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Biology

生物组织样本的串行块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM）

Published: March 26, 2021 doi: 10.3791/62045
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 3,4, 1,4
1College of Optometry, University of Houston, 2Department of Biology, DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center, Baylor College of Medicine

Summary

该协议概述了使用串行块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM） 的常规方法，这是一种强大的 3D 成像技术。SBF-SEM 的成功应用取决于适当的固定和组织染色技术，以及仔细考虑成像设置。本协议包含整个过程的实际考虑。

Abstract

串行块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM） 可收集数百到数千张连续注册的超结构图像，为组织显微解剖提供前所未有的三维视图。虽然 SBF-SEM 近年来的使用呈指数级增长，但适当的组织制备和成像参数等技术方面对于这种成像模式的成功至关重要。此成像系统受益于设备的自动化性质，允许显微镜在成像过程中无人看管，并在一天内自动收集数百张图像。然而，如果没有适当的组织制备，细胞超结构可能会被改变，以得出不正确或误导性的结论。此外，图像是通过扫描树脂嵌入生物样本的块面生成的，这通常会带来必须解决的挑战和考虑。成像过程中块内电子的积累，称为"组织充电"，可导致对比度损失和无法欣赏细胞结构。此外，虽然增加电子束强度/电压或降低光束扫描速度可以增加图像分辨率，但这也可能产生破坏树脂块和扭曲成像系列中后续图像的不幸副作用。在这里，我们提出了一个常规协议，准备生物组织样本，以保持细胞超结构和减少组织充电。我们还为快速获取高质量的序列图像提供成像考虑，对组织块的损害最小。

Introduction

1981年，莱顿首次描述了串行块面扫描电子显微镜（SBF-SEM），他设计了一个扫描电子显微镜，该显微镜由内置的显微原子增强，可以切割和成像嵌入树脂中的组织薄部分。不幸的是，技术限制限制其使用导电样品，因为非导电样品，如生物组织积累不可接受的充电水平（电子积累在组织样本）1。虽然用蒸发的碳减少组织充电在切割之间涂上块面，但这大大增加了成像采集时间和图像存储仍然是一个问题，因为当时的计算机技术不足以管理设备创建的大文件大小。2004年，登克和霍斯特曼使用装有可变压力室2的SBF-SEM重新审视了这一方法。这允许将水蒸气引入成像室，从而减少样品内部的充电，使非导电样品的成像可行，尽管图像分辨率会丢失。组织制备和成像方法的进一步改进现在允许使用高真空成像，SBF-SEM成像不再依赖水蒸气来消散充电3，4，5，6，7，8，9。虽然 SBF-SEM 近年来的使用呈指数级增长，但适当的组织制备和成像参数等技术方面对于这种成像模式的成功至关重要。

SBF-SEM 允许自动收集数千个串行注册的电子显微镜图像，平面分辨率小至 3-5 nm10，11。组织，浸渍重金属和嵌入树脂，被放置在扫描电子显微镜（SEM）内，其中含有装有钻石刀的超微观。平坦的表面用钻石刀切割，刀被收回，块的表面被扫描在一个带电子束的刺刀图案中，以创建组织超结构的图像。然后，该块在 z 轴中提升指定量（例如 100 nm），称为"z 步"，在重复过程之前切割新表面。这样，当组织被切断时，会产生一个三维（3D）图像块。此成像系统进一步受益于设备的自动化性质，使显微镜在成像过程中无人看管，一天内可以自动收集数百张图像。

虽然SBF-SEM成像主要使用背散射电子形成块面图像，但二次电子是在成像过程中产生的。次要电子可以积累，与背散射和原光束电子一起，无法逃离方块，并产生"组织充电"，这可能导致块面的局部静电场。这种电子积累可以扭曲图像或导致电子从方块中弹出，并有助于后散射探测器收集的信号，降低信号与噪声的比例13。虽然通过降低电子束电压或强度或减少光束停留时间可以降低组织充电水平，但这会导致信号与噪声比减少 14。当使用低电压或强度的电子束，或者光束只允许在每个像素空间内停留较短的时间时，从组织中弹出的背散电子较少，并被电子探测器捕获，导致信号较弱。Denk 和 Horstmann 通过将水蒸气引入室内来解决这个问题，从而以图像分辨率为代价降低了房间和块面的电荷。由于腔室压力为10-100 Pa，电子束的一部分是分散的，导致图像噪声和分辨率的丧失，然而，这也产生离子在标本室中和电荷在样品块2。在成像过程中，样品块内的中和电荷使用焦气喷射到块面上，或将负电压引入SBF-SEM阶段，以降低探针束拉升能量，增加收集的信号6、7、15。与其引入阶段偏置、腔室压力或局部氮注入来减少块表面的电荷积聚，还可以通过将碳引入树脂混合物来增加树脂的导电性，从而允许更积极的成像设置16。以下一般协议是2010年发布的Deerinck等人协议的改编，涵盖了对组织制备和成像方法的修改，我们发现在保持高分辨率图像采集3、17、18、19的同时，最大限度地减少组织充电是有用的。虽然前面提到的协议侧重于组织处理和重金属浸渍，但该协议提供了对 SBF-SEM 研究固有的成像、数据分析和重建工作流程的洞察。在我们的实验室中，此协议已成功并可重复应用于各种组织，包括角膜和前段结构， 眼睑，胆小和硬质腺，视网膜和视神经，心脏，肺和气道，肾脏，肝脏，肌骨质，和大脑皮层/梅杜拉，并在各种物种，包括老鼠，大鼠，兔子，豚鼠，鱼，单层和分层细胞培养，猪，非人类灵长类动物，以及人类20，21，22，23。虽然对于特定的组织和应用来说，小的变化可能是值得的，但事实证明，在我们核心成像设施的背景下，此通用协议具有高度可复制性和有用性。

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Protocol

所有动物均按照视觉和眼科研究协会《视觉和眼科研究声明》和休斯顿大学光学学院动物处理指南中描述的指南处理。所有动物程序均由处理机构批准：鼠、鼠、兔、豚鼠和非人类灵长类动物程序均由休斯顿大学动物护理和使用委员会批准，斑马鱼程序由德保大学动物护理和使用委员会批准，猪程序由贝勒医学院动物护理和使用委员会批准。所有人体组织均按照《赫尔辛基关于人体组织研究的宣言》处理，并获得了适当的机构审查委员会批准。

