Summary
Målet med denne protokollen er å isolere intakte pacemaker regioner av musen nyre bekken ved hjelp av vibratome seksjonering. Disse seksjonene kan deretter brukes til in situ Ca2+ avbildning for å belyse Ca2+ forbigående egenskaper til pacemakerceller og andre interstitielle celler i vibratomskiver.
Abstract
Nyrebekkenet (RP) er en traktformet, glatt muskelstruktur som letter normal urintransport fra nyrene til urinlederen ved regelmessige, fremdriftssammentrekninger. Regelmessige RP-sammentrekninger er avhengige av pacemakeraktivitet, som stammer fra den mest proksimale regionen av RP ved bekken-nyrekrysset (PKJ). På grunn av vanskeligheten med å få tilgang til og bevare intakte preparater av PKJ, har de fleste undersøkelser om RP-pacemaking fokusert på encellet elektrofysiologi og Ca2 + bildebehandlingseksperimenter. Selv om viktige avsløringer om RP-pacemaking har kommet ut av slikt arbeid, har disse eksperimentene flere iboende begrensninger, inkludert manglende evne til å nøyaktig bestemme cellulær identitet i blandede suspensjoner og mangelen på in situ-avbildning av RP pacemakeraktivitet. Disse faktorene har resultert i en begrenset forståelse av mekanismene som ligger til grunn for normale rytmiske RP-sammentrekninger. I dette dokumentet beskrives en protokoll for å forberede intakte segmenter av mus PKJ ved hjelp av en vibratome seksjoneringsteknikk. Ved å kombinere denne tilnærmingen med mus som uttrykker cellespesifikke reportere og genetisk kodede Ca2+ indikatorer, kan undersøkere kunne studere de spesifikke celletypene og mekanismene som er ansvarlige for peristaltiske RP-sammentrekninger som er avgjørende for normal urintransport, mer nøyaktig.
Introduction
Nyrebekkenet (RP) er en traktformet, glatt muskelstruktur som transporterer urin fra nyrene til urinlederen. RP transporterer urin ved å generere regelmessige rytmiske sammentrekninger (peristaltikk)1,2,3,4,5, som driver en bolus av urin fra nyrene distalt til urinlederen og til slutt til blæren, hvor den lagres til micturition oppstår6,7. Tap av denne vanlige aktiviteten har alvorlige konsekvenser, inkludert hydronefrose og nyresvikt1,3,8; Derfor er det et kritisk behov for å studere mekanismene som ligger til grunn for regelmessige, rytmiske RP-sammentrekninger. Peristaltiske sammentrekninger stammer fra den mest proksimale regionen i RP-i bekken-nyrekrysset (PKJ)9,10,11,12,13,14,15 ( Figur1A-C) og forplante seg distisk for å skyve urin fra papillaen inn i RP ( Figur1B). Elektrisk pacemakeraktivitet registreres i PKJ som spontane forbigående depolariseringer10,11,12,13,15,16,17, som antas å oppstå fra spesialiserte pacemakerceller. Disse pacemakercellene, tidligere kalt atypiske glatte muskelceller (ASMCer), antas å generere eller koordinere pacemakeraktivitet og drive sammentrekningene av "typiske" glatte muskelceller (SMB-er) 9,10,11,18,19,20,21,22,23.
ASMCer er mest tallrike i den proksimale RP, ved PKJ (Figur 1A-C), der peristaltiske sammentrekninger og elektrisk pacemakeraktivitet stammer fra5,7,8,9,12,13,14,16,17,18,19,20,21 ,22. En nylig publisert studie av denne gruppen identifiserte blodplate-avledet vekstfaktor reseptor-alfa (PDGFRα), i kombinasjon med glatt muskel myosin tung kjede (smMHC), som en unik biomarkør for disse interstitiale cellene (ICs)24, et funn som har blitt bekreftet av andre grupper25. Basert på deres morfologi og proteinuttrykksmønster ble disse cellene kalt PDGFRα+ IC type 1 (PIC1)24,26. PIC1s ligger i muskellaget til PKJ der de viser høyfrekvente, kortvarige Ca2+ transienter, antatt å ligge til grunn for genereringen av pacemakerpotensialer24. Det finnes imidlertid andre celletyper i PKJ, inkludert PDGFRα+ ICer (PIC2s) som ikke er smMHC-uttrykkende, i det eventyrlige laget. Tidligere rapporter har antydet at ikke-smMHC ICer kan delta i reguleringen av pacemaker aktivitet19. Videre studier av ikke-smMHC ICs hindres imidlertid av dårlig distinksjon under Ca2 + bildestudier. Vanligvis er heterogene celletyper i RP-preparatene ukritisk lastet med Ca2+-sensitive fargestoffer (f.eks. For å overvinne disse utfordringene og for å studere en rekke celletyper i RP, kan genetisk kodede Ca2+ indikatorer (GECIer) brukes til selektivt å uttrykke Ca2+-sensitive fluoroforer i celletyper av interesse.
