Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Seriell block-face scanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) av biologiska vävnadsprover

Published: March 26, 2021 doi: 10.3791/62045
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 3,4, 1,4
1College of Optometry, University of Houston, 2Department of Biology, DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center, Baylor College of Medicine

Summary

Detta protokoll beskriver en rutinmetod för att använda seriell block-face scanning elektronmikroskopi (SBF-SEM), en kraftfull 3D-bildteknik. Framgångsrik tillämpning av SBF-SEM beror på korrekt fixering och vävnad färgning tekniker, samt noggrant övervägande av bildinställningar. Detta protokoll innehåller praktiska överväganden för hela denna process.

Abstract

Seriell block-face scanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) möjliggör insamling av hundratals till tusentals serieregistrerade strukturella bilder, vilket ger en oöverträffad tredimensionell vy av vävnad mikroanatomi. Medan SBF-SEM har sett en exponentiell ökning av användningen under de senaste åren, tekniska aspekter såsom korrekt vävnad beredning och bildframställning parametrar är av största vikt för framgången med denna bildframställning modalitet. Detta bildsystem drar nytta av enhetens automatiserade karaktär, vilket gör att man kan lämna mikroskopet obevakat under bildprocessen, med den automatiska samlingen av hundratals bilder möjliga på en enda dag. Men utan lämplig vävnad förberedelse cellulära ultrastruktur kan ändras på ett sådant sätt att felaktiga eller vilseledande slutsatser kan dras. Dessutom genereras bilder genom att skanna block-ansiktet på ett hartsinbäddat biologiskt prov och detta innebär ofta utmaningar och överväganden som måste åtgärdas. Ackumulering av elektroner inom blocket under avbildning, känd som "vävnadsladdning", kan leda till en förlust av kontrast och en oförmåga att uppskatta cellulär struktur. Dessutom, medan ökande elektronstråleintensitet / spänning eller minskande strålskanningshastighet kan öka bildupplösningen, kan detta också ha den olyckliga bieffekten att skada hartsblocket och förvränga efterföljande bilder i bildserien. Här presenterar vi ett rutinprotokoll för beredning av biologiska vävnadsprover som bevarar cellulär ultrastruktur och minskar vävnadsladdningen. Vi tillhandahåller också bildframställning överväganden för snabb förvärv av högkvalitativa seriella bilder med minimal skada på vävnad block.

Introduction

Seriell block ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) beskrevs först av Leighton 1981 där han skapade ett scanningelektronmikroskop förstärkt med en inbyggd mikrotom som kunde skära och avbilda tunna delar av vävnad inbäddad i harts. Tyvärr begränsade tekniska begränsningar användningen till ledande prover, eftersom icke-ledande prover som biologisk vävnad ackumulerade oacceptabla laddningsnivåer (elektronuppbyggnad i vävnadsprovet)1. Medan beläggning block-face mellan nedskärningar med avdunstad kol minskad vävnad laddning, denna kraftigt ökade bildförvärvstid och bildlagring förblev ett problem eftersom datorteknik vid den tiden var otillräcklig för att hantera de stora filstorlekar som skapats av enheten. Denna metod sågs över av Denk och Horstmann 2004 med hjälp av en SBF-SEM utrustad med en variabel tryckkammare2. Detta gjorde det möjligt att föra in vattenånga i bildkammaren, vilket minskar laddningen i provet, vilket gör avbildning av icke-ledande prover livskraftiga, om än med förlust av bildupplösning. Ytterligare förbättringar av vävnadsberednings- och bildframställningsmetoder möjliggör nu avbildning med högt vakuum, och SBF-SEM-avbildning förlitar sig inte längre på vattenånga för att avledaladdning 3,4,5,6,7,8,9. Medan SBF-SEM har sett en exponentiell ökning av användningen under de senaste åren, tekniska aspekter såsom korrekt vävnad beredning och bildframställning parametrar är av största vikt för framgången med denna bildframställning modalitet.

SBF-SEM möjliggör automatiserad insamling av tusentals serieregistrerade elektronmikroskopibilder, med planupplösning så liten som 3-5 nm10,11. Vävnad, impregnerad med tungmetaller och inbäddad i harts, placeras i ett scanningelektronmikroskop (SEM) som innehåller en ultramicrotome utrustad med en diamantkniv. En plan yta skärs med diamantkniven, kniven dras tillbaka och blockets yta skannas i ett rastermönster med en elektronstråle för att skapa en bild av vävnads ultrastruktur. Blocket höjs sedan en angiven mängd (t.ex. 100 nm) i z-axeln, känd som ett "z-steg", och en ny yta skärs innan processen upprepas. På detta sätt produceras ett 3-dimensionellt (3D) block av bilder när vävnaden skärs bort. Detta bildsystem drar ytterligare nytta av enhetens automatiserade karaktär, vilket gör att man kan lämna mikroskopet obevakat under bildprocessen, med den automatiserade samlingen av hundratals bilder möjliga på en enda dag.

