Summary
Målet med denne protokol er at isolere intakt pacemaker regioner af musen nyre bækken ved hjælp af vibratome sektionsopderinger. Disse sektioner kan derefter bruges til in situ Ca2 + billeddannelse til at belyse Ca2 + forbigående egenskaber pacemaker celler og andre interstitielle celler i vibratome skiver.
Abstract
Nyres bækkenet (RP) er en tragtformet, glat muskelstruktur, der letter normal urintransport fra nyrerne til urinrøret ved regelmæssige, fremdrivende sammentrækninger. Regelmæssige RP-sammentrækninger er afhængige af pacemakeraktivitet, som stammer fra den mest proksimale region af RP ved bækken-nyre krydset (PKJ). På grund af vanskelighederne med at få adgang til og bevare intakte præparater af PKJ, har de fleste undersøgelser af RP pacemaking fokuseret på enkeltcellet elektrofysiologi og Ca2 + billeddiagnostiske eksperimenter. Selv om vigtige afsløringer om RP pacemaking er opstået fra et sådant arbejde, disse eksperimenter har flere iboende begrænsninger, herunder manglende evne til præcist at bestemme cellulære identitet i blandede suspensioner og manglen på in situ billeddannelse af RP pacemaker aktivitet. Disse faktorer har resulteret i en begrænset forståelse af de mekanismer, der ligger til grund for normale rytmiske RP sammentrækninger. I dette papir, er en protokol beskrevet til at forberede intakte segmenter af musen PKJ ved hjælp af en vibratome sektionsteknik. Ved at kombinere denne tilgang med mus, der udtrykker cellespecifikke reportere og genetisk kodede Ca2+-indikatorer, kan efterforskere være i stand til mere præcist at studere de specifikke celletyper og mekanismer, der er ansvarlige for peristaltiske RP-sammentrækninger, der er afgørende for normal urintransport.
Introduction
Nyres bækkenet (RP) er en tragtformet, glat muskelstruktur, der transporterer urin fra nyrerne til urinrøret. RP transporterer urin ved at generere regelmæssige rytmiske sammentrækninger (peristalsis)1, 2,3,4,5, som driver en bolus af urin fra nyrerne distally til ureter og i sidste ende til blæren, hvor det opbevares, indtil micturition opstår6,7. Tab af denne regelmæssige aktivitet har alvorlige konsekvenser, herunder hydronephrose og nyresvigt1,3,8; Der er derfor et kritisk behov for at undersøge de mekanismer, der ligger til grund for regelmæssige, rytmiske RP-sammentrækninger. Peristaltiske sammentrækninger stammer fra den mest proksimale region i RP-in bækken-nyre krydset (PKJ)9,10,11,12,13,14,15 (Figur 1A-C) og formere sig distally at skubbe urin fra papilla i RP ( Figur1B). Elektrisk pacemaker aktivitet registreres i PKJ som spontane forbigående depolarizations10,11,12,13,15,16,17, som menes at opstå fra specialiserede pacemaker celler. Disse pacemaker celler, tidligere kaldet atypiske glatte muskelceller (ASMCs), menes at generere eller koordinere pacemaker aktivitet og drive sammentrækninger af "typiske" glatte muskelceller (SMCs)9,10,11,18,19,20,21,22,23.
ASMCs er mest rigelige i den proksimale RP, på PKJ (Figur 1A-C), hvor peristaltiske sammentrækninger og elektrisk pacemaker aktivitet stammer5,7, 8,9,12,13,14,16,17,18,19,20,21 ,22. En nylig offentliggjort undersøgelse af denne gruppe identificeret blodplade-afledt vækstfaktor receptor-alpha (PDGFRα), i kombination med glat muskel myosin tung kæde (smMHC), som en unik biomarkør for disse interstitielle celler (ICs)24, en konstatering, der er blevet bekræftet af andre grupper25. Baseret på deres morfologi og proteinudtryksmønster blev disse celler kaldt PDGFRα+ IC type 1 (PIC1)24,26. PIC1s opholde sig i muskel lag af PKJ, hvor de viser højfrekvente, kort varighed Ca2 + transienter, menes at ligge til grund for generering af pacemaker potentialer24. Der findes dog andre celletyper i PKJ, herunder ikke-smMHC-udtryk PDGFRα+ ICs (PIC2s) i adventitiallaget. Tidligere rapporter har antydet , at ikke-smMHC ICs kan deltage i reguleringen af pacemaker aktivitet19. Yderligere undersøgelse af ikke-smMHC-ICs hæmmes imidlertid af dårlig skelnen under Ca 2+-billeddiagnostiske undersøgelser. Typisk er heterogene celletyper i RP-præparaterne vilkårligt fyldt med Ca2+følsomme farvestoffer (f.eks. Fluo-4). For at overvinde disse udfordringer og studere en række celletyper i RP kan genetisk kodede Ca2+-indikatorer (GECIs) anvendes til selektivt at udtrykke Ca2+følsomme fluorophorer i celletyper af interesse.