De fleste studiene som belyste Ca2 + forbigående egenskaper i PIC1s / ASMCs ble oppnådd ved å avbilde flat-sheet RP vev preparater19,21,27. Siden PIC1s er den eneste celletypen i PKJ som uttrykker smMHC, er betinget uttrykk for GECI, GCaMP, i smMHC+ celler hensiktsmessig å studere PIC1s i denne konfigurasjonen. Men ettersom PIC1s og PIC2s begge uttrykker PDGFRα, forbyr betinget uttrykk for GCaMP-varianter i PDGFRα+ celler celleforskjell i flatarkforberedelser. For å omgå dette problemet ble en vibratome seksjonering tilnærming brukt til å skille PIC1s og PIC2s over PKJ vev veggen24. For å avsløre disse diskrete cellulære populasjonene ble RP seksjonert koronally, noe som gjorde det mulig å identifisere PIC2s i adventitia og PIC1s i muskelveggen basert på kjent immunhiistokjemisk merking og GECI-uttrykksmønstre. Som et resultat av denne nye PKJ-bildemetoden ble PIC1s og PIC2s funnet å vise distinkte Ca2 + signalegenskaper24. Videre, ved å isolere de mest proksimale delene av PKJ-regionen (figur 2), ble pacemakerområdet til RP bevart på en måte som ikke var oppnådd tidligere. Her beskrives en protokoll for å vise hvordan du isolerer PKJ-preparater fra musen nyre ved hjelp av vibratome seksjonering, hvordan du setter opp disse forberedelsene for Ca2 + bildebehandling eksperimenter, og hvordan du skiller de forskjellige celletypene over PKJ-veggen.
Protocol
Alle musene som ble brukt og protokollene beskrevet i denne studien var i samsvar med National Institutes of Health Guide for care and use of Laboratory Animals, og Institutional Animal Use and Care Committee ved University of Nevada, Reno, NV. Eksperimenter og dyrebruk samsvarte også med prinsippene og forskriftene som beskrevet av Grundy28.
1. Generer PDGFRα-GCaMP6f- og SMCGCaMP3-mus
- Kryss GCaMP6flox/+ mus (B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/J) med PDGFRαCre-mus (C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J) for å generere PDGFRα-GCaMP6f-mus.
- Kryss GCaMP3lox/+ mus (B6.129S-Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J) med mannlige smMHCCreERT2 mus (B6. FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J) for å generere SMC-GCaMP3-mus.
MERK: Bare hannmus på korset (GCaMP3lox/+ mus og smMHCCreERT2 mus) kan brukes da Cre-uttrykket drives fra Y-kromosomet. smMHCCreERT2-mus kan også krysses med GCaMP6flox/+ mus for forbedret Ca2+ signal-til-støy-forhold og raskere Ca2+ signaltemporale egenskaper.
2. Forbered og injiser transgene mus med tamoksifen for å indusere betinget uttrykk for GCaMP
- Aktiver inducible Cre rekombininase for cellespesifikt GCaMP-uttrykk i bestemte celletyper, som tidligere beskrevet29.
3. Forbered løsninger
- Forbered 1 L Krebs-Ringer bikarbonat (KRB) oppløsning som inneholder 120,35 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 15,5 mM NaHCO3,1,2 mM Na2HPO 4,1,2 mM MgCl2, 11,5 mM glukose og 2,5 mMMM På bruksdagen opprettholder du KRB-løsningen på is.
MERK: KRB kan oppbevares ved 4 °C i opptil én uke og bør forhåndsbobles med en blanding på 97 % O2 og 3 % CO2 i minst 10 minutter før bruk.
4. Forbered silisium elastomerbelagt disseksjon og mikroskopavbildningsretter
- Bland silisiumelastomerkomponenter i henhold til produsentens instruksjoner. Fyll en Petri-tallerken på 35 mm x 10 mm og en Petri-tallerken på henholdsvis 60 mm x 15 mm Petri omtrent en fjerdedel full av flytende silisiumelastomer for avbildningsforsøk og disseksjon. Polymeriser silisiumelastomeren ved 37 °C i 1 dag før bruk.
MERK: For å forbedre kontrasten til tynne nyreseksjoner, påfør en liten, svart sirkel av papir på bunnen av bildebehandling petri parabolen før du fyller med silisium elastomer.
5. Nyre disseksjon
- Bedøv mus ved innånding av 3-4% isofluran i en ventilert hette. Bekreft induksjonen av dypbedøvelse ved tap av tå og / eller hale klype refleks, og euthanize musene ved cervical dislokasjon.
- Påfør 70% etanol på brystet for å dempe pelsen. Bruk ekstern disseksjonssaks, åpne bukhulen via et langsgående snitt, med sakseblader vinklet bort fra dyret for å forhindre skade på de indre organene.
- Bruk innvendige vevs tang og intern disseksjon saks, klem tarmene og løft dem bort fra bukveggen. Mens du løfter tarmene, kutt undersiden av tarmene fri fra kroppen ved det proksimale tolvfingertarmen og distal kolon for å få tilgang til det retroperitoneale rommet som inneholder nyrene.
- Når nyrene er utsatt, trekk dem ut individuelt. Klem forsiktig og løft den distale enden av urinlederen (~ 4 mm unna nyrene) med vevspinner. Bruk disseksjonssaksen, kutt under den klemte urinlederen mot nyrene. Fortsett å kutte under nyrene til det har blitt frigjort fra det omkringliggende bindevevet.
MERK: For å maksimere vevsintegritet og skjærekonsistens under vibromeksjoner, må nyrene være så intakte som mulig. For å sikre dette, unngå klemming eller kutting av nyrene med tang og disseksjonssaks. - Plasser nyrene med festet urinlederen i iskald KRB-løsning. Gjenta trinn 5.4 og 5.5 med den kontralaterale nyren. Vedlikehold nyrene i KRB-oppløsningen på is.
MERK: Fortsett umiddelbart til neste del av protokollen for å bevare PKJ-vevs levedyktigheten. På grunn av sin anatomiske plassering dypt inne i nyreparenchyma, blir PKJ fratatt kontakt med KRB-løsning.
6. Forbered nyrene for vibratome seksjonering
- Overfør nyrene til en silisium elastomerbelagt disseksjonsfat (60 mm x 15 mm), og fyll den med iskald KRB-løsning til nyrene er helt nedsenket.
