Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopie (SBF-SEM) van biologische weefselmonsters

Published: March 26, 2021 doi: 10.3791/62045
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 3,4, 1,4
1College of Optometry, University of Houston, 2Department of Biology, DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center, Baylor College of Medicine

Summary

Dit protocol schetst een routinemethode voor het gebruik van seriële blok-gezicht scanning elektronenmicroscopie (SBF-SEM), een krachtige 3D-beeldvormingstechniek. Succesvolle toepassing van SBF-SEM hangt af van de juiste fixatie- en weefselkleuringstechnieken, evenals zorgvuldige overweging van beeldvormingsinstellingen. Dit protocol bevat praktische overwegingen voor het gehele proces.

Abstract

Serial block-face scanning electron microscopie (SBF-SEM) maakt het mogelijk om honderden tot duizenden serieel geregistreerde ultrastructurele beelden te verzamelen, wat een ongekend driedimensionaal beeld biedt van weefselmicroanatomie. Hoewel SBF-SEM de afgelopen jaren een exponentiële toename van het gebruik heeft gezien, zijn technische aspecten zoals een goede weefselvoorbereiding en beeldvormingsparameters van het grootste belang voor het succes van deze beeldvormingsmodaliteit. Dit beeldvormingssysteem profiteert van het geautomatiseerde karakter van het apparaat, waardoor men de microscoop onbeheerd kan achterlaten tijdens het beeldvormingsproces, met de geautomatiseerde verzameling van honderden beelden mogelijk op één dag. Zonder de juiste weefselvoorbereiding kan de cellulaire ultrastructuur echter zodanig worden gewijzigd dat onjuiste of misleidende conclusies kunnen worden getrokken. Bovendien worden afbeeldingen gegenereerd door het blokvlak van een met hars ingebed biologisch monster te scannen en dit brengt vaak uitdagingen en overwegingen met zich mee die moeten worden aangepakt. De accumulatie van elektronen in het blok tijdens beeldvorming, bekend als "weefsel opladen", kan leiden tot een verlies van contrast en een onvermogen om cellulaire structuur te waarderen. Bovendien kan het verhogen van de intensiteit/spanning van elektronenbundels of het verlagen van de stralingsscansnelheid de beeldresolutie verhogen, maar dit kan ook de ongelukkige bijwerking hebben van het beschadigen van het harsblok en het vervormen van latere beelden in de beeldvormingsreeks. Hier presenteren we een routineprotocol voor de voorbereiding van biologische weefselmonsters die cellulaire ultrastructuur behouden en het opladen van weefsel verminderen. We bieden ook beeldvormingsoverwegingen voor de snelle verwerving van hoogwaardige seriële beelden met minimale schade aan het weefselblok.

Introduction

Serial block face scanning electron microscopie (SBF-SEM) werd voor het eerst beschreven door Leighton in 1981, waar hij een scanning elektronenmicroscoop maakte, aangevuld met een ingebouwde microtome die dunne delen weefsel ingebed in hars kon snijden en in beeld kon snijden. Helaas beperkten technische beperkingen het gebruik ervan tot geleidende monsters, omdat niet-geleidende monsters zoals biologisch weefsel onaanvaardbare oplaadniveaus (elektronenopbouw in het weefselmonster)1. Terwijl het coaten van de blokwand tussen sneden met verdampte koolstof verminderde weefsel opladen, deze sterk verhoogde beeldverwervingstijd en beeldopslag bleef een probleem omdat computertechnologie op dat moment onvoldoende was om de grote bestandsgroottes die door het apparaat werden gecreëerd te beheren. Deze methodiek is in 2004 door Denk en Horstmann opnieuw bekeken met behulp van een SBF-SEM uitgerust met een variabele drukkamer2. Dit maakte de introductie van waterdamp in de beeldvormingskamer mogelijk, waardoor het opladen in het monster werd beperkt, waardoor beeldvorming van niet-geleidende monsters levensvatbaar werd, zij het met verlies van beeldresolutie. Verdere verbeteringen in weefselvoorbereidings - en beeldvormingsmethoden maken het nu mogelijk om beeldvorming met behulp van hoog vacuüm mogelijk te maken, en SBF-SEM-beeldvorming is niet langer afhankelijk van waterdamp om het opladen3,4,5,6,7,8,9af te voeren . Hoewel SBF-SEM de afgelopen jaren een exponentiële toename van het gebruik heeft gezien, zijn technische aspecten zoals een goede weefselvoorbereiding en beeldvormingsparameters van het grootste belang voor het succes van deze beeldvormingsmodaliteit.

SBF-SEM maakt de geautomatiseerde verzameling van duizenden serieel geregistreerde elektronenmicroscopiebeelden mogelijk, met een planaire resolutie van 3-5 nm10,11. Weefsel, geïmpregneerd met zware metalen en ingebed in hars, wordt geplaatst in een scanning elektronenmicroscoop (SEM) met een ultramicrotome uitgerust met een diamantmes. Een vlak oppervlak wordt gesneden met het diamantmes, het mes wordt ingetrokken en het oppervlak van het blok wordt gescand in een rasterpatroon met een elektronenstraal om een beeld van weefsel ultrastructuur te creëren. Het blok wordt vervolgens een bepaalde hoeveelheid (bijv. 100 nm) in de z-as verhoogd, bekend als een "z-stap", en een nieuw oppervlak wordt gesneden voordat het proces wordt herhaald. Op deze manier wordt een 3-dimensionaal (3D) blok beelden geproduceerd terwijl het weefsel wordt weggesneden. Dit beeldvormingssysteem profiteert verder van het geautomatiseerde karakter van het apparaat, waardoor men de microscoop onbeheerd kan achterlaten tijdens het beeldvormingsproces, met de geautomatiseerde verzameling van honderden beelden mogelijk op één dag.

Terwijl SBF-SEM-beeldvorming voornamelijk backscattered elektronen gebruikt om een beeld van het blokvlak te vormen, worden secundaire elektronen gegenereerd tijdens het beeldvormingsproces12. Secundaire elektronen kunnen zich ophopen, naast backscattered en primaire-bundel elektronen die niet ontsnappen aan het blok, en produceren "weefsel opladen," die kan leiden tot een gelokaliseerd elektrostatisch veld aan de block-face. Deze elektronenaccumulatie kan het beeld vervormen of ervoor zorgen dat elektronen uit het blok worden geworpen en bijdragen aan het signaal dat door de backscatterdetector wordt verzameld, waardoor de signaal-ruisverhouding wordt verlaagd13. Hoewel het niveau van weefsellading kan worden verlaagd door de spanning of intensiteit van de elektronenbundel te verminderen of de verblijftijd van de bundel te verkorten, resulteert dit in een verminderde signaal-ruisverhouding14. Wanneer een elektronenbundel met een lagere spanning of intensiteit wordt gebruikt, of de bundel slechts gedurende een kortere periode in elke pixelruimte mag blijven hangen, worden minder teruggetrokken elektronen uit het weefsel geworpen en door de elektronendetector opgevangen, wat resulteert in een zwakker signaal. Denk en Horstmann hebben dit probleem aangepakt door waterdamp in de kamer te brengen, waardoor de lading in de kamer en op het blokgezicht wordt verminderd ten koste van de beeldresolutie. Bij een kamerdruk van 10-100 Pa wordt een deel van de elektronenbundel verspreid, wat bijdraagt aan beeldruis en een verlies van resolutie, maar dit produceert ook ionen in de monsterkamer die de lading binnen het monsterblok neutraliseren2. Recentere methoden voor het neutraliseren van lading binnen het monsterblok gebruiken focale gasinjectie van stikstof over het blokvlak tijdens beeldvorming, of het introduceren van negatieve spanning in het SBF-SEM-stadium om de energie van de sondestraallading te verminderen en het verzamelde signaal te verhogen6,7,15. In plaats van stadiumbias, kamerdruk of gelokaliseerde stikstofinjectie te introduceren om de ladingsopbouw op het blokoppervlak te verminderen, is het ook mogelijk om de geleidbaarheid van de hars te verhogen door koolstof in de harsmix te introduceren, waardoor agressievere beeldvormingsinstellingen mogelijk zijn16. Het volgende algemene protocol is een aanpassing van het in 2010 gepubliceerde Deerinck et al.-protocol en omvat wijzigingen in weefselvoorbereidings - en beeldvormingsmethoden die we nuttig vonden voor het minimaliseren van weefselladen met behoud van beeldverwerving met hoge resolutie3,17,18,19. Hoewel het eerder genoemde protocol gericht was op weefselverwerking en impregneren van zware metalen, biedt dit protocol inzicht in de beeldvormings-, gegevensanalyse- en reconstructieworkflow die inherent is aan SBF-SEM-studies. In ons laboratorium, dit protocol is met succes en reproduceerbaar toegepast op een breed scala van weefsels, waaronder hoornvlies en voorste segment structuren, ooglid, traan en harderian klier, netvlies en oogzenuw, hart, long en luchtwegen, nier, lever, cremaster spier, en cerebrale cortex / medulla, en in een verscheidenheid van soorten, waaronder muis, rat, konijn, cavia, vis, monolayer en gelaagde celculturen, varken, niet-menselijke primaat, evenals mens2. Hoewel kleine veranderingen de moeite waard kunnen zijn voor specifieke weefsels en toepassingen, is dit algemene protocol zeer reproduceerbaar en nuttig gebleken in de context van onze kernbeeldvormingsfaciliteit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dieren werden behandeld volgens de richtlijnen beschreven in de Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Vision and Ophthalmic Research en de University of Houston College of Optometry animal handling guidelines. Alle dierprocedures werden goedgekeurd door de instellingen waar ze werden behandeld: muis-, ratten-, konijnen-, cavia- en niet-menselijke primatenprocedures werden goedgekeurd door de University of Houston Animal Care and Use Committee, zebravisprocedures werden goedgekeurd door de DePauw University Animal Care and Use Committee en varkensprocedures werden goedgekeurd door het Baylor College of Medicine Animal Care and Use Committee. Al het menselijk weefsel werd behandeld in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki met betrekking tot onderzoek naar menselijk weefsel en er werd een passende goedkeuring van de instellingscommissie verkregen.