De fleste undersøgelser , der belyser Ca2+ forbigående egenskaber i PIC1s/ASMCs , blev opnået ved at billeddannelse af RP-vævspræparater med fladt blad19,21,27. Da PIC1'er er den eneste celletype i PKJ, der udtrykker smMHC, er betinget udtryk for GECI, GCaMP, i smMHC+ celler egnet til at studere PIC1'er i denne konfiguration. Men da PIC1s og PIC2s begge udtrykker PDGFRα, forbyder betinget udtryk for GCaMP-varianter i PDGFRα+ celler celleforskel i flade arkpræparater. For at omgå dette problem blev der anvendt en vibratomesektionsmetode til at skelne mellem PIC1'er og PIC2'er på tværs af PKJ-vævsvæggen24. For at afsløre disse diskrete cellulære populationer blev RP sektionsbestemt koronar, hvilket gjorde det muligt at identificere PIC2'er i adventitia og PIC1'er i muskelvæggen baseret på kendt immunohistokemisk mærkning og GECI-udtryksmønstre. Som et resultat af denne nye PKJ billedbehandling tilgang, PIC1s og PIC2s blev anset for at vise forskellige Ca2 + signalering egenskaber24. Ved at isolere de mest proksimale dele af PKJ-regionen (figur 2) blev RP's pacemakerregion desuden bevaret på en måde, der ikke tidligere var blevet gennemført. Her er en protokol beskrevet for at vise, hvordan man isolerer PKJ-præparater fra muse nyrerne ved hjælp af vibratomsektionering, hvordan man opsætter disse præparater til Ca2+ billedeksperimenter, og hvordan man skelner mellem de forskellige celletyper på tværs af PKJ-væggen.
Protocol
Alle anvendte mus og de protokoller, der er beskrevet i denne undersøgelse, var i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for care and use of Laboratory Animals og Institutional Animal Use and Care Committee ved University of Nevada, Reno, NV. Forsøg og anvendelse af dyr var også i overensstemmelse med de principper og bestemmelser, der er beskrevet i Grundy28.
1. Generer PDGFRα-GCaMP6f- og SMCGCaMP3-mus
- Cross GCaMP6flox/+ mus (B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/J) med PDGFRαCre mus (C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J) til at generere PDGFRα-GCaMP6f mus.
- Cross GCaMP3lox/+ mus (B6.129S-Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J) med mandlige smMHCCreERT2 mus (B6. FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J) til at generere SMC-GCaMP3 mus.
BEMÆRK: Kun hanmus på korset (GCaMP3lox/+ mus og smMHCCreERT2 mus) kan bruges som Cre-udtryk er drevet fra Y-kromosomet. smMHCCreERT2 mus kan også krydses med GCaMP6flox/+ mus for forbedret Ca2+ signal-til-støj-forhold og hurtigere Ca2+ signal tidsmæssige egenskaber.
2. Forbered og injicere transgene mus med tamoxifen for at fremkalde betinget udtryk for GCaMP
- Aktiver cre-rekombinerbart for cellespecifikt GCaMP-udtryk i bestemte celletyper som tidligere beskrevet29.
3. Forbered løsninger
- Forbered 1 L Krebs-Ringer bicarbonat (KRB) opløsning indeholdende 120,35 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 15,5 mM NaHCO3,1,2 mM Na2HPO 4,1,2 mM MgCl2, 11,5 mM glukose og 2,5 mM CaCl2. På brugsdagen skal krb-opløsningen på isen opretholdes.
BEMÆRK: KRB kan opbevares ved 4 °C i op til en uge og skal forbobles med en blanding på 97% O2 og 3% CO2 i mindst 10 minutter før brug.
4. Forbered silicium elastomer-belagt dissektion og mikroskop billedbehandling retter
- Bland siliciumelastomerkomponenter i overensstemmelse med producentens anvisninger. Fyld en 35 mm x 10 mm petriskål og en 60 mm x 15 mm petriskål ca. en fjerdedel fuld af flydende siliciumelastomer til henholdsvis billedeksperimenter og dissektion. Siliciumelastomeren polymeriseres ved 37 °C i 1 dag før brug.
BEMÆRK: For at øge kontrasten af tynde nyre sektioner, anvende en lille, sort cirkel af papir til bunden af billeddannelse Petri parabol før påfyldning med silicium elastomer.
5. Nyredissektion
- Bedøve mus ved indånding af 3-4% isoflurane i en ventileret hætte. Bekræft induktion af dyb anæstesi ved tab af tå og / eller hale knivspids refleks, og derefter aflive musene ved livmoderhalskræft dislokation.
- Påfør 70% ethanol på brystet for at dæmpe pelsen. Brug ekstern dissektionssaks til at åbne bughulen via et langsgående snit med saksblade vinklet væk fra dyret for at forhindre skader på de indre organer.
- Brug interne vævs pincet og intern dissektion saks, klemme tarmene og løfte dem væk fra bugvæggen. Mens løfte tarmene, skære undersiden af tarmene fri fra kroppen på proksimale duodenum og distal kolon for at få adgang til retroperitoneal plads, der indeholder nyrerne.
- Når nyrerne er eksponeret, udtrække dem individuelt. Klem forsigtigt og løft den distale ende af ureteren (~ 4 mm væk fra nyrerne) med vævsplyns. Brug dissektion saks, skåret under klemt ureter mod nyrerne. Fortsæt med at skære under nyrerne, indtil det er blevet befriet fra det omgivende bindevæv.
BEMÆRK: For at maksimere vævsintegriteten og skærekonsistensen under vibromsektionen skal nyrerne være så intakte som muligt. For at sikre dette skal du undgå at klemme eller skære i nyrerne med pincet og dissektionssaks. - Placer nyrerne med tilhørende ureter i iskold KRB-opløsning. Gentag trin 5.4 og 5.5 med den kontralaterale nyre. Hold nyrerne i KRB-opløsning på is.
BEMÆRK: Fortsæt straks til næste afsnit af protokollen for at bevare PKJ-vævs levedygtighed. På grund af sin anatomiske placering dybt inde i nyreparenchymaet er PKJ frataget kontakt med KRB-opløsning.
6. Forbered nyrerne til vibratome-sektion
- Overfør nyrerne til en silicium elastomerbelagt dissektionsskål (60 mm x 15 mm), og fyld den med iskold KRB-opløsning, indtil nyrerne er helt nedsænket.