- Under et dissekerende mikroskop forankrer du nyrene til bunnen av parabolen ved å sette minutienpinner inn i den proksimale urinlederen og gjennom den tynne fremre nyrekapselen eller det omkringliggende fettvevet.
MERK: Pass på at du ikke punkterer nyreparenchymavevet. - Bruk fin vårsaks og interne tang for å fjerne fettvev fra bunnen av nyrene for å eksponere den distale RP og proksimale urinlederen.
- Fjern den proksimale urinlederen og en del av den distale RP fra bunnen av RP ved hjelp av fin vårsaks.
MERK: Pass på at du ikke kutter det omkringliggende nyreparenchymaet. Den svarte stiplede linjen i figur 1A angir den omtrentlige posisjonen til dette kuttet. Dette kuttet skaper en flat base på nyrene for mer ensartet vevsseksjon. Ved dissekering av nyrene må man være klar over den anatomiske posisjonen til PKJ-regionen. Figur 1B viser at den intakte nyre kan kuttes langs et sagittalplan for å eksponere medulla, papilla (distal medulla der samlekanaler konvergerer) og proksimal og distal RP. Hvis papillaen skulle eksponeres helt, som i figur 1C, kan PKJ og proksimal RP (prox RP) visualiseres. Dette bør imidlertid ikke gjøres for vibratomteknikken; Denne beskrivelsen er å orientere leseren til PKJ-plasseringen generelt, understreket i den anatomiske forskjellen som vises i de overførte lysbildene i PKJ-regionen og midt-RP-regionen i figur 1D,E. - Pierce den ytre nyrekapselen med finspiss tang, vinkle spissene bort fra nyrekroppen. Bruk tang med hver hånd, klem de løse endene av kapselen og skrell dem fra hverandre. Fortsett å skrelle tilbake den gjenværende nyrekapselmembranen til den er helt fjernet.
MERK: Nyrekapselen er et tøft, fibrøst lag som omgir nyrene. Den må fjernes før vibromseksjon for optimal kutting.
7. Klargjør og kalibrer vibratominstrumentet
- Sett et barberblad inn i bladholderen på vibratominstrumentet, og juster bladklaringsvinkelen til ~18°.
MERK: Som et valgfritt trinn for seksjonering av høyere kvalitet, bør en kalibreringsblokk (følger med noen vibratominstrumenter) brukes til å justere bladposisjonen for hvert nytt blad som brukes i henhold til produsentens instruksjoner. Dette vil sikre optimal posisjonering av bladet og minimere vertikal vibrasjon. - Juster bladets fremføringshastighet til 0,2 mm/s, den horisontale vibrasjonen/rensingen av bladet til en amplitude på 2,00 mm og Z-trinnstørrelsen på bladet til ~100-150 μm. Forsikre deg om at nyreseksjonens tykkelse ikke overstiger 150 μm, da dette vil påvirke Ca2 + bildebehandlingseksperimenter negativt (fordi PKJ-veggen ofte vil rulle og brette seg på seg selv hvis den er for tykk).
MERK: Brukeren bør finjustere disse skjæreparametrene fordi innstillingene vil variere mellom individuelle nyrepreparater og vibratominstrumenter. Finjustering bør skje under seksjonering når brukeren visuelt kan inspisere seksjoner under et mikroskop, som beskrevet i trinn 7.2. - Monter et isbad og bufferbrett på vibratominstrumentet. Fyll isbadet med knust is, og fyll det indre sceneområdet med iskald KRB-løsning (fyll til ca. halvfull). Under vibratomeksjoner overvåker og erstatter du den knuste isen som har smeltet.
8. Vibratome seksjonering av nyrene
- Bruk stumpe tang for å forsiktig gripe og fjerne den tilberedte nyren fra iskald KRB-løsning. Plasser straks nyrene på absorberende papir i ~ 2-4 s for å fjerne overflødig ekstern fuktighet. Rull nyrene forsiktig over det absorberende papiret for å sikre at alle sider av parenchyma har tørket slik at det er optimal vedheft av nyrene til vibratomtrinnet.
MERK: Siden RP er plassert inne i nyrene og derfor beskyttet av ytre parenchyma, vil denne korte tørkeperioden ikke være skadelig for vevsintegriteten. - Påfør umiddelbart et tynt lag cyanoacrylatlim (~ 1 cm2) på bunnen av vibratomprøveplaten, og bruk stumpe tang for å plassere nyrene, urinlederen ned, på området dekket av lim. Påfør forsiktig nedadgående trykk på toppen av nyrene med den flate kanten av tangene i ca. 10-20 s for å tørke limet.
MERK: For å stabilisere nyrene under denne prosedyren, bruk et ekstra par tang for å holde nyrene oppreist når limet tørker. Det er kritisk at nyrene fester seg til prøveplaten i oppreist stilling slik at seksjonene kuttes rett. For å sikre at nyrene har holdt seg til prøveplaten, skyv forsiktig siden av nyrene. Hvis nyrene har holdt seg til platen, bør bunnen av nyrene forbli festet til platen. - Fest prøveplaten godt til bunnen av bufferskuffen. Juster nivået av KRB-løsning slik at toppen av nyrene er helt nedsenket. Under seksjoneringstrinnene, når vibratombladet beveger seg dypere inn i bufferbrettet, fjerner du KRB-løsningen slik at bladholderen ikke blir nedsenket i løsningen.
MERK: Hvis limet ikke har tørket helt før du fortsetter med dette trinnet, vil limet ofte bevege seg opp fra basen og videre til nyreparenchyma. Dette overflødige limet vil gjøre seksjonering mer variabel. Hvis dette skjer, fjern nyrene fra platen og fortsett med et nytt nyrepreparat. - For automatisk vibromseksjon velger du start- og sluttposisjonene til vibratombladskjæringssyklusen. Kontroller at disse posisjonene er ~ 0,5-1 cm klare for nyrene for å sikre at hele nyreplanet er seksjonert med hvert bladutvikling.