1. Weefselverwerking

  1. Bereid een stamoplossing van 0,4 M natriumcacodylaatbuffer door natriumcacodylaatpoeder te mengen in ddH2O. Meng de buffer grondig en de pH stel de oplossing in op 7,3. Deze buffer wordt gebruikt om fixatieve (hieronder beschreven samenstelling in stap 1.3), wasbuffer, evenals osmium- en kaliumferrocyanideoplossingen te maken.
    OPMERKING: Perfusiefixatie is vaak de beste fixatiemethode voor SBF-SEM-studies, omdat fixatie snel en door het hele lichaam plaatsvindt. Als perfusiefixatie niet mogelijk is binnen je studieontwerp, ga dan naar stap 1.3.
  2. Voer perfusiefixatie uit met de juiste fysiologische druk voor het diermodel24,25,26. Dit gebeurt via transcardiale sequentiële perfusie met geïmpïneerde zoutoplossing gevolgd door fixatief, elk geplaatst op een specifieke hoogte (bijv. 100 cm) boven het organisme (aangepast aan de fysiologische druk van het vasculaire systeem in het diermodel), waarbij fixatief in de linkerventrikel stroomt en uit een incisie in het rechteratrium komt. Weefsel van belang zal bleek worden als bloed wordt vervangen door fixatief, als het geheel of een deel van uw weefsel niet blancheert, kan het zijn dat weefsel niet op de juiste manier wordt gefixeerd en dat ultrastructuur mogelijk niet wordt bewaard.
  3. Gebruik een scheermesje of scherpe scalpel om weefselmonsters in blokken van niet groter dan 2 mm x 2 mm x 2 mm te snijden. Als stap 1.2 is overgeslagen, doe dit dan snel zodat weefsel zo snel mogelijk kan worden ondergedompeld.
    1. Als alternatief kunt u weefsel onder fixatief ontleden en overbrengen naar vers fixatief om het onderdompelingsproces te voltooien. De uiteindelijke samenstelling van het fixatief bestaat uit 0,1 M natriumcacodylaatbuffer die 2,5% glutaraldehyde en 2 mM calciumchloride bevat. Laat de fixatie minimaal 2 uur bij kamertemperatuur en maximaal 's nachts bij 4 °C doorgaan. Gebruik indien mogelijk een tuimel-/kantelplaat om de monsters voorzichtig te roeren tijdens het bevestigen.
    2. Als alternatief, als er een inverter magnetron beschikbaar is, fixeer weefsel in het bovengenoemde fixatief onder vacuüm op 150 watt gedurende 4 cycli van 1 minuut aan, 1 minuut uit. Microgolffixatie is de voorkeursmethode voor stap 1.3 omdat het snel weefsel fixeert en weefsel ultrastructuurbehoudt 27.
      OPMERKING: Weefsel mag tijdens dit protocol nooit drogen, zorg ervoor dat weefsel snel van de ene oplossing naar de andere wordt overgedragen.
  4. Was vast weefsel 5x gedurende 3 minuten elk (15 minuten in totaal) op kamertemperatuur in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer met 2 mM calciumchloride.
  5. Maak de volgende osmium ferrocyanide oplossing vers, bij voorkeur tijdens de vorige wasstappen. Combineer een 4% osmium tetroxideoplossing (bereid in ddH2O) met een gelijk volume van 3% kaliumferrocyanide in 0,2 M cacodylaatbuffer met 4 mM calciumchloride. Na de vorige wasstap plaatst u het weefsel in deze oplossing gedurende 1 uur op ijs in het donker en in de zuurkast.
    OPMERKING: Osmiumtetroxide is een gele kristallijne stof die in een ampul wordt geleverd. Om de osmiumtetroxide-oplossing te maken, scheurt u de ampul open, voegt u ddH2O toe en soniceert u gedurende 3-4 uur in het donker totdat de kristallen volledig zijn opgelost. Osmium tetroxide oplossing is een heldergele oplossing, als de oplossing zwart is is het osmium verminderd en mag het niet meer gebruikt worden.
  6. Terwijl het weefsel in de osmium ferrocyanide-oplossing broedt, begint u met het bereiden van de thiocarbohydrazide (TCH) oplossing. Bereid deze oplossing vers en laat hem direct beschikbaar zijn aan het einde van de 1 uur durende osmium ferrocyanide fixatieperiode. Combineer 0,1 g thiocarbohydrazide met 10 ml ddH2O en plaats deze oplossing gedurende 1 uur in een oven van 60 °C. Om ervoor te zorgen dat de oplossing is opgelost, wervelt u voorzichtig om de 10 minuten. Filter deze oplossing voor gebruik door een spuitfilter van 0,22 μm.
  7. Was het weefsel vóór incubatie in TCH met kamertemperatuur ddH2O 5x gedurende elk 3 minuten (in totaal 15 minuten).
  8. Plaats het weefsel in de gefilterde TCH-oplossing gedurende in totaal 20 minuten bij kamertemperatuur (figuur 1A-C).
  9. Na incubatie in TCH, was het weefsel 5x gedurende 3 minuten elk (15 minuten in totaal) bij kamertemperatuur ddH2O.
  10. Plaats weefsel in ddH2O met 2% osmiumtetroxide (niet osmium verminderd met kaliumferrocyanide) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Dit moet gebeuren in de zuurkast en in het donker, omdat osmium kan worden verminderd door licht (bijv. onder aluminiumfolie) (Figuur 1D-F).
  11. Na osmium tetroxide incubatie, was weefsel 5x gedurende 3 minuten elk (15 minuten totaal) bij kamertemperatuur ddH2O.
  12. Plaats weefsel in 1% waterig uranylacetaat (uranylacetaatpoeder gemengd in ddH2O) 's nachts in een koelkast bij 4 °C.
  13. Vlak voordat u weefsel uit de koelkast haalt, bereidt u verse Walton's lood aspartaatoplossing. Begin met het oplossen van 0,066 g loodnitraat in 10 ml asparaginezuuroplossing van 0,03 m (0,04 g asparaginezuur in 10 ml gedestilleerd water) en stel de pH in op 5,5 bij 1 N KOH (0,5611 g in 10 ml gedestilleerd water).
    LET OP: Bij het aanpassen van de pH kan een neerslag ontstaan. Dat is onaanvaardbaar.
    1. Voeg met behulp van een roerstaaf langzaam de 1 N KOH dropwise toe terwijl u de pH controleert. Verwarm de afgewerkte heldere loodoplossing gedurende 30 minuten voor in een oven van 60 °C. Als er een neerslag ontstaat, kan de oplossing niet worden gebruikt en moet een andere oplossing worden bereid.
  14. Haal het weefsel uit de koelkast en was elk 5x gedurende 3 minuten (15 minuten in totaal) bij kamertemperatuur ddH2O.
  15. Plaats na het wassen het weefsel gedurende 30 minuten in de opgewarmde Walton-aspartaatoplossing met behoud van de temperatuur op 60 °C.
  16. Na incubatie in walton's lood aspartaat, was het weefsel 5x gedurende 3 minuten elk (15 minuten totaal) bijkamertemperatuurddH 2 O (Figuur 1G-I).
  17. Dehydrateer het weefsel door middel van een ijskoude acetonreeks (30%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100% en 100% aceton (in ddH2O indien van toepassing) waardoor 10 minuten voor elke stap in de serie mogelijk is.
  18. Na de ijskoude uitdrogingsreeks plaatst u weefsel gedurende 10 minuten in aceton op kamertemperatuur.
    1. Formuleer gedurende deze tijd Embed 812 ACM hars. Gebruik het recept "harde mix" omdat het beter bestand is tegen stralingsschade. Meng de hars grondig en plaats het weefsel gedurende 4 uur in Embed 812:aceton (1:3 mix), gevolgd door Embed 812:aceton (1:1 mix) gedurende 8 uur of 's nachts, en tenslotte Embed 812:aceton (3:1 mix) 's nachts. Voer deze harsinfiltratiestappen uit bij kamertemperatuur.
  19. Plaats de volgende dag het weefsel 4-8 uur in 100% Embed 812, vervolgens in verse 100% Embed 812 's nachts en ten slotte in verse 100% Embed 812 gedurende 4 uur. Voer deze harsinfiltratiestappen uit bij kamertemperatuur.
    1. Vlak voor het inbedden, plaats een kleine hoeveelheid hars in een mengcontainer en meng langzaam (een houten stok kan worden gebruikt om te roeren) in koolstofzwart poeder totdat de hars verzadigd is met het poeder, maar nog steeds vloeibaar is en niet korrelig wordt. Het moet op dikke inkt lijken en langzaam van de houten stok kunnen druppelen zonder zichtbare klonten.
  20. Oriënteer de weefselmonsters in een siliconenrubberen mal en maak een foto zodat de monsteroriëntatie in het harsblok wordt geregistreerd en kan worden verwezen. Bedek de monsters in koolstofzwarte verzadigde hars aan de punt van de siliconenvorm en plaats de mal ~1 uur in een oven bij 65 °C.
    1. Plaats de mal op een helling om de hars aan de punt van de mal te bevatten waar deze het weefselmonster bedekt. Plaats een etiket met een identificatiemiddel voor experimenten/weefselmonsters in de mal aan de andere kant van de hars (figuur 2A).
  21. Haal de siliconen mal uit de oven en vul de rest van de mal met heldere hars (geen carbonzwart) en zorg ervoor dat het etiket zichtbaar blijft. Hard de hars doordrenkt met koolstofzwart genoeg uit om niet gemakkelijk te mengen met de heldere hars.
    1. Bereid een extra goed in de mal die geen weefsel bevat. Begin met de extra put, vul de rest van de mal met heldere hars.
    2. Als de koolstofzwarte hars in de heldere hars begint te bloeden, plaatst u de siliconenvorm gedurende extra tijd (bijv. 15 minuten) terug in de oven.
    3. Zodra alle weefselmonsters zijn afgesplijst met heldere hars, plaatst u de siliconenvorm gedurende 48 uur terug in de oven (plat, zonder helling) op 65 °C om het uithardingsproces te voltooien.

2. Blokvoorbereiding

OPMERKING: De methode is afhankelijk van hoe het monster in het blok is georiënteerd en hoe de doorsnede moet plaatsvinden. De meest voorkomende weefseloriëntatie vindt het weefsel echter gecentreerd in de punt van het harsblok, loodrecht op het lange uiteinde van het harsblok.