1. 组织处理

  1. 通过在ddH2O中混合可可酸钠粉，准备0.4 M可可酸钠缓冲液的库存溶液。 彻底混合缓冲区，并将溶液调整到7.3。此缓冲区用于制造固定性（下面第 1.3 步中描述的成分）、洗涤缓冲以及渗透和铁氰化钾溶液。
    注意：灌注固定通常是 SBF-SEM 研究的最佳固定方法，因为固定会迅速和在整个身体发生。如果在学习设计中无法进行灌注固定，请跳到步骤 1.3。
  2. 对动物模型24、25、26进行适当的生理压力的灌注固定。这是通过心肌连续灌注与肝盐水，然后固定，每个放置在一个特定的高度（例如，100厘米）以上的生物体（适合在动物模型的血管系统的生理压力），固定性流入左心室，并退出在右中庭的切口。兴趣组织将变得苍白，因为血液被固定性取代，如果你的组织的所有或部分不漂白，那么组织可能无法适当固定，超结构可能无法保存。
  3. 使用剃须刀刀片或锋利的手术刀将组织样本修剪成不超过 2 mm x 2 mm x 2 mm 的方块。如果跳过步骤 1.2，则快速这样做，以便组织能够尽快固定。
    1. 或者，在固定下解剖组织，并转移到新鲜固定物，以完成浸入过程。固定剂的最终成分包括0.1M可可酸钠缓冲液，其中含有2.5%的谷氨酸和2m氯化钙。允许在室温下进行至少 2 小时，最多在 4 °C 下过夜。 如果可能，使用摇动器/倾斜板在固定时轻轻搅拌样品。
    2. 或者，如果有逆变微波炉，在真空下将组织固定在真空下 150 瓦，4 个周期 1 分钟开，1 分钟休息。微波固定是第1.3步的首选方法，因为它可以快速修复组织并保存组织超结构27。
      注意：在本协议期间，不应允许组织干燥，应注意将组织快速从一个溶液转移到下一个解决方案。
  4. 在室温下，在含有2mM氯化钙的0.1 M可可酸钠缓冲器中，将固定组织洗5次，每次3分钟（共15分钟）。
  5. 使以下硫酸钠溶液新鲜，最好在以前的洗涤步骤。将 4% 的二氧化硫钠溶液（在 ddH2O 中制备）与 0.2 M 可可酸酸钾缓冲液中等量的 3% 铁酸钾与 4 m 氯化钙混合。在上一步洗涤后，将组织放在此溶液中 1 小时，在黑暗中的冰上和烟罩中放置。
    注：二氧化钠是一种黄色晶体物质，在安培中。要创建二氧化硅溶液，打开安培，加入ddH2O，并在黑暗中声波3-4小时，直到晶体完全溶解。氧化钠溶液是一种透明黄色溶液，如果溶液为黑色，则渗透量已减少，不应再使用。
  6. 当组织在铁氰化钠溶液中孵化时，开始准备硫化氢化物 （TCH） 溶液。新鲜准备此解决方案，并在 1 小时铁氰化钠固定期结束时随时可用。将 0.1 克硫化氢化物与 10 毫升 ddH2O 混合，并将此溶液放入 60 °C 烤箱中 1 小时。为确保溶解溶解，每 10 分钟轻轻旋转一次。在使用之前，通过 0.22μm 注射器过滤器过滤此解决方案。
  7. 在TCH孵育之前，用室温ddH2O 5x清洗组织，每次3分钟（共15分钟）。
  8. 在室温下将组织置于过滤的TCH溶液中共20分钟（图1A-C）。
  9. 在TCH中孵化后，在室温下每洗5次（共15分钟）3分钟。
  10. 在室温下将含有2%二氧化钠（不含二氧化硅钾的渗透物）放在ddH2O中放置30分钟。这应该在烟罩和黑暗中完成，因为渗透可以通过光（例如，在铝箔下）（图1D-F）减少。
  11. 在二氧化钠孵育后，在室温下将组织洗5次，每次3分钟（共15分钟）ddH 2O。
  12. 将组织置于1%的醋酸尿素（尿乙酸酯粉末混合在ddH2O）过夜，在冰箱中4°C。
  13. 就在从冰箱中取出组织之前，准备新鲜的沃尔顿铅分离溶液。首先在 10 mL 的 0.03 M 阿斯粒子酸溶液（蒸馏水中 0.04 g 阿斯巴酸）中溶解 0.066 克硝酸铅，并将 pH 调整为 5.5，采用 1 N KOH（蒸馏水中 0.5611 克，蒸馏水 10mL）。
    注意：调整pH时会形成沉淀物。这是不能接受的。
    1. 使用搅拌棒，在监控pH时缓慢地添加1 N KOH滴水。在 60 °C 烤箱中预热完成的透明铅分开溶液 30 分钟。如果沉淀形成解决方案，则无法使用解决方案，并且必须准备另一个解决方案。
  14. 从冰箱中取出组织，在室温下每洗 3 分钟（共 15 分钟）ddH 2O。
  15. 洗涤后，将组织放在加热的沃尔顿铅分方溶液中30分钟，同时将温度保持在60°C。
  16. 在沃尔顿的铅分立中孵育后，在室温下每洗组织 5 次 3 分钟（共 15 分钟）ddH 2O （图 1G-I）。
  17. 通过冰冷的乙酮系列（30%，50%，70%，95%，95%，100%，100%，100%和100%的乙酮（在ddH2O，如果适用）去水，允许10分钟的每个步骤系列。
  18. 在冰冷脱水系列之后，将组织置于室温乙酮中10分钟。
    1. 在此期间，制定嵌入812 ACM树脂。使用"硬混合"配方，因为它更耐光束损坏。将树脂彻底混合，将组织放入嵌入 812：acetone （1：3 混合） 4 小时，然后嵌入 812：acetone （1：1 混合）8 小时或过夜，最后嵌入 812：acetone （3：1 混合） 过夜。在室温下执行这些树脂渗透步骤。
  19. 第二天，将组织放入100%嵌入8124-8小时，然后在新鲜100%嵌入812过夜，最后进入新鲜100%嵌入8124小时。在室温下执行这些树脂渗透步骤。
    1. 在嵌入之前，将少量树脂放入混合容器中，然后慢慢混合（木棍可用于搅拌）碳黑粉末，直到树脂与粉末饱和，但仍是液体，不会变粒状。它应该像厚厚的墨水，能够慢慢从木棍上滴下来，没有可见的团块。
  20. 将组织样品定位于硅橡胶模具中，并拍照，以便记录树脂块内的样品方向，并可参考。将样品盖在硅胶模具尖端的炭黑饱和树脂中，并将模具放入烤箱中，在 65 °C 下放置 1 小时。
    1. 将模具放在斜坡上，以包含覆盖组织样本的模具尖端的树脂。在树脂的另一端的模具上放置一个带有实验/组织样本标识符的标签（图2A）。
  21. 从烤箱中取出硅胶模具，用透明树脂（无碳黑）填充模具的剩余部分，确保标签保持可见。用碳黑处理注入的树脂，使之不易与透明树脂混合。
    1. 在不包含组织的模具中准备额外的井。从额外的油井开始，用透明树脂填充模具的剩余部分。
    2. 如果注入的碳黑树脂开始向透明树脂中出血，请将硅胶模具放回烤箱中多长时间（例如，15 分钟）。
    3. 一旦所有的组织样本都加了透明树脂，将硅胶模具放回烤箱（平，无倾斜），在65°C下48小时完成固化过程。