- Forbered en flerbrønnet plate (24- eller 48-brønn) ved å fylle brønner med KRB-løsning og legg platen på is.
MERK: Når de genereres, bør individuelle seksjoner plasseres i separate brønner for å holde oversikt over seksjonsdybden. - Start den automatiske skjæreprosessen. Under den første passeringen av bladet, sørg for at bladet kommer i kontakt med toppen av nyrene. Hvis det ikke er kontakt, justerer du startposisjonen for Z-posisjonen til bladet.
- Bruk tang, samle seksjoner som frigjøres fra nyrene. Overfør umiddelbart seksjonene til individuelle brønner, og noter Z-dybden på seksjonene for å måle omtrentlig PKJ-plassering i nyreseksjoner.
MERK: Avhengig av kuttparametrene, kan det hende at noen seksjoner ikke kuttes fri fra nyreblokken. Hvis dette skjer, bruk forsiktig fin vårsaks for å kutte seksjoner fra nyreblokken. Brukere oppfordres også til aktivt å visualisere seksjoner under et lysmikroskop mens de flyter fritt i individuelle brønner for å sikre optimale kuttinnstillinger og vevsplassering. Seksjoner som inneholder PKJ vil vanligvis bli avledet ~ 1000-1500 μm fra toppen av nyrene. - Fortsett seksjoneringsprotokollen til PKJ-områdene blir tydeligere. Se avsnittet om representativ resultat for beskrivelse av PKJ-regionene som seksjoneringsproveny.
- På dette tidspunktet optimaliserer du seksjonsparametrene for å sikre at seksjoner frigjøres fra nyreblokken jevnt og er intakte. I tillegg må du sørge for at PKJ-områdene er kontinuerlige og ubrutte fordi ødelagte PKJ-vegger ikke tillater tilstrekkelig avbildning av celler i veggen på grunn av kollaps. Hvis veggene blir ødelagt, reduser seksjonshastigheten og øk seksjonstykkelsen, og fortsett å observere seksjoner under et lysmikroskop for å finjustere skjæreparametrene.
- Oppbevar seksjoner ved 4 °C i KRB-oppløsning til eksperimenteringen begynner.
9. Nyreskive Ca2 + bildeoppkjøp
- Overfør en individuell nyreskive til en silisium elastomerbelagt bilderett (35 mm x 10 mm), og fyll straks parabolen med frisk, iskald KRB-løsning.
- Sett minutienpinner rundt periferien av en nyreskive for å feste delen til bunnen av bildefatet.
MERK: Dette trinnet er avgjørende for å forhindre at delen beveger seg rundt når fysiologiske løsninger perfunderes over skiven under avbildning. - Plasser bildefatet på scenen til et oppreist spinnende diskkonfektmikroskop og begynn umiddelbart å parfyme med KRB-løsning.
MERK: I denne protokollen ble det brukt et oppreist mikroskop utstyrt med en høyhastighets Nipkow spinnende disk konfokal skannerenhet. - Opprettholde perfusjonshastigheten ved 3 ml/min og krb oppløsningstemperatur ved 36 ± 1 °C. Før avbildning, la stykket likevekte i 1 time.
- Velg riktig dikroisk bildebit og lasere. Skaff deg bilder med en elektron-multipliserende ladekoblet enhet (EMCCD) eller vitenskapelig komplementært metalloksid-halvlederkamera.
MERK: Det konfokale systemet i denne protokollen er utstyrt med en 488 nm laser for å begeistre GCaMP6f eller GCaMP3. Bilder ble anskaffet ved hjelp av et EMCCD-kamera på 512 piksler x 512 piksler. - Bruk en objektiv linse med lav forstørrelse, vanninnlevelse (4x eller 10x) for å finne nyreskiven. Midtstill bildefeltet på områder i stykket der PKJ-en er til stede. Identifiser landemerker, som vist i figur 2D, for å finne PKJ (dvs. halvcirkler av muskelvev suspendert mellom parenchymalt vev).
- Når PKJ er plassert, bruk en objektiv linse med høyere forstørrelsesvann (20x, 40x eller 60x) for å forstørre interesseområdet.
MERK: I denne protokollen var den 20x objektive numeriske blenderåpningen (NA) 1,0, 40x objektivET NA var 0,8, og 60x objektivET NA var 1,0. - Skille forskjellige celler av interesse i PKJ-veggen ved hjelp av transgene mus som uttrykker henholdsvis GCaMP6f eller GCaMP3 i PDGFRα+ celler eller SMB-er. Vær oppmerksom på de forskjellige typene Ca2+ forbigående varigheter i PDGFRα+ celler i PKJ-veggen i PDGFRα+ GCaMP6f+ nyreskiver (Figur 3C, se representative resultater for beskrivelse) og i GCaMP3+ SMCer i SMC GCaMP3+ nyreskiver (Figur 3D, se representative resultater for beskrivelse).
- Når celler av interesse for PKJ-vegg er identifisert, justerer du laserintensiteten for å gi et godt signal-til-støy-forhold. Ta opp bilder med en tidsmessig samplingsfrekvens mellom 16 Hz og 32 Hz ved hjelp av passende anskaffelsesprogramvare.
MERK: Avhengig av laserintensiteten som brukes under bildet, anbefales det å begrense antall opptak på grunn av blekeeffektene på Ca2+ fluoroforer. Brukeren bør velge opptakslengde basert på de spesifikke eksperimentelle målene.