  1. Knip in de meeste gevallen eerst het uiteinde van het blok bij om het weefsel te lokaliseren door het monsterblok in de microtome-boorkop te plaatsen met het taps toelopende uiteinde ongeveer 5-6 mm uit de boorkop. Vergrendel het op zijn plaats met de ingestelde schroef en plaats het onder een warmtelamp.
  2. Na enkele minuten is het blok kneedbaar en gemakkelijk te trimmen. Plaats de boorkop in de stereomicroscoophouder en gebruik een nieuw scheermesje met dubbele rand om dunne secties parallel met het blokvlak te maken totdat het weefsel zichtbaar is. Dit is het best te zien door licht over het blokvlak te hengelen, het weefselmonster zal minder reflecterend en korrelig zijn in vergelijking met die delen van de hars die verstoken zijn van weefsel. Raadpleeg de foto die is genomen van weefselmonsters voorafgaand aan de introductie van koolstofzwarte verzadigde hars voor een idee van hoe en waar het weefsel zich bevindt.
  3. Zet één monsterpenhouder opzij voor trimmen. Deze speldhouder wordt nooit in de SEM-kamer geplaatst en kan daarom zonder handschoenen worden gehanteerd, dit wordt de trimpenhouder genoemd. Elke monsterhouder die bestemd is om in de beeldvormingskamer te worden geplaatst, mag nooit zonder handschoenen worden aangeraakt. Dit voorkomt het inbrengen van vet en olie in de microscoopkamer.
  4. Plaats een aluminium monsterpen in de trimpenhouder en draai de stelschroef iets vast met het vlak (vlakke oppervlak) van de pen 3-4 mm boven de penhouder.
  5. Maak verschillende diepe, kriskras krassen in het gezicht van de pin om een groter oppervlak te bieden voor de lijm die wordt gebruikt om het monster op zijn plaats te houden. Als een aluminium pen wordt gebruikt, wordt een kleine stalen platte schroevendraaier aanbevolen voor deze stap (figuur 2B).
  6. Plaats de boorkop met het weefselmonster terug onder de warmtelamp totdat de hars zacht en kneedbaar wordt en plaats deze vervolgens in de klauwplaat onder de stereomicroscoop.
  7. Gebruik een tweesnijdend scheermesje om overtollige hars weg te snijden van het deel van het harsblok dat het weefselmonster bevat. Uiteindelijk zal de grootte van het weefselblok dat aan de pin is bevestigd ongeveer 3 mm in diameter en 2-3 mm hoog zijn.
    1. Duw het scheermes voorzichtig recht naar beneden in het harsblok ongeveer 1-2 mm en duw het scheermes vervolgens voorzichtig horizontaal in het harsblok op een diepte die gelijk is aan de vorige snede. Doe dit langzaam en met grote zorg, omdat het mogelijk is om het deel van het blok met het weefselmonster te beschadigen of weg te snijden. Als de twee sneden samenkomen, zal de overtollige hars zich van het blok scheiden. Blijf hars verwijderen totdat er slechts een verhoogd oppervlak van 3 mm x 3 mm overblijft.
  8. Plaats na deze eerste trimming het blok (nog steeds in de boorkop) enkele minuten onder het warmtelampje.
  9. Zodra de hars zacht en kneedbaar wordt, plaatst u het blok terug onder de stereomicroscoop. Snijd met een nieuw scheermesje met twee kanten de bovenkant van het harsblok af, ongeveer 1 mm onder het bijgesneden gedeelte, met een enkele gladde snede. Een vlak oppervlak heeft de voorkeur omdat dit aan de specimenpen wordt gelijmd. Zorg ervoor dat het monster niet verloren gaat, omdat deze stap enige kracht vereist die naar het verwijderde deel van het blok kan worden overgedragen en ervoor kan zorgen dat het wegvliegt. Plaats het gesneden en bijgesneden monster opzij.
  10. Plaats de trimpenhouder met de gesneden aluminium pen in de stereomicroscoophouder. Breng een dunne laag cyanoacrylaatlijm aan op het punt van de pin, zodat deze de pin volledig bedekt zonder een zichtbare meniscus te vormen. Pak het bijgesneden stuk van het weefselblok met een tang en plaats het op de penvlak. Centreer het weefselmonster op de monsterpen. Duw het naar beneden en houd het enkele seconden vast. Laat de lijm enkele minuten intrekken.
  11. Wanneer de lijm goed droog is, plaatst u de trimpenhouder terug onder de stereomicroscoop. Vijl met behulp van een fijn vijl overtollige hars weg, zodat er geen hars overhangt. De harsvorm moet lijken op de ronde penkop.
  12. Zoek het weefsel op het verhoogde deel van uw harsblok, schuine verlichting is hiervoor nuttig. Met behulp van een scheermes met dubbele rand moet het verhoogde deel van de hars dat het weefselmonster bevat, worden bijgesneden tot een gebied dat niet groter is dan 1 mm2. Indien mogelijk kan het blokvlak nog kleiner worden bijgesneden, dit vermindert de belasting van het diamantmes en verbetert de levensduur.
    1. Verwijder zoveel mogelijk overtollige hars, waardoor het blok iets langer in één dimensie blijft. Dit gebeurt langzaam en met zorg, omdat het mogelijk is dat de hars die het weefselmonster bevat, afbreekt als er te veel kracht wordt uitgeoefend. Hoewel een scheermes wordt aanbevolen, kan een fijn metalen vijl voor deze stap worden gebruikt.
  13. Met een fijne metalen vijlhoek de overtollige hars, in het gebied buiten het verhoogde gedeelte dat het weefselmonster bevat, naar beneden naar de rand van de pen (figuur 2C).
  14. Verwijder harsdeeltjes en stof uit het voorbereide monster voordat u zilververf aanbrengt, gevolgd door goudsputteren. Meng zilver met aceton zodat het een gemakkelijk smeerbare vloeistof is, vergelijkbaar met nagellak (maar niet zo dun dat het van de applicator druipt) en breng een dunne laag aan op het hele monsterblokoppervlak. Aceton verdampt snel, dus het kan nodig zijn om extra aceton toe te voegen naarmate de zilververf begint te verdikken.
    1. Laat de zilververf 's nachts drogen voordat u in de microscoop laadt.
      OPMERKING: Deze zilverlaag moet dun zijn om te voorkomen dat het blokvlak groter wordt dan 1 mm x 1 mm, en hoewel de zilververf het diamantmes nooit heeft beschadigd, worden kleinere blokvlakken nog steeds aanbevolen om de levensduur van het diamantmes te behouden. De aceton vermengd met het zilver moet volledig verdampen voordat het monster in de microscoop sputtert of wordt geladen om te voorkomen dat acetondamp in de beeldvormingskamer wordt gebracht.
    2. Breng na het aanbrengen van zilververf een dunne laag goud aan op het monsterblok. Met behulp van een standaard vacuüm sputterapparaat uitgerust met een standaard goudfolie doel, zal een kamerdruk van 200 milliTorr (Argon gas) en 40 milliampère lopen gedurende 2 minuten resulteren in een 20 nm dikke gouden coating.
  15. Plaats na het coaten het gemonteerde en bijgesneden blok in een buis met het juiste experimentlabel erop. Maak aangepaste buizen met behulp van wegwerptransferpipetten.
    1. Snijd de transferpipet net onder de lamp, laat een kort deel van de transferpipetbuis onder het bolvormige uiteinde zitten. Verkort het buisvormige gedeelte dat is weggesneden en snijd de pipetpunt voldoende terug zodat de aluminium monsterpen er strak in kan worden geduwd.
    2. Plaats het uiteinde met de aluminium monsterpen in het bolvormige uiteinde van de gewijzigde transferpipet.
  16. Voordat u een voorbereid weefselblok laadt, knipt u voorzichtig overtollige zilververf van het oppervlak van het blokvlak weg.

3. SEM-instellingen voor het weergeven van het blokvlak

OPMERKING: De beeldvormingsinstellingen die volgen, zijn geproduceerd op het apparaat dat door de auteurs wordt gebruikt, dat wordt vermeld in de verstrekte tabel met materialen. Hoewel dit apparaat in staat is om beeldvorming met variabele druk te maken, werden de beste resultaten vastgelegd onder hoog vacuüm.

  1. Stilstaande tijd: Gebruik 12 μs/px tijdens seriële doorsneden. Wanneer een interessegebied is geïdentificeerd, kan een afbeelding met een hogere resolutie worden verkregen bij 32 μs/px.
  2. Vacuüminstellingen: Gebruik een pistooldruk van 9e-008 Pa, een kolomdruk van 1,1e-004 Pa en een kamerdruk van 9,5e-002 Pa.
  3. Opnametijd: Leg met de bovenstaande instellingen een px-afbeeldingsstapel van 2048x2048 vast met een snelheid van 50 seconden per afbeelding. Afbeeldingen met een hogere resolutie van regio's van belang kunnen worden vastgelegd op 4096x4096 px met iets minder dan 9 minuten per afbeelding.
  4. Sectiedikte: Gebruik 100-200 nm. Minder is mogelijk, maar kan een lagere bundelspanning, intensiteit of verblijftijd vereisen.
  5. Hoogspanning (HV): Gebruik 7-12 kV. Terwijl het verhogen van de spanning de vlekgrootte vermindert en resolutie verhoogt, introduceert het meer mogelijkheid voor straalschade. Hogere kV verhoogt de straalpenetratie, wat resulteert in verlies van details. Het verlagen van de kV degradeert echter de signaal-ruisverhouding (figuur 3)14.
  6. Straalintensiteit (BI): Het SBF-SEM-apparaat van de auteur biedt een straalintensiteitsschaal variërend van 1-20. Op deze schaal geven waarden van 5-7 kwaliteitsbeelden zonder overmatig opladen en stralingsschade. Hoe hoger de BI, hoe groter de resolutie, maar er is meer kans op opladen en bundelschade14.
  7. Vlekgrootte en beeldvergroting: Bepaal de vlekgrootte aan de de straalintensiteit en het spanningsniveau. Idealiter mag de vlekgrootte niet groter zijn dan de gebruikte pixelgrootte. De pixelgrootte wordt bepaald door het gezichtsveld (FOV) te delen door het aantal pixels. Een FOV van 25 μm met een beeldgrootte van 2048x2048 px zou bijvoorbeeld 12,2 nm per pixel geven. Daarom mag de spotgrootte niet groter zijn dan 12,2 nm. Figuur 4 laat zien hoe HV, BI en spotgrootte met elkaar samenhangen.
  8. Werkafstand (WD) - Bij blokgezichtsbeeldvorming is de werkafstand niet instelbaar. Het is gewoon een factor van focus. Het zal bijna identiek zijn voor alle afgebeelde blokken. Hoewel de werkafstand niet instelbaar is, speelt deze een cruciale rol in de resolutie van het vastgelegde beeld. Naarmate de werkafstand afneemt, neemt de resolutielimiet voor vastgelegde beelden toe. In sommige gevallen kan het mogelijk zijn om de werkafstand te verkleinen door wijzigingen aan te brengen in de beeldkamer, maar deze wijzigingen moeten naar goeddunken van de gebruiker worden aangebracht. Om de werkafstand te verkleinen en de beeldresolutie te vergroten, hebben we de microtomeschroeven van de deurbevestiging losgemaakt en de microtome verplaatst zodat deze ~ 2 mm dichter bij de bundeldetector rustte na het opnieuw vastdraaien van de schroeven.
  9. Resolutie - Met behulp van de bovenstaande instellingen is een x - y-resolutie tot 3,8 nm mogelijk. Het is belangrijk op te merken dat de resolutie wordt beperkt door de grootte van de bundelvlek en de pixelresolutie van de beeldopnamen (bijvoorbeeld een gezichtsveld van 20 μm dat is vastgelegd in een pixelafbeelding van 2048x2048 heeft een pixelresolutie van 9,8 nm, zelfs als een spotgrootte van 3,8 nm is gebruikt). Beeldresolutie in het z-vlak is afhankelijk van doorsnededikte, we merken dat 100-200 nm goed werkt met dit protocol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Muis Cornea
Dit protocol is uitgebreid toegepast op het hoornvlies van de muis. Met behulp van SBF-SEM-beeldvorming bleek een netwerk van elastinevrije microfibrilbundels (EFMBs) aanwezig te zijn in het volwassen muis hoornvlies. Eerder werd aangenomen dat dit netwerk alleen aanwezig was tijdens embryonale en vroege postnatale ontwikkeling. SBF-SEM onthulde een uitgebreid EFMB-netwerk in het hele hoornvlies, met individuele vezels met een diameter van 100-200 nm wanneer gemeten in doorsnede. Er werd ook vastgesteld dat dit EFMB-netwerk in verschillende lagen was georganiseerd, met vezels die nauw verbonden waren met keratocyten, zelfs binnen ondiepe invaginaties op het keratocytoppervlak (figuur 5). De ontdekking van EFMB-vezels in het volwassen hoornvlies leidde tot immunogold-labeling transmissie elektronenmicroscopie (TEM), fluorescentie en confocale studies om de aard van dit netwerk verder te begrijpen23.