Medan SBF-SEM-avbildning främst använder bakåtstänkta elektroner för att bilda en bild av block-face, genereras sekundära elektroner under bildprocessen12. Sekundära elektroner kan ackumuleras, tillsammans med backscattered och primärstråleelektroner som inte flyr blocket, och producera "vävnadsladdning", vilket kan leda till ett lokaliserat elektrostatiskt fält vid block-face. Denna elektronackumulering kan förvränga bilden eller orsaka att elektroner matas ut från blocket och bidrar till signalen som samlas in av backscatterdetektorn, vilket minskar signal-till-brusförhållandet13. Medan nivån på vävnadsladdningen kan minskas genom att elektronstrålens spänning eller intensitet minskas, eller minska strålens uppehållstid, resulterar detta i ett minskat signal-till-brusförhållande14. När en elektronstråle med lägre spänning eller intensitet används, eller om strålen endast får bo inom varje pixelutrymme under en kortare tid, matas mindre bakåtstänkta elektroner ut från vävnaden och fångas upp av elektrondetektorn vilket resulterar i en svagare signal. Denk och Horstmann hanterade detta problem genom att införa vattenånga i kammaren och därigenom minska laddningen i kammaren och på blockytan på bekostnad av bildupplösningen. Med ett kammartryck på 10-100 Pa är en del av elektronstrålen utspridd vilket bidrar till bildljud och förlust av upplösning, men detta producerar också joner i provkammaren som neutraliserar laddningen inomprovblocket 2. Nyare metoder för neutralisering av laddning inom provblocket använder fokal gasinsprutning av kväve över block-ytan under avbildning, eller införande av negativ spänning till SBF-SEM-stadiet för att minska sondstråle-slevande energi och öka signalensom samlas in 6,7,15. I stället för att införa scenförskjutning, kammartryck eller lokaliserad kväveinjektion för att minska laddningsuppbyggnaden på blockytan, är det också möjligt att öka hartsens ledningsförmåga genom att införa kol i hartsblandningen vilket möjliggör mer aggressiva avbildningsinställningar16. Följande allmänna protokoll är en anpassning av Deerinck et al. protokollet som publicerades 2010 och täcker ändringar av vävnadsberednings- och bildmetoder som vi fann användbara för att minimera vävnadsladdning samtidigt som högupplöst bildförvärv3,17,18,19. Medan det tidigare nämnda protokollet fokuserade på vävnadsbearbetning och tungmetallimpregnering, ger detta protokoll insikt i arbetsflödet för avbildning, dataanalys och rekonstruktion som är inneboende i SBF-SEM-studier. I vårt laboratorium har detta protokoll framgångsrikt och reproducerbart tillämpats på en mängd olika vävnader inklusive hornhinna och främre segmentstrukturer, ögonlock, lacrimal och harderian körtel, näthinnan och optik nerv, hjärta, lunga och luftvägar, njure, lever, cremaster muskel, och hjärnbarken / medulla, och i en mängd olika arter inklusive mus, råtta, kanin, marsvin, fisk, monolayer och stratifierade cellkulturer, gris, icke-mänskliga primater, liksom mänskliga20,21,22,23. Även om små förändringar kan vara värda för specifika vävnader och applikationer, har detta allmänna protokoll visat sig vara mycket reproducerbart och användbart i samband med vår kärnavbildningsanläggning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djur hanterades enligt de riktlinjer som beskrivs i Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Vision and Ophthalmic Research och University of Houston College of Optometry animal handling guidelines. Alla djurförsök godkändes av de institutioner där de hanterades: Mus, råtta, kanin, marsvin och icke-mänskliga primatprocedurer godkändes av University of Houston Animal Care and Use Committee, zebrafiskprocedurer godkändes av DePauw University Animal Care and Use Committee, och grisprocedurer godkändes av Baylor College of Medicine Animal Care and Use Committee. All mänsklig vävnad hanterades i enlighet med Helsingforsdeklarationen om forskning om mänsklig vävnad och lämpligt godkännande från granskningsnämnden erhölls.