10. Ca2+ bildeanalyse
- Utfør Ca2+ bildeanalyse av forskjellige celletyper i PKJ pacemaker regioner ved romlig kartlegging som tidligere beskrevet for andre intakte pacemakerpreparater i mage-tarmkanalen29,30.
Representative Results
In situ Ca2+ avbildning av PKJ kan avsløre viktig cellulær aktivitet av RP pacemakerceller. Ved å bruke mus som uttrykker genetisk kodede Ca2+-indikatorer (for eksempel GCaMP), drevet av cellespesifikke promotorer, kan informasjon om RP-pacemaking oppnås med nøyaktighet og detaljer som ikke er mulig fra Ca2+ bildebehandlingseksperimenter fra flatark RP-preparater. Begynnelsen av PKJ er preget av det plutselige utseendet av halvsirkler av muskel suspendert mellom nyre parenchymalt vev (Figur 2C; proksimal PKJ vedlagt i stiplet boks). Under etterfølgende runder med seksjonering blir den indre medulla skiller seg fra det omkringliggende kortikale vevet. Under et lett mikroskop vises den indre medulla striated i regioner, lettere i farge sammenlignet med kortikale vev og diskontinuerlig på sin lange akse med resten av nyrene (Figur 2B,D). På dette tidspunktet vil flere PKJ-regioner begynne å vises. Eksempler på dette er vist i figur 2D (stiplede rektangler, H og G) hvor 3 halvsirkler av muskel er suspendert av parenchymalt vev. Disse muskelbåndene vil bli nøye apposed til den indre papilla og vil vanligvis nabo en nyre arteriole (Figur 2D, stiplede rektangler; Figur 2F-H, svarte pilspisser). Etter hvert som flere distale seksjoner avledes, vil disse muskelbåndene integreres for å danne en mer komplett, enhetlig struktur, noe som indikerer slutten på PKJ-regionen (Figur 2E).
Figur 3A,B viser en PKJ-seksjon ved lav effekt (4-10x) fra en mus som uttrykker GCaMP i PDGFRα+ celler (GCaMP6f uttrykt av inducible Cre-recombinase drevet av Pdgfra). Ved hjelp av landemerker som nyrearteriolen (Figur 3A; stjerne), bør eksperimentere lett kunne skille den tynne PKJ-veggen suspendert mellom parenchymalt vev (Figur 3B; stjerner). Uttrykket av GCaMP6f i dette spesifikke transgene vevet er spredt over hele bredden av PKJ, over både muskel- og adventitiallagene (Figur 3C).
I PDGFRα+ GCaMP6f+ nyreskiver vil et nettverk av celler som vanligvis strekker seg over bredden på PKJ-veggen være fluorescerende (figur 3C) og vise oscillerende Ca2+ forbigående av ulike varigheter og frekvenser. PDGFRα+ celler i PKJ-veggen viser to forskjellige typer Ca2+ forbigående varigheter. I det eventyrlige laget (orientert nærmere cortex) er PDGFRα+ celler tilstede som et nettverk av celler og deres prosesser definert. Adventitial PDGFRα+ celler har lav frekvens (4 ± 2,7 Hz) og lang varighet (1 ± 0,67 s) Ca2+ transienter. Det andre laget av PDGFRα+ celler, tilstede i muskellaget (orientert nærmere medulla), viser lignende Ca2 + forbigående frekvenser og varigheter som SMC GCaMP3+ celler (beskrevet nedenfor) som de er samme celletype.
I SMC GCaMP3+ nyreskiver er et lag med GCaMP3+ celler til stede i muskellaget ( Figur3D). Det vil ikke være noe fluorescerende signal i adventitiallaget (Figur 3D; stjerne). GCaMP3+ SMB-er i muskellaget viser vanligvis høyfrekvente (10 ± 4 Hz) og kort varighet (632 ± 74 s) Ca2+ transienter. PDGFRα+ celler i PKJ-adventitia fremkaller lang varighet, lavfrekvente Ca2+ transienter (Figur 3E, Video 1). Ca2+ bildebehandlingseksperimenter fra vev som uttrykker GCaMP3 drevet av Myh11 promotor er imidlertid begrenset til det muskulære aspektet av PKJ (Figur 3D). Sammenlignet med PDGFRα+ celler i adventitia, SMB-er avfyrt kortere varighet Ca2 + transienter oftere (Figur 3F, Video 2).
I tillegg til å forstå signalegenskaper i PKJ PDGFRα+ ICs, har anvendelsen av denne teknikken for å studere andre celletyper i den vibratome-seksjonerte nyren blitt demonstrert i dette papiret. Ved nøye undersøkelse av nyremedulla (hos mus som uttrykker GCaMP6f i PDGFRα+ celler), ble det observert en rekke fluorescerende Ca2+ signaler i og rundt innsamling av kanaler (Video 3). Medullær PDGFRα+ celler avfyrt spontan Ca2 + forbigående av variabel frekvens og varighet. Disse Ca2 + bildestudier av nyre vibratome seksjoner kan også utvides til å studere nyrearterioler (~ 50-80 mm diameter) som ofte nabo PKJ muskel segmenter (Figur 2F, G; hvite piler). Ca2+ avbildning av nyrearterioler (fra vev som uttrykker GCaMP i glatte muskelceller) demonstrerer oscillerende Ca2+ transienter i SMB -er (Video 4).