2. 块准备

注：该方法将取决于样本在块中的定位方式以及如何进行分区。然而，最常见的组织方向发现组织集中在树脂块的尖端，垂直于树脂块的长端。

  1. 在大多数情况下，首先修剪块的末端，通过将标本块放在微托姆夹头中，锥形末端从夹头中伸出约 5-6 毫米来定位组织。用螺丝将其锁定到位，并将其置于热灯下。
  2. 几分钟后，该块将是可塑的，易于修剪。将夹头放在立体显微镜支架中，使用新的双刃剃须刀刀片使细块与块面平行，直到组织可见为止。这最好通过在块面上旋转光来观察，与没有组织的树脂部分相比，组织样本的反射和粒度会降低。在引入炭黑饱和树脂之前，请查阅组织样本的照片，了解组织的位置和位置。
  3. 将一个标本销支架放在一边进行修剪。此销架永远不会放入 SEM 腔室，因此无需手套即可处理，这称为修剪销支架。 任何准备放入成像室的标本持有人，都不得在没有手套的情况下被触摸。这避免了将油脂和油引入显微镜室。
  4. 将铝制标本销放在修剪销架中，并稍微拧紧固定的螺钉，将销的面（平面）固定在销架上方 3-4mm。
  5. 在针脚表面制作几个深而纵横交错的划痕，为用于固定标本的胶水提供更大的表面积。如果使用铝针，建议在此步骤中使用小型钢平头螺丝刀（图 2B）。
  6. 将含有组织样品的夹头放回热灯下，直到树脂变软且可塑，然后放入立体显微镜下的夹头容器中。
  7. 使用双刃剃须刀刀片从含有组织样本的树脂块部分修剪出多余的树脂。最终，固定在针脚上的组织块大小约为直径为 3 mm，高度约为 2-3 mm。
    1. 小心地将剃须刀直接推入大约 1-2 毫米的树脂块中，然后小心地将剃须刀水平推入树脂块，深度与之前的切割相同。这样做缓慢和非常小心，因为有可能损坏或切断包含组织样本的块的一部分。当两个切口相遇时，多余的树脂将与块分离。继续去除树脂，直到只剩下3毫米×3毫米的凸起面积。
  8. 进行初始修剪后，将方块（仍放在夹头中）放在热灯下几分钟。
  9. 一旦树脂变得柔软和可塑性，将方块放回立体显微镜下。使用新的双刃剃须刀刀片，切断树脂块的顶部，比修剪的部分低约1毫米，单次平滑切割。平坦的表面是可取的，因为这将粘在标本针。小心不要让样品丢失，因为这一步骤需要一些力，可以转移到块的去除部分，并导致它飞走。将切割和修剪的样品放在一边。
  10. 将包含切割铝销的修剪销架放在立体显微镜插座中。将薄薄的氰丙烯酸胶层涂在针面上，使其完全覆盖销，而不会形成可见的半月板。用钳子拾起组织块的修剪部分，放在针面上。将组织样本放在标本销上。向下推并按住几秒钟。让胶水设置几分钟。
  11. 当胶水完全干燥时，将修剪销支架放回立体显微镜下。使用精细的文件，文件远离多余的树脂，使没有树脂悬垂针。树脂形状应类似于圆形针头。
  12. 将组织定位在树脂块的凸起部分，斜光对此很有用。使用双刃剃须刀，含有组织样本的树脂的凸起部分必须修剪到不超过1毫米2的区域。如果可能，块面可以修剪更小，这将减少钻石刀的压力，并改善其寿命。
    1. 尽可能多地去除多余的树脂，使方块在一个维度上稍长一些。这是缓慢和谨慎地完成的，因为如果施加过多的力，含有组织样本的树脂可能会分解。虽然建议使用剃须刀，但可用于此步骤的精细金属文件。
  13. 用细金属文件角度多余的树脂，在包含组织样本的凸起部分外的区域，向针的边缘（图2C）。
  14. 在涂上银漆，然后涂上金溅，从准备好的样品中取出树脂颗粒和灰尘。将银与酸酮混合，使其成为一种易于扩散的液体，类似于指甲油（但不会太薄，从施用器上滴下来），并将薄外套涂抹在整个样品块表面。Acetone 蒸发迅速，因此当银漆开始变厚时，可能需要添加额外的 Acetone。
    1. 让银漆在装进显微镜前干燥过夜。
      注意：此银层必须较薄，以避免将块面扩展到 1 mm x 1 mm 以上，虽然银漆从未损坏过钻石刀，但仍建议使用较小的块面来保持钻石刀的寿命。与银混合的王牌必须完全蒸发，然后才能将样品溅入显微镜，以避免将心电图蒸汽引入成像室。
    2. 应用银漆后，在样品块上涂上一层薄薄的金。使用配备标准金箔目标的标准真空溅射装置，200毫Torr（砷气）和40毫安的室压运行2分钟将导致20纳米厚的金涂层。
  15. 涂层后，将安装和修剪的方块放在带有相应实验标签的管子中。使用一次性传输移液器创建自定义管。
    1. 切断灯泡正下方的转移移液管，将转移移液管的一小部分固定在球状末端以下。缩短被切断的管状部分，并切回足够的移液器尖端，以便铝标本销可以紧贴在它里面。
    2. 将包含铝标本销的末端放在改装转移移液器的球状末端。
  16. 在加载准备好的组织块之前，小心地修剪块面表面多余的银漆。