1. Vävnadsbehandling

  1. Förbered en stamlösning på 0,4 M natriumkaktylatbuffert genom att blanda natriumkaktofyllatpulver i ddH2O. Blanda försiktigt bufferten och pH justera lösningen till 7.3. Denna buffert används för att göra fixativ (komposition som beskrivs nedan i steg 1.3), tvättbuffert, liksom osmium- och kalium ferrocyanidlösningar.
    OBS: Perfusion fixering är ofta den bästa metoden för fixering för SBF-SEM studier, eftersom fixering sker snabbt och i hela kroppen. Om perfusionsfixering inte är möjlig i din studiedesign, hoppa till steg 1.3.
  2. Utför perfusionfixering med lämpligt fysiologiskt tryck för djurmodellen24,25,26. Detta görs via transcardial sekventiell perfusion med hepariniserad saltlösning följt av fixativ, var och en placerad på en specifik höjd (t.ex. 100 cm) ovanför organismen (lämplig för det fysiologiska trycket i kärlsystemet i djurmodellen), med fixativ som strömmar in i vänster ventrikel och lämnar ett snitt som görs i höger atrium. Vävnad av intresse blir blek när blod ersätts med fixativ, om hela eller en del av din vävnad inte blancheras så kanske vävnaden inte är lämpligt fixerad och ultrastrukturen kanske inte bevaras.
  3. Använd ett rakblad eller en vass skalpell för att trimma vävnadsprover till block som inte är större än 2 mm x 2 mm x 2 mm. Om steg 1.2 hoppades över, gör detta snabbt så att vävnad kan fördjupas så snabbt som möjligt.
    1. Alternativt dissekera vävnad under fixativ och överföra till färsk fixering för att slutföra nedsänkningsprocessen. Fixativets slutliga sammansättning består av 0,1 M natriumkaktylatbuffert som innehåller 2,5% glutaraldehyd och 2 mM kalciumklorid. Låt fixeringen fortsätta i minst 2 timmar vid rumstemperatur och högst över natten vid 4 °C. Använd om möjligt en vipp-/tiltplatta för att försiktigt omröra proverna under fixeringen.
    2. Alternativt, om en växelriktare mikrovågsugn finns tillgänglig, fixa vävnad i ovannämnda fixativ under vakuum vid 150 watt i 4 cykler av 1 minut på, 1 minut av. Mikrovågsfixering är den föredragna metoden för steg 1.3 eftersom den snabbt fixerar vävnad och bevarar vävnad ultrastruktur27.
      OBS: Vävnad får aldrig torka under detta protokoll, var försiktig så att vävnad snabbt överförs från en lösning till en annan.
  4. Tvätta fast vävnad 5x i 3 minuter vardera (15 minuter totalt) vid rumstemperatur i 0,1 M natriumkakoodylatbuffert som innehåller 2 mM kalciumklorid.
  5. Gör följande osmium ferrocyanidlösning fräsch, helst under de tidigare tvättstegen. Kombinera en 4% osmium tetroxidlösning (beredd i ddH2O) med en lika stor volym på 3% kalium ferrocyanid i 0,2 M kakodylatbuffert med 4 mM kalciumklorid. Efter föregående tvättsteg, placera vävnaden i denna lösning i 1 timme på is i mörkret och i rökhuven.
    OBS: Osmium tetroxid är en gul kristallin substans som kommer i en ampull. För att skapa osmium tetroxidlösningen, öppna ampullen, tillsätt ddH2O och ultraljudsinat i 3-4 timmar i mörkret tills kristallerna är helt upplösta. Osmium tetroxidlösning är en klar gul lösning, om lösningen är svart har osmiumet minskat och bör inte längre användas.
  6. Medan vävnaden inkuberar i osmium ferrocyanidlösningen, börja förbereda tioocarbohydrazidlösningen (TCH). Förbered denna lösning fräsch och ha den lätt tillgänglig i slutet av 1 timmes osmium ferrocyanid fixeringsperiod. Kombinera 0,1 g tioocarbohydrazid med 10 ml ddH2O och placera denna lösning i en ugn på 60 °C i 1 timme. För att säkerställa att lösningen är upplöst, snurra försiktigt var 10: e minut. Före användning, filtrera denna lösning genom ett 0,22 μm sprutfilter.
  7. Innan du inkuberar i TCH, tvätta vävnaden med rumstemperatur ddH2O 5x i 3 minuter vardera (15 minuter totalt).
  8. Placera vävnaden i den filtrerade TCH-lösningen i totalt 20 minuter vid rumstemperatur (figur 1A-C).
  9. Efter inkubation i TCH, tvätta vävnaden 5x i 3 minuter vardera (15 minuter totalt) i rumstemperatur ddH2O.
  10. Placera vävnad i ddH2O som innehåller 2% osmiumtrtroxid (inte osmium reducerat med kaliumferocyanid) i 30 minuter vid rumstemperatur. Detta bör göras i rökhuven och i mörkret eftersom osmium kan reduceras med ljus (t.ex. under aluminiumfolie) (Figur 1D-F).
  11. Efter osmium tetroxid inkubation, tvätta vävnad 5x i 3 minuter vardera (15 minuter totalt) i rumstemperatur ddH2O.
  12. Placera vävnad i 1% vattenhaltigt uranylacetat (uranylacetatpulver blandat i ddH2O) över natten i ett kylskåp vid 4 °C.
  13. Precis innan du tar bort vävnaden från kylskåpet, förbered färsk Waltons bly aspartatlösning. Börja med att lösa upp 0,066 g blynitrat i 10 ml 0,03 M asparaginsyralösning (0,04 g asparaginsyra i 10 ml destillerat vatten) och justera pH till 5,5 med 1 N KOH (0,5611 g i 10 ml destillerat vatten).
    VARNING: En fällning kan bildas vid justering av pH. Detta är inte acceptabelt.
    1. Använd en omrörstång och tillsätt långsamt 1 N KOH droppevis medan du övervakar pH. Förvärm den färdiga klar bly aspartatelösningen i en 60 °C ugn i 30 minuter. Om en fällning bildas kan lösningen inte användas och en annan lösning måste beredas.
  14. Ta ut vävnaden ur kylskåpet och tvätta 5x i 3 minuter vardera (15 minuter totalt) i rumstemperatur ddH2O.
  15. Efter tvättning, placera vävnaden i den uppvärmda Waltons bly aspartatlösning i 30 minuter samtidigt som temperaturen bibehålls vid 60 °C.
  16. Efter inkubation i Waltons bly aspartat, tvätta vävnaden 5x i 3 minuter vardera (15 minuter totalt) i rumstemperatur ddH2O (Figur 1G-I).
  17. Torka vävnaden genom en iskall acetonserie (30%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%, och 100% aceton (i ddH2O i förekommande fall) vilket tillåter 10 minuter för varje steg i serien.
  18. Efter den iskalla uttorkningsserien, placera vävnaden i rumstemperatur aceton i 10 minuter.
    1. Under denna tid formulerar du Embed 812 ACM harts. Använd receptet "hård blandning" eftersom det är mer motståndskraftigt mot strålskador. Blanda hartset noggrant och placera vävnaden i Inbäddning 812:aceton (1:3-blandning) i 4 timmar, följt av Inbäddning 812:aceton (1:1-blandning) i 8 timmar eller över natten och slutligen Bädda in 812:aceton (3:1 mix) över natten. Utför dessa hartsinfiltrationssteg vid rumstemperatur.
  19. Nästa dag placerar du vävnaden i 100% Bädda in 812 i 4-8 timmar, sedan i färska 100% Bädda in 812 över natten och slutligen i färska 100% bädda in 812 i 4 timmar. Utför dessa hartsinfiltrationssteg vid rumstemperatur.
    1. Strax före inbäddning, placera en liten mängd harts i en blandningsbehållare och blanda långsamt (en träpinne kan användas för omrörning) i kolsvart pulver tills hartset är mättat med pulvret men är fortfarande flytande och blir inte kornigt. Det ska likna tjockt bläck och kunna långsamt droppa från träpinnen utan synliga klumpar.
  20. Orientera vävnadsproverna i en silikongummiform och ta en bild så att provorienteringen i hartsblocket registreras och kan refereras. Täck proverna i kolsvart mättat harts vid silikonformens spets och placera formen i en ugn i ~ 1 timme vid 65 °C.
    1. Placera formen i en lutning för att innehålla hartset vid spetsen av formen där det täcker vävnadsprovet. Placera en etikett med en experiment-/vävnadsprovidentifierare i formen i motsatt ände av hartset (figur 2A).
  21. Ta bort silikonformen från ugnen och fyll resten av formen med klart harts (inget kolsvart) och se till att etiketten förblir synlig. Härda hartset infunderat med kolsvart nog för att inte lätt blanda med klarharts.
    1. Förbered en extra brunn i formen som inte innehåller vävnad. Börja med den extra brunnen, fyll resten av formen med klart harts.
    2. Om kolsvart infuserat harts börjar blöda in i det klara hartset, placera silikonformen tillbaka i ugnen för ytterligare tid (t.ex. 15 minuter).
    3. När alla vävnadsprover har toppats med klart harts, placera silikonformen tillbaka i ugnen (platt, ingen lutning) vid 65 °C i 48 timmar för att slutföra härdningsprocessen.