Figur 1: Grunnleggende nyreanatomi og plassering av PKJ pacemaker region. (A) Diagram over den intakte nyren som viser retningen til RP og urinlederen. Nyrearterien og nyrevenen vises i henholdsvis rød og blå. (B) Den intakte nyre kan kuttes langs et sagittalplan for å eksponere det indre aspektet av nyrene, inkludert medulla, papilla (distal medulla der innsamling av kanaler konvergerer), og proksimal og distal RP. (C) Medulla og papilla kan utskilles for å eksponere PKJ og prox RP helt. (D og E) representerer overførte lysbilder fra henholdsvis PKJ pacemaker-regionen og distal RP. Sekvensiell seksjonering mot den distale enden av bekkenet resulterer i halvcirkler av muskler i PKJ-regionen (Di) kombinere til en, tykkere muskuløs ring (Ei) som innkapsler hele papilla. Svarte, stiplede rektangler i Di og Ei viser omtrentlige områder i koronar nyre seksjoner der overførte lysbilder ble anskaffet. Retningen på bildene D og E er 90° mot klokken til respektive innsett (Di og Ei). Skalastenger i D og E = 20 μm. Forkortelser: RP = nyrebekken; prox RP = proksimal nyrebekken; PKJ = bekken-nyrekryss; PICer = blodplateavledede vekstfaktorreseptor-alfapositive mellomliggende celler; SMC = glatt muskelcelle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vibratome seksjonering av hele nyrer for å generere tynne seksjoner. (A) Nyrer er montert urinrørssiden ned til bunnen av vibratominstrumentet, og et standardblad (festet til vibratomhodet) brukes til å kutte sekvensielle seksjoner fra den proksimale til distale enden av nyrene. (B) Diagrammatisk representasjon av en tynn seksjon kuttet fra hele nyrene med kommenterte landemerker. PKJ muskelsegmenter (svart stiplet rektangel) er ofte funnet suspendert mellom parenchymalt vev. (C) Lett mikroskopisk bilde av en proksimal nyreseksjon. Utseendet til muskelbånd suspendert mellom parenchymalt vev indikerer begynnelsen av de proksimale PKJ-projeksjonene (angitt inne i hvitt stiplet rektangel). (D) Lett mikroskopisk bilde som representerer det optimale området der flere (2-3) PKJ-segmenter finnes (områder innenfor hvite stiplede rektangler). Tynne PKJ muskelstrimler er suspendert mellom nyreparenchyma og justeres tett med nyrearterioler og medulla. (E) Lys mikroskopisk bilde av en distal nyreseksjon. Individuelle muskelsegmenter har fusjonert for å danne et enkelt, kontinuerlig muskelbånd (hvitt stiplet rektangel) som omgir den indre papillaen (ikke til stede i dette bildet). Skalastolper C-E = 500 μm. F-H Zoomed (20x) regioner fra panelet D angir plasseringen av PKJ (svarte pilspisser), nyrearterioler (hvite pilspisser) og kutte steder for å isolere PKJ (stiplede hvite linjer). Skalastenger F-H = 100 μm. Forkortelse: PKJ = bekken-nyrekryss. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3:Ca. 2+ avbildning av vibratome seksjoner. (A) Representativt laveffektsbilde (4x) av en vibratome seksjon som betegner plasseringen av nyrearteriolen (stjerne). Skala bar = 200 μm. (B) Zoomet (20x) representativt bilde av PKJ (merket) suspendert mellom nyre parenchymal vev betegne steder av PKJ muskel (hvit pilspiss), nyre arteriole (stjerne). Skalalinje = 50 μm. (C) Høyeffektsbilde (40x) av PKJ som uttrykker GCaMP i PDGFRα+-celler. Skala bar = 20 μm. (D) Høy effekt (20x) bilde av PKJ uttrykke GCaMP i glatte muskelceller. Skalastang = 20 μm. (E) Romlig kart over Ca2+ transienter samplet fra en GCaMP+ PDGFRα+ celle angitt i panel C. Slå opp tabell med kode for F/F0. (F) Romlig kart over Ca2+ transienter samplet fra en GCaMP+ PDGFRα+ celle angitt i panel D. Slå opp tabell med kode for F/F0. (G) Representative data for Ca2+ forbigående frekvens (Hz) for GCaMP+ PDGFRα+ celler og GCaMP+ smMHC celler. (H) Representative data for Ca2+ forbigående varighet (er) for GCaMP+ PDGFRα+ celler og GCaMP+ smMHC celler. Forkortelser: PKJ = bekken-nyrekryss; PDGFRα+ = blodplate-avledet vekstfaktorreseptor-alfa-positiv; smMHC = glatt muskel myosin tung kjede. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Spontan Ca2+ transienter i GCaMP+ PDGFRα+ celler i PKJ vibratome seksjoner. Forkortelser: PKJ = bekken-nyrekryss; PDGFRα+ = blodplate-avledet vekstfaktorreseptor-alfa-positiv. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 2: Spontan Ca2 + transienter i GCaMP+ glatte muskelceller i bekken-nyre kryss vibratome seksjoner. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 3: Spontan Ca2 + transienter i GCaMP+ PDGFRα+ celler i nyre medullær vibratome seksjoner. Forkortelse: PDGFRα+ = blodplate-avledet vekstfaktor reseptor-alfa-positiv. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 4: Lav-amplitude Ca2+ forbigående aktivitet i vibratome delene av nyrearteriolen. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Discussion
RP består av en heterogen populasjon av celler med differensialcelletetthet observert i ulike RP-regioner. PIC1s (tidligere referert til som ASMCs) er mest tallrike i PKJ, hvor pacemakeraktivitet stammer fra24. Protokollen, beskrevet her, tillater etterforskere å isolere pacemaker-regionen fra resten av musen nyre. Ved å kutte deler av PKJ ved hjelp av en vibratom, holdes pacemakerregionene i RP (identifisert som muskelbånd festet til parenchyma) intakt, og gir dermed bruk av in situ-avbildning for å nøyaktig studere RP pacemakerceller når de kombineres med cellespesifikke fluorescensreportere.