3. 用于成像块面的 SEM 设置

注：以下成像设置是在作者使用的设备上生成的，该设备列在所提供的 材料表 中。虽然该设备能够进行可变压力成像，但最佳结果是在高真空下捕获的。

  1. 居住时间： 在串行分区期间使用 12 μs/px。确定感兴趣的区域后，可以 32 μs/px 获得更高的分辨率图像。
  2. 真空设置： 使用 9e-008 Pa 的枪压、1.1e-004 Pa 的柱压和 9.5e-002 Pa 的腔室压力。
  3. 捕获时间： 通过上述设置，以每张图像 50 秒的速度捕获 2048x2048 px 图像堆栈。以每张图像不到 9 分钟的速度，可以 4096x4096 px 的速度拍摄感兴趣区域的高分辨率图像。
  4. 部分厚度： 使用 100-200 纳米。可能更少，但可能需要较低的光束电压、强度或停留时间。
  5. 高压（高压）：使用7-12千伏。虽然增加电压可降低点大小并增加分辨率，但它会引入更多发生光束损坏的可能性。较高的 kV 可增加光束穿透率，从而导致细节丢失。然而，降低kV会降低信号与噪音的比例（图3）14。
  6. 光束强度 （BI）：作者的SBF-SEM设备提供1-20光束强度尺度。在这个尺度上，5-7值提供高质量的图像，而不会造成过多的充电和光束损坏。BI越高，分辨率越大，充电和光束损坏的可能性就越大。
  7. 斑点大小和图像放大： 根据光束强度和电压水平确定点大小。理想情况下，现货尺寸不应大于所使用的像素大小。像素大小通过将视场 （FOV） 除以像素数来确定。例如，图像大小为 2048x2048 px 的 25μm FOV 将为每像素提供 12.2 nm。因此，现货尺寸不应大于 12.2 nm。 图4 显示了HV、BI和斑点大小的相关性。
  8. 工作距离 （WD） - 使用块面成像，工作距离不可调。这只是焦点的一个因素。对于所有映像的块，它将几乎完全相同。虽然工作距离不可调，但它在捕获的图像的分辨率中起着至关重要的作用。随着工作距离的缩短，捕获的图像的分辨率限制增加。在某些情况下，通过在成像室内进行修改，可以缩短工作距离，但这些修改必须由用户自行决定。为了缩短工作距离并提高图像分辨率，我们松开门架微原子螺丝，重新定位微原子，使其在重新拧紧螺丝后离光束探测器更近 2 毫米。
  9. 分辨率 -使用上述设置，x&y分辨率高达3.8纳米是可能的。需要注意的是，分辨率受光束点大小以及图像捕获的像素分辨率的限制（例如，在 2048x2048 像素图像中捕获的 20μm 视场的像素分辨率为 9.8 nm，即使使用了 3.8 nm 的点大小）。z 平面中的图像分辨率取决于分割厚度，我们发现 100-200 nm 与此协议配合得很好。

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Representative Results

鼠标科内亚
此协议已广泛应用于小鼠角膜。使用 SBF-SEM 成像，显示成人小鼠角膜内存在无弹性蛋白微纤维束 （EFMB） 网络。以前认为，该网络仅在胚胎和产后早期发育期间存在。SBF-SEM 揭示了整个角膜中广泛的 EFMB 网络，在横截面测量时，发现单个纤维的直径为 100-200 nm。还发现，这个EFMB网络是组织在不同的层，纤维与角细胞紧密相连，甚至躺在角细胞表面的浅入侵（图5）。在成人角膜中发现EFMB纤维，导致免疫标记传输电子显微镜（TEM），荧光和共焦研究，以进一步了解这个网络的性质23。

该协议的进一步应用导致发现以前未知的中央角膜神经群，这些神经与基底上皮细胞在上皮边界（图6）融合。以前，人们认为，在这个边界上与上皮相互作用的所有神经都渗透到角膜上皮中，并造成亚巴氏和上皮丛状。在这项研究中，45%的中枢神经与基底上皮相互作用，接受细胞细胞融合，而不是简单的渗透。使用应用于SBF-SEM数据集的固理方法，可以表明这种新型神经群的表面体积比大约是穿透神经的一半，与它们的"肿胀"外观一致（神经融合 - 3.32±0.25，神经渗透 - 1.39±0.14，p ≤0.05）。3D重建穿透和融合神经束及其线粒体，突出表明线粒体缺乏在神经束的融合部分。使用SBF-SEM发现神经元上皮细胞融合，导致荧光研究验证了两个融合细胞之间的膜连续性21。

中央角膜是一种血管组织，因此外周肢体附体对角膜的整体健康特别重要。这个区域的细胞-细胞关系和超结构是复杂的：然而，在荧光和单节TEM研究中，欣赏这些细胞-细胞相互作用和超结构连接的能力受到限制。因此，一个包含肢体血管、神经束和相关细胞的 SBF-SEM 图像堆栈被手动分割用于 3D 重建（图 7）。在这张图片中，可以看到血管内皮结和覆盖的围网之间的密切关联，可以看到血管内皮细胞、中微子的细胞核和前缘沿着血管壁外表面爬行的个体颗粒，以及经过的神经束。

综合起来，这一工作体证明了该协议在富含细胞外基质和上皮的组织以及血管和相关细胞中生产高质量 3D 电子显微镜数据集的能力。

高阶灵长类灵长类动物 - 神经丛和血管网络
高阶灵长类动物的视网膜神经纤维层 （RNFL） 包含并依赖于广泛的血管网络。通常，视网膜疾病涉及视网膜神经纤维层的两个参数的变化，以及其中发现的血管。了解 RNFL 与其血管网络在健康、非病理组织中的关系是了解疾病可能发生的任何变化的第一步。为了更好地了解这种关系，SBF-SEM协议应用于正常的高阶灵长类网膜，并进行了血管网络的重建，并从这种重建中提取了体积数据（图8）。RNFL 的这 4，642，307 μm3 区域包含血管床 1.207x10-4 μL 的体积，占 RNFL 总体积的 2.6%。这项工作证明了该协议在密集的神经组织中生产高质量的3D电子显微镜数据集的能力。

斑马鱼和巨型达尼奥心脏 - 条纹肌肉和发展血管
斑马鱼和巨型丹尼奥都是心脏发育和再生的重要模型。从历史上看，斑马鱼的心脏被认为是由两个解剖上截然不同的心肌片段组成，它们共同作用，以支持斑马鱼的生理需求。然而，这两个心室层之间的界面没有得到很好的理解。使用此协议，发现了一个以前未识别的结区，由薄薄的成纤维细胞片组成。研究发现，此表中的开口允许两个单独的心肌段接触，并形成复杂的粘附结点，包括脱体体和筋膜附着物 22。

该协议已用于进一步研究正在发育的巨型达尼奥心脏的血管网络（图9）。这种方法允许发展的心脏肌细胞网络的3D欣赏及其与开发微血管的关系。综合起来，这项工作证明了该协议在肌肉和高血管组织中生产高质量 3D 电子显微镜数据集的能力。