2. Blockera förberedelse

OBS: Metoden beror på hur provet är orienterat i blocket och hur sektioneringen ska ske. Den vanligaste vävnadsorienteringen finner dock vävnaden centrerad i toppen av hartsblocket, vinkelrätt mot den långa änden av hartsblocket.

  1. Trimma i de flesta fall först änden av blocket för att hitta vävnaden genom att placera provblocket i mikrotomchucken med den avsmalnande änden som sticker upp cirka 5-6 mm ur chucken. Lås den på plats med den inställda skruven och placera den under en värmelampa.
  2. Efter flera minuter kommer blocket att vara formbart och lätt att trimma. Placera chucken i stereomikroskophållaren och använd ett nytt rakblad med dubbla kanter för att göra tunna sektioner parallella med blockytan tills vävnaden är synlig. Detta ses bäst av meteljus över blockansiktet, vävnadsprovet kommer att vara mindre reflekterande och granulärt jämfört med de delar av hartset som saknar vävnad. Konsultera fotografiet som tagits av vävnadsprover innan du introducerar kolsvart mättat harts för en uppfattning om hur och var vävnaden finns.
  3. Ställ åt sidan en stifthållare för trimning. Denna stifthållare placeras aldrig i SEM-kammaren och kan därför hanteras utan handskar, detta kommer att kallas trimstiftshållaren. Varje provhållare som är avsedd att placeras i bildkammaren får aldrig vidröras utan handskar. Detta undviker att föra in fett och olja i mikroskopkammaren.
  4. Placera en aluminiumprovstift i trimstiftshållaren och dra åt den inställda skruven något med stiftets yta (plan yta) som hålls 3-4 mm ovanför stifthållaren.
  5. Gör flera djupa, korsande repor i stiftens yta för att ge en större yta för limet som används för att hålla provet på plats. Om en aluminiumstift används rekommenderas en liten platthuvudskruvmejsel i stål för detta steg (figur 2B).
  6. Placera chucken som innehåller vävnadsprovet tillbaka under värmelampan tills hartset blir mjukt och formbart och placera det sedan i chuckbehållaren under stereomikroskopet.
  7. Använda ett dubbelkantat rakblad för att trimma bort överflödigt harts från den del av hartsblocket som innehåller vävnadsprovet. I slutändan kommer storleken på vävnadsblocket som är fäst vid stiftet att vara cirka 3 mm i diameter och 2-3 mm i höjd.
    1. Tryck försiktigt rakhyveln rakt ner i hartsblocket ungefär 1-2 mm och tryck sedan försiktigt rakhyveln horisontellt in i hartsblocket på ett djup som motsvarar det tidigare snittet. Gör detta långsamt och med stor försiktighet, eftersom det är möjligt att skada eller skära bort den del av blocket som innehåller vävnadsprovet. När de två snitten möts kommer överskottshartset att separeras från blocket. Fortsätt att ta bort harts tills endast en 3 mm x 3 mm upphöjd yta återstår.
  8. Efter denna första trimning, placera blocket (fortfarande i chucken) under värmelampan i flera minuter.
  9. När hartset blir mjukt och formbart placerar du tillbaka blocket under stereomikroskopet. Använd ett nytt rakblad med dubbla kanter och skär av toppen av hartsblocket, ungefär 1 mm under den trimmade delen, med ett enda jämnt snitt. En plan yta är att föredra eftersom detta kommer att limmas på provstiftet. Var försiktig så att provet inte går förlorat, eftersom det här steget kräver viss kraft som kan överföras till den borttagna delen av blocket och få det att flyga iväg. Lägg det skurna och trimmade provet åt sidan.
  10. Placera trimstiftshållaren som innehåller den skurna aluminiumstiftet i stereomikroskopbehållaren. Applicera ett tunt lager cyanoakrylatlim på stiftet så att det helt täcker stiftet utan att bilda en synlig menisk. Plocka upp den trimmade delen av vävnadsblocket med tång och placera i på stiftet. Centrera vävnadsprovet på provstiftet. Tryck ner den och håll den i flera sekunder. Låt limmet ställas in i flera minuter.
  11. När limmet är ordentligt torrt, placera tillbaka trimstiftshållaren under stereomikroskopet. Använd en fin fil, arkivera bort överflödigt harts så att inget harts hänger över stiftet. Hartsformen ska likna det cirkulära stifthuvudet.
  12. Leta reda på vävnaden på den upphöjda delen av ditt hartsblock, sned belysning är användbar för detta. Med hjälp av en rakhyvel med dubbla kanter skall den upphöjda delen av hartset som innehåller vävnadsprovet trimmas till ett område som inte är större än 1 mm2. Om möjligt kan blockansiktet trimmas ännu mindre, vilket minskar belastningen på diamantkniven och förbättrar dess livslängd.
    1. Ta bort så mycket överflödigt harts som möjligt, vilket gör blocket något längre i en dimension. Detta görs långsamt och med försiktighet, eftersom det är möjligt för hartset som innehåller vävnadsprovet att brytas bort om för mycket kraft appliceras. Medan en rakhyvel rekommenderas, kan en fin metallfil användas för det här steget.
  13. Med en fin metallfilvinkel vinkel det överskott av harts, i området utanför den upphöjda delen som innehåller vävnadsprovet, ner mot stiftets kant (Figur 2C).
  14. Ta bort hartspartiklar och damm från det beredda provet innan du applicerar silverfärg följt av guldsputtring. Blanda silver med aceton så att det är en lättspridbar vätska, som liknar nagellack (men inte så tunn att den droppar av applikatorn) och applicera en tunn kappa på hela provblockytan. Aceton avdunstar snabbt, så det kan vara nödvändigt att lägga till ytterligare aceton när silverfärgen börjar tjockna.
    1. Låt silverfärgen torka över natten innan den lastas in i mikroskopet.
      OBS: Detta silverskikt måste vara tunt för att undvika att blockeras över 1 mm x 1 mm, och även om silverfärgen aldrig har skadat diamantkniven rekommenderas fortfarande mindre blockytor för att bevara diamantknivens livslängd. Acetonen som blandas med silvret måste avdunsta helt innan provet sputtrar eller lastas i mikroskopet för att undvika att acetonånga förs in i bildkammaren.
    2. Efter applicering av silverfärg, applicera ett tunt lager guld på provblocket. Med hjälp av en standard vakuumsputtringsanordning utrustad med ett standardmål för guldfolie resulterar ett kammartryck på 200 milliTorr (Argon-gas) och 40 milliamps som körs i 2 minuter i en 20 nm tjock guldbeläggning.
  15. Efter beläggningen placerar du det monterade och trimmade blocket i ett rör med lämplig experimentetikett fastsatt. Skapa anpassade rör med engångsöverföringspipetter.
    1. Skär överföringspipetten precis under glödlampan och lämna en kort del av överföringspipettröret fäst under glödlampans ände. Förkorta den rörformiga delen som skars bort och skär tillbaka pipettspetsen tillräckligt så att aluminiumprovstiftet kan skjutas gosigt inuti den.
    2. Placera änden som innehåller aluminiumprovstiftet i den glödlampor änden av den modifierade överföringspipetten.
  16. Innan du laddar ett förberett vävnadsblock, trimma försiktigt bort överflödig silverfärg från blockytan.