Selv om denne tilnærmingen kan gi ny innsikt i RP-tempomaking, er det noen hensyn som eksperimenter bør være kjent med for å forbedre bilderesultatene og seksjoneringseffektiviteten. For en utrent bruker er denne metoden for PKJ-isolasjon og avbildning lettere å lære enn typisk skarp disseksjon av flatark RP-preparater. Skarp disseksjon av RP fra hele nyrer krever uker med konsistent praksis for å isolere levedyktig vev for fysiologiske eksperimenter. Siden denne vibratome seksjoneringsprotokollen krever lite skarp disseksjonskunnskap, er den tilgjengelig for brukere som ikke har erfaring med å dissekere andre glatte muskelstrukturer.
Det er imidlertid noen kritiske punkter å merke seg for denne protokollen. Vellykket å følge nyrer til vibratomprøveplaten krever fingerferdighet og tålmodighet. Hvis nyrene er orientert feil og lener seg til den ene siden, vil skrå i stedet for rette seksjoner bli kuttet. På grunn av PKJ-ens delikate natur kan den skrå vinkelen ofte ødelegge muskelbåndene i pacemaker-regionen. Videre resulterer avbildning av skrå seksjoner i dårlig bildeinnsamling, da cellenettverk vanligvis ikke er i samme fokusplan. Prosedyren er også tidkrevende, med seksjonering av en enkelt nyre som ofte tar opptil en time å fullføre, i løpet av hvilken tid oppsettet krever overvåking.
Mens bevegelsen av vibratomet kan sped opp, hvis hastigheten økes for mye (>20% enn det som anbefales i protokollen), vil bladet makulere i stedet for å kutte nyrene rent, noe som resulterer i tap av delikate PKJ-strukturer. På samme måte kan en skjærehastighet som er for lav føre til at delen blir hakket. Optimalisering av skjærehastighet og bladamplitude er viktig. Det må også utvises forsiktighet ved håndtering av vibratome seksjoner. På grunn av sin delikate natur blir PKJ-musklene lett forstyrret under håndtering og kan rive. En godt trent bruker vil kunne høste ca 1-2 PKJ-regioner per 4 nyreskiver som passer for Ca2 + bildebehandlingsforsøk. Vanligvis har PKJ-seksjoner som ikke oppfyller Ca2+ avbildningskriterier: 1) dårlig GCaMP-uttrykk, 2) en kontret PKJ-vegg eller 3) en ødelagt PKJ-vegg. For dataanalyse kan omtrent 3-4 celler per synsfelt (FOV) ta prøver.
Mens det er mange celler i FOV av PDGFRα-GCaMP6f og SMC-GCaMP3 PKJ seksjoner, utelukker små vevsbevegelser ofte celler fra analyse. Dette kan vanligvis løses ved å bruke en stabiliseringsprotokoll på bilder. Under forhold der preparater ikke beveger seg, kan minst 3-5 celler prøves fra PDGFRα-GCaMP6f-seksjoner og 5-6 celler fra SMC-GCaMP3-seksjoner. Vanligvis er tiden tatt fra dyreoffer (optimal alder for mus 8-16 uker) til å utføre Ca2 + bildebehandlingsforsøk er 2-3 timer, noe som er tilstrekkelig for å sikre vevsintegritet, hvis vev inkuberes i iskalde løsninger gjennom hele prosedyren når det er nødvendig. Oppsummert har en vibratom skjæreprotokoll blitt beskrevet her for å generere intakte preparater av RP PKJ-regioner fra musen nyre. Denne teknikken gjør det mulig å bevare RP pacemaker regioner for in situ Ca2 + bildestudier for å undersøke RP pacemaker mekanismer.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble finansiert av R01 DK124509 fra NIDDK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 142485 | To store kidney slices in |
| 35 mm x 10 mm Petri dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | Kidney slice calcium imaging dish |
| 48-well culture plate | ThermoFisher Scientific | 152640 | To store kidney slices in |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Sigma Aldrich | P5481 | Kidney sharp dissection dish |
| Absorbent paper | Fisher Scientific | 06-666A | To dry the kidney before applying glue |
| B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 13148 | GCaMP3 Mice |
| B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J | The Jackson Laboratory | 24105 | GCaMP6f Mice |
| B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J | The Jackson Laboratory | 19079 | smMHC-CRE Mice |
| C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J | The Jackson Laboratory | 13148 | PDGFRa-CRE Mice |
| Cyanoacrylate glue | Amazon | B001PILFVY | For adhering the kidney to the specimen plate |
| Ethanol | Phamco-Aaper | SDA 2B-6 | For dissection |
| Extra-Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14083-08 | Used for internal dissecting scissors |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Used for external dissecting scissors |
| Fine-tip forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Used for fine dissection of kidney |
| Gillette Silver Blue double-edge blades | Amazon | B009XHQGYO | For insertion into blade holder of vibratome |
| ImageJ | NIH | For calcium imaging analysis | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 1001936060 | For anesthesia |
| Minutien pins | Fisher Scientific | NC9677548 | Pins were cut in half to reduce their length |
| Silicon elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | For gently holding and moving the kidney |
| Student Dumont Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Used for internal dissecting forceps |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | For sharp dissection and cleanup of isolated kidney |
| Vibrocheck | Leica | 14048142075 | Optional component for calibrating blade movement during cutting |
| VT1200 S Vibrating Blade Microtome | Leica | 14912000001 | Configuration 1 is used in our protocol |
References
- Constantinou, C. E., Djurhuus, J. C. Pyeloureteral dynamics in the intact and chronically obstructed multicalyceal kidney. The American Journal of Physiology. 241 (5), 398-411 (1981).
