Summary
このプロトコルの目的は、ビブラートメの切断を使用してマウス腎盂の無傷のペースメーカー領域を分離することです。これらのセクションは、その後、ビブラート細胞内のペースメーカー細胞および他の間質細胞のCa2+一過性特性を解明するために、Situ Ca2+イメージングに使用することができます。
Abstract
腎盂 (RP) は、定期的な、推進的な収縮によって腎臓から尿管への正常な尿輸送を容易にする漏斗状の平滑筋構造です。通常の RP 収縮は、骨盤-腎臓接合部 (PKJ) で RP の最も近位領域に由来するペースメーカーの活動に依存します。PKJの無傷の準備にアクセスして保存するのが難しいため、RPペースメイキングに関する調査のほとんどは、単細胞の電気生理学とCa2+ イメージング実験に焦点を当てています。RPペースメイキングに関する重要な啓示は、このような研究から生まれたが、これらの実験は、混合懸濁液中の細胞のアイデンティティを正確に決定することができない、RPペースメーカーの活動のその際の画像化の欠如を含むいくつかの本質的な制限を有する。これらの要因は、正常なリズミカルなRP収縮の根源となるメカニズムの限定的な理解をもたらしました。本論文では、ビブラートメセプティング技術を用いてマウスPKJのセグメントを無傷で調製するプロトコルについて説明する。このアプローチを、細胞特異的なレポーターと遺伝的にコードされたCa2+ 指標を発現するマウスと組み合わせることで、研究者は、正常な尿輸送に不可欠な蠕動RP収縮を担う特定の細胞タイプおよびメカニズムをより正確に研究することができるかもしれない。
Introduction
腎盂 (RP) は、尿管に腎臓から尿を輸送する漏斗状の平滑筋構造です。RPは、定期的なリズミカルな収縮(蠕動性)1、2、3、4、5を生成することによって尿を輸送し、腎臓から尿管に尿のボーラスを推進し、最終的には膀胱に尿のボーラスを推進し、そこで6,7回のミチュリションが起こるまで貯蔵される。この定期的な活動の損失は、水腎症や腎不全1、3、8を含む悲惨な結果を持っています。したがって、定期的でリズミカルなRP収縮の根底にあるメカニズムを研究する必要があります。蠕動収縮は、骨盤・腎臓接合部(PKJ)9,10,11,12,13,14,15(図1A -C)のRP-内RPの最も近位領域に由来し、乳頭からRPに尿を押し込むために遠位的に伝播する(図1B)。電気ペースメーカー活性は、特殊なペースメーカー細胞から生じると考えられている自発的な過渡脱分極10、11、12、13、15、16、17としてPKJに記録される。これらのペースメーカー細胞は、以前は非定型平滑筋細胞(ASMC)と呼ばれ、ペースメーカー活性を生成または調整し、「典型的な」平滑筋細胞(SMC)9、10、11、18、19、20、21、22、23の収縮を促進すると考えられている。
ASMCは、近位RPに最も豊富であり、PKJ(図1A-C)では、蠕動収縮および電気ペースメーカー活動が5、7、8、9、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22.この群により最近発表された研究は、血小板由来成長因子受容体α(PDGFRα)を同定し、平滑筋筋重鎖(smMHC)と組み合わせて、これらの間質細胞(IC)24に対するユニークなバイオマーカーとして、他の群25によって裏付けられていることを知った。これらの細胞は、それらの形態およびタンパク質発現パターンに基づいて、PDGFRα+ICタイプ1(PIC1)24,26と呼ばれた。PIC1sは、彼らが高周波、短い期間Ca2+トランジェントを表示するPKJの筋肉層に存在し、ペースメーカー電位24の生成の根源であると考えられている。しかし、他の細胞タイプは、非smMHC発現PDGFRα+IC(PIC2s)を含む、PKJに存在する。以前の報告では、smMHC IC以外がペースメーカー活動の規制に参加する可能性が示唆されている。しかし、非smMHC ICのさらなる研究は、Ca2+イメージング研究中の貧弱な区別によって妨げられる。典型的には、RP製剤内の異種細胞タイプは、Ca2+に敏感な色素(例えば、Fluo-4)を無差別に装填される。これらの課題を克服し、RPで様々な細胞タイプを研究するために、遺伝的にコードされたCa2+指標(GECI)を利用して、目的の細胞タイプでCa2+に敏感な蛍光色素を選択的に発現させることができます。