图像设置、充电和分辨率
虽然对于高质量的 SBF-SEM 成像，需要适当的固定和重金属染色，但同样重要的是使用导导树脂和适当的成像设置来处理正在解决的问题。在此协议中，使用炭黑是为了提高样品块的导电性，并为安装销提供一条管道，以便从块面清除二次电子。这已被证明在对抗组织充电方面是有效的，这种充电经常会降低未用炭黑16制备的组织中的图像质量。此外，应用于块的银漆和金溅射为电子积聚提供了一条耗散途径。某些设备允许添加焦荷补偿器，通过在块面上涂上一股氮气来减少充电，但我们在使用炭黑以及将银漆和金溅到块 15上方面也取得了类似的成功。缺乏样本电导率会导致电子积聚可见组织充电（图1），以及作为突然图像转移和扭曲可见的放电，从而显著降低图像质量（图10B &F）。碳黑的使用允许在高真空下成像，并允许使用图像设置，从而产生高信号与噪声比和提高图像分辨率。导致图像质量提高的一个这样的设置是像素停留时间。SBF-SEM 成像过程涉及对样品表面的电子束进行扫描，以生成显微镜探测器可以收集并解释为信号的背散射电子。允许该光束停留在每个像素空间内的时间长度可导致分配给每个像素位置（图 3A = B）2的更精确的像素值。然而，必须在增加的信号到噪声、分辨率和对块面造成的损害之间取得平衡。光束有效地用高能电子照射块面，高能电子可以分解和软化树脂，导致图像降解和切割并发症（图10）28。z 分辨率要求越薄，维护高分辨率成像就越困难。我们通常使用 100-200 nm 的 z 步，但 z 步大小为 25-50 nm 已报告 5、29、30、31。这种尺寸的 z 步，由于光束损坏导致树脂的分解和软化可能导致树脂的压缩，导致刀子错过切口或切割块面，但与"聊天"，其中刀跳过块的表面，产生波纹和带13。虽然小步是一个有吸引力的前景，重要的是要记住具体的研究问题，当选择一个适当的z步。过度采样可能导致大量数据存储考虑，以及增加产生 3D 重建所需的时间。

组织固定和染色
在重金属孵化之前，组织必须固定在谷胱甘肽中。虽然我们强烈建议在真空下微波固定，以保存组织超结构27，如果实验室级微波没有可用的商用逆变微波与可变瓦数可以替代32，33，34，35。如果这样做，应采用额外的护理，以确保组织失真不会发生。不适当的组织固定可能导致组织形态的改变，如图10E所见。该协议，像大多数现代SBF-SEM染色协议，已经改编自染色程序概述的德林克在2010年17，基于渗透-硫化氢钠-渗透污渍创建威灵厄姆和卢瑟福在1984年36。本协议中使用的重金属与组织样本中的细胞结构（图 1）相差无几。最初的渗透孵化发生与减少的渗透，结合到C+C键在不饱和脂肪导致膜和脂质染色37，38。二氧化硫可减少硫化钾，有助于饱和脂质的染色，也有助于稳定磷脂39、40。硫化氢氢随后被添加为从第一次孵化与渗透结合的垂体，作为在协议41的后期阶段进一步渗透的桥梁。醋酸铀是一种铀盐，是脂质、核酸和蛋白质的有效对比剂，而柠檬酸铅能增强蛋白质和糖原的对比度。这些制剂对细胞成分的不同亲和力进一步增强了组织内在渗透孵化42之上的整体对比。

成像块面
图11、图12、图13说明了电压、像素停留时间和光束强度的综合效应。传统实践表明，为了实现最佳成像和防止光束对样品块的损坏，需要低电压、短停留时间和低光束强度的组合。与这些设置相反，图11、图 12、图13说明，比传统设置更高的电压（例如 7 kV）、更长的居住时间（32μs/px）和更高的光束电量（在我们的情况下设置 6）可以产生优于常规设置的图像质量。

SBF-SEM 允许收集串行电子显微镜图像，这些图像可以作为由 voxels 组成的 3D 数据集收集。虽然这是一个令人难以置信的强大的使用SBF-SEM，这种方法也允许快速和可重复的成像罕见的生物事件或细胞。使用 SBF-SEM 进行图像采集可用于监控稀有事件，并暂停成像以收集这些事件的更高放大/分辨率图像。此外，该块可以从显微镜室和块面切开用于传输电子显微镜 （TEM） 成像。这样，可以使用 SBF-SEM 收集大量稀有事件数据集，也可以使用 TEM 在安格斯特罗姆尺度上进行欣赏。