3. SEM-inställningar för avbildning av blockytan

OBS: De bildinställningar som följer har producerats på den enhet som används av författarna, som anges i den angivna materialförteckningen. Medan denna enhet kan variabel tryckavbildning, fångades bästa resultat under högt vakuum.

  1. Uppehållstid: Använd 12 μs/px under seriell sektionering. När en intresseregion har identifierats kan en bild med högre upplösning förvärvas vid 32 μs/px.
  2. Vakuuminställningar: Använd ett kanontryck på 9e-008 Pa, ett spalttryck på 1,1e-004 Pa och ett kammartryck på 9,5e-002 Pa.
  3. Fångsttid: Med ovanstående inställningar kan du ta en 2048x2048 px bildstack med en hastighet av 50 sekunder per bild. Bilder med högre upplösning av intresseområden kan fångas på 4096x4096 px på knappt 9 minuter per bild.
  4. Sektionstjocklek: Använd 100-200 nm. Mindre är möjligt, men kan kräva lägre strålspänning, intensitet eller uppehållstid.
  5. Högspänning (HV): Använd 7-12 kV. Samtidigt som spänningen ökar minskar spotstorleken och ökar upplösningen, inför den större möjlighet till strålskador. Högre kV ökar strålpenetrationen vilket resulterar i förlust av detaljer. Om kV sänks bryts dock signal-till-brusförhållandet ned(bild 3)14.
  6. Strålintensitet (BI): Författarens SBF-SEM-enhet erbjuder en strålintensitetsskala från 1-20. På denna skala ger värden på 5-7 kvalitetsbilder utan överdriven laddning och strålskador. Ju högre BI desto större upplösning finns det dock större risk för laddning och balkskador14.
  7. Platsstorlek och bildförstoring: Bestäm dekorstorleken med strålintensiteten och spänningsnivån. Helst bör dekorstorleken inte vara större än den pixelstorlek som används. Pixelstorleken bestäms genom att dividera synfältet (FOV) med antalet pixlar. Till exempel skulle en 25 μm FOV med en bildstorlek på 2048x2048 px ge 12,2 nm per pixel. Därför bör spotstorleken inte vara större än 12,2 nm. Bild 4 visar hur HV, BI och spotstorlek är relaterade.
  8. Arbetsavstånd (WD) - Med block face imaging är arbetsavståndet inte justerbart. Det är helt enkelt en fokusfaktor. Det kommer att vara nästan identiskt för alla block som avbildas. Även om arbetsavståndet inte är justerbart spelar det en avgörande roll i upplösningen av den bild som tagits. När arbetsavståndet minskar ökar upplösningsgränsen för bilder som tagits. I vissa fall kan det vara möjligt att minska arbetsavståndet genom att göra ändringar i bildkammaren, men dessa ändringar måste göras efter användarens gottfinnande. För att minska arbetsavståndet och öka bildupplösningen lossade vi dörrfästets mikrotomskruvar och omplacerade mikrotomen så att den vilade ~2 mm närmare balkdetektorn efter att skruvarna åtstätts.
  9. Upplösning - Med ovanstående inställningar är x & y upplösning så hög som 3,8 nm möjligt. Det är viktigt att notera att upplösningen begränsas av strålpunktsstorlek samt pixelupplösningen på bildbilderna (t.ex. ett 20 μm-synfält fångat i en pixelbild på 2048x2048 har en pixelupplösning på 9,8 nm, även om en 3,8 nm dekorstorlek användes). Bildupplösning i z-planet är beroende av sektioneringstjocklek, vi tycker att 100-200 nm fungerar bra med detta protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mus Hornhinna
Detta protokoll har tillämpats i stor utsträckning på mus hornhinnan. Med hjälp av SBF-SEM imaging visade sig ett nätverk av elastin-fria mikrofibril buntar (EFMBs) vara närvarande inom den vuxna mus hornhinnan. Man trodde tidigare att detta nätverk endast var närvarande under embryonal och tidig postnatal utveckling. SBF-SEM visade ett omfattande EFMB-nätverk i hela hornhinnan, med enskilda fibrer som visade sig vara 100-200 nm i diameter när de mättes i tvärsnitt. Det konstaterades också att detta EFMB-nätverk organiserades i distinkta lager, med fibrer som är nära förknippade med keratocyter, även liggande i grunda invaginationer på keratocytytan (Figur 5). Upptäckten av EFMB-fibrer i den vuxna hornhinnan ledde till immunogold-märkning transmission elektronmikroskopi (TEM), fluorescens och konfokala studier för att ytterligare förstå arten av detta nätverk23.