Verdere toepassing van dit protocol leidde tot de ontdekking van een voorheen onbekende populatie van centrale hoornvlieszenuwen die fuseren met basale epitheelcellen aan de stromal-epitheliale rand (Figuur 6). Eerder werd aangenomen dat alle zenuwen die interageren met het epitheel aan deze grens in het hoornvliesepitheel doordrongen en rammelden en het subbasale en epitheliale plexi produceerden. In deze studie onderging ~45% van de centrale zenuwen die interageren met het basale epitheel celcelfusie in plaats van eenvoudige penetratie. Met behulp van stereologische methoden toegepast op SBF-SEM datasets, was het mogelijk om aan te tonen dat deze nieuwe zenuwpopulatie een oppervlakte-volumeverhouding had die ongeveer de helft was van die van doordringende zenuwen, consistent met hun "gezwollen" uiterlijk (Zenuwfusie - 3,32±0,25, Zenuwpenetratie - 1,39±0,14, p ≤ 0,05). 3D-reconstructies van penetrerende en samensmeltende zenuwbundels en hun mitochondriën werden gemaakt, wat het gebrek aan mitochondriën in gesmolten delen van de zenuwbundels benadrukte. De ontdekking van neuronaal-epitheliale celfusie met behulp van SBF-SEM leidde tot fluorescentiestudies die de membraancontinuïteit tussen de twee gesmolten cellen verifiëren21.

Het centrale hoornvlies is een avasculaire weefsel, en als zodanig de perifere limbale vasculatuur is van bijzonder belang voor de algehele gezondheid van het hoornvlies. De cel-celrelaties en ultrastructuur van deze regio zijn complex; het vermogen om deze celcelinteracties en ultrastructurele verbindingen te waarderen is echter beperkt in fluorescentie- en SINGLE SECTION TEM-studies. Om deze reden werd een SBF-SEM-beeldstapel met limbale vasculatuur, zenuwbundels en bijbehorende cellen handmatig gesegmenteerd voor 3D-reconstructie (Figuur 7). In deze afbeelding is de nauwe associatie tussen vasculaire endotheelverbindingen en een bedekkende pericyt, de individuele korrels van een perivasculaire mastcel, de kern en de voorrand van een neutrofiel die langs het buitenoppervlak van de bloedvatwand kruipt, evenals een passerende zenuwbundel te zien.

Samen toont dit werk het vermogen van dit protocol aan om hoogwaardige 3D-elektronenmicroscopiegegevenssets te produceren in weefsels die rijk zijn aan extracellulaire matrix en epitheel, evenals vasculatuur en bijbehorende cellen.

Hogere Orde Primate Retina - Zenuwplexus en vasculair netwerk
De retinale zenuwvezellaag (RNFL) van primaten van hogere orde bevat en is afhankelijk van een uitgebreid vasculair netwerk. Vaak brengen ziekten van het netvlies veranderingen met zich mee in zowel de parameters van de retinale zenuwvezellaag als de vasculatuur die erin wordt aangetroffen. Het begrijpen van de relatie tussen de RNFL en zijn vasculaire netwerk in gezond, niet-pathologisch weefsel is de eerste stap om alle veranderingen te begrijpen die kunnen optreden als gevolg van ziekte. Om deze relatie beter te begrijpen, werd het SBF-SEM-protocol toegepast op het normale primaten retina van de hogere orde en werd de reconstructie van het vasculaire netwerk uitgevoerd en volumetrische gegevens uit deze reconstructie gehaald (figuur 8). Dit 4.642.307 μm3-gebied van de RNFL bevatte een vasculair bed van 1,207x10-4 μL in volume, goed voor 2,6% van het totale volume van de RNFL. Dit werk toont het vermogen van dit protocol om hoogwaardige 3D-elektronenmicroscopiegegevenssets in dicht neurologisch weefsel te produceren.

Zebravis en Reuze Danio Hart - Geriste Spier en Ontwikkelend Vasculature
Zowel de zebravis als de gigantische danio zijn belangrijke modellen voor hartontwikkeling en regeneratie. Historisch gezien wordt het zebravishart beschouwd als een hart van twee anatomisch verschillende myocardsegmenten die samen functioneren ter ondersteuning van de fysiologische eisen van de zebravis. De interface tussen deze twee ventriculaire lagen werd echter niet goed begrepen. Met behulp van dit protocol werd een voorheen niet-herkend junctioneel gebied ontdekt dat bestond uit een dun vel fibroblasten. Er werd vastgesteld dat openingen in dit blad het mogelijk maakten twee afzonderlijke myocardsegmenten in contact te brengen en complexe hechtingen te vormen, waaronder desmosomen en fascia-hechtingen22.

Dit protocol is gebruikt bij verder onderzoek naar het vasculaire netwerk van het zich ontwikkelende reuzenhart Danio (figuur 9). Deze methode maakt de 3D-appreciatie van het zich ontwikkelende cardiale myocytnetwerk en de relatie met het ontwikkelen van microvasculatuur mogelijk. Samen toont dit werk het vermogen van dit protocol om hoogwaardige 3D-elektronenmicroscopiegegevenssets te produceren in spier- en sterk gevasculariseerde weefsels.

Beeldinstellingen, opladen en resolutie
Hoewel een geschikte fixatie en zware metaalkleuring noodzakelijk is voor hoogwaardige SBF-SEM-beeldvorming, is het gebruik van geleidende hars en de juiste beeldvormingsinstellingen voor de vragen die worden behandeld even belangrijk. In dit protocol wordt het gebruik van koolstofzwart gebruikt om de geleidbaarheid van het monsterblok te verhogen en een buis naar de montagepen te bieden voor de klaring van secundaire elektronen uit het blokvlak. Dit is effectief gebleken in de bestrijding van weefselladen die vaak de beeldkwaliteit aangradeert in weefsels die niet zijn bereid met koolstofzwart16. Bovendien zorgt de zilververf en goudsputtering die op het blok wordt aangebracht voor een dissipatieroute voor elektronenopbouw. Sommige apparaten maken de toevoeging van een focal charge compensator mogelijk, die het opladen vermindert door een rookwolk stikstof over de blokwand aan te brengen, maar we hebben vergelijkbaar succes gehad met het gebruik van koolstofzwart en de toepassing van zilververf en goud sputteren op het blok15. Gebrek aan monstergeleiding kan leiden tot elektronenopbouw die zichtbaar is als weefsellading(figuur 1),evenals ontladingen die zichtbaar zijn als abrupte beeldverschuiving en kromming die de beeldkwaliteit drastisch verminderen (figuur 10B & F). Het gebruik van carbonzwart maakt beeldvorming onder hoogvacuüm mogelijk en het gebruik van beeldinstellingen die resulteren in een hoge signaal-ruisverhouding en een verbeterde beeldresolutie. Een dergelijke instelling die leidt tot een verbeterde beeldkwaliteit is pixel dwell time. Het SBF-SEM-beeldvormingsproces omvat het rasterscannen van een elektronenstraal over het monsteroppervlak om backscattered elektronen te genereren die de microscoopdetector kan verzamelen en interpreteren als signaal. De tijdsduur dat deze straal binnen de ruimte van elke pixel mag blijven, leidt ertoe dat aan elke pixellocatie een nauwkeurigere pixelwaarde wordt toegewezen (figuur 3A & B)2. Er moet echter een evenwicht worden gevonden tussen meer signaal-ruis, resolutie en schade aan de blokwand. De straal bestraalt de blokwand effectief met hoogenergetische elektronen die hars kunnen afbreken en verzachten, wat resulteert in beelddegradatie en snijcomplicaties (figuur 10)28. Hoe dunner de z-resolutie vereist is, hoe moeilijker het wordt om beeldvorming met hoge resolutie te behouden. We gebruiken over het algemeen z-stappen van 100-200 nm, maar z-stap maten van 25-50 nm zijn gerapporteerd5,29,30,31. Bij z-stappen van deze grootte kan het afbreken en verzachten van hars als gevolg van balkschade leiden tot compressie van de hars waardoor het mes een snede mist of het blokvlak snijdt, maar met "geklets" waarbij het mes over het oppervlak van het blok springt en rimpelingen en banden creëert13. Hoewel kleine z-stappen een aantrekkelijk vooruitzicht zijn, is het belangrijk om de specifieke onderzoeksvraag in gedachten te houden bij het kiezen van een geschikte z-stap. Overbemonstering kan leiden tot aanzienlijke overwegingen voor gegevensopslag en een toename van de tijd die nodig is om 3D-reconstructies te produceren.

Weefselfixatie en kleuring
Voorafgaand aan de incubatie van zware metalen moeten weefsels worden gefixeerd in glutaraldehyde. Hoewel we microgolffixatie onder vacuüm ten zeerste aanbevelen voor het behoud van weefsel ultrastructuur27,kan een commerciële invertermagnetron met variabel wattage worden vervangen32,33,34,35als een magnetron van laboratoriumkwaliteit niet beschikbaar is. Als dit gebeurt, moet extra zorg worden gebruikt om ervoor te zorgen dat weefselvervorming niet optreedt. Onjuiste weefselfixatie kan leiden tot veranderde weefselmorfologie, zoals te zien is in figuur 10E. Dit protocol is, net als de meeste moderne SBF-SEM-kleuringsprotocollen, aangepast aan de kleuringsprocedure die Deerinck in 201017schetste , gebaseerd op de osmium-thiocarbohydrazide-osmiumvlekken die Willingham en Rutherford in 198436hebben gemaakt. De zware metalen die in dit protocol worden gebruikt, voegen contrast toe aan de cellulaire structuren in een weefselmonster (figuur 1). De initiële osmium incubatie vindt plaats met gereduceerd osmium dat zich bindt aan C=C bindingen in onverzadigde vetten wat leidt tot membraan - en lipidenkleuring37,38. Osmium wordt verminderd door kaliumferrocyanide, dat helpt bij de kleuring van verzadigde lipiden en ook werkt om fosfolipiden te stabiliseren39,40. Thiocarbohydrazide wordt vervolgens toegevoegd als een mordent die zich vanaf de eerste incubatie aan het osmium bindt en fungeert als een brug waarop in een later stadium in protocol41verder osmium is gebonden . Uranylacetaat, een uraniumzout, is een effectief contrastmiddel voor lipiden, nucleïnezuren en eiwitten, terwijl loodcitraat het contrast van eiwitten en glycogenen verbetert. De variërende affiniteiten van deze middelen voor cellulaire componenten versterken het algehele contrast binnen weefsels verder dan de osmium incubaties42.

Beeldvorming van het blok-gezicht
Figuur 11, Figuur 12, Figuur 13 illustreren de gecombineerde effecten van spanning, pixel dwell tijd en bundelintensiteit. Conventionele praktijk suggereert dat een combinatie van laagspanning, korte verblijftijd en dimlichtintensiteit noodzakelijk zijn voor optimale beeldvorming en het voorkomen van stralingsschade aan het monsterblok. In tegenstelling tot deze instellingen illustreren figuur 11, figuur 12, figuur 13 dat hogere spanningen (bijv. 7 kV), langere verblijftijden (32 μs/px) en hogere bundelintensiteiten (instelling 6 in ons geval) een superieure beeldkwaliteit kunnen produceren ten opzichte van conventionele instellingen.