PIC1s/ASMCにおけるCa2+一過性特性を解明する研究の大半は、平板RP組織製剤19、21、27をイメージングすることによって達成された。PIC1sは、SMMHCを発現するPKJ内の唯一の細胞型であるため、GECI、GCaMPの条件式は、smMHC+細胞において、この構成でPIC1を研究するのに適している。しかし、PIC1およびPIC2sがPDGFRαを発現するにともなって、PDGFRα+細胞におけるGCaMP変異体の条件発現は、平板製剤における細胞の区別を禁止する。この問題を回避するために、PKJ組織壁24を横切るPIC1とPIC2を区別するためにビブラートメ断面アプローチを使用しました。これらの離散細胞集団を明らかにするために、RPはコロナで切除され、既知の免疫ヒストケミカル標識法およびGECI発現パターンに基づいて、筋肉壁のアドベンチシアおよびPIC1sのPIC2を同定することを可能にした。この新しいPKJイメージングアプローチの結果として、PIC1とPIC2sは、別個のCa2+シグナリング特性24を表示することが判明した。さらに、PKJ領域の最も近位のセクション(図2)を単離することにより、RPのペースメーカー領域は、これまで達成されていなかった方法で保存された。ここでは、振動子切断面を用いてPKJ製剤をマウス腎臓から分離する方法、Ca2+イメージング実験用にこれらの製剤を設定する方法、およびPKJ壁をまたいで異なる細胞タイプを区別する方法を示すプロトコルについて説明する。
Protocol
この研究で使用されたすべてのマウスおよびこの研究に記載されているプロトコルは、国立実験動物のケアと使用のための健康ガイド、およびネバダ大学リノ校の施設動物使用およびケア委員会に従っていました。実験と動物の使用も、グランディ28で説明されている原理と規制に準拠しています。
1. PDGFRα-GCaMP6fおよびSMCGCaMP3マウスを生成する
- クロスGCaMP6flox/+ マウス (B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/J)を PDGFRαクレ マウス(C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J)で PDGFRαα-GCaMP6f マウスを生成します。
- クロスGCaMP3ロックス/+マウス(B6.129S-Gt(ローザ)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J)と雄のsmMHCCreERT2マウス(B6.SMC-GCaMP3マウスを生成するためにFVB-Tg(Myh11-cre/ER T2)1Soff/J)。
注:十字架の雄マウス(GCaMP3lox/+マウスおよびsmMHCCreERT2マウス)のみが、Y染色体から駆動されるCre発現として使用することができる。smMHCCreERT2マウスは、GCaMP6flox/+マウスと交差して、Ca2+シグナル対ノイズ比を改善し、より速いCa2+信号時間特性を得ることもできます。
2. 遺伝子導入マウスにタモキシフェンを用いて準備し、注射して、GCaMPの条件発現を誘導する
- 前述の29のように、特定の細胞タイプにおける細胞特異的GCaMP発現に対する誘導性 Cre リコンビナーゼを活性化する。
3. ソリューションの準備
- 120.35 mM NaCl、5.9 mM KCl、15.5 mM NaHCO 3、1.2 mM Na2HPO 4、1.2mM MgCl 2、11.5 mMグルコース、および2.5 mM CaCl2を含むクレブスリンガー重炭酸塩(KRB)溶液1 Lを準備します。使用日には、氷の上にKRB溶液を維持します。
注:KRBは4°Cで最大1週間保存することができ、使用前に少なくとも10分間97%O2と3%CO2の混合で事前に泡立てる必要があります。
4. シリコンエラストマーコーティング解剖および顕微鏡イメージングディッシュの準備
- メーカーの指示に従ってシリコンエラストマーコンポーネントを混合します。35 mm x 10 mm のペトリ皿と 60 mm x 15 mm ペトリ皿を、それぞれ、イメージング実験と解剖のために液体シリコンエラストマーの約 4 分の 1 を充填します。使用前に1日間、37°Cでシリコンエラストマーを重合します。
注:薄い腎臓切片のコントラストを高めるには、シリコンエラストマーで満たす前に、イメージングペトリ皿のベースに小さな黒い紙の円を適用します。
5. 腎解剖
- 換気フードに3~4%のイオブルランを吸入することにより、マウスを麻酔します。足の指や尾のピンチ反射の喪失によって深部麻酔の誘導を確認し、その後、頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。
- 70%エタノールを胸部に塗布して毛皮を湿らせる。外的解剖はさみを使用して、縦切開を介して腹腔を開き、はさみ刃を動物から離して、内臓の損傷を防ぎます。
- 内部組織鉗子と内部解剖はさみを使用して、腸をつまんで腹壁から離れて持ち上げます。腸を持ち上げながら、近位十二指腸と遠位結腸で腸の下側を切り取り、腎臓を含む後腹膜空間にアクセスします。
- 腎臓が露出したら、それらを個別に抽出します。尿管の遠位端を組織鉗子でそっとつまんで持ち上げます(腎臓から4mm離れています)。解剖はさみを使用して、つままれた尿管の下を腎臓に向かって切る。周囲の結合組織から解放されるまで腎臓の下で切断し続けます.