Ytterligare tillämpning av detta protokoll ledde till upptäckten av en tidigare okänd population av centrala hornhinnans nerver som smälter samman med basala epitelceller vid den stromal-epitelial gränsen (Figur 6). Tidigare trodde man att alla nerver interagerar med epitel vid denna gräns trängde in i hornhinnans epitel och ramifierade producerar subbasal och epitel plexi. I denna studie genomgick ~ 45% av centrala nerver som interagerar med det basala epitel cellcellsfusionen snarare än enkel penetration. Med hjälp av stereologiska metoder som tillämpas på SBF-SEM-datauppsättningar var det möjligt att visa att denna nya nervpopulation hade ett yt-till-volymförhållande ungefär hälften av det penetrerande nerverna, förenligt med deras "svullna" utseende (Nerve Fusion - 3.32±0.25, Nervpenetration - 1.39±0.14, s. ≤ 0.05). 3D-rekonstruktioner av genomträngande och smälta nerv buntar och deras mitokondrier skapades, belyser bristen på mitokondrier i smälta delar av nerv buntar. Upptäckten av neuronal-epitelial cell fusion med SBF-SEM ledde till fluorescens studier verifiera membran kontinuitet mellan de två smälta cellerna21.

Den centrala hornhinnan är en avaskulär vävnad, och som sådan är perifera limbal vaskulatur av särskild betydelse för hornhinnans allmänna hälsa. Cellcellsrelationerna och ultrastrukturen i denna region är komplexa. Förmågan att uppskatta dessa cell-cell interaktioner och strukturella anslutningar har dock begränsats i fluorescens och en sektion TEM studier. Av denna anledning segmenterades en SBF-SEM bildstapel som innehåller limbal vaskulatur, nerv buntar och associerade celler manuellt för 3D återuppbyggnad (Figur 7). I denna bild kan den nära associeringen mellan vaskulär endotel korsningar och en överlägg pericyte, de enskilda granulerna i en perivaskulär mastcell, kärnan och framkanten av en neutrophil krypa längs blodkärl väggens yttre yta, liksom en passerande nerv bunt ses.

Sammantaget visar detta arbete förmågan hos detta protokoll att producera högkvalitativa 3D elektronmikroskopi datauppsättningar i vävnader rik på extracellulär matris och epitel, liksom vaskulatur och tillhörande celler.

Högre ordning Primat Näthinna - Nerv Plexus och Vaskulär Nätverk
Retinal nerv fiberskiktet (RNFL) av högre ordning primater innehåller och beror på ett omfattande vaskulär nätverk. Ofta innebär sjukdomar i näthinnan förändringar i båda parametrarna i näthinnans nervfiberskikt samt vaskulaturen som finns i den. Att förstå förhållandet mellan RNFL och dess kärlnätverk i friska, icke-patologiska vävnad är det första steget för att förstå eventuella förändringar som kan uppstå till följd av sjukdom. För att bättre förstå detta förhållande tillämpades SBF-SEM protokollet på normala högre ordning primat näthinnan och återuppbyggnaden av vaskulär nätverket utfördes och volymetriska data extraheras från denna återuppbyggnad (figur 8). Denna 4 642 307 μm3-region i RNFL innehöll en kärlbädd 1,207x10-4 μL i volym, vilket utgör 2,6% av RNFL: s totala volym. Detta arbete visar förmågan hos detta protokoll att producera högkvalitativa 3D elektronmikroskopi data uppsättningar i tät neurologisk vävnad.

Zebrafisk och jätte Danio Hjärta - Strimmiga muskler och utveckla vaskulatur
Både zebrafisken och jätte danio är viktiga modeller för hjärtutveckling och regenerering. Historiskt anses zebrafiskhjärtat bestå av två anatomiskt distinkta hjärtmuskelsegment som fungerar tillsammans till stöd för zebrafiskens fysiologiska krav. Gränssnittet mellan dessa två ventrikulära lager var dock inte väl förstått. Med hjälp av detta protokoll upptäcktes en tidigare okänd junctional region bestående av ett tunt ark av fibroblaster. Det konstaterades att öppningar inom detta ark tillät två separata kortdier att komma i kontakt och bilda komplexa vidhäftningskorsningar inklusive desmosomes och fasciavidhäftningar 22.

Detta protokoll har använts i det fortsatta arbetet med att undersöka det kärlnätverk som finns i det växande jätte daniohjärtat (Figur 9). Denna metod möjliggör 3D-uppskattning av det utvecklande hjärt myocyt nätverket och dess samband med att utveckla mikrovaskulatur. Sammantaget visar detta arbete förmågan hos detta protokoll att producera högkvalitativa 3D elektronmikroskopi data uppsättningar i muskler och mycket vascularized vävnader.