- Constantinou, C. E., Yamaguchi, O. Multiple-coupled pacemaker system in renal pelvis of the unicalyceal kidney. TheAmerican Journal of Physiology. 241 (5), 412-418 (1981).
- Constantinou, C. E., Hrynczuk, J. R. Urodynamics of the upper urinary tract. Investigative Urology. 14 (3), 233-240 (1976).
- Schmidt-Nielsen, B., Schmidt-Nielsen, B. On the function of the mammalian renal papilla and the peristalsis of the surrounding pelvis. Acta Physiologica. 202 (3), Oxford, England. 379-385 (2011).
- Dwyer, T. M., Schmidt-Nielsen, B. The renal pelvis: machinery that concentrates urine in the papilla. Physiology. 18 (1), 1-6 (2003).
- Hill, W. G. Control of urinary drainage and voiding. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 10 (3), 480-492 (2015).
- Brading, A. F. The physiology of the mammalian urinary outflow tract. Experimental Physiology. 84 (1), 215-221 (1999).
- Dixon, J. S., Gosling, J. A. The musculature of the human renal calices, pelvis and upper ureter. Journal of Anatomy. 135, Pt 1 129-137 (1982).
- Lang, R. J., et al. Pyeloureteric peristalsis: role of atypical smooth muscle cells and interstitial cells of Cajal-like cells as pacemakers. The Journal of Physiology. 576, 695-705 (2006).
- Lang, R. J., Takano, H., Davidson, M. E., Suzuki, H., Klemm, M. F. Characterization of the spontaneous electrical and contractile activity of smooth muscle cells in the rat upper urinary tract. Journal of Urology. 166 (1), 329-334 (2001).
- Lang, R. J., Exintaris, B., Teele, M. E., Harvey, J., Klemm, M. F. Electrical basis of peristalsis in the mammalian upper urinary tract. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 25 (5), 310-321 (1998).
- Morita, T., Ishizuka, G., Tsuchida, S. Initiation and propagation of stimulus from the renal pelvic pacemaker in pig kidney. Investigative Urology. 19 (3), 157-160 (1981).
- Tsuchida, S., Morita, T., Harada, T., Kimura, Y. Initiation and propagation of canine renal pelvic peristalsis. Urologia Internationalis. 36 (5), 307-314 (1981).
- Yamaguchi, O. A., Constantinou, C. E. Renal calyceal and pelvic contraction rhythms. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 257 (4), 788-795 (1989).
- Klemm, M. F., Exintaris, B., Lang, R. J. Identification of the cells underlying pacemaker activity in the guinea-pig upper urinary tract. Journal of Physiology. 519 (3), 867-884 (1999).
- Lang, R. J., et al. Spontaneous electrical and Ca2+ signals in the mouse renal pelvis that drive pyeloureteric peristalsis. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 37 (4), 509-515 (2010).
- Lutzeyer, W. Pacemaker process of ureteral peristalsis in multicalyceal kidneys. Urologia Internationalis. 37 (4), 240-246 (1982).
- Lang, R. J., Hashitani, H. Pacemaker mechanisms driving pyeloureteric peristalsis: modulatory role of interstitial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 77-101 (2019).
- Hashitani, H., et al. Interstitial cell modulation of pyeloureteric peristalsis in the mouse renal pelvis examined using FIBSEM tomography and calcium indicators. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (5-6), 797-813 (2017).
- Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Suzuki, H., Parkington, H. C. Role of Ca2+ entry and Ca2+ stores in atypical smooth muscle cell autorhythmicity in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 152 (8), 1248-1259 (2007).
- Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Parkington, H. C., Suzuki, H. Spontaneous electrical and Ca2+ signals in typical and atypical smooth muscle cells and interstitial cell of Cajal-like cells of mouse renal pelvis. The Journal of Physiology. 583, 1049-1068 (2007).
- Hashitani, H., Lang, R. J., Mitsui, R., Mabuchi, Y., Suzuki, H. Distinct effects of CGRP on typical and atypical smooth muscle cells involved in generating spontaneous contractions in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 158 (8), 2030-2045 (2009).
- Iqbal, J., et al. Potassium and ANO1/ TMEM16A chloride channel profiles distinguish atypical and typical smooth muscle cells from interstitial cells in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 165 (7), 2389-2408 (2012).
- Grainger, N., et al. Identification and classification of interstitial cells in the mouse renal pelvis. Journal of Physiology. 598 (15), 3283-3307 (2020).
- Hashitani, H., Mitsui, R., Lang, R. Functional heterogeneity of PDGFRα (+) cells in spontaneously active urogenital tissues. Neurourology and Urodynamics. 39 (6), 1667-1678 (2020).
- Hashitani, H., Lang, R. J. ATYPICAL or INTERSTITIAL, take your PIC. Journal of Physiology. 598 (15), 3061-3062 (2020).
- Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Suzuki, H., Parkington, H. C. Role of Ca2+ entry and Ca2+ stores in atypical smooth muscle cell autorhythmicity in the mouse renal pelvis. British Journal of Pharmacology. 152 (8), 1248-1259 (2007).
- Grundy, D. Principles and standards for reporting animal experiments in The Journal of Physiology and Experimental Physiology. Experimental Physiology. 100 (7), 755-758 (2015).
- Drumm, B. T., Hennig, G. W., Baker, S. A., Sanders, K. M. Applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular Ca 2+ signaling in situ. Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-13 (2019).
- Leigh, W. A., et al. A high throughput machine-learning driven analysis of Ca2+ spatio-temporal maps. Cell Calcium. 91, 102260 (2020).