- Under et dissekerende mikroskop forankres nyrerne til bunden af skålen ved at indsætte minutienstifter i den proksimale ureter og gennem den tynde forreste nyrekapsel eller det omgivende fedtvæv.
BEMÆRK: Pas på ikke at punktere nyreparenchymavævet. - Brug fine fjeder saks og interne pincet til at fjerne fedtvæv fra bunden af nyrerne til at udsætte distale RP og proksimal ureter.
- Fjern den proksimale ureter og en del af den distale RP fra bunden af RP ved hjælp af fin fjedersaks.
BEMÆRK: Pas på ikke at skære den omgivende nyre parenchyma. Den sorte stiplede linje i figur 1A angiver den omtrentlige placering af dette snit. Dette snit skaber en flad base på nyrerne for mere ensartet vævssektion. Når man dissekerer nyrerne, skal man være opmærksom på PKJ-regionens anatomiske position. Figur 1B viser, at den intakte nyre kan skæres langs et sagittalt plan for at eksponere medulla, papilla (distal medulla, hvor opsamlingskanaler konvergerer) og proksimal og distal RP. Hvis papillen skulle blive eksponeret fuldstændigt, som i figur 1C, kan PKJ og proksimal RP (prox RP) visualiseres. Dette bør dog ikke gøres for vibratometeknikken; denne beskrivelse er at orientere læseren til PKJ placering generelt, understreget i den anatomiske forskel vist i de transmitterede lys billeder af PKJ regionen og midten af RP regionen i figur 1D,E. - Pierce den ydre nyre kapsel med fine spids pincet, lystfiskeri spidsen væk fra nyrerne kroppen. Brug pincet med hver hånd, klemme de løse ender af kapslen og skræl dem fra hinanden. Fortsæt med at skrælle den resterende nyrekapselmembran tilbage, indtil den fjernes helt.
BEMÆRK: Nyrekapslen er et hårdt, fiberlag, der omgiver nyrerne. Det skal fjernes, før vibrerer sektionsskæring for optimal skæring.
7. Forbered og kalibrer vibratominstrumentet
- Sæt et barberblad i vibrominstrumentets bladholder, og juster bladfrigangsvinklen til ~18°.
BEMÆRK: Som et valgfrit trin til sektionsafbrling af højere kvalitet skal der anvendes en kalibreringsblok (forsynet med nogle vibratomeinstrumenter) til at justere klingens position for hvert nyt blad, der anvendes i henhold til fabrikantens anvisninger. Dette vil sikre optimal placering af klingen og minimere lodrette vibrationer. - Klingens avancementhastighed justeres til 0,2 mm/s, klingens vandrette vibration/udsving til en amplitude på 2,00 mm og klingens Z-trinsstørrelse til ~100-150 μm. Sørg for, at nyresektionens tykkelse ikke overstiger 150 μm, da dette vil have en negativ indvirkning på Ca2+ billedeksperimenter (fordi PKJ-væggen ofte ruller og foldes på sig selv, hvis den er for tyk).
BEMÆRK: Brugeren bør finjustere disse skæreparametre, fordi indstillingerne varierer mellem individuelle nyrepræparater og vibratomeinstrumenter. Finjustering bør finde sted under afsnit, når brugeren visuelt kan inspicere sektioner under et mikroskop som beskrevet i trin 7.2. - Installer et isbad og en bufferbakke på vibratomeinstrumentet. Fyld isbadet med knust is, og fyld det indre sceneområde med iskold KRB-opløsning (fyld til ca. halvt fyldt). Under vibratomesektionen skal du overvåge og udskifte den knuste is, der er smeltet.
8. Vibratome sektioning nyrerne
- Brug stumpe tang til forsigtigt at gribe fat i og fjerne den forberedte nyre fra iskold KRB-opløsning. Placer straks nyrerne på absorberende papir til ~ 2-4 s for at fjerne overskydende ekstern fugt. Rul forsigtigt nyrerne hen over det absorberende papir for at sikre, at alle sider af parenchymaen er tørret, så der er optimal vedhæftning af nyrerne til vibratomestadiet.
BEMÆRK: Da RP er placeret inde i nyrerne og derfor beskyttet af det ydre parenchyma, vil denne korte tørringsperiode ikke være skadelig for vævsintegriteten. - Påfør straks et tyndt lag cyanoacrylatlim (~1 cm2)på bunden af vibratomeprøvepladen, og brug stumpe tang til at placere nyrerne, uretersiden nedad, på det område, der er dækket af lim. Forsigtigt anvende nedadgående tryk på toppen af nyrerne med den flade kant af pincet i ca 10-20 s til at tørre limen.
BEMÆRK: For at stabilisere nyrerne under denne procedure skal du bruge et ekstra par pincet for at holde nyrerne oprejst, når limen tørrer. Det er afgørende, at nyrerne klæber til prøvepladen i opretstående stilling, så sektioner skæres lige. For at sikre, at nyrerne med succes har klæbet til prøvepladen, skal du forsigtigt skubbe siden af nyrerne. Hvis nyrerne med succes har klæbet til pladen, skal bunden af nyrerne forblive fastgjort til pladen. - Fastgør prøvepladen til bunden af bufferbakken. Juster niveauet af KRB-opløsningen, så toppen af nyrerne er helt nedsænket. Når vibrombladet bevæger sig dybere ind i bufferbakken, skal du fjerne KRB-opløsningen under sektionstrinnene, så klingeholderen ikke bliver nedsænket i opløsning.