Bildinställningar, laddning och upplösning
Även om lämplig fixering och tungmetallfärgning är nödvändig för SBF-SEM-avbildning av hög kvalitet, är lika viktigt att använda ledande harts och korrekta avbildningsinställningar för de frågor som tas upp. I detta protokoll används användningen av kolsvart för att öka provblockets ledningsförmåga och ge en ledning till monteringsstiftet för clearance av sekundära elektroner från block-face. Detta har visat sig vara effektivt för att bekämpa vävnadsladdning som ofta försämrar bildkvaliteten i vävnader som inte är beredda med kolsvart16. Dessutom ger silverfärgen och guldsputtningen som appliceras på blocket en avledningsväg för elektronuppbyggnad. Vissa enheter möjliggör tillsats av en brännladdningskompensator, vilket minskar laddningen genom att applicera en kvävepuff över blockansiktet, men vi har haft liknande framgång med användning av kolsvart och applicering av silverfärg och guldputtning på blocket15. Brist på provledningsförmåga kan leda till elektronuppbyggnad synlig som vävnadsladdning (figur 1), liksom utsläpp som är synliga som abrupt bildförskjutning och förskjutning som dramatiskt minskar bildkvaliteten (Figur 10B & F). Användningen av kimsvart möjliggör avbildning under högvakuum och användning av bildinställningar som resulterar i högt signal-till-brusförhållande och förbättrad bildupplösning. En sådan inställning som leder till förbättrad bildkvalitet är pixel uppehållstid. SBF-SEM-avbildningsprocessen innebär rasterskanning av en elektronstråle över provytan för att generera backscattered elektroner som mikroskopdetektorn kan samla in och tolka som signal. Hur länge denna stråle får uppehålla sig inom utrymmet för varje pixel leder till att ett mer exakt pixelvärde tilldelas varje pixelplats (bild 3A & B)2. Det finns dock en balans mellan ökad signal-till-brus, upplösning och skada som delas ut på block-face. Strålen bestrålar effektivt blockansiktet med högenergielektroner som kan brytas ner och mjuka upp harts vilket resulterar i bildnedbrytning och skärkomplikationer (figur 10)28. Desto tunnare krävs z-upplösning, desto svårare blir det att upprätthålla högupplöst bildbehandling. Vi använder i allmänhet z-steg på 100-200 nm, men z-stegstorlekar på 25-50 nm harrapporterats 5,29,30,31. Med z-steg av denna storlek kan nedbrytning och mjukning av harts på grund av strålskador leda till antingen kompression av hartset vilket gör att kniven missar ett snitt eller skär blockytan men med "prat" där kniven hoppar över blockytan och skapar krusningar och band13. Även om små z-steg är en attraktiv utsikt, är det viktigt att hålla den specifika forskningsfrågan i åtanke när du väljer ett lämpligt z-steg. Överprovtagning kan leda till betydande överväganden om datalagring samt en ökning av den tid som krävs för att producera 3D-rekonstruktioner.

Vävnadsfixering och färgning
Före inkubation av tungmetaller måste vävnader fixeras i glutaraldehyd. Medan vi starkt rekommenderar mikrovågsfixering under vakuum för bevarande av vävnad ultrastruktur27, om en laboratoriekvalitet mikrovågsugn inte finns tillgänglig kan en kommersiell växelriktar mikrovågsugn med variabelt wattal ersättas32,33,34,35. Om detta görs bör extra försiktighet användas för att säkerställa att vävnadsförvrängning inte uppstår. Felaktig vävnadsfixering kan leda till förändrad vävnadsmorfologi, vilket kan ses i figur 10E. Detta protokoll, som de flesta moderna SBF-SEM färgningsprotokoll, har anpassats från färgningsproceduren som beskrivs av Deerinck 201017, baserat på osmium-thiocarbohydrazide-osmium fläckar skapade av Willingham och Rutherford 198436. De tungmetaller som används i detta protokoll ger kontrast till cellulära strukturer inom ett vävnadsprov (figur 1). Den första osmiuminkubationen sker med reducerat osmium som binder till C=C-bindningar i omättade fetter som leder till membran- och lipidfärgning37,38. Osmium reduceras av kalium ferrocyanid, vilket hjälper till vid färgning av mättade lipider och verkar också för att stabilisera fosfolipider39,40. Thiocarbohydrazid tillsätts därefter som en mordent som binder till osmiumet från den första inkubationen, som fungerar som en bro där ytterligare osmium är bundet i ett senare skede av protokollet41. Uranylacetat, som är ett uransalt, är ett effektivt kontrasterande medel för lipider, nukleinsyror och proteiner, medan blycitrat ökar kontrasten mellan proteiner och glykogener. De varierande affiniteterna hos dessa medel för cellulära komponenter förbättrar ytterligare den övergripande kontrasten inom vävnader utöver osmiuminkubationerna42.

Avbildning av block-face
Figur 11, Figur 12, Figur 13 illustrerar de kombinerade effekterna av spänning, pixeluppbringstid och strålintensitet. Konventionell praxis tyder på att en kombination av låg spänning, kort uppehållstid och låg strålintensitet är nödvändiga för optimal avbildning och förhindrar strålskador på provblocket. I motsats till dessa inställningar visar figur 11, figur 12, figur 13 att högre spänningar (t.ex. 7 kV), längre uppehållstider (32 μs/px) och högre strålintensiteter (inställning 6 i vårt fall) kan ge överlägsen bildkvalitet jämfört med konventionella inställningar.

SBF-SEM möjliggör insamling av seriella elektronmikroskopibilder som kan samlas in som en 3D-datauppsättning bestående av voxels. Även om detta är en otroligt kraftfull användning av SBF-SEM, möjliggör denna metod också snabb och repeterbar avbildning av sällsynta biologiska händelser eller celler. Bildförvärv med SBF-SEM kan övervakas för sällsynta händelser och avbildningen pausas för att samla in bilder med högre förstoring/upplösning av dessa händelser. Dessutom kan blocket avlägsnas från mikroskopkammaren och block-face sektioneras för överföringselektronmikroskopi (TEM) avbildning. På så sätt kan stora datamängder av sällsynta händelser samlas in med SBF-SEM samt uppskattas på angstromskalan med hjälp av TEM.