SBF-SEM maakt het mogelijk om seriële elektronenmicroscopiebeelden te verzamelen die kunnen worden verzameld als een 3D-dataset bestaande uit voxels. Hoewel dit een ongelooflijk krachtig gebruik van SBF-SEM is, maakt deze methode ook de snelle en herhaalbare beeldvorming van zeldzame biologische gebeurtenissen of cellen mogelijk. Beeldverwerving met behulp van SBF-SEM kan worden gecontroleerd op zeldzame gebeurtenissen en beeldvorming kan worden onderbroken om afbeeldingen met een hogere vergroting/resolutie van deze gebeurtenissen te verzamelen. Bovendien kan het blok uit de microscoopkamer worden verwijderd en kan het blokvlak worden doorsneden voor transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) beeldvorming. Op deze manier kunnen grote datasets van zeldzame gebeurtenissen worden verzameld met behulp van SBF-SEM en gewaardeerd op de angstrom-schaal met behulp van TEM.

Figure 1
Figuur 1: SBF-SEM en TEM vergelijkingen bij verschillende stappen in het protocol. Dit protocol bevat meerdere stappen waarbij monsterweefsel wordt gekleurd met zware metalen. Dit beïnvloedt niet alleen het weefselcontrast en de waardering van cellulaire structuren en organellen, maar ook de oplaadniveaus die optreden wanneer het weefsel wordt afgebeeld. Deze figuur bevat drie verschillende aanzichten van voorbereid weefsel: een lage vergrotingsweergave(A, D & G),een hoge vergrotingsweergave(B, E & H)en een TEM-vergelijking van voorbereid muis hoornvlies (C, F & I). Opgemerkt kan worden dat hogere vergrotingsbeelden kunnen leiden tot een verhoogde weefsellading, omdat de elektronenbundel geconcentreerd is in een kleiner deel van het weefsel. De bovenste rij (A-C) is een representatief monster van weefsel dat is verwerkt tot de voltooiing van stap 1.8 en is geïmpregneerd met kaliumferrocyanide, osmiumtetroxide en thiocarbohydrazide. De pijlen in de eerste twee kolommen tonen de epitheliaal-stromale interface als referentiepunt. Let op het lage contrastniveau in vergelijking met de onderste twee rijen, evenals de verhoogde niveaus van weefselladen. Het monster in de middelste rij (D-F) is verwerkt tot en met stap 1.10 en profiteert van een extra osmium tetroxidestap en staat zichtbaar meer tegenover elkaar dan het monster in de bovenste rij. Hoewel cellulaire structuren waarneembaar zijn, is opladen nog steeds aanwezig. Het monster in de onderste rij (G-I) profiteert van het volledige kleuringsprotocol en heeft minimale weefsellading. TEM-beeldvorming onthult weefselcontrastniveaus die worden gegeven door de zware metalen die bij elke stap aanwezig zijn (rechterkolom): organellen in het hoornvlies endotheel (*) zijn meer contrast en zichtbaar naarmate de weefselverwerking doorgaat via het protocol. Bovendien worden stromale collageen- en fibrillinedetails zichtbaarder (pijlpunt) naarmate het protocol is voltooid. Paneel A, D & G schaalbalk = 50 μm. Paneel B, E & H schaalbalk = 10 μm. Paneel C, F & I schaalbalk = 1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Schematisch van ingebed weefselblok, monsterpen en uiteindelijke voorbereiding. (A) Weefsel moet in een bekende richting worden geplaatst aan de punt van de harsvorm en het bovenste derde deel van de mal gevuld met koolstofzwarte verzadigde hars. Het gebied van de schimmel dat het verst van het weefsel verwijderd is, moet duidelijk blijven, zodat het experimentetiket duidelijk zichtbaar is. (B) Het oppervlak van de monsterpen moet worden bekrast om een rasterpatroon te produceren, dit maakt een groter contactoppervlak mogelijk voor de cyanoacrylaatlijm om uit te harden tussen het voorbereide monsterblok en de pin. (C) De koolstofzwarte verzadigde hars moet een groot contactoppervlak met de kop van de monsterpen maken, maar het gebied dat door het diamantmes wordt gesneden, mag niet groter zijn dan 1x1 mm. Het is een goede gewoonte om het blok naar de punt toe te taps toe te staan. Dit minimaliseert snijkrachten op het diamantmes en door een bredere basis is het blok beter bestand tegen het scheiden van de pen tijdens het snijden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Vergelijking van instellingen voor het vastleggen van afbeeldingen. ( A &B) Panelen A en B vergelijken beeldkwaliteit en resolutie als functie van pixel dwell time. Paneel A is gemaakt met een verblijftijd van 32 μs/pixel bij 4 kV en lijdt aan een verminderde signaal/ruisverhouding, zoals blijkt uit het "korrelige" uiterlijk van de vergrote inzet. Paneel B is gemaakt met een verblijftijd van 100 μs/pixel bij 4 kV. Het verhogen van de pixel dwell-tijd verhoogt de signaal-ruisverhouding en onthult een verhoogd niveau van cellulaire details, maar verhoogde pixel dwell-tijd heeft het potentieel om te leiden tot weefseloplading en / of warmteopbouw die het blok verzacht en snijartefacten (geklets) introduceert bij het doorsnijden. Panelen C en D vergelijken beelden die zijn vastgelegd onder identieke belichtingsomstandigheden, maar met twee verschillende kV-waarden van de bundel. Weefsel in deze panelen werd geïmpregneerd met goudkleurige nanogolddeeltjes om verschillen in bundelpenetratiediepten duidelijker te maken. Paneel C werd gevangen met 9 kV terwijl paneel D werd gevangen op 21 kV. Verhoogde kV heeft het voordeel van een verhoogd contrast (D), maar details gaan verloren als gevolg van het verzamelen van elektronen uit een grotere diepte van weefsel (C). Als gevolg van het bemonsteren van een grotere doorsnede zijn grotere aantallen immunogolddeeltjes specifiek voor GAP 43 zichtbaar, terwijl niet-specifieke etikettering hetzelfde blijft, wat resulteert in een verhoogde signaal-ruisverhouding. Paneel A & B schaalbalk = 2 μm. Paneel C & D schaalbalk = 1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Bundelintensiteit, kV en vlekgrootte. (A) Bij contact met het weefselmonster levert de elektronenbundel (lichtblauw) een traanvormig interactievolume op, waaruit verschillende vormen van energie worden geproduceerd uit de interactie tussen bundelelektronen en het weefselmonster. De traanvorm is een functie van weefseldichtheid en zware metaalkleuring samen met straalenergie, en de kantelhoek van de elektronenstraal43. Terwijl röntgenstralen, vijzelelektronen en tertiaire elektronen worden geproduceerd tijdens SBF-SEM-beeldvorming, is de primaire zorg met backscattered (donkerblauw) en secundaire (groene) elektronen13. Het beeld geproduceerd met SBF-SEM beeldvorming wordt geproduceerd door het verzamelen van backscattered elektronen. Deze elektronen zijn afkomstig van elastische interacties tussen de bundel en het monster, en het verzamelde signaal is sterk afhankelijk van het atoomaantal atomen waarmee wordt gecommuniceerd - vandaar de behoefte aan zware metaalkleuring44. Secundaire elektronen zijn afkomstig van inelastische interacties tussen de bundel en het monster en de detectie van hun signaal is sterk afhankelijk van de oppervlakteoriëntatie. Omdat het blokvlak vlak is in SBF-SEM, dragen secundaire elektronen niet zinvol bij aan het verzamelde signaal13. In feite kan secundaire elektronenaccumulatie op het oppervlak van het blok een belangrijke oplaadbron zijn en een schadelijk effect hebben op de beeldkwaliteit2. (B) Deze grafiek toont de relatie tussen bundelintensiteit, bundel kV en vlekgrootte. De vlekgrootte is de ruimtelijke resolutie van de straal en bepaalt de resolutielimiet van de beelden die worden geproduceerd. Het verlagen van kV verhoogt de spotgrootte, maar vermindert ook de beelddiepte waardoor detaillering mogelijk is. Dit heeft ook tot gevolg dat het detecteerbare signaal afneemt. Het verhogen van de bundelintensiteit biedt een eerste verbetering van de spotgrootte en signaaldetectie, maar verhoogt snel het niveau van weefselladen. Uiteindelijk zijn de gekozen bundelintensiteit en kV-waarden steekproefafhankelijk en het best empirisch bepaald in relatie tot de wetenschappelijke vraag die wordt gesteld. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Elastinevrije microfibrilbundelnetwerk in het hoornvlies van de muis. 3D-reconstructie van microfibrils (wit) nauw verbonden met keratocyten (geel, oranje & groen) in het hoornvlies stroma. De microvezels zijn te zien naast, en in sommige gevallen in ondiepe groeven in, cornea keratocyten (pijlen) (A). Dit netwerk van elastinevrije microfibrillen is georganiseerd in verschillende lagen binnen het hoornvlies stroma (B). Schaalbalk = 2 μm. Het gereconstrueerde beeldblok is 45x45 μm in de x & y as, en 30 μm in de z as met voxel een resolutie van 22x22x100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Reconstructie van hoornvlieszenuwen die door basale lamina gaan aan de stromaal-epitheliale rand. 3D reconstructie van een doordringende zenuw (paars) terwijl deze door de basale lamina (groen) gaat. Deze zenuw kan worden gezien om te bifurceren voorafgaand aan penetratie. Na het penetreren in het epitheel ondergingen beide zenuwtakken vertakkingen. Mitochondriën (geel) zijn zichtbaar in de stromale en epitheliale delen van de zenuwbundel. Schaalbalk = 2,5 μm. Het gereconstrueerde beeldblok is 25x25 μm in de x & y as, en 14 μm in de z-as met een voxel resolutie van 12x12x100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Limbale vasculatuur en bijbehorende cellen in het perifere hoornvlies van de muis. Een enkel beeld (A) van een 3D-beeldblok (B) kan worden gezien waardoor een vat, zenuwbundel en bijbehorende cellen reizen. Paneel C toont een gereconstrueerd vat (rood) met een bijbehorend pericyt (grijs) eromheen gewikkeld dat de endotheelcelverbindingen bedekt. Een zenuwbundel (blauw) bifurceert in de nabijheid van dit vat terwijl het door het weefsel reist. Een neutrofiel (geel) kan parallel aan de lange as van het vat worden gezien, met zijn polymorfe kern zichtbaar in zijn cellichaam en de achterliggende uropod zichtbaar als een uitsteeksel rechts van het beeld. Aan de onderzijde van het vat is een mastcel (magenta) zichtbaar. Paneel D isoleert deze mastcel, waar de korrels (groen) gemakkelijker te zien zijn over de kern (paars) in de cel. Paneel E benadrukt de cellulaire structuren die op de cellulaire reconstructies zijn gelegd, met endotheelkernen aangeduid in blauw en aanhechtingsmicrodeeltjes zichtbaar in het vatlumen (oranje). Pijlen tonen celcelranden tussen endotheelcellen, die verder kunnen worden gezien als verhoogde richels die zich uitstrekken langs de cellen aan de lichtgevende kant van het vat. Paneel A schaalbalk = 2 μm. Het beeldblok dat wordt gebruikt om deze cellen te reconstrueren is 30x30 μm in de x & y-as en 42,5 μm in de z-as met een voxelresolutie van 14,6x14,6x100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Gereconstrueerd vasculair netwerk van de niet-menselijke primaat retinale zenuwvezellaag. (A) Een 200x200 μm SBF-SEM beeld van het primaten retina genomen op 8192x8192 px. De bemonsterde locatie is ~ 500 micron van de inferieure temporale randmarge van een gezond oog zonder pathologie. De beeldserie gereconstrueerd in panelen C & D werd vastgelegd op 2048x2048 px, waarbij de beeldvorming werd gepauzeerd zodat geïnteresseerde regio's konden worden afgebeeld op 8192x8192 px. Paneel B is het vertraagde gebied van paneel A, rechtstreeks afkomstig van de oorspronkelijke afbeelding. Let op het grote aantal axonen en hun mitochondriën. (C) Orthoslice sectie door een 200x200x200 μm weefselvolume van een controleoog inferieure temporele zenuwvezellaag, met vasculatuur gesegmenteerd. (D) Z-projectie van de zenuwvezellaag vasculatuur. Deze serie illustreert de oplossing die mogelijk is op een groot gebied met behulp van deze methodologie. Paneel A schaalbalk = 20 μm. Paneel B schaalbalk = 2 μm. Beeldserie voxel resolutie is 97,6x97,6x500 nm. De resolutie van de pixel is 24,4x24,4 nm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: Segmentatie en 3D volumeweergave van vaten in het gigantische danio (Devario malabaricus) compacte hart. (A) Tweedimensionale micrograaf in een beeldstapel, met het profiel van een centraal venulair vat (pijl) en een endotheelkern (pijlpunt), met omringende hart myocyten rijk aan mitochondriën en goed georganiseerde sarcomen (*). (B) Tweedimensionale micrograaf van de beeldstapel met een capillair vat (pijl). (C) Biorthogonale projecties van de micrograafstapel met het capillair in paneel B geprojecteerd door één orthogonale schijf. (D) 3D-weergave van gesegmenteerde endotheelcellen langs het gereconstrueerde vat. Geïllustreerd in groen, rood, blauw en paars zijn vier afzonderlijke endotheelcellen; de in blauw afgebeelde endotheelcel is te zien in dwarsdoorsnede in paneel B (pijl), terwijl de endotheelcellen in rood (pijl) en groen (pijlpunt) in dwarsdoorsnede in paneel A worden gezien. Panelen A & B schaalbalk = 2 μm. Het gereconstrueerde beeldblok is 30x30 μm in de x & y as en 16 μm in de z-as met een voxel resolutie van 14,6x14,6x100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 10
Figuur 10: Beeldvormingscomplicaties en artefacten. (A) De golvende en vervormde aard van dit beeld is het resultaat van beeldvorming met behulp van een te lange pixeltijd. Dit verwarmt het harsblok, waardoor het blok gezicht zacht en rubberachtig, wat resulteert in een vervormd beeld bij het snijden. (B) Deze afbeelding bevat een groot aantal artefacten. Het sterretje geeft een golvende vervorming aan die wordt veroorzaakt door eerdere beeldvorming bij een hogere vergroting en vergelijkbaar met paneel A, waardoor de straal wordt geconcentreerd op een kleiner gebied met een langere pixel verblijftijd heeft de hars in dit interessegebied verzacht. Hoewel het verzamelde beeld met een hogere vergroting vrij was van artefacten, kan dit leiden tot een volgende reeks afbeeldingen waarbij het monster dat ten grondslag ligt aan het interessegebied vervormd lijkt. Dit paneel illustreert ook het probleem van de ophoping van puin op het blokvlak (pijl) tijdens de beeldvorming, ook aangegeven door de pijl in paneel E. Als dit een hardnekkig beeldvormingsprobleem wordt, moet het vacuüm worden gebroken, de kamer worden geopend en puin dat zich op het diamantmes en rond het monster heeft opgehoopt, wegblazen. Kleine ontladingen van elektronen uit het blokvlak kunnen leiden tot de snelle contrastveranderingen en lijnen die door de witte pijlpunt worden aangeduid. (C) Deze afbeelding illustreert mes krassen op het blok gezicht. Dit kan gebeuren als gevolg van een beschadigd mes of ophoping van vuil aan de rand van het mes. (D) Het aangegeven artefact (pijl) is het resultaat van de elektronenbundel die gedurende een langere periode op (zonder doorsnede) het blokvlak is gericht, waarbij het monster zich nog in de beeldkamer bevindt. (E) Onjuiste fixatie van weefsel kan leiden tot scheiding van cellulaire structuren en bindweefsel (*). (F) Als er een grote hoeveelheid opladen optreedt in uw weefsel of harsblok, kan daaropvolgende accumulatie en ontlading optreden, wat leidt tot het "overslaan" van het beeld zoals op deze afbeelding te zien is. Let op de vervorming van het weefsel in de afbeelding op deze overgeslagen punten (pijlen). Paneel A schaalbalk = 1 μm. Paneel B schaalbalk = 2 μm. Paneel C schaalbalk = 5 μm. Paneel D schaalbalk = 2 μm. Paneel E schaalbalk = 25 um. Paneel F schaalbalk = 50 um. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 11
Figuur 11: Beeldvormingsweefsel bij 3 kV met behulp van verschillende pixel dwell-tijden en straalintensiteiten. Alle beelden werden verzameld met behulp van een 3 kV-straal, de straalintensiteit is op een apparaatspecifieke schaal variërend van 1 tot 20. Het afgebeelde veld is van het vasculaire lumen dat witte en rode bloedcellen bevat. Bij deze lage kV is het moeilijk om cellulaire details te waarderen. Het verhogen van de pixel dwell-tijd had weinig effect. Verhoging van de straalintensiteit tot 6 verbeterd beeldcontrast. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 12
Figuur 12: Beeldvormingsweefsel bij 7 kV met behulp van verschillende pixel dwell-tijden en straalintensiteiten. Alle beelden zijn verzameld met behulp van een 7 kV-straal, de straalintensiteit is op een apparaatspecifieke schaal variërend van 1 tot 20. Het afgebeelde veld is van het vasculaire lumen dat witte en rode bloedcellen bevat. Met 7 kV droegen de toenemende intensiteit van de straal en de verblijftijd van de pixel bij aan beeldvorming van hogere kwaliteit. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 13
Figuur 13: Beeldvormingsweefsel bij 12 kV met behulp van verschillende pixel dwell-tijden en straalintensiteiten. Alle beelden zijn verzameld met behulp van een 12 kV-straal, de straalintensiteit is op een apparaatspecifieke schaal variërend van 1 tot 20. Het afgebeelde veld is van het vasculaire lumen dat witte en rode bloedcellen bevat. Bij 12 kV wordt de beeldvorming geoptimaliseerd door de pixel dwell-tijd en straalintensiteit aan te passen. Opladen is verminderd / afwezig bij kortere pixel dwell-tijden, terwijl cellulaire details en beeldcontrast het beste zijn met een langere pixel dwell-tijd en een hogere straalintensiteit. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het doel van dit methodedocument is om de weefselvoorbereidings- en beeldvormingsmethodologie te benadrukken die ons lab in staat heeft gesteld om op betrouwbare wijze seriële elektronenmicroscopiebeelden met hoge resolutie vast te leggen, en om te wijzen op kritieke stappen die tot dit resultaat leiden, evenals mogelijke valkuilen die kunnen optreden bij het uitvoeren van SBF-SEM-beeldvorming. Succes met behulp van dit protocol vereist een goede fixatie van weefsel, impregnatie van zware metalen in het monster, wijzigingen van de inbeddingshars om het opladen te verminderen, evenals inzicht in de microscoop- en beeldvormingsinstellingen die worden gebruikt om afbeeldingen te verzamelen. De stelregel, "quality in, quality out" is een geschikt axioma voor SBF-SEM imaging. Omdat het doel van SBF-SEM vaak de waardering of kwantificering van ultrastructurele details is, moet extra zorg worden besteed aan fixatiestrategie om ervoor te zorgen dat weefselvervorming niet optreedt. Als weefsel op enig moment in de voorbereiding van monsters vervormd raakt (d.w.z. zwelling, krimp of verstoring van cellulaire morfologie ondergaat), zullen weefselreconstructie en kwantificering geen nauwkeurige gegevens opleveren. Bovendien kan het gebruik van onjuiste beeldvormingsinstellingen leiden tot verlies van gegevens die niet kunnen worden heroverd, omdat SBF-SEM-beeldvorming een destructief proces is. Bovendien moet voorzichtig worden gebruikt bij het laden van een weefselmonster, omdat het delicate diamantmes kan worden beschadigd door een overhaaste of onjuiste monstervoorbereiding. Dit kan resulteren in spaanders of breuken in het mes, waardoor zichtbare krassen in afbeeldingen kunnen achterblaten (figuur 10C). Het diamantmes kan ook worden beschadigd door verkalkte structuren, harde korrels of per ongeluk ingebed glas (bijv. van reagensamputaties).