BEMÆRK: Hvis limen ikke er helt tørret, før du fortsætter med dette trin, vil limen ofte bevæge sig op fra bunden og videre til nyreparenchymaet. Denne overskydende lim vil gøre sektionsopdelen mere variabel. Hvis dette sker, skal du fjerne nyrerne fra pladen og fortsætte med et frisk nyrepræparat. - For automatisk vibreringssektion skal du vælge start- og slutpositionerne for vibratomebladets skærecyklus. Kontroller, at disse positioner er ~ 0,5-1 cm fri af nyrerne for at sikre, at hele nyreplanet er sektionsopdelt med hver vingefremgang.
- Forbered en multi-welled plade (24- eller 48-brønd) ved at fylde brønde med KRB-opløsning og læg pladen på is.
BEMÆRK: Når de enkelte sektioner genereres, skal de placeres i separate brønde for at holde styr på sektionsdybden. - Start den automatiske skæringsproces. Under klingens første gennemløb skal du sikre dig, at klingen kommer i kontakt med toppen af nyrerne. Hvis der ikke er kontakt, skal du justere klingens start-Z-position.
- Brug pincet, indsamle sektioner, der er befriet fra nyrerne. Overfør straks sektionerne til individuelle brønde, og bemærk sektionernes Z-dybde for at måle den omtrentlige PKJ-placering inden for nyresektioner.
BEMÆRK: Afhængigt af snitparametrene må nogle sektioner ikke skæres fri fra nyreblokken. Hvis dette sker, skal du forsigtigt bruge fin fjedersaks til at skære sektioner fra nyreblokken. Brugerne opfordres også til aktivt at visualisere sektioner under et let mikroskop, mens fritflydende i individuelle brønde for at sikre optimale snitindstillinger og vævsplacering. Sektioner, der indeholder PKJ vil typisk blive afledt ~ 1000-1500 μm fra toppen af nyrerne. - Fortsæt sektionsprotokollen, indtil PKJ-regionerne bliver mere synlige. Se afsnittet med repræsentative resultater for at få en beskrivelse af PKJ-regionerne, efterhånden som provenuet fra områderne skrider frem.
- På dette tidspunkt skal du optimere sektionsparametrene for at sikre, at sektioner frigøres fra nyreblokken ensartet og er intakte. Derudover skal du sørge for, at PKJ-regionerne er kontinuerlige og ubrudte, fordi ødelagte PKJ-vægge ikke tillader tilstrækkelig billeddannelse af celler i væggen på grund af sammenbrud. Hvis væggene går i stykker, skal du nedsætte sektionshastigheden og øge sektionstykkelsen og fortsætte med at observere sektioner under et let mikroskop for at finjustere skæreparametrene.
- Opbevar sektioner ved 4 °C i KRB-opløsning, indtil eksperimenterne begynder.
9. Nyre skive Ca2 + billede erhvervelse
- Overfør en individuel nyreskive til en silicium elastomerbelagt billedskål (35 mm x 10 mm), og fyld straks skålen med frisk, iskold KRB-opløsning.
- Indsæt minutien stifter omkring periferien af en nyre skive for at sikre afsnittet til bunden af billedbehandling parabol.
BEMÆRK: Dette trin er afgørende for at forhindre sektionen i at bevæge sig rundt, når fysiologiske opløsninger perfunderes over skiven under billeddannelse. - Placer billedskålen på scenen i et opretstående roterende disk confocal mikroskop og start straks med at perfusing med KRB-opløsning.
BEMÆRK: I denne protokol blev der anvendt et opretstående mikroskop udstyret med en højhastigheds-Nipkow-roterende diskkonfokal scannerenhed. - Perfusionshastigheden skal fastholdes ved 3 mL/min. og KRB-opløsningstemperatur ved 36 ± 1 °C. Før billedbehandling, lad skiven til at ekvilibrere i 1 time.
- Vælg den relevante dichroic imaging terning og lasere. Anskaf billeder med en elektron-multiplikationsladningskoblet enhed (EMCCD) eller videnskabeligt komplementært metaloxid-halvlederkamera.
BEMÆRK: Konfokalt system i denne protokol er udstyret med en 488 nm laser til at begejstre GCaMP6f eller GCaMP3. Billeder blev erhvervet ved hjælp af en 512 pixel x 512 pixel EMCCD kamera. - Brug en lav forstørrelse, vand-nedsænkning objektiv linse (4x eller 10x) for at finde nyreskiven. Centrer billedfeltet på områder i udsnittet, hvor PKJ er til stede. Identificer landemærker, som afbildet i figur 2D, for at finde PKJ (dvs. halvcirkler af muskelvæv suspenderet mellem parenchymalt væv).
- Når PKJ er placeret, skal du bruge en højere forstørrelse vand-nedsænkning objektiv linse (20x, 40x, eller 60x) for at forstørre det område af interesse.
BEMÆRK: I denne protokol var den 20x objektive numeriske blænde (NA) 1,0, 40x mål NA var 0,8, og 60x mål NA var 1,0. - Skelne mellem forskellige celler af interesse i PKJ-væggen ved hjælp af transgene mus, der udtrykker GCaMP6f eller GCaMP3 i henholdsvis PDGFRα+ celler eller SMV'er. Overhold de forskellige typer Ca2+ forbigående varigheder i PDGFRα+ celler i PKJ-væggen i PDGFRα+ GCaMP6f+ nyreskiver (Figur 3C, se repræsentative resultater for beskrivelse) og i GCaMP3+ SPC'er i SMC GCaMP3+ nyreskiver (Figur 3D, se repræsentative resultater for beskrivelse).
- Når celler af interesse i PKJ væg er blevet identificeret, justere laser intensitet til at give et godt signal-til-støj-forhold. Optag billeder med en tidsmæssig samplingfrekvens på mellem 16 Hz og 32 Hz ved hjælp af passende anskaffelsessoftware.