Figure 1
图1：SBF-SEM 和 TEM 在协议中不同步骤进行比较。 此协议包含多个步骤，其中样品组织被重金属染色。这不仅影响组织对比度和细胞结构和器官的欣赏，还影响组织成像时产生的充电水平。此图包含三种对预制组织的独特视图：低放大视图（A、D 和 G）、高放大视图（B、E 和 H），以及预制鼠标角膜（C、F & I）的 TEM 比较。可以注意到，由于电子束集中在较小的组织区域，更高的放大图像会导致组织充电增加。顶排（A-C）是从完成步骤 1.8 加工的组织中提取的代表样本，并浸入铁氰化钾、二氧化氢和硫化氢。前两列中的箭头显示上皮-频闪界面作为参考点。请注意，与底部两行相比，对比度较低，组织充电水平也有所提高。中间行（D-F）中的样本通过完成步骤 1.10 进行处理，并受益于额外的二氧化钠步骤，并且明显比上排的示例对比度更高。虽然细胞结构是可辨识的，但充电仍然存在。底部行（G-I）中的样本受益于完整的染色协议，并且具有最小的组织充电。TEM 成像显示每一步（右列）中重金属所传授的组织对比水平：角膜内皮 （*） 中的细胞器随着组织处理通过协议的继续而更加对比和明显。此外，随着协议的完成，频闪胶原蛋白和纤维素细节变得更加明显（箭头）。面板 A、D 和 G 比例栏 = 50μm。 面板 B、E 和 H 比例分尺条 = 10μm。 面板 C、F 和 I 缩放条 =1 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2：嵌入式组织块、标本针和最终制备的示意图。 （A）组织应放置在树脂模具最尖端的已知方向，以及充满炭黑饱和树脂的模具的上三分之一。离组织最远的霉菌区域应保持清晰，以便可以清楚地看到实验标签。（B） 标本针面应划伤以产生网格模式，这允许蓝藻酸胶在准备好的标本块和针之间硬化更大的接触区域。（C） 碳黑饱和树脂应与标本针头接触面积较大，但钻石刀切割的区域不应大于 1x1 mm。将方块逐渐向尖端倾斜是一种好做法。这样可以最大限度地减少钻石刀上的切割力，并且具有更宽的底座，该块在分割过程中更耐从销中分离。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3：图像捕获设置的比较。 （A & B） 面板 A 和 B 比较图像质量和分辨率作为像素停留时间的函数。 面板 A 使用 32 μs/像素的 4 kV 居住时间创建，其信号与噪声比降低，这一点在放大的插图的"颗粒状"外观中显而易见。 面板 B 使用 100μs/像素的 4 kV 居住时间创建。增加像素停留时间会增加信号与噪声比，并显示细胞细节水平增加，但增加像素停留时间有可能导致组织充电和/或热积聚，从而软化方块，并在分割时引入切割人工制品（聊天）。面板 C 和 D 比较在相同的曝光条件下捕获的图像，但具有两个不同的光束 kV 值。这些面板中的组织浸渍了金色调的纳米金粒子，使光束穿透深度的差异更加明显。 面板 C 在 9 kV 时捕获，而 面板 D 在 21 kV 时捕获。增加的 kV 具有增加对比度（D）的优点，但是由于从更深的组织（C）收集电子，细节会丢失。由于对较大的横截面进行采样，可看到 GAP 43 特有的更多免疫金颗粒，而非特定标记保持不变，导致信号与噪声比率增加。面板 A = B 比例栏 = 2μm.面板 C 和 D 比例尺 = 1μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4：光束强度、kV和点大小。 （A）接触组织样本后，电子束（浅蓝色）产生泪滴状的相互作用体积，从光束电子与组织样本之间的相互作用中产生不同形式的能量。泪滴形状是组织密度和重金属染色以及光束能量和电子束43的倾斜角度的函数。虽然X射线、螺旋电子和三级电子是在SBF-SEM成像过程中产生的，但主要关注的是背散（深蓝色）和二级（绿色）电子13。使用 SBF-SEM 成像产生的图像是通过收集散射回散的电子生成的。这些电子来自光束和样品之间的弹性相互作用，所收集的信号高度依赖于与之相互作用的原子数量，因此需要重金属染色44。次要电子源于光束与样品之间的无弹性相互作用，其信号的检测高度依赖于表面方向。由于块面在 SBF-SEM 中是平的，因此次要电子对收集的13个信号没有有意义的贡献。事实上，块表面的二次电子积累可能是充电的主要来源，对图像质量有有害影响2。（B） 此图显示了光束强度、光束 kV 和点大小之间的关系。点大小是光束的空间分辨率，并决定正在生成的图像的分辨率限制。降低 kV 可增加点大小，但也会降低成像深度，从而更精细地欣赏细节。这也有减少可检测信号的效果。光束强度的增加在点大小和信号检测方面提供了初步的改进，但会迅速增加组织充电水平。归根结底，选择的光束强度和 kV 值取决于样品，并且根据所提出的科学问题在经验上确定最佳。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5：小鼠角膜中无弹性素微纤维捆绑网络。与 角膜群内角膜（黄色、橙色和绿色）密切相关的微纤维（白色）的3D重建。微纤维可以看见相邻的角膜角细胞（箭头）（A），在某些情况下，在浅槽内。这种无弹性蛋白微纤维网络组织在角膜频闪（B） 内的不同层中。比例栏 =2 μm。重建的图像块在 x &y 轴中为 45x45 μm，在 z 轴中重建为 30 μm，其中 voxel 的分辨率为 22x22x100 nm。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图6：在脊椎上皮边界通过基底拉米纳的角膜神经重建。 穿透神经（紫色）的3D重建，因为它通过基底拉米纳（绿色）。这种神经在渗透前可以看见是分裂的。穿透上皮后，两个神经分支都受到影响。线粒体（黄色）在神经束的频闪和上皮部分可见。比例杆 = 2.5 μm。重建的图像块在 x &y 轴中为 25x25 μm，在 z 轴中重建为 14 μm，体素分辨率为 12x12x100 nm。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 7
图7：边缘血管和外周小鼠角膜中的相关细胞。 从 3D 图像块 （B） 中可以看到单个图像（A），通过该图像，容器、神经束和相关细胞可以通过该图像（B）进行传递。 面板 C 显示一个重建的容器（红色），其周围包裹着相关环形（灰色），覆盖内皮细胞结。神经束（蓝色）在穿过组织时，在靠近该容器的地方裂开。中性粒细胞（黄色）与容器的长轴平行，其多态核在其细胞体内可见，尾随的乌罗普德可见，向图像右侧突出。桅杆细胞（洋红色）在容器的底面可见。 面板 D 分离此桅杆细胞，在那里可以更容易地看到其颗粒（绿色）覆盖细胞内的细胞核（紫色）。 面板 E 突出显示覆盖在细胞重建上的细胞结构，内皮核表示为蓝色，粘附微粒在容器流明（橙色）中可见。箭头显示内皮细胞之间的细胞-细胞边界，这可以进一步视为沿着血管发光侧的细胞延伸的凸起的脊。面板 A 比例杆 = 2 μm。用于重建这些细胞的图像块在 x &y 轴中为 30x30 μm，在 z 轴中为 42.5 μm，体素分辨率为 14.6x14.6x100 nm。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 8
图8：非人类灵长类视网膜神经纤维层重建血管网络。 （A） 以8192x8192 px拍摄的灵长类灵长类网膜的200x200μm SBF-SEM图像。采样的位置是约500微米，来自健康眼的低时间边缘边缘，没有病理学。在面板 C &d 中重建的图像系列拍摄于 2048x2048 px，图像暂停，以便感兴趣的区域可以映像为 8192x8192 px。 面板 B 是 面板 A的内嵌区域，直接取自原始图像。注意大量的轴突及其线粒体。（C） 正光部分通过200x200x200 μm组织体积的控制眼低时间神经纤维层，与血管分割。（D） 神经纤维层血管的 Z 投影。本系列使用此方法说明了在大型领域可能的分辨率。面板 A 比例栏 = 20μm. 面板 B 比例杆 = 2 μm。图像系列沃克塞尔分辨率为97.6x97.6x500纳米。感兴趣的像素分辨率区域为 24.4x24.4 nm。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 9
图9：巨型丹尼奥（德瓦里奥马拉巴利库斯）紧凑心脏中的血管的分割和3D体积渲染。 （A） 图像堆栈中的二维显微图，显示中央静脉大小的容器（箭头）和内皮核（箭头）的轮廓，周围心脏肌细胞富含线粒体和组织良好的肉瘤（*）。（B） 图像堆栈的二维显微图，带有毛细血管（箭头）。（C） 微图堆栈的生物轨道投影，显示通过一个正交切片投影 的面板 B 中的毛细管。（D） 在重建容器内细分段内皮细胞的 3D 渲染。以绿色、红色、蓝色和紫色绘制的图示是四个独立的内皮细胞：在面板 B（箭头）的横截面中可以看到蓝色描绘的内皮细胞，而在面板 A. 面板 A 和 B 比例栏 = 2 μm 的横截面中可以看到用红色（箭头）和绿色（箭头）描绘的内皮细胞。重建的图像块为 x &y 轴中的 30x30 μm，z 轴中的 16μm，伏塞尔分辨率为 14.6x14.6x100 nm。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 10
图10：成像并发症和人工制品。 （A） 图像的波浪和扭曲性质是使用像素停留时间过长的成像的结果。这加热树脂块，使块面柔软和橡胶，导致切割时图像失真。（B） 此图像包含大量文物。星号表示先前成像在更高的放大倍数和类似于 面板 A时引起的波浪扭曲，将光束集中在像素停留时间较长的较小区域，从而软化了感兴趣区域的树脂。虽然收集的更高放大镜没有人工制品，但这可能导致随后的一系列图像，其中感兴趣区域背后的样本似乎扭曲。该面板还说明了成像过程中方块表面（箭头）上碎片堆积的问题 ，E面板中的箭头也表示此问题。如果这成为持续的成像问题，则必须打破真空，打开腔室，吹走钻石刀和样品周围积聚的碎片。块面的电子小放电可导致白色箭头表示的快速对比度变化和线条。（C） 此图像说明了方块表面的刀划痕。这可能发生由于损坏的刀，或碎片堆积在刀的边缘。（D） 表示（箭头）的人工制品是电子束长时间聚焦（不分割）块面的结果，样品仍留在成像室中。（E） 组织固定不当可导致细胞结构和结缔组织 （*） 分离。（F） 如果在组织或树脂块中发生大量充电，则随后可能会积累和放电，从而导致图像"跳过"，如此图像所见。注意这些跳过点（箭头）图像中组织失真。面板 A 比例栏 = 1 μm. 面板 B 比例杆 = 2 μm。 面板 C 比例栏 = 5μm。 面板 D 比例杆 = 2 μm。 面板 E 比例杆 = 25 嗯。面板 F 比例栏 = 50 嗯。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 11
图11：使用各种像素停留时间和光束的特性在3kV成像组织。 所有图像都是使用 3 kV 光束收集的，光束强度在设备特定的尺度上，范围从 1 到 20 不等。所拍摄的场是含有白色和红色血细胞的血管流明。在这个低kV很难欣赏细胞细节。增加像素停留时间收效甚微。将光束强度增加到 6 个改进的图像对比度。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 12
图12：使用各种像素停留时间和光束的特性，在7千伏成像组织。 所有图像都是使用 7 kV 光束收集的，光束强度在设备特定的尺度上，范围从 1 到 20 不等。所拍摄的场是含有白色和红色血细胞的血管流明。在 7 kV 时，光束强度和像素停留时间的增加有助于提高成像质量。 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 13
图13：使用各种像素停留时间和光束的特性，在12千伏时成像组织。 所有图像都是使用 12 kV 光束收集的，光束强度在设备特定的尺度上，范围从 1 到 20 不等。所拍摄的场是含有白色和红色血细胞的血管流明。在 12 kV 时，通过调整像素停留时间和光束强度来优化成像。充电在较短的像素停留时间减少/缺失，而蜂窝细节和图像对比度最好与更长的像素停留时间和更高的光束强度。请单击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