Figure 1
Figur 1: Jämförelser mellan SBF-SEM och TEM i olika steg i protokollet. Detta protokoll innehåller flera steg där provvävnad är fläckad med tungmetaller. Detta påverkar inte bara vävnadskontrast och uppskattning av cellulära strukturer och organeller, utan också de laddningsnivåer som uppstår när vävnaden avbildas. Denna siffra innehåller tre distinkta vyer av beredd vävnad: en låg förstoringsvy (A, D & G), en hög förstoringsvy (B, E & H) och en TEM-jämförelse av beredd musmajonhinnan (C, F & I). Det kan noteras att högre förstoringsbilder kan resultera i ökad vävnadsladdning, eftersom elektronstrålen är koncentrerad till en mindre region av vävnad. Den översta raden (A-C) är ett representativt prov från vävnad som bearbetas genom slutförandet av steg 1,8 och har impregnerats med kalium ferrocyanid, osmium tetroxid och tiookarbohydrazid. Pilarna i de två första kolumnerna visar det epitelial-stromala gränssnittet som referenspunkt. Notera den låga kontrastnivån i jämförelse med de två nedre raderna, liksom de ökade nivåerna av vävnadsladdning. Provet på den mellersta raden (D-F) bearbetades genom slutförandet av steg 1.10 och drar nytta av ytterligare ett osmium tetroxidsteg och är synligt mer kontrasterat än provet på den översta raden. Medan cellulära strukturer kan urskiljas, är laddning fortfarande närvarande. Provet på den nedre raden (G-I) drar nytta av hela färgningsprotokollet och har minimal vävnadsladdning. TEM imaging avslöjar vävnad kontrast nivåer förmedlas av tungmetaller som finns vid varje steg (höger kolumn): organeller i hornhinnans endotel (*) är mer kontrasterade och uppenbara som vävnad bearbetning fortsätter genom protokollet. Dessutom blir stromal kollagen och fibrillin detaljer mer synliga (pilspets) när protokollet är klart. Panel A, D & G skalstång = 50 μm. Panel B, E & H skalstång = 10 μm. Panel C, F & I skalstång = 1 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2:Schematisk för inbäddat vävnadsblock, provstift och slutligberedning. (A) Vävnaden ska placeras i en känd orientering vid hartsformens spets och den övre tredjedelen av formen fylld med kolsvart mättat harts. Den region av formen längst bort från vävnaden bör förbli tydlig så att experimentetiketten tydligt kan ses. B)Provstiftets yta bör repas för att ge ett rutnätsmönster, vilket möjliggör ett större kontaktområde för cyanoakrylatlimmet för att härda mellan det beredda provblocket och stiftet. C)Det kolsvarta mättade hartset bör ha en stor kontaktyta med provexemplarets stifthuvud, men den region som skärs av diamantkniven bör inte vara större än 1x1 mm. Det är bra att avsmalna blocket mot spetsen. Detta minimerar skärkrafterna på diamantkniven och genom att ha en bredare bas är blocket mer motståndskraftigt mot att separera från stiftet under sektioneringen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Bild 3: Jämförelse avbildinspelningsinställningar. Panel A skapades med en 32 μs/pixel uppehållstid vid 4 kV och lider av ett minskat signal-till-brusförhållande vilket framgår av det "korniga" utseendet på den förstorade inset. Panel B skapades med en 100 μs/pixel uppehållstid vid 4 kV. Att öka pixeltiden ökar förhållandet mellan signal och brus och avslöjar en ökad nivå av cellulära detaljer, men ökad pixelupptrivningstid har potential att leda till vävnadsladdning och / eller värmeuppbyggnad som mjukar upp blocket och introducerar skärande artefakter (chatt) vid sektionering. Panelerna C och D jämför bilder tagna under identiska exponeringsförhållanden men med två olika stråle kV-värden. Vävnad i dessa paneler var impregnerad med guldtonade nanogold partiklar för att göra skillnader i strålpenetration djup tydligare. Panel C fångades på 9 kV medan panel D fångades på 21 kV. Ökad kV har fördelen av ökad kontrast (D), men detaljer går förlorade som ett resultat av insamling av elektroner från ett större djup av vävnad (C). Som ett resultat av provtagning av ett större tvärsnitt är ett större antal immunogoldpartiklar som är specifika för GAP 43 synliga medan icke-specifik märkning förblir densamma vilket resulterar i ett ökat signal-till-brusförhållande. Panel A & B skala bar = 2 μm. Panel C & D skala bar = 1 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4:Strålintensitet, kV och punktstorlek. (A) Vid kontakt med vävnadsprovet ger elektronstrålen (ljusblå) en droppformad interaktionsvolym, från vilken olika former av energi produceras från interaktionen mellan strålelektroner och vävnadsprovet. Droppformen är en funktion av vävnadstäthet och tungmetallfärgning tillsammans med strålenergi och elektronstrålens lutningsvinkel43. Medan röntgenstrålar, augerelektroner och tertiära elektroner produceras under SBF-SEM-avbildning, är det främsta problemet med backscattered (mörkblå) och sekundära (gröna) elektroner13. Bilden som produceras med SBF-SEM imaging produceras genom insamling av backscattered elektroner. Dessa elektroner härstammar från elastiska interaktioner mellan strålen och provet, och signalen som samlas in är mycket beroende av atomnumret av atomer som interageras med - därav behovet av tungmetallfärgning44. Sekundära elektroner kommer från oelastiska interaktioner mellan strålen och provet och detektion av deras signal är starkt beroende av ytorientering. Eftersom block-face är platt i SBF-SEM bidrar sekundära elektroner inte meningsfullt till signalen som samlas in13. Faktum är att sekundär elektronackumulering på blockets yta kan vara en viktig laddningskälla och har en skadlig effekt påbildkvaliteten 2. (B) Detta diagram visar förhållandet mellan strålintensitet, strål kV och dekorstorlek. Dekorstorleken är strålens rumsliga upplösning och bestämmer upplösningsgränsen för de bilder som produceras. Att sänka kV ökar spotstorleken, men minskar också bilddjupet vilket möjliggör finare detaljuppskattning. Detta har