BEMÆRK: Afhængigt af den laserintensitet, der anvendes under billeddannelsen, anbefales det at begrænse antallet af optagelser på grund af blegningseffekterne på Ca2+ fluorophorer. Brugeren skal vælge optagelseslængde baseret på de specifikke eksperimentelle mål.
10. Ca2+ billedanalyse
- Udfør Ca2+ billedanalyse af forskellige celletyper i PKJ pacemakerområder ved spatiotemporal kortlægning som tidligere beskrevet for andre intakte pacemakerpræparater i mave-tarmkanalen29,30.
Representative Results
In situ Ca2 + billeddannelse af PKJ kan afsløre vigtige cellulære aktivitet RP pacemaker celler. Ved at bruge mus, der udtrykker genetisk kodede Ca2+-indikatorer (f.eks. GCaMP), drevet af cellespecifikke promotorer, kan oplysninger om RP-pacemaking opnås med nøjagtighed og detaljer, som ikke er muligt fra Ca2+ billedeksperimenter fra RP-præparater med fladt ark. Begyndelsen af PKJ er kendetegnet ved det pludselige udseende af halvcirkler af muskler suspenderet mellem nyreparenchymalt væv(Figur 2C; proksimal PKJ omgivet af stiplede boks). Under efterfølgende runder af sektionsopdelt bliver den indre medulla skelnelig fra det omgivende kortikale væv. Under et let mikroskop vises den indre medulla striated i regioner, lysere i farve sammenlignet med kortikalt væv og diskontinuerligt på sin lange akse med resten af nyrerne (Figur 2B,D). På dette tidspunkt vil flere PKJ-områder begynde at dukke op. Eksempler på dette er vist i Figur 2D (stiplede rektangler, H og G), hvor 3 halvcirkler af muskler er suspenderet af parenchymalt væv. Disse muskelbånd vil blive tæt apposed til den indre papilla og vil typisk nabo en nyre arterie (Figur 2D, stiplede rektangler; Figur 2F-H, sorte pilespidser). Efterhånden som flere distale sektioner udledes, vil disse muskelbånd blive integreret for at danne en mere komplet, samlet struktur, der angiver slutningen af PKJ-regionen (Figur 2E).
Figur 3A,B viser en PKJ-sektion ved lav effekt (4-10x) fra en mus, der udtrykker GCaMP i PDGFRα+ celler (GCaMP6f udtrykt af inducible Cre-recombinase drevet af Pdgfra). Ved hjælp af landemærker som nyrepulsåren (Figur 3A; stjerne) bør forsøgspersonerne let kunne skelne mellem det tynde PKJ-væg, der er ophængt mellem parenchymalt væv(figur 3B;stjerner). Udtrykket af GCaMP6f i dette specifikke transgene væv er spredt over hele bredden af PKJ, på tværs af både muskel-og adventitial lag (Figur 3C).
I PDGFRα+ GCaMP6f+ nyreskiver vil et netværk af celler, der typisk strækker sig over bredden af PKJ-væggen, være fluorescerende (Figur 3C) og vise oscillerende Ca2+ transienter af forskellige varigheder og frekvenser. PDGFRα+ celler i PKJ-væggen viser to forskellige typer Ca2+ forbigående varigheder. I adventitiallaget (orienteret tættere på cortex) defineres PDGFRα+ celler, der er til stede som et netværk af celler og deres processer. Adventitial PDGFRα+ celler udviser lavfrekvente (4 ± 2,7 Hz) og langvarige (1 ± 0,67 s) Ca2 + transienter. Det andet lag af PDGFRα+ celler, der findes i muskellaget (orienteret tættere på medulla), udviser lignende Ca2+ forbigående frekvenser og varigheder som SMC GCaMP3+ celler (beskrevet nedenfor), da de er den samme celletype.
I SMC GCaMP3+ nyreskiver er der et lag GCaMP3+ celler til stede i muskellaget ( Figur3D). Der vil ikke være noget lysstofrør i det utilsigtede lag(figur 3D; stjerne). GCaMP3+ SMV'er i muskellaget udviser typisk højfrekvente (10 ± 4 Hz) og kortvarige (632 ± 74 s) Ca2+ transienter. PDGFRα+ celler placeret i PKJ adventitia fremkalde langvarige, lavfrekvente Ca2 + transienter(Figur 3E, Video 1). Men Ca2 + billeddiagnostiske eksperimenter fra væv udtrykke GCaMP3 drevet af Myh11 promotor er begrænset til muskuløs aspekt af PKJ (Figur 3D). Sammenlignet med PDGFRα+ celler i adventitia, fyrede SMV'er kortere varighed Ca2 + transienter oftere(Figur 3F, Video 2).
Ud over at forstå signalegenskaber i PKJ PDGFRα+ ICs er anvendelsen af denne teknik til undersøgelse af andre celletyper i den vibratome-sektionede nyre blevet påvist i dette papir. Efter nøje undersøgelse af nyremedicinulla (hos mus, der udtrykker GCaMP6f i PDGFRα+ celler), blev der observeret en række fluorescerende Ca2+-signaler i og omkring indsamlingskanaler (Video 3). Medullære PDGFRα+ celler affyret spontane Ca2 + transienter af variabel frekvens og varighed. Disse Ca2 + imaging undersøgelser af nyre vibratome sektioner kunne også udvides til at studere nyrearterioler (~ 50-80 mm diameter), der ofte nabo PKJ muskel segmenter(Figur 2F,G; hvide pile). Ca2+ billeddannelse af nyrearterioler (fra væv, der udtrykker GCaMP i glatte muskelceller) viser oscillerende Ca2+ transienter i SMV'er(Video 4).