本文的目的是突出组织制备和成像方法，使我们的实验室能够可靠地捕获高分辨率串行电子显微镜图像，并指出导致这一结果的关键步骤以及进行 SBF-SEM 成像时可能发生的潜在陷阱。使用此协议的成功需要正确固定组织、将重金属浸渍到样品中、修改嵌入树脂以减少充电，以及了解用于收集图像的显微镜和成像设置。格言，"质量在，质量出"是SBF-SEM成像的合适公理。由于 SBF-SEM 的目标通常是对超结构细节的欣赏或量化，因此必须格外注意固定策略，以确保组织失真不会发生。如果组织在准备样品时随时变形（即发生肿胀、收缩或细胞形态中断），则组织重建和量化不会产生准确的数据。此外，使用不正确的成像设置可能导致无法重新捕获的数据丢失，因为 SBF-SEM 成像是一个破坏性过程。此外，在装载组织样品时必须小心谨慎，因为精致的钻石刀可能会因仓促或不正确的样品制备而损坏。这可能导致刀片或碎屑，在图像中留下可见的划痕（图 10C）。钻石刀也可以被钙化结构、硬颗粒或意外嵌入的玻璃（例如试剂安培）损坏。

虽然迄今为止大多数 SBF-SEM 文献都使用 1 到 3 kV 范围内的光束加速电压，而像素停留时间接近 1-5 μs/px（图11)45,46,47,48,49，当前协议使用 7-12 kV 的加速电压和 12 μs/px 的像素居住时间进行串行成像，为感兴趣的成像区域使用 32 μs/px（数字 12 和 13).这些设置，加上100-200 nm的切片厚度，可对各种生物组织进行高质量和高分辨率成像。增加的加速度电压允许增加对比度、分辨率以及信号与噪声比。增加居住时间进一步提高了分辨率和信号噪声比，而切片厚度的增加导致在分割过程中块表面的充电减少，并在随后的图像中对抗光束引起的损坏14.虽然这种成像方法可能不同于惯例，但生成的图像和数据集不言而喻。如果我们不得不推测这种成功的原因，它可能是我们高 kV 值、更长的像素停留时间和块准备的独特组合的结果。增加成像 kV 会导致电子束和样品之间的交互体积增加。这种相互作用体积既更深又更宽，导致理论上从样本块内较深的电子数量增加，或随着斑点大小泪滴直径增加而从组织更宽的横截面检测到的电子数量增加。由于 SBF-SEM 对块的表面细节感兴趣，因此这导致信号与噪声比的理论下降。然而，kV的增加也把电子推入更深的样本中，在那里它们不太可能逃离方块，并有助于探测器收集的电子。随着信号通过更长的像素停留时间和更高的光束强度增加的附加好处，这种成像方法可能会导致来自样品表面的信号相对于来自交互体积内的噪声的更大增加。此外，使用炭黑以及银和金涂层引入的样品导电性增加有助于改善充电积累，这种积聚现在发生在块内更深，离块面更远。事实上 图11, 图12, 图13 显示当 kV 增加时，样品充电开始减少，因为它可能会被推入更深的块。使用传统设置可以用足够的对比度捕获低放大镜中的样品，但这些图像在仔细检查时往往缺乏细节。我们的数据清楚地表明，当使用相对较高的放大倍数时，目标为蜂窝细节，增加常规设置可以产生卓越的结果。P. Goggin 等人在 2020 年的文章提供了一个有用的表，概述了改变成像设置对最终图像质量的影响，并且在需要优化新组织协议时提供有用的参考14.本协议建议的 100-200 nm 切片厚度具有允许快速收集大型 SBF-SEM 数据集的额外好处。例如，在以 12μs/px 的速度收集图像时，在 2048x2048 px 时通过 100 μm 深度进行成像需要 14 小时，而剖面为 100nm/节，但如果以 25nm/节分段，则需要 56 小时。虽然 x，y 分辨率由于节厚而保持不变，但不包括使用较大部分附带的更高 kV 值和像素停留时间进行映像的附加能力，但必须注意，沿 z 轴的分辨率确实会受到影响。z分辨率的丧失是一个重要的考虑因素，在决定组织应如何定向在树脂块和成像平面时，应考虑，并有可能排除对较小细胞特征或相互作用（例如，几十纳米尺度的突触入侵或细胞内特征）的研究。然而，除了快速成像时间，该协议还有额外的好处，因为它迅速产生理想的数据集，用于固态分析以及罕见的生物事件或细胞的研究。较大的节厚度也有助于手动 3D 重建，因为以 100 nm/节分割的 100 μm 区域需要手动分割 1，000 张图像，而以 25 nm/节分割的相同区域则需要手动分割 4，000 张图像。

