivits här för att generera intakta preparat av RP PKJ regioner från mus njure. Denna teknik gör det möjligt att bevara RP pacemaker regioner för in situ Ca2 + imaging studier för att undersöka RP pacemaker mekanismer.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta projekt finansierades av R01 DK124509 från NIDDK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 142485 | To store kidney slices in |
| 35 mm x 10 mm Petri dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | Kidney slice calcium imaging dish |
| 48-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 152640 | To store kidney slices in |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Sigma Aldrich | P5481 | Kidney sharp dissection dish |
| Absorbent paper | Fisher Scientific | 06-666A | To dry the kidney before applying glue |
| B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 13148 | GCaMP3 Mice |
| B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 24105 | GCaMP6f Mice |
| B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J | The Jackson Laboratory | 19079 | smMHC-CRE Mice |
| C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J | The Jackson Laboratory | 13148 | PDGFRa-CRE Mice |
| Cyanoacrylate glue | Amazon | B001PILFVY | For adhering the kidney to the specimen plate |
| Ethanol | Phamco-Aaper | SDA 2B-6 | For dissection |
| Extra-Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14083-08 | Used for internal dissecting scissors |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Used for external dissecting scissors |
| Fine-tip forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Used for fine dissection of kidney |
| Gillette Silver Blue double-edge blades | Amazon | B009XHQGYO | For insertion into blade holder of vibratome |
| ImageJ | NIH | For calcium imaging analysis | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 1001936060 | For anesthesia |
| Minutien pins | Fisher Scientific | NC9677548 | Pins were cut in half to reduce their length |
| Silicon elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | For gently holding and moving the kidney |
| Student Dumont Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for internal dissecting forceps |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | For sharp dissection and cleanup of isolated kidney |
| Vibrocheck | Leica | 14048142075 | Optional component for calibrating blade movement during cutting |
| VT1200 S Vibrating Blade Microtome | Leica | 14912000001 | Configuration 1 is used in our protocol |
References
- Constantinou, C. E., Djurhuus, J. C. Pyeloureteral dynamics in the intact and chronically obstructed multicalyceal kidney. The American Journal of Physiology. 241 (5), 398-411 (1981).
- Constantinou, C. E., Yamaguchi, O. Multiple-coupled pacemaker system in renal pelvis of the unicalyceal kidney. TheAmerican Journal of Physiology. 241 (5), 412-418 (1981).
- Constantinou, C. E., Hrynczuk, J. R. Urodynamics of the upper urinary tract. Investigative Urology. 14 (3), 233-240 (1976).
- Schmidt-Nielsen, B., Schmidt-Nielsen, B. On the function of the mammalian renal papilla and the peristalsis of the surrounding pelvis. Acta Physiologica. 202 (3), Oxford, England. 379-385 (2011).
- Dwyer, T. M., Schmidt-Nielsen, B. The renal pelvis: machinery that concentrates urine in the papilla. Physiology. 18 (1), 1-6 (2003).
- Hill, W. G. Control of urinary drainage and voiding. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 10 (3), 480-492 (2015).
- Brading, A. F. The physiology of the mammalian urinary outflow tract. Experimental Physiology. 84 (1), 215-221 (1999).
- Dixon, J. S., Gosling, J. A. The musculature of the human renal calices, pelvis and upper ureter. Journal of Anatomy. 135, Pt 1 129-137 (1982).
- Lang, R. J., et al. Pyeloureteric peristalsis: role of atypical smooth muscle cells and interstitial cells of Cajal-like cells as pacemakers. The Journal of Physiology. 576, 695-705 (2006).
- Lang, R. J., Takano, H., Davidson, M. E., Suzuki, H., Klemm, M. F. Characterization of the spontaneous electrical and contractile activity of smooth muscle cells in the rat upper urinary tract. Journal of Urology. 166 (1), 329-334 (2001).
- Lang, R. J., Exintaris, B., Teele, M. E., Harvey, J., Klemm, M. F. Electrical basis of peristalsis in the mammalian upper urinary tract. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 25 (5), 310-321 (1998).
- Morita, T., Ishizuka, G., Tsuchida, S. Initiation and propagation of stimulus from the renal pelvic pacemaker in pig kidney. Investigative Urology. 19 (3), 157-160 (1981).
- Tsuchida, S., Morita, T., Harada, T., Kimura, Y. Initiation and propagation of canine renal pelvic peristalsis. Urologia Internationalis. 36 (5), 307-314 (1981).
- Yamaguchi, O. A., Constantinou, C. E. Renal calyceal and pelvic contraction rhythms. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 257 (4), 788-795 (1989).
- Klemm, M. F., Exintaris, B., Lang, R. J. Identification of the cells underlying pacemaker activity in the guinea-pig upper urinary tract. Journal of Physiology. 519 (3), 867-884 (1999).
- Lang, R. J., et al. Spontaneous electrical and Ca2+ signals in the mouse renal pelvis that drive pyeloureteric peristalsis. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 37 (4), 509-515 (2010).
- Lutzeyer, W. Pacemaker process of ureteral peristalsis in multicalyceal kidneys. Urologia Internationalis. 37 (4), 240-246 (1982).
- Lang, R. J., Hashitani, H. Pacemaker mechanisms driving pyeloureteric peristalsis: modulatory role of interstitial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 77-101 (2019).
- Hashitani, H., et al. Interstitial cell modulation of pyeloureteric peristalsis in the mouse renal pelvis examined using FIBSEM tomography and calcium indicators. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (5-6), 797-813 (2017).
- Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Suzuki, H., Parkington, H. C. Role of Ca2+ entry and Ca2+ stores in atypical smooth muscle cell autorhythmicity in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 152 (8), 1248-1259 (2007).
- Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Parkington, H. C., Suzuki, H. Spontaneous electrical and Ca2+ signals in typical and atypical smooth muscle cells and interstitial cell of Cajal-like cells of mouse renal pelvis. The Journal of Physiology. 583, 1049-1068 (2007).
- Hashitani, H., Lang, R. J., Mitsui, R., Mabuchi, Y., Suzuki, H. Distinct effects of CGRP on typical and atypical smooth muscle cells involved in generating spontaneous contractions in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 158 (8), 2030-2045 (2009).
- Iqbal, J., et al. Potassium and ANO1/ TMEM16A chloride channel profiles distinguish atypical and typical smooth muscle cells from interstitial cells in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 165 (7), 2389-2408 (2012).
- Grainger, N., et al. Identification and classification of interstitial cells in the mouse renal pelvis. Journal of Physiology. 598 (15), 3283-3307 (2020).
- Hashitani, H., Mitsui, R., Lang, R. Functional heterogeneity of PDGFRα (+) cells in spontaneously active urogenital tissues. Neurourology and Urodynamics. 39 (6), 1667-1678 (2020).
- Hashitani, H., Lang, R. J. ATYPICAL or INTERSTITIAL, take your PIC. Journal of Physiology. 598 (15), 3061-3062 (2020).
- Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Suzuki, H., Parkington, H. C. Role of Ca2+ entry and Ca2+ stores in atypical smooth muscle cell autorhythmicity in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 152 (8), 1248-1259 (2007).
- Grundy, D. Principles and standards for reporting animal experiments in The Journal of Physiology and Experimental Physiology. Experimental Physiology. 100 (7), 755-758 (2015).
- Drumm, B. T., Hennig, G. W., Baker, S. A., Sanders, K. M. Applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular Ca 2+ signaling in situ. Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-13 (2019).
- Leigh, W. A., et al. A high throughput machine-learning driven analysis of Ca2+ spatio-temporal maps. Cell Calcium. 91, 102260 (2020).