Figur 1: PKJ-pacemakerområdets grundlæggende nyreanatomi og placering. Nyrepulsåren og nyreåren vises i henholdsvis rød og blå. (B) Den intakte nyre kan skæres langs en sagittal plan for at afsløre det indre aspekt af nyrerne, herunder medulla, papilla (distal medulla hvor indsamling kanaler konvergerer), og proksimale og distale RP. (C) Den medulla og papilla kan fjernes til helt at udsætte PKJ og prox RP. (D og E) repræsenterer transmitterede lysbilleder fra henholdsvis PKJ-pacemakerområdet og distal RP. Sekventiel sektion mod den distale ende af bækkenet resulterer i de halvcirkler af muskler i PKJ regionen (Di) kombinere i en, tykkere muskuløs ring(Ei), der indkapsler hele papilla. Sorte, stiplede rektangler i Di og Ei viser omtrentlige områder i koronar nyre sektioner, hvor transmitterede lysbilleder blev erhvervet. Retningen af billeder D og E er 90° anti-uret til de respektive insets (Di og Ei). Skalastænger i D og E = 20 μm. Forkortelser: RP = nyres bækken; prox RP = proksimalt nyres bækken; PKJ = bækken-nyre krydset; PICs = blodplade-afledt vækstfaktor receptor-alfa-positive interstitielle celler; SMC = glat muskelcelle. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Vibratomesektion af hele nyrer for at generere tynde sektioner. (A) Nyrerne monteres på uretersiden ned til bunden af vibratomeinstrumentet, og et standardblad (fastgjort til vibratomhovedet) bruges til at skære sekventielle sektioner fra den proksimale til distale ende af nyrerne. (B) Diagrammatisk repræsentation af en tynd sektion skåret fra hele nyrerne med kommenterede vartegn. PKJ muskel segmenter (sort stiplet rektangel) findes ofte suspenderet mellem parenchymalt væv. (C) Lys mikroskopisk billede af en proksimal nyre sektion. Udseendet af muskelbånd suspenderet mellem parenchymalt væv indikerer begyndelsen af de proksimale PKJ-fremskrivninger (angivet inde i hvidt stiplet rektangel). (D) Lys mikroskopisk billede, der repræsenterer det optimale område, hvor flere (2-3) PKJ segmenter kan findes (områder inden for hvid stiplede rektangler). Tynde PKJ muskelstrimler er suspenderet mellem nyreparenchyma og tilpasse tæt med nyrearterioler og medulla. (E)Let mikroskopisk billede af en distal nyre sektion. Individuelle muskelsegmenter er fusioneret til et enkelt, kontinuerligt muskelbånd (hvidt stiplet rektangel), der omgiver den indre papilla (ikke til stede i dette billede). Skalalinjer C-E = 500 μm. F-H Zoomede (20x) områder fra panel D angiver placeringen af PKJ (sorte pilespidser), nyrearterioler (hvide pilespidser) og klippesteder til isolering af PKJ (stiplede hvide linjer). Skalastænger F-H = 100 μm. Forkortelse: PKJ = bækken-nyre krydset. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:Ca2+ billeddannelse af vibratomesektioner. (A) Repræsentativt laveffektbillede (4x) af en vibratomesektion, der angiver placeringen af nyrepulsåren (stjerne). Skala bar = 200 μm. (B) Zoomet (20x) repræsentativt billede af PKJ (mærket) suspenderet mellem nyre parenchymalt væv betegner steder af PKJ muskel (hvid pilespids), nyre arteriole (stjerne). Skalalinje = 50 μm. (C) High-power (40x) billede af PKJ, der udtrykker GCaMP i PDGFRα+ celler. Skalalinje = 20 μm. (D) High-power (20x) billede af PKJ, der udtrykker GCaMP i glatte muskelceller. Skalalinje = 20 μm. (E) Spatiotemporalt kort over Ca2+ transienter udtaget fra en GCaMP+ PDGFRα+ celle angivet i panel C. Slå tabelkodet op for F/F0. (F) Spatiotemporal kort over Ca2+ transienter udtaget fra en GCaMP+ PDGFRα+ celle angivet i panel D. Slå tabelkodet op for F/F0. (G) Repræsentative data for Ca2+ forbigående frekvens (Hz) for GCaMP+ PDGFRα+ celler og GCaMP+ smMHC-celler. (H) Repræsentative data for Ca2+ forbigående varighed (r) for GCaMP+ PDGFRα+ celler og GCaMP+ smMHC-celler. Forkortelser: PKJ = bækken-nyre krydset; PDGFRα+ = blodplade-afledt vækstfaktor receptor-alfa-positiv; smMHC = glat muskel myosin tung kæde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Spontan Ca2+ transienter i GCaMP+ PDGFRα+ celler i PKJ vibratome sektioner. Forkortelser: PKJ = bækken-nyre krydset; PDGFRα+ = blodplade-afledt vækstfaktor receptor-alfa-positiv. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente).
Video 2: Spontan Ca2 + transienter i GCaMP+ glatte muskelceller i bækken-nyre krydset vibratome sektioner. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente).
Video 3: Spontan Ca2+ transienter i GCaMP+ PDGFRα+ celler i nyremedullære vibratome sektioner. Forkortelse: PDGFRα+ = blodplade-afledt vækstfaktor receptor-alfa-positiv. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente).
Video 4: Lav-amplitude Ca2 + forbigående aktivitet i vibratome dele af nyrepulsåren. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente).
Discussion
RP består af en heterogen population af celler med differentialcelletæthed observeret i forskellige RP-regioner. PIC1s (tidligere benævnt ASMCs) er mest rigelige i PKJ, hvor pacemaker aktivitet stammerfra 24. Protokollen, der er beskrevet her, giver efterforskerne mulighed for at isolere pacemakerområdet fra resten af muse nyrerne. Ved at skære dele af PKJ ved hjælp af en vibratome, pacemaker regioner RP (identificeret som muskelbånd knyttet til parenchyma) holdes intakt, hvilket giver mulighed for brug af in situ billeddannelse til præcist at studere RP pacemaker celler, når det kombineres med celle-specifikke fluorescens reportere.