SBF-SEM 在相对较短的时间内生成大型数据集具有优势。虽然数据分析可以使用定量方法（如立体学）进行，但通过图像分割创建 3D 重建通常具有信息性。使用 SBF-SEM 创建的图像堆栈可视为 voxels 的集合，而细分是将这些声素分配给用户定义的对象的过程，从而创建组织结构的 3D 表示。这些重建通常提供组织超结构和细胞相互作用（图5，图6，图7，图8，图9）的迄今看不见的视角。此外，一旦重建工作得以建立，就有可能利用重建中固有的数据从分段组织中提取大量信息。参数范围从表面积，体积，长度和距离，以及角数据都很容易获得，一旦重建已经创建50，51。虽然这非常有用，尤其是当与从重建的数据集中拉出的视频和图像配对时，手动分割所需的时间是尝试从 SBF-SEM 数据集推断数据时的一个重要考虑因素。目前，SBF-SEM 图像堆栈的手动和半手动细分可同时提供大量免费和可购买的软件。重建软件的一个免费选项是图像处理包斐济图像J，一个开源的图像处理程序，其中包含一个分割编辑器插件，允许手动分割52，53。此外，软件重建提供了一个替代的免费分割选项54（图8）。虽然可能价格昂贵，但可购买的选项通常包含更坚固的功能集，如半自动分割过程或电影和图像创建套件。其中一个选项用于创建图 5、图6、图 7 和图 9中的重建（材料表中提供详细信息）。 此外，还可用于使用虚拟现实创建、分析和渲染基于对比的 3D 重建，并有可能大大加快20、55的重建进程。虽然并非所有应用都可用，但计算机辅助手动分割可提供大量软件工具，从而有可能大大缩短细分56、57、58所需的时间。无论使用的软件如何，通过分段，在分段之前应进行大量预想和对所回答问题的理解，或通过连续重建填补知识缺口，因为这个过程是费力和时间密集的。

3D 重建的制作有其自身的考虑。拥有更大的数据集处理能力可能是一个限制因素，因此优化系统资源的使用对于保持生产性工作流程和加快重建和渲染过程至关重要。在渲染 3D 重建时，大多数软件将分段图像堆栈转换为由相互连接的三角形组成的表面。如果重建项目规模大或复杂，这些三角形的渲染可能需要大量的计算能力。在进行 3D 重建时，限制重建软件可用于将分割的图像转换为重建表面的三角形数量是有帮助的。这可用于监控细分过程中的 3D 重建进度。分割完成后，在渲染重建图像或视频之前，可以删除三角形限制。或者，如果重建软件允许，我们发现使用体积渲染而不是表面生成来监控重建进度是成功的。卷渲染虽然不适合用于发布或呈现的图像或视频，但需要的处理能力要小得多，因此有助于在重建和准备重建图像和视频时提供流畅的体验。此外，手动分割 SBF-SEM 数据集以定义使用其独特的标识符重建的每个对象时，这是最佳做法。例如，如果上皮细胞领域正在重建，而不是将所有上皮细胞分配给一个名为"上皮"的声素组，则每个上皮细胞应分配自己的名称（即 Epi1、Epi2、Epi3 等）。这为重建完成后提供了更大的自由度，因为每个单元格可以包括或排除在最终渲染中，分配不同的颜色或透明，或在制作视频时单独删除或引入。此外，这允许从每个重建对象（而不是整个对象组）收集表面积或体积等指标。

从 SBF-SEM 图像堆栈中提取定量数据的另一个极其强大的工具是立体学实践。立体学利用三维物体与其二维表示（即电子显微图）之间的固有数学关系。SBF-SEM 数据集是立体学应用的理想之选，因为与分段重建相比，这种从大型数据集中提取 3D 信息的方法的时间和劳动密集度要低得多。立体学通常包括将几何网格应用于随机、均匀采样的图像，在过去 50 年中广泛使用，以便对细胞/细胞的数量、长度、表面积和体积21、59、60、61、62、63进行准确和公正的估计。虽然 3D 重建可以令人印象深刻，并为生物组织提供了新视角，但它通常更快、更准确、可重复，并且有利于大样本量使用固态方法提取数据。虽然有许多论文讨论立体学64，65，66的实际应用，但一些教科书提供了有用的，深入的方法概述，并提供了一些固态网格，可用于组织超结构67，68，69的研究。

SBF-SEM是一种强大的成像方法，可实现组织超结构的三维欣赏。虽然能够创建具有 SEM 分辨率的 3D 数据集，将以前无法回答的问题放在我们触手可及的范围内，但适当的组织准备和对 SBF-SEM 成像的理解对于使用这种显微镜方法的研究的成功至关重要。我们希望，将这一议定书应用于今后的研究，将使我们能够更深入地了解我们周围的生物奥秘，并继续将我们进一步推向人类知识的前沿。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们要感谢萨姆·汉隆博士、伊芙琳·布朗和玛格丽特·贡多博士提供的优秀技术援助。这项研究部分得到了国家卫生研究院（NIH）R01 EY-018239和P30 EY007551（国家眼科研究所）的支持，部分得到了狮子视力基金会的支持，部分得到了NIH 1R15 HD084262-01（国家儿童健康与人类发展研究所）的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/16 x 3/8 Aluminum Rivets Industrial Rivet & Fastener Co. 6N37RFLAP/1100 Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver Wiha Quality Tools 27225
Acetone Electron Microscopy Sciences RT 10000 Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid Sigma-Aldrich A8949
Calcium Chloride FisherScientific C79-500
Conductive Silver Paint Ted Pella 16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target Denton Vacuum N/A This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors Fisher Scientific 50-949-411
Embed 812 Electron Microscopy Sciences 14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM Gatan & Tescan N/A This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) Electron Microscopy Sciences 72630-05
Gluteraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
Gorilla Super Glue - Impact Tough NA NA Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black HM Royal EC-600JD Refered to as carbon black in text.
KOH FisherScientific 18-605-593
Lead Nitrate Fisher Scientific L62-100
Microwave Pelco BioWave Pro This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 201030
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Silicone Embedding Mold Ted Pella 10504
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences 12300
Samco Transfer Pipette ThermoFisher Scientific 202 Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files Electron Microscopy Sciences 62115
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich 223220
Uranyl Acetate Polysciences, Inc. 21447-25
Reconstruction Software
Amira Software Thermo Scientific N/A Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ) ImageJ.net N/A TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB) University of Helsinki, Institute of Biotechnology N/A
Reconstuct Software Neural Systems Lab N/A
SuRVoS Workbench Diamond Light Source & The University of Nottingham N/A
SyGlass IstoVisio, Inc. N/A Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.

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References

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生物学，第169期，串行块面扫描电子显微镜，SBF-SEM，3D-EM，3D重建，组织准备，标本制备，序列部分，超结构，高分辨率，体积成像，生物，大体积
生物组织样本的串行块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM）
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