注:ビブラートメの切断の間に組織の完全性および切断の一貫性を最大にするために、腎臓は可能な限り無傷でなければならない。これを確実にするために、鉗子と解剖はさみで腎臓をつまんだり切断したりしないでください。 - 腎臓に付属の尿管を付けて、氷冷KRB溶液に入れる。逆側腎臓でステップ5.4と5.5を繰り返します。氷の上のKRB溶液の腎臓を維持する。
注: 直ちに、プロトコルの次のセクションに進み、PKJ 組織の生存率を維持します。腎臓のパレンチマの深い解剖学的位置のために、PKJはKRB溶液との接触を奪われる。
6. ビブラートメの切り離しのために腎臓を準備する
- 腎臓をシリコンエラストマーコーティング解剖皿(60mm x 15mm)に移し、腎臓が完全に水没するまで氷冷KRB溶液で満たします。
- 解剖顕微鏡の下で、近位尿管にミヌティエンピンを挿入し、薄い前腎カプセルまたは周囲の脂肪組織を通して腎臓を皿の基部に固定します。
注:腎臓のパレンチマ組織を穿刺しないように注意してください。 - 細かいスプリングハサミと内鉗子を使用して、腎臓の基部から脂肪組織を取り除き、遠位RPおよび近位尿管を露出させる。
- 近位尿管と遠位RPの一部を、微細なスプリングハサミを使用してRPのベースから取り外します。
注:周囲の腎臓のパレンチマをカットしないように注意してください。図1Aの黒い破線は、このカットの近似位置を示しています。この切断は、より均一な組織断面化のための腎臓に平らな塩基を作成します。腎臓を解剖する際には、PKJ領域の解剖学的位置を認識する必要があります。図1Bは、無傷の腎臓を矢状平面に沿って切断して、髄質、乳頭(集結管が収束する遠位髄質)および近位および遠位RPを露出させることができることを示す。図1Cのように乳頭を完全に露出させた場合、PKJと近位RP(prox RP)を可視化することができます。しかし、これはビブラートメのテクニックでは行うべきではありません。この説明は、一般に、PKJの場所に読者を向ける、図1D、EのPKJ領域と中RP領域の透過光画像に示される解剖学的差異において強調される。 - 細かい先端の鉗子で外側の腎カプセルを突き刺し、腎臓の体から離れて先端を引き離す。各手で鉗子を使用して、カプセルの緩い端をつまみ、それらを引き離します。残りの腎カプセル膜を完全に除去するまで剥がし続けます。
注:腎カプセルは、腎臓を囲むタフな繊維状の層です。最適な切断のためにビブラートメの切り離し前に取り外す必要があります。
7. ビブラートメの装置を準備し、調整する
- ビブラートメの刃ホルダーにカミソリの刃を挿入し、ブレードクリアランス角度を~18°に調整します。
注:より高品質の切り抜きのためのオプションのステップとして、キャリブレーションブロック(いくつかのビブラートメの楽器で提供される)は、メーカーの指示に従って使用される新しいブレードごとにブレードの位置を調整するために使用する必要があります。これにより、ブレードの最適な位置を確保し、垂直振動を最小限に抑えます。 - ブレードの進行速度を0.2 mm/s、ブレードの水平振動/シアーを2.00mmの振幅に、Zステップサイズを~100~150μmに調整します。腎臓セクションの厚さが150μmを超えないようにすることで、Ca2+ イメージング実験に悪影響を及ぼします(PKJの壁が厚すぎると、しばしばそれ自体に折り畳まれるため)。
注:設定は個々の腎臓の準備とビブラートメの器械間で異なるので、ユーザーはこれらの切断パラメータを微調整する必要があります。ステップ 7.2 で説明したように、ユーザーが顕微鏡下でセクションを視覚的に検査できる場合は、断面化中に微調整を行う必要があります。 - ビブラートメの器械に氷浴および緩衝皿を取付けろ。砕いた氷で氷浴を満たし、氷冷KRB溶液で内側の段階領域を満たします(約半分いっぱいに充填)。ビブラートメの切り離し中は、溶けた砕いた氷を監視し、交換します。
8. 腎臓を切り離すビブラートメ
- 鈍い終わりの鉗子を使用して、調製した腎臓を氷冷KRB溶液からそっとつかんで取り除きます。すぐに腎臓を吸収性の紙の上に置き、~2~4sの範囲で余分な外部水分を除去します。腎臓を吸収性の紙にそっと転がして、パレンチマのすべての側面が乾燥し、ビブラートメステージへの腎臓の最適な接着が確実に行えるようにします。
注:RPは腎臓の内側に位置し、したがって、外側のパレンチマによって保護されているので、この短い乾燥期間は、組織の完全性に有害ではありません。 - すぐにビブラートメの標本の板の基部にシアノクリレート接着剤の薄い層(〜1cm2)を適用し、接着剤で覆われた領域に腎臓、尿管側を下に置くために鈍い終わりの鉗子を使用する。約10〜20 sの鉗子の平らな端で腎臓の上部に穏やかに下向きの圧力を加え、接着剤を乾燥させます。