Terwijl de meerderheid van de SBF-SEM literatuur tot nu toe gebruik maakt van bundelversnellingsspanningen in het bereik van 1 tot 3 kV naast pixel verblijftijden dichter bij 1-5 μs/px (Figuur 11)45,46,47,48,49, maakt het huidige protocol gebruik van versnellingsspanningen van 7-12 kV en een pixel dwell-tijd van 12 μs/px voor seriële beeldvorming en 32 μs/px voor imaging-gebieden van belang (Figuren 12 & 13). Deze instellingen, in combinatie met een plakdikte van 100-200 nm, maken een hoogwaardige en hoge resolutie beeldvorming van een breed scala aan biologisch weefsel mogelijk. Verhoogde versnellingsspanning zorgt voor een toename van contrast, resolutie en signaal-ruisverhouding. Een langere verblijftijd verhoogt de resolutie en de signaal-ruisverhouding verder, terwijl een grotere plakdikte leidt tot minder opladen op het blokoppervlak tijdens het doorsnijden en door straal veroorzaakte schade in volgende beelden bestrijdt14. Hoewel deze beeldvormingsmethode kan verschillen van conventie, spreken de geproduceerde afbeeldingen en gegevenssets voor zich. Als we moesten speculeren over de reden voor dit succes, is het mogelijk dat het een gevolg is van onze unieke combinatie van hoge kV-waarden, langere pixel-verblijftijden en blokvoorbereiding. Het verhogen van de beeldvorming kV resulteert in een verhoogd interactievolume tussen de elektronenbundel en het monster. Dit interactievolume is zowel dieper als breder, wat resulteert in een theoretische toename van het aantal gedetecteerde elektronen dat afkomstig is van dieper in het monsterblok, of van een bredere doorsnede van weefsel naarmate de druppel ter grootte van een vlek in diameter toeneemt. Omdat SBF-SEM geïnteresseerd is in de oppervlaktedetails van het blok, resulteert dit in een theoretische afname van de signaal-ruisverhouding. De toename van kV duwt elektronen echter ook dieper in het monster waar ze minder snel uit het blok ontsnappen en bijdragen aan de elektronen die door de detector worden verzameld. Met het extra voordeel van een verhoogd signaal via langere pixelbezettingstijden en een hogere bundelintensiteit, is het mogelijk dat deze beeldvormingsmethode resulteert in een grotere toename van het signaal van het monsteroppervlak in relatie tot ruis afkomstig binnen het interactievolume. Bovendien helpt de verhoogde monstergeleiding die wordt geïntroduceerd met koolstofzwarte en zilveren en gouden coating om de ladingsopbouw te verbeteren, die nu dieper in het blok en verder van het blokvlak plaatsvindt. inderdaad Figuur 11, Figuur 12, Figuur 13 tonen aan dat naarmate kV wordt verhoogd, het opladen van monsters begint af te nemen omdat het mogelijk dieper in het blok wordt geduwd. Monsters die bij een lage vergroting zijn afgebeeld, kunnen met voldoende contrast worden vastgelegd met behulp van de conventionele instellingen, maar deze afbeeldingen missen vaak details bij een nauwgezette inspectie. Onze gegevens laten duidelijk zien dat bij het gebruik van relatief hoge vergroting waarbij het doel cellulaire details is, het verhogen van de conventionele instellingen uitzonderlijke resultaten kan opleveren. Het artikel van P. Goggin uit 2020, et al, biedt een nuttige tabel met het effect van het wijzigen van beeldinstellingen op de uiteindelijke beeldkwaliteit, en is een nuttige referentie om te raadplegen als het optimaliseren van het protocol voor nieuwe weefsels noodzakelijk wordt14. De in dit protocol aanbevolen plakdikte van 100-200 nm heeft als bijkomend voordeel dat het verzamelen van grote SBF-SEM-datasets in een snel tempo mogelijk is. Tijdens het verzamelen van afbeeldingen bij bijvoorbeeld 12μs/px vereist beeldvorming door een diepte van 100 μm bij 2048x2048 px ~ 14 uur tijdens het doorsnijden bij 100nm / sectie, maar zou ~ 56 uur nodig hebben als het wordt doorsneden bij 25nm / sectie. Hoewel de x-y-resolutie ongewijzigd blijft als gevolg van de dikte van de sectie, waarbij geen rekening wordt gehouden met de toegevoegde mogelijkheid om afbeeldingen te maken met hogere kV-waarden en pixel dwell-tijden die bij grotere secties worden geleverd, is het belangrijk op te merken dat de resolutie langs de z-as eronder lijdt. Het verlies van z-resolutie is een belangrijke overweging en moet worden overwogen bij het bepalen hoe weefsel moet worden georiënteerd in het harsblok en in relatie tot het beeldvlak, en kan de studie van kleinere celkenmerken of interacties uitsluiten (bijv. synaptische invaginaties of intracellulaire kenmerken op de schaal van tientallen nanometers). Naast de snelle beeldvormingstijd heeft dit protocol echter extra voordelen omdat het snel ideale datasets produceert voor stereologische analyse en de studie van zeldzame biologische gebeurtenissen of cellen. Grotere sectiedikte kan ook helpen bij handmatige 3D-reconstructie, omdat een gebied van 100 μm met een doorsnede van 100 nm/sectie handmatige segmentatie van 1.000 afbeeldingen vereist, terwijl dezelfde regio met een doorsnede van 25 nm/sectie handmatige segmentatie van 4.000 afbeeldingen vereist.