Mens denne tilgang kan give ny indsigt i RP pacemaking, der er nogle overvejelser, at eksperimenterende bør være bekendt med at forbedre billedbehandling resultater og sektionsopdelning effektivitet. For en utrænet bruger er denne metode til PKJ isolation og billeddannelse lettere at lære end typisk skarp dissektion af fladarks RP-præparater. Skarp dissektion af RP fra hele nyrer kræver ugers konsekvent praksis for med succes at isolere levedygtige væv til fysiologiforsøg. Da denne vibratome sektionsprotokol kræver lidt skarp dissektion viden, det er tilgængeligt for brugere, der ikke har erfaring dissekere andre glatte muskelstrukturer.
Der er dog nogle kritiske punkter at bemærke for denne protokol. Succesfuldt at klæbe nyrer til vibratome prøvepladen kræver fingerfærdighed og tålmodighed. Hvis nyrerne er orienteret forkert og læner sig til den ene side, skrå snarere end lige sektioner vil blive skåret. På grund af PKJ's sarte natur kan den skrå vinkel ofte ødelægge pacemakerområdets muskelbånd. Desuden resulterer billeddannelse af skrå sektioner i dårlig billeddannelse erhvervelse som cellenetværk er ikke typisk i samme brændplan. Proceduren er også tidskrævende, med sektionsopderinger af en enkelt nyre, der ofte tager op til en time at gennemføre, i hvilket tidsrum opsætningen kræver overvågning.
Mens vibratomets bevægelse kan fremskyndes, vil bladet, hvis hastigheden øges for meget (>20% end det, der anbefales i protokollen), makulere i stedet for rent at skære nyrerne, hvilket resulterer i tab af sarte PKJ-strukturer. På samme måde kan en skærehastighed, der er for lav, få sektionen til at blive takkede. Optimering af skærehastighed og vingeforstærkning er afgørende. Der skal også udvises forsigtighed ved håndtering af vibratomesektioner. På grund af deres sarte natur forstyrres PKJ-musklerne let under håndtering og kan rive. En veluddannet bruger vil være i stand til at høste ca 1-2 PKJ regioner pr 4 nyre skiver, der er egnet til Ca2 + billeddiagnostiske eksperimenter. Typisk, PKJ sektioner, der ikke opfylder Ca2 + billeddannelse kriterier har: 1) dårlig GCaMP udtryk, 2) en forvrænget PKJ væg, eller 3) en brækket PKJ væg. Til dataanalyse kunne der udtages prøver af ca. 3-4 celler pr. synsfelt (FOV).
Mens der er mange celler i FOV af PDGFRα-GCaMP6f og SMC-GCaMP3 PKJ sektioner, små vævsbevægelser ofte udelukke celler fra analyse. Dette kan normalt løses ved at anvende en stabiliseringsprotokol på billeder. Under forhold, hvor præparater ikke bevæger sig, kan der udtages prøver af mindst 3-5 celler fra PDGFRα-GCaMP6f-sektioner og 5-6 celler fra SMC-GCaMP3-sektioner. Typisk er den tid, det tager fra dyreofring (optimal alder for mus er 8-16 uger) til at udføre Ca2 + billeddiagnostiske eksperimenter 2-3 timer, hvilket er tilstrækkeligt til at sikre vævsintegritet, hvis væv inkuberes i iskolde opløsninger under hele proceduren, når det kræves. Sammenfattende er en vibratomeskæringsprotokol blevet beskrevet her for at generere intakte præparater af RP PKJ-regioner fra muse nyrerne. Denne teknik gør det muligt at bevare RP pacemaker regioner for in situ Ca2 + billeddiagnostik undersøgelser for at undersøge RP pacemaker mekanismer.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette projekt blev finansieret af R01 DK124509 fra NIDDK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 142485 | To store kidney slices in |
| 35 mm x 10 mm Petri dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | Kidney slice calcium imaging dish |
| 48-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 152640 | To store kidney slices in |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Sigma Aldrich | P5481 | Kidney sharp dissection dish |
| Absorbent paper | Fisher Scientific | 06-666A | To dry the kidney before applying glue |
| B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 13148 | GCaMP3 Mice |
| B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 24105 | GCaMP6f Mice |
| B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J | The Jackson Laboratory | 19079 | smMHC-CRE Mice |
| C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J | The Jackson Laboratory | 13148 | PDGFRa-CRE Mice |
| Cyanoacrylate glue | Amazon | B001PILFVY | For adhering the kidney to the specimen plate |
| Ethanol | Phamco-Aaper | SDA 2B-6 | For dissection |
| Extra-Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14083-08 | Used for internal dissecting scissors |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Used for external dissecting scissors |
| Fine-tip forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Used for fine dissection of kidney |
| Gillette Silver Blue double-edge blades | Amazon | B009XHQGYO | For insertion into blade holder of vibratome |
| ImageJ | NIH | For calcium imaging analysis | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 1001936060 | For anesthesia |
| Minutien pins | Fisher Scientific | NC9677548 | Pins were cut in half to reduce their length |
| Silicon elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | For gently holding and moving the kidney |
| Student Dumont Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for internal dissecting forceps |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | For sharp dissection and cleanup of isolated kidney |
| Vibrocheck | Leica | 14048142075 | Optional component for calibrating blade movement during cutting |
| VT1200 S Vibrating Blade Microtome | Leica | 14912000001 | Configuration 1 is used in our protocol |
References
- Constantinou, C. E., Djurhuus, J. C. Pyeloureteral dynamics in the intact and chronically obstructed multicalyceal kidney. The American Journal of Physiology. 241 (5), 398-411 (1981).
- Constantinou, C. E., Yamaguchi, O. Multiple-coupled pacemaker system in renal pelvis of the unicalyceal kidney. TheAmerican Journal of Physiology. 241 (5), 412-418 (1981).
- Constantinou, C. E., Hrynczuk, J. R. Urodynamics of the upper urinary tract. Investigative Urology. 14 (3), 233-240 (1976).
- Schmidt-Nielsen, B., Schmidt-Nielsen, B. On the function of the mammalian renal papilla and the peristalsis of the surrounding pelvis. Acta Physiologica. 202 (3), Oxford, England. 379-385 (2011).
- Dwyer, T. M., Schmidt-Nielsen, B. The renal pelvis: machinery that concentrates urine in the papilla. Physiology. 18 (1), 1-6 (2003).
- Hill, W. G. Control of urinary drainage and voiding. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 10 (3), 480-492 (2015).
- Brading, A. F. The physiology of the mammalian urinary outflow tract. Experimental Physiology. 84 (1), 215-221 (1999).
- Dixon, J. S., Gosling, J. A. The musculature of the human renal calices, pelvis and upper ureter. Journal of Anatomy. 135, Pt 1 129-137 (1982).
- Lang, R. J., et al. Pyeloureteric peristalsis: role of atypical smooth muscle cells and interstitial cells of Cajal-like cells as pacemakers. The Journal of Physiology. 576, 695-705 (2006).
- Lang, R. J., Takano, H., Davidson, M. E., Suzuki, H., Klemm, M. F. Characterization of the spontaneous electrical and contractile activity of smooth muscle cells in the rat upper urinary tract. Journal of Urology. 166 (1), 329-334 (2001).
- Lang, R. J., Exintaris, B., Teele, M. E., Harvey, J., Klemm, M. F. Electrical basis of peristalsis in the mammalian upper urinary tract. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 25 (5), 310-321 (1998).
- Morita, T., Ishizuka, G., Tsuchida, S. Initiation and propagation of stimulus from the renal pelvic pacemaker in pig kidney. Investigative Urology. 19 (3), 157-160 (1981).
- Tsuchida, S., Morita, T., Harada, T., Kimura, Y. Initiation and propagation of canine renal pelvic peristalsis. Urologia Internationalis. 36 (5), 307-314 (1981).
- Yamaguchi, O. A., Constantinou, C. E. Renal calyceal and pelvic contraction rhythms. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 257 (4), 788-795 (1989).
- Klemm, M. F., Exintaris, B., Lang, R. J. Identification of the cells underlying pacemaker activity in the guinea-pig upper urinary tract. Journal of Physiology. 519 (3), 867-884 (1999).
- Lang, R. J., et al. Spontaneous electrical and Ca2+ signals in the mouse renal pelvis that drive pyeloureteric peristalsis. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 37 (4), 509-515 (2010).
- Lutzeyer, W. Pacemaker process of ureteral peristalsis in multicalyceal kidneys. Urologia Internationalis. 37 (4), 240-246 (1982).
- Lang, R. J., Hashitani, H. Pacemaker mechanisms driving pyeloureteric peristalsis: modulatory role of interstitial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 77-101 (2019).
- Hashitani, H., et al. Interstitial cell modulation of pyeloureteric peristalsis in the mouse renal pelvis examined using FIBSEM tomography and calcium indicators. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (5-6), 797-813 (2017).
- Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Suzuki, H., Parkington, H. C. Role of Ca2+ entry and Ca2+ stores in atypical smooth muscle cell autorhythmicity in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 152 (8), 1248-1259 (2007).
- Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Parkington, H. C., Suzuki, H. Spontaneous electrical and Ca2+ signals in typical and atypical smooth muscle cells and interstitial cell of Cajal-like cells of mouse renal pelvis. The Journal of Physiology. 583, 1049-1068 (2007).
- Hashitani, H., Lang, R. J., Mitsui, R., Mabuchi, Y., Suzuki, H. Distinct effects of CGRP on typical and atypical smooth muscle cells involved in generating spontaneous contractions in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 158 (8), 2030-2045 (2009).
- Iqbal, J., et al. Potassium and ANO1/ TMEM16A chloride channel profiles distinguish atypical and typical smooth muscle cells from interstitial cells in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 165 (7), 2389-2408 (2012).
- Grainger, N., et al. Identification and classification of interstitial cells in the mouse renal pelvis. Journal of Physiology. 598 (15), 3283-3307 (2020).
- Hashitani, H., Mitsui, R., Lang, R. Functional heterogeneity of PDGFRα (+) cells in spontaneously active urogenital tissues. Neurourology and Urodynamics. 39 (6), 1667-1678 (2020).
- Hashitani, H., Lang, R. J. ATYPICAL or INTERSTITIAL, take your PIC. Journal of Physiology. 598 (15), 3061-3062 (2020).
- Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Suzuki, H., Parkington, H. C. Role of Ca2+ entry and Ca2+ stores in atypical smooth muscle cell autorhythmicity in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 152 (8), 1248-1259 (2007).
- Grundy, D. Principles and standards for reporting animal experiments in The Journal of Physiology and Experimental Physiology. Experimental Physiology. 100 (7), 755-758 (2015).
- Drumm, B. T., Hennig, G. W., Baker, S. A., Sanders, K. M. Applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular Ca 2+ signaling in situ. Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-13 (2019).
- Leigh, W. A., et al. A high throughput machine-learning driven analysis of Ca2+ spatio-temporal maps. Cell Calcium. 91, 102260 (2020).