注:この手順の間に腎臓を安定させるために、接着剤が乾くにつれて腎臓を直立に保つために追加の鉗子のペアを使用してください。腎臓が直立した位置で検体プレートに付着し、切片をまっすぐに切断することが重要です。腎臓が検体プレートに正常に付着していることを確認するには、腎臓の側面を静かに押します。腎臓がプレートに正常に付着した場合、腎臓の基部はプレートに固定されたままにする必要があります。 - 試料プレートを緩衝皿の底にしっかりと固定します。腎臓の上部が完全に浸漬されるようにKRB溶液のレベルを調整します。切り離し工程中、ビブラートメブレードがバッファトレイに深く移動するに従って、KRB溶液を取り外して、ブレードホルダが溶液に浸かないようにします。
注:このステップを進める前に接着剤が完全に乾燥していない場合、接着剤はしばしばベースから腎臓のパレンチマに上に移動します。この余分な接着剤は、断面をより可変になります。これが起こった場合は、プレートから腎臓を取り除き、新鮮な腎臓の準備を進めます。 - 自動ビブラートメ切断の場合は、ビブラートメブレード切断サイクルの開始位置と終了位置を選択します。これらの位置が腎臓から約0.5〜1cmクリアされていることを確認し、各ブレードの進歩に伴って腎臓平面全体が切り離されていることを確認します。
- KRB溶液で井戸を充填することにより、多ウェルプレート(24-または48ウェル)を準備し、氷の上にプレートを置きます。
注:生成された場合、セクションの深さを追跡するために、個々のセクションを別々のウェルに配置する必要があります。 - 自動切断処理を開始します。ブレードの最初のパスの間に、ブレードが腎臓の一番上に接触することを確認してください。接触していない場合は、ブレードの開始Z位置を調整します。
- 鉗子を使用して、腎臓から解放されるセクションを収集します。すぐに個々のウェルにセクションを移し、腎臓セクション内のおおよそのPKJ位置を測定するためにセクションのZ-深さに注意してください。
注:カットパラメータによっては、一部のセクションが腎臓ブロックから切り離されない場合があります。この場合は、細かいスプリングハサミを使用して、腎臓ブロックから切り取ってください。ユーザーはまた、最適なカット設定と組織の位置を確保するために、個々の井戸に自由に浮遊しながら、光顕微鏡の下でセクションを積極的に視覚化することをお勧めします。PKJを含むセクションは、通常、腎臓の上部から〜1000〜1500μmから導出される。 - PKJ 領域がより明らかになるまで、断面化プロトコルを続行します。セクションの進行に従って、PKJ領域の説明については、代表的な結果セクションを参照してください。
- この時点で、セクションが腎臓ブロックから均一に解放され、無傷であることを確認するために、セクションパラメータを最適化します。また、壊れたPKJ壁は崩壊による壁内の細胞の適切なイメージングを許可しないため、PKJ領域が連続的で壊れていないことを確認してください。壁が壊れた場合は、断結速度を下げ、断面の厚さを増し、光顕微鏡下でセクションを観察し続けて切断パラメータを微調整します。
- 実験が始まるまでKRB溶液で4°Cのセクションを保管してください。
9. 腎臓スライスCa2+ 画像取得
- 個々の腎臓スライスをシリコンエラストマーコーティングされたイメージングディッシュ(35 mm x 10 mm)に移し、すぐに新鮮な氷冷KRB溶液で皿を満たします。
- 腎臓スライスの周囲にminutienピンを挿入して、イメージング皿の基部にセクションを固定します。
注: このステップは、イメージング中に生理学的溶液がスライス上に浸透している場合に、セクションが動き回るのを防ぐために重要です。 - 直立した回転ディスク共焦点顕微鏡のステージにイメージング皿を置き、すぐにKRB溶液を使用して浸透を開始します。
注:このプロトコルでは、高速ニプコウ回転ディスク共焦点スキャナユニットを搭載した直立顕微鏡が使用されました。 - 3mL/minでの灌流速度、KRB溶液温度を36°c±1°Cに保ちます。 イメージングの前に、スライスを1時間平衡化します。
- 適切な二色イメージングキューブとレーザーを選択します。電子乗算電荷結合デバイス(EMCCD)または科学的相補金属酸化物半導体カメラで画像を取得します。
注:このプロトコルの共焦点システムはGCaMP6fまたはGCaMP3を励起するために488 nmレーザーが装備されている。画像は、512ピクセル×512ピクセルのEMCCDカメラを使用して取得しました。 - 低倍率の水浸し対物レンズ(4xまたは10x)を使用して、腎臓のスライスを見つけます。PKJ が存在するスライスの領域にイメージングフィールドを中央に配置します。 図2Dに示すように、PKJ(すなわち、接合組織間に浮遊する筋肉組織の半円)を見つけるために、ランドマークを特定する。
- PKJ が配置されたら、より高い拡大水浸性対物レンズ(20x、40x、または 60 倍)を使用して対象領域を拡大します。