SBF-SEM heeft als voordeel dat het in relatief korte tijd grote datasets genereert. Hoewel gegevensanalyse kan worden uitgevoerd met behulp van kwantitatieve methoden zoals stereologie, die hieronder zullen worden besproken, kan het vaak informatief zijn om 3D-reconstructies te maken via beeldsegmentatie. Een afbeeldingsstack die is gemaakt met SBF-SEM kan worden beschouwd als een verzameling voxels, terwijl segmentatie het proces is van het toewijzen van deze voxels aan door de gebruiker gedefinieerde objecten, waardoor 3D-representaties van weefselstructuren worden gemaakt. Deze reconstructies bieden vaak een tot nu toe ongezien perspectief op weefsel ultrastructuur en cel-cel interactie (Figuur 5, Figuur 6, Figuur 7, Figuur 8, Figuur 9). Bovendien is het na de reconstructie mogelijk om gegevens die inherent zijn aan de reconstructies te gebruiken om een schat aan informatie uit gesegmenteerd weefsel te extraheren. Parameters variërend van oppervlakte, volume, lengte en afstand, evenals hoekgegevens zijn allemaal direct beschikbaar zodra een reconstructie is gemaakt50,51. Hoewel dit ongelooflijk nuttig kan zijn, vooral in combinatie met video's en afbeeldingen uit gereconstrueerde datasets, is de tijd die nodig is voor handmatige segmentatie een belangrijke overweging bij het extrapoleren van gegevens uit SBF-SEM-datasets. Er zijn momenteel een groot aantal gratis en in te koop verkrijgbare software beschikbaar voor de handmatige en semi-handmatige segmentatie van SBF-SEM-afbeeldingsstacks. Een gratis optie voor reconstructiesoftware is het beeldverwerkingspakket Fiji voor ImageJ, een open source beeldverwerkingsprogramma, dat een segmentatie-editorplug-in bevat die handmatige segmentatie52,53mogelijk maakt. Bovendien biedt de software Reconstruct een alternatieve gratis segmentatieoptie54 (figuur 8). Hoewel mogelijk dure, koopbare opties bevatten vaak robuustere functiesets, zoals semi-geautomatiseerde segmentatieprocessen of suites voor het maken van films en afbeeldingen. Een dergelijke optie werd gebruikt om de reconstructies te maken die te vinden zijn in figuur 5, figuur 6, figuur 7 en figuur 9 (Details beschikbaar in tabel met materialen). Daarnaast zijn er tools beschikbaar voor het maken, analyseren en renderen van contrastgebaseerde 3D-reconstructies met behulp van virtual reality met het potentieel om het wederopbouwproces aanzienlijk te versnellen20,55. Hoewel niet altijd beschikbaar voor alle toepassingen, zijn er tal van softwaretools beschikbaar voor computerondersteunde handmatige segmentatie die de tijd die nodig is voor segmentatie56,57,58aanzienlijk kunnen verkorten . Ongeacht de gebruikte software, moeten aanzienlijke voorgedachten en inzicht in de vraag die wordt beantwoord, of kenniskloof die moet worden opgevuld, door seriële reconstructies voorafgaan aan segmentatie, omdat het proces moeizaam en tijdsintensief is.

De productie van 3D-reconstructies komt met zijn eigen overwegingen. Met grotere datasets kan verwerkingskracht een beperkende factor zijn, en dus kan het optimaliseren van het gebruik van systeembronnen van cruciaal belang zijn voor het onderhouden van een productieve workflow en het versnellen van het reconstructie- en renderingproces. Bij het renderen van een 3D-reconstructie zetten de meeste software gesegmenteerde afbeeldingsstapels om in een oppervlak dat bestaat uit onderling verbonden driehoeken. Als een reconstructieproject groot of ingewikkeld is, kan het renderen van deze driehoeken veel rekenkracht vereisen. Tijdens het werken aan een 3D-reconstructie kan het nuttig zijn om het aantal driehoeken te beperken dat de reconstructiesoftware kan gebruiken om de gesegmenteerde afbeeldingen om te zetten in gereconstrueerde oppervlakken. Dit kan handig zijn voor het monitoren van de voortgang van een 3D-reconstructie tijdens het segmentatieproces. Zodra de segmentatie is voltooid, kan de driehoekslimiet worden verwijderd voordat afbeeldingen of video's van reconstructies worden weergegeven. Als alternatief, en als de reconstructiesoftware het toelaat, hebben we succes gevonden bij het monitoren van de voortgang van een reconstructie met behulp van volumeweergave in plaats van oppervlaktegeneratie. Volumeweergave, hoewel niet zo geschikt voor afbeeldingen of video's bedoeld voor publicatie of presentatie, vereist veel minder verwerkingskracht en kan als zodanig nuttig zijn bij het bieden van een soepele ervaring bij het reconstrueren en voorbereiden van afbeeldingen en video's van reconstructies. Bovendien is het het beste om bij het handmatig segmenteren van een SBF-SEM-gegevensset elk object te definiëren dat moet worden gereconstrueerd met een eigen unieke id. Als bijvoorbeeld een veld met epitheelcellen wordt gereconstrueerd, in plaats van alle epitheelcellen toe te wijzen aan een voxelgroep met de naam "epitheel", moet elke epitheelcel zijn eigen bijnaam krijgen (d.w.z. Epi1, Epi2, Epi3, enz.). Dit biedt meer vrijheid wanneer de reconstructie is voltooid, omdat elke cel kan worden opgenomen of uitgesloten van de uiteindelijke rendering, verschillende kleuren of transparanten kan worden toegewezen of afzonderlijk kan worden verwijderd of geïntroduceerd als een video wordt geproduceerd. Bovendien kunnen metrische gegevens zoals oppervlakte of volume worden verzameld van elk gereconstrueerd object in plaats van de objectgroep als geheel.

Een andere ongelooflijk krachtige tool voor het extraheren van kwantitatieve gegevens uit SBF-SEM-beeldstapels is de praktijk van stereologie. Stereologie maakt gebruik van de inherente wiskundige relaties tussen driedimensionale objecten en hun tweedimensionale representaties (d.w.z. elektronenmicrografen). SBF-SEM datasets zijn ideaal voor de toepassing van stereologie, omdat deze methode voor het extraheren van 3D-informatie uit grote datasets aanzienlijk minder tijd- en arbeidsintensief is in vergelijking met gesegmenteerde reconstructie. Stereologie bestaat over het algemeen uit het toepassen van geometrische rasters op willekeurige, uniform bemonsterde beelden en is de afgelopen 50 jaar veel gebruikt om nauwkeurige en onbevooroordeelde schattingen van cel/organelgetal, lengte, oppervlakte en volume21,59,60,61,62,63te produceren . Hoewel 3D-reconstructies indrukwekkend kunnen zijn en een nieuw perspectief op biologische weefsels bieden, is het vaak sneller, nauwkeuriger, reproduceerbaar en bevorderlijk voor grote steekproefgroottes om een stereologische benadering van gegevensextractie te gebruiken. Hoewel er veel artikelen zijn over de praktische toepassing van stereologie64,65,66, bieden een aantal leerboeken nuttige, diepgaande overzichten van de methodologie en bieden ze een aantal stereologische rasters die kunnen worden toegepast op de studie van weefsel ultrastructuur67,68,69.