注: このプロトコルでは、20x の目的の開口(NA)は 1.0、40x 目標 NA は 0.8、60x 目標 NA は 1.0 でした。 - PDGFRα+細胞またはSMCにおいてGCaMP6fまたはGCaMP3を発現するトランスジェニックマウスをそれぞれ用いて、PKJ壁に関心のある異なる細胞を区別する。PDGFRα+ GCaMP6f +腎臓スライスのPKJ壁のPDGFRα+細胞における異なるタイプのCa2+一過性持続時間を観察する(図3C、説明については代表的な結果を参照)およびSMC GCaMP3+腎臓スライスのGCaMP3 +SMC(図3D、説明については代表的な結果を参照)。
- PKJ壁に関心のある細胞が特定されたら、レーザー強度を調整して良好な信号対雑音比を得ます。適切な取得ソフトウェアを使用して、16 Hz ~32 Hz の時間サンプリング周波数で画像を記録します。
注:イメージング中に使用されるレーザー強度に応じて、Ca2+ フルオロフォアの漂白効果による録音の数を制限することをお勧めします。ユーザーは、特定の実験目標に基づいて記録の長さを選択する必要があります。
10. Ca2+ イメージング解析
- PKJペースメーカー領域における異なる細胞型のCa2+イメージング解析を、消化管29,30における他の無傷のペースメーカー製剤に対して先に説明した空間的マッピングによって行う。
Representative Results
PKJのSITUCa2+イメージングでは、RPペースメーカー細胞の重要な細胞活性を明らかにすることができる。細胞特異的なプロモーターによって駆動される遺伝的にコードされたCa2+指標(GCaMPなど)を発現するマウスを用いることで、平板RP製剤からのCa2+イメージング実験では不可能な精度と詳細でRPペースメイキングに関する情報を得ることができます。PKJの始まりは、腎臓の形質組織間に吊り下げられた筋肉の半円の突然の出現によって区別される(図2C;近位PKJは破線ボックスで囲まれている)。断面のその後のラウンド中に、内側の髄質は周囲の皮質組織と区別可能になる。軽顕微鏡の下では、内側の髄質は領域に線条化されて現れ、皮質組織と比較して色が明るく、腎臓の残りの部分との長い軸上で不連続である(図2B、D)。この時点で、より多くの PKJ 領域が表示され始めます。この例は、筋肉の3半円が、組織組織によって懸濁されている図2D(破線の長方形、HおよびG)に示されている。これらの筋肉帯は、内側の乳頭に密接にアプポーズされ、通常は腎動脈(図2D、破線長方形)に隣接します。図2F-H、黒矢印)。より遠位セクションが導出されるにつれて、これらの筋肉のバンドは、PKJ領域の終わりを示す、より完全で統一された構造を形成するために統合される(図2E)。
図3A、Bは、PDGFRα+細胞においてGCaMPを発現するマウスから低消費電力(4-10x)でPKJセクションを示している(Pdgfraにより駆動される誘導性クレリコンビナーゼによりGCaMP6fを発現させる)。 腎動脈硬化(図3A;アスタリスク)などのランドマークを使用して、実験者は、パレンチマル組織間に懸濁した薄いPKJ壁を容易に区別できるべきである(図3B;アスタリスク)。この特定のトランスジェニック組織におけるGCaMP6fの発現は、PKJの全幅にわたって、筋肉層および来期層の両方に広がっている(図3C)。
PDGFRα+ GCaMP6f+腎臓スライスでは、通常PKJ壁の幅を越えて延びる細胞のネットワークが蛍光(図3C)となり、様々な持続時間および周波数の発振Ca2+トランジェントを表示します。PKJ壁のPDGFRα+細胞は、2種類のCa2+過渡持続時間を表示する。この出現層(皮質に近い配向)において、細胞のネットワークとして存在するPDGFRα+細胞およびそのプロセスが定義される。アドベンジアルPDGFRα+細胞は、低周波(4±2.7Hz)および長い期間(1±0.67 s)Ca2+過渡を示す。 PDGFRα+細胞の第2層は、筋肉層(髄質に近い配向)に存在し、同じ細胞タイプであるのと同様のCa2+過渡周波数および持続時間(以下に記載)と同様のCa2+の過渡周波数および持続時間を示す。
SMC GCaMP3+腎臓スライスでは、GCaMP3+細胞の層が筋肉層に存在する(図3D)。この場合、発振層には蛍光シグナルは存在しません(図3D;アスタリスク)。通常、筋肉層のGCaMP3+ SMCは高周波(10±4Hz)および短い持続時間(632±74 s)Ca2+トランジェントを示します。PKJアドベンティアに位置するPDGFRα+細胞は、長時間、低周波Ca2+過渡性を引き出す(図3E、ビデオ1)。しかしながら、Myh11プロモート器によって駆動されるGCaMP3を発現する組織からのCa2+イメージング実験は、PKJの筋肉態面に限定されている(図3D)。PDGFRα+細胞と比較して、SMCはより頻繁に短い持続時間Ca2+の過渡を発射した(図3F、ビデオ2)。
この技術を用いて、PKJPDGFRα+ICのシグナル伝達特性を理解するほか、この技術を応用して、ビブラートメ切除腎臓の他の細胞型を研究することが本論文で実証されている。腎髄質の綿密な検討(PDGFRα+細胞中でGCaMP6fを発現するマウス)では、カ2+シグナルの配列が収集ダクト内および周囲に観察された(ビデオ3)。髄質PDGFRα+細胞は、可変周波数および持続時間の自発的Ca2+過渡を発した。腎臓ビブラート膜切片のこれらのCa2+イメージング研究は、しばしばPKJ筋セグメントに隣接する腎動脈(〜50〜80mmの直径)の研究にも拡大することができた(図2F、G;白矢印)。腎動脈のCa2+イメージング(平滑筋細胞におけるGCaMPを発現する組織から)は、SMCにおけるCa2+過渡症の振動を示す(ビデオ4)。
図1:PKJペースメーカー領域の基礎腎解剖および位置(A)RPおよび尿管の向きを示す無傷の腎臓の図。腎動脈と腎静脈はそれぞれ赤と青で表示されます。(B)無傷の腎臓を矢状平面に沿って切り取って、髄質、乳頭(集結管が収束する遠位髄)、近位および遠位RPを含む腎臓の内側の側面を露出させることができる。(C) 髄質と乳頭を切除してPKJとprox RPを完全に露出させることができる。(DとE) は、それぞれ PKJ ペースメーカー領域と遠位 RP からの伝送光画像を表します。骨盤の遠位端に向かって連続的に切り離した結果、PKJ領域の筋肉の半円(Di)は、乳頭全体をカプセル化する1つの、より厚い筋肉リング(Ei)に結合する。DiとEiの黒い破線の長方形は、透過した光画像が取得されたコロナ腎臓セクションのおおよその領域を示しています。画像DとEの向きは、それぞれのインセット(DiとEi)に対して90°反時計回りです。DおよびE = 20 μmのスケールバー。略語: RP = 腎骨盤;PROX RP = 近位腎骨盤;PKJ = 骨盤腎接合部;PIC = 血小板由来増殖因子受容体 -α陽性間質細胞;SMC = 平滑筋細胞。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:細い切片を生成するために腎臓全体のビブラーム断面化(A)、腎臓は、ビブラートメの底部に尿管側に取り付けられ、標準的なブレード(ビブラートームヘッドに取り付けられた)は、腎臓の近位から遠位まで連続する切片を切断するために使用されます。(B) 色付きランドマークを持つ腎臓全体から切り取られた薄い部分の図示表現。PKJの筋肉セグメント(黒い破線の長方形)は、多くの場合、パレンキマル組織間に浮遊して見られる。(C)近位腎臓部の光顕微鏡画像。接合組織間に吊り下げられた筋肉帯の出現は、近位PKJ突起の始まりを示す(白い破線の長方形の中に示される)。(D) 複数の (2-3) PKJ セグメントが見つかる最適な領域を表す光顕微鏡画像 (白い破線の長方形内の領域)。薄いPKJ筋帯は、腎臓の毛肉の間に懸濁され、腎結細動脈および髄質と密接に整列する。(E) 遠位腎臓部の光顕微鏡画像個々の筋肉セグメントは、単一の連続的な筋肉バンド(白い破線の長方形)を形成するためにマージされました(この画像には存在しません)。スケールバー C-E = 500 μm. F-HパネルDからのズーム(20倍)領域は、PKJ(黒矢印)、腎動脈(白い矢印)、およびPKJ(白い線)を単離するためのカット部位の位置を示す。スケールバー F-H = 100 μm。略語: PKJ = 骨盤腎接合部.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:振動子部のCa2+イメージング(A)腎動脈の位置を示すビブラートーム部の代表低出力画像(4x)(アスタリスク)。スケールバー=200μm(B)は、PKJ筋肉(白矢印頭)、腎動脈(アスタリスク)の位置を示す腎臓の形質組織間に懸濁されたPKJ(標識)の代表的な画像を拡大した(20倍)。スケールバー=50μm(C)PDGFRα+細胞中のGCaMPを発現するPKJの高出力(40倍)像。スケールバー= 20 μm(D) 平滑筋細胞でGCaMPを発現するPKJの高出力(20倍)画像。スケールバー= 20 μm(E) パネルCに示されたGCaMP + PDGFRα+セルからサンプリングされたCa2+トランジェントの時空間マップ。F/F0用にコード化されたテーブルを検索します。(F)パネルDに示されたGCaMP + PDGFRα+セルからサンプリングされたCa2+トランジェントの時空間的マップ。F/F0用にコード化されたテーブルを検索します。(G)GCaMP+PDGFRα+細胞およびGCaMP+smMHC細胞のCa2+一時周波数(Hz)の代表的なデータ。(H)GCaMP+PDGFRα+細胞およびGCaMP+smMHC細胞のCa2+一過性持続時間(複数可)の代表的なデータ。略語: PKJ = 骨盤腎接合;PDGFRα+ = 血小板由来増殖因子受容体-α陽性;smMHC = 平滑筋ミオシン重鎖.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ 1:PKJビブラートメの切片におけるGCaMP+PDGFRα+細胞における自発的Ca2+過渡現象。 略語: PKJ = 骨盤腎接合;PDGFRα+ = 血小板由来増殖因子受容体α陽性。このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
ビデオ2:骨盤腎接合性ビブラートメの切り分けにおけるGCaMP+平滑筋細胞における自発的なCa2+過渡的。このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
ビデオ3:腎髄質ビブラートメの切片におけるGCaMP+PDGFRα+細胞における自発的Ca2+過渡現象。略称: PDGFRα+ = 血小板由来増殖因子受容体α陽性.このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
ビデオ4: 腎動脈のビブラートーム切片における低振幅Ca2+ 一過性活性。 このビデオを見るには、ここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
Discussion
RPは、さまざまなRP領域で観察された差動細胞密度を有する異種集団で構成されています。PIC1 (以前は ASMC と呼ばれていた) は、ペースメーカーの活動が24を起源とする PKJ で最も豊富です。ここで説明するプロトコルは、研究者がマウス腎臓の残りの部分からペースメーカー領域を分離することを可能にする。ビブラートを用いてPKJの切片を切断することで、RPのペースメーカー領域(パレンチマに付着した筋帯として識別される)はそのまま維持され、細胞特異的な蛍光レポーターと組み合わせるとRPペースメーカー細胞を正確に研究するために、その現場イメージングでの使用を可能にする。
このアプローチは、RP ペースメイキングに関する新しい洞察を提供することができますが、イメージングの結果と断面化の効率を向上させるために実験者がよく知っておくべきいくつかの考慮事項があります。訓練を受けていないユーザーにとって、PKJの絶縁およびイメージングのこの方法は、平板RP製剤の典型的な鋭い解剖よりも学びやすい。腎臓全体からのRPの鋭い解剖は、生理学実験のために生存可能な組織を正常に分離するために数週間の一貫した練習を必要とします。このビブラートーム断面プロトコルは、ほとんど鋭い解離の知識を必要としませんので、他の平滑筋構造を解剖した経験がないユーザーにアクセスできます。
ただし、このプロトコルには重要な点がいくつかあります。正常にビブラートメの標本プレートに腎臓を接着する器用さと忍耐が必要です。腎臓の配向が間違っていて片側に傾いている場合、まっすぐな切片ではなく斜めが切られます。PKJの繊細な性質により、斜めの角度はしばしばペースメーカー領域の筋肉帯を破壊する可能性があります。さらに、斜めの切片のイメージングは、セルネットワークが一般的に同じ焦点面に入っていないため、撮像が不十分になります。この手順には時間がかかり、単一の腎臓の切片が完了するまでに最大1時間かかることが多く、その間にセットアップを監視する必要があります。
ビブラートメの動きはスピードアップできますが、速度が速すぎると(プロトコルで推奨されているものよりも>20%)、刃は腎臓をきれいに切断するのではなく細断され、繊細なPKJ構造が失われます。同様に、切断速度が低すぎると、セクションがギザギザになる可能性があります。切削速度とブレード振幅の最適化が不可欠です。ビブラートメのセクションの取り扱いにも注意が必要です。その繊細な性質のために、PKJの筋肉は取り扱い中に容易に破壊され、引き裂くことができる。十分な訓練を受けたユーザーは、Ca2+ イメージング実験に適した4つの腎臓スライスごとに約1〜2個のPKJ領域を収穫することができます。典型的には、Ca2+ イメージング基準を満たさないPKJセクションは、1)GCaMP発現が悪く、2)歪んだPKJ壁、または3)壊れたPKJ壁を有する。データ分析では、視野(FOV)あたり約3〜4個のセルをサンプリングできます。
PDGFRα-GCaMP6fおよびSMC-GCaMP3 PKJ切片のFOVには多くの細胞があるが、小組織の動きはしばしば細胞を分析から除外する。これは通常、イメージに安定化プロトコルを適用することで解決できます。調製物が動かない条件下では、少なくとも3〜5細胞は、SMC-GCaMP3セクションからPDGFRα-GCaMP6fセクションおよび5-6細胞からサンプリングすることができる。典型的には、動物の犠牲(マウスの最適年齢は8〜16週間)からCa2+ イメージング実験を行うまでの時間は2〜3時間であり、組織が必要な場合に手順全体を通して氷冷溶液中で培養される場合、組織の完全性を確保するのに十分である。要約すると、マウス腎臓からRP PKJ領域の調製物をそのまま生成するビブラートメ切断プロトコルをここに説明した。この技術により、RPペースメーカーのメカニズムを調査するためのin situ Ca2+ イメージング研究用のRPペースメーカー領域の保存が可能になります。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
このプロジェクトは、NIDDKからR01 DK124509によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 142485 | To store kidney slices in |
| 35 mm x 10 mm Petri dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | Kidney slice calcium imaging dish |
| 48-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 152640 | To store kidney slices in |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Sigma Aldrich | P5481 | Kidney sharp dissection dish |
| Absorbent paper | Fisher Scientific | 06-666A | To dry the kidney before applying glue |
| B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 13148 | GCaMP3 Mice |
| B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 24105 | GCaMP6f Mice |
| B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J | The Jackson Laboratory | 19079 | smMHC-CRE Mice |
| C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J | The Jackson Laboratory | 13148 | PDGFRa-CRE Mice |
| Cyanoacrylate glue | Amazon | B001PILFVY | For adhering the kidney to the specimen plate |
| Ethanol | Phamco-Aaper | SDA 2B-6 | For dissection |
| Extra-Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14083-08 | Used for internal dissecting scissors |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Used for external dissecting scissors |
| Fine-tip forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Used for fine dissection of kidney |
| Gillette Silver Blue double-edge blades | Amazon | B009XHQGYO | For insertion into blade holder of vibratome |
| ImageJ | NIH | For calcium imaging analysis | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 1001936060 | For anesthesia |
| Minutien pins | Fisher Scientific | NC9677548 | Pins were cut in half to reduce their length |
| Silicon elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | For gently holding and moving the kidney |
| Student Dumont Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for internal dissecting forceps |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | For sharp dissection and cleanup of isolated kidney |
| Vibrocheck | Leica | 14048142075 | Optional component for calibrating blade movement during cutting |
| VT1200 S Vibrating Blade Microtome | Leica | 14912000001 | Configuration 1 is used in our protocol |
References
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