SBF-SEM is een krachtige beeldvormingsmethode die de driedimensionale waardering van weefsel ultrastructuur mogelijk maakt. Hoewel de mogelijkheid om 3D-datasets met SEM-resolutie te maken voorheen onbeantwoorde vragen binnen ons bereik brengt, is een goede weefselvoorbereiding en inzicht in SBF-SEM-beeldvorming van het grootste belang voor het succes van studies die deze microscopiemethode gebruiken. Wij hopen dat de toepassing van dit protocol op toekomstige studies zal leiden tot een steeds groter inzicht in de biologische mysteries die ons omringen en ons verder zal blijven duwen in de grenzen van de menselijke kennis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgments

We willen Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown en Margaret Gondo bedanken voor hun uitstekende technische assistentie. Dit onderzoek werd deels ondersteund door National Institutes of Health (NIH) R01 EY-018239 en P30 EY007551 (National Eye Institute), deels door de Lion's Foundation for Sight, en deels door NIH 1R15 HD084262-01 (National Institute of Child Health &Human Development).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/16 x 3/8 Aluminum Rivets Industrial Rivet & Fastener Co. 6N37RFLAP/1100 Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver Wiha Quality Tools 27225
Acetone Electron Microscopy Sciences RT 10000 Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid Sigma-Aldrich A8949
Calcium Chloride FisherScientific C79-500
Conductive Silver Paint Ted Pella 16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target Denton Vacuum N/A This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors Fisher Scientific 50-949-411
Embed 812 Electron Microscopy Sciences 14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM Gatan & Tescan N/A This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) Electron Microscopy Sciences 72630-05
Gluteraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
Gorilla Super Glue - Impact Tough NA NA Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black HM Royal EC-600JD Refered to as carbon black in text.
KOH FisherScientific 18-605-593
Lead Nitrate Fisher Scientific L62-100
Microwave Pelco BioWave Pro This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 201030
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Silicone Embedding Mold Ted Pella 10504
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences 12300
Samco Transfer Pipette ThermoFisher Scientific 202 Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files Electron Microscopy Sciences 62115
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich 223220
Uranyl Acetate Polysciences, Inc. 21447-25
Reconstruction Software
Amira Software Thermo Scientific N/A Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ) ImageJ.net N/A TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB) University of Helsinki, Institute of Biotechnology N/A
Reconstuct Software Neural Systems Lab N/A
SuRVoS Workbench Diamond Light Source & The University of Nottingham N/A
SyGlass IstoVisio, Inc. N/A Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).
  2. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  3. He, Q., Hsueh, M., Zhang, G., Joy, D. C., Leapman, R. D. Biological serial block face scanning electron microscopy at improved z-resolution based on Monte Carlo model. Scientific Reports. 8 (1), 12985 (2018).
  4. Zankel, A., Wagner, J., Poelt, P. Serial sectioning methods for 3D investigations in materials science. Micron. 62, 66-78 (2014).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43 (5), 612-620 (2012).
  7. Bouwer, J. C., et al. Deceleration of probe beam by stage bias potential improves resolution of serial block-face scanning electron microscopic images. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2 (1), 11 (2017).
  8. Kizilyaprak, C., Longo, G., Daraspe, J., Humbel, B. M. Investigation of resins suitable for the preparation of biological sample for 3-D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 189 (2), 135-146 (2015).
  9. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  10. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: an ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  11. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  12. Piňos, J., Mikmeková, Š, Frank, L. About the information depth of backscattered electron imaging. Journal of Microscopy. 266 (3), 335-342 (2017).
  13. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
  14. Goggin, P., et al. Development of protocols for the first serial block-face scanning electron microscopy (SBF SEM) studies of bone tissue. Bone. 131, 115107 (2020).
  15. Deerinck, T. J., et al. High-performance serial block-face SEM of nonconductive biological samples enabled by focal gas injection-based charge compensation. Journal of Microscopy. 270 (2), 142-149 (2018).
  16. Nguyen, H. B., et al. Conductive resins improve charging and resolution of acquired images in electron microscopic volume imaging. Scientific Reports. 6, 23721 (2016).
  17. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. National Center for Microscopy and Imaging Research. 6 (8), (2010).
  18. Deerinck, T. J., et al. Enhancing Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Enable High Resolution 3-D Nanohistology of Cells and Tissues. Microscopy and Microanalysis. 16, 1138-1139 (2010).
  19. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  20. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy: A provocative technique to define 3-dimensional ultrastructure of microvascular thrombosis. Thrombosis Research. 196, 519-522 (2020).
  21. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy reveals neuronal-epithelial cell fusion in the mouse cornea. PLoS One. 14 (11), 0224434 (2019).
  22. Lafontant, P. J., et al. Cardiac Myocyte Diversity and a Fibroblast Network in the Junctional Region of the Zebrafish Heart Revealed by Transmission and Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. PLoS One. 8 (8), 72388 (2013).
  23. Hanlon, S. D., Behzad, A. R., Sakai, L. Y., Burns, A. R. Corneal stroma microfibrils. Experimental Eye Research. 132, 198-207 (2015).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  25. Davenport, A. T., Grant, K. A., Szeliga, K. T., Friedman, D. P., Daunais, J. B. Standardized method for the harvest of nonhuman primate tissue optimized for multiple modes of analyses. Cell Tissue Bank. 15 (1), 99-110 (2014).
  26. Schuster, A., et al. An isolated perfused pig heart model for the development, validation and translation of novel cardiovascular magnetic resonance techniques. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 12 (1), 53 (2010).
  27. Hanlon, S. D., Patel, N. B., Burns, A. R. Assessment of postnatal corneal development in the C57BL/6 mouse using spectral domain optical coherence tomography and microwave-assisted histology. Experimental Eye Research. 93 (4), 363-370 (2011).
  28. Longiéras, N., Sebban, M., Palmas, P., Rivaton, A., Gardette, J. L. Multiscale approach to investigate the radiochemical degradation of epoxy resins under high-energy electron-beam irradiation. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 44 (2), 865-887 (2006).
  29. Hashimoto, T., Thompson, G. E., Zhou, X., Withers, P. J. 3D imaging by serial block face scanning electron microscopy for materials science using ultramicrotomy. Ultramicroscopy. 163, 6-18 (2016).
  30. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: A novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801 (2009).
  31. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  32. Katoh, K. Microwave-Assisted Tissue Preparation for Rapid Fixation, Decalcification, Antigen Retrieval, Cryosectioning, and Immunostaining. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2016, 7076910 (2016).
  33. Login, G. R., Dvorak, A. M. A review of rapid microwave fixation technology: its expanding niche in morphologic studies. Scanning. 15 (2), 58-66 (1993).
  34. Jamur, M. C., Faraco, C. D., Lunardi, L. O., Siraganian, R. P., Oliver, C. Microwave fixation improves antigenicity of glutaraldehyde-sensitive antigens while preserving ultrastructural detail. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 307-311 (1995).
  35. Leong, A. S., Sormunen, R. T. Microwave procedures for electron microscopy and resin-embedded sections. Micron. 29 (5), 397-409 (1998).
  36. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  37. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  38. Belazi, D., Solé-Domènech, S., Johansson, B., Schalling, M., Sjövall, P. Chemical analysis of osmium tetroxide staining in adipose tissue using imaging ToF-SIMS. Histochemistry and Cell Biology. 132 (1), 105-115 (2009).
  39. Rivlin, P. K., Raymond, P. A. Use of osmium tetroxide-potassium ferricyanide in reconstructing cells from serial ultrathin sections. Journal of Neuroscience Methods. 20 (1), 23-33 (1987).
  40. Aguas, A. P. The use of osmium tetroxide-potassium ferrocyanide as an extracellular tracer in electron microscopy. Stain Technology. 57 (2), 69-73 (1982).
  41. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  42. Watson, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. II. Application of solutions containing lead and barium. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 4 (6), 727-730 (1958).
  43. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy. Scanning Microscopy in Nanotechnology. , 1-40 (2006).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Buchacker, T., et al. Assessment of the Alveolar Capillary Network in the Postnatal Mouse Lung in 3D Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Frontiers in Physiology. 10, 1357 (2019).
  46. Keeling, E., et al. 3D-Reconstructed Retinal Pigment Epithelial Cells Provide Insights into the Anatomy of the Outer Retina. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), (2020).
  47. Shang, P., et al. Chronic Alcohol Exposure Induces Aberrant Mitochondrial Morphology and Inhibits Respiratory Capacity in the Medial Prefrontal Cortex of Mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 561173 (2020).
  48. Pfeifer, C. R., et al. Quantitative analysis of mouse pancreatic islet architecture by serial block-face SEM. Journal of Structural Biology. 189 (1), 44-52 (2015).
  49. Wilke, S. A., et al. Deconstructing complexity: serial block-face electron microscopic analysis of the hippocampal mossy fiber synapse. Journal of Neuroscience. 33 (2), 507-522 (2013).
  50. Cocks, E., Taggart, M., Rind, F. C., White, K. A guide to analysis and reconstruction of serial block face scanning electron microscopy data. Journal of Microscopy. 270 (2), 217-234 (2018).
  51. Borrett, S., Hughes, L. Reporting methods for processing and analysis of data from serial block face scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 263 (1), 3-9 (2016).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  54. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, Pt 1 52-61 (2005).
  55. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality Head-mounted displays. arXiv . , arXiv:1804.08197 (2018).
  56. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  57. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  58. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198 (1), 43-53 (2017).
  59. Anderson, H. R., Stitt, A. W., Gardiner, T. A., Archer, D. B. Estimation of the surface area and volume of the retinal capillary basement membrane using the stereologic method of vertical sections. Analytical & Quantitative Cytology & Histology. 16 (4), 253-260 (1994).
  60. Gibbons, C. H., Illigens, B. M., Wang, N., Freeman, R. Quantification of sweat gland innervation: a clinical-pathologic correlation. Neurology. 72 (17), 1479-1486 (2009).
  61. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec. 292 (1), Hoboken. 113-122 (2009).
  62. Mahon, G. J., et al. Chloroquine causes lysosomal dysfunction in neural retina and RPE: implications for retinopathy. Current Eye Research. 28 (4), 277-284 (2004).
  63. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. Journal of Microscopy. 150, Pt 2 117-136 (1988).
  64. Weibel, E. R. Stereological methods in cell biology: where are we--where are we going. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (9), 1043-1052 (1981).
  65. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  66. Kristiansen, S. L., Nyengaard, J. R. Digital stereology in neuropathology. Apmis. 120 (4), 327-340 (2012).
  67. Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology. 2nd edn. , Garland Science/BIOS Scientific Publishers. (2005).
  68. Reith, A., Mayhew, T. M. Stereology and Morphometry in Electron Microscopy: Problems and Solutions. , Hemisphere Publishing Corporation. (1988).
  69. Mouton, P. R. Principles and practices of unbiased stereology: an introduction for bioscientists. , Johns Hopkins University Press. (2002).

Tags

Biologie Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM 3D-EM 3D-Reconstruction Tissue Preparation Specimen Preparation Serial Sections Ultrastructure High-resolution Volumetric Imaging Biological Large Volume
Serial Block-Face Scanning Electron Microscopie (SBF-SEM) van biologische weefselmonsters
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Courson, J. A., Landry, P. T., Do,… More

Courson, J. A., Landry, P. T., Do, T., Spehlmann, E., Lafontant, P. J., Patel, N., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples. J. Vis. Exp. (169), e62045, doi:10.3791/62045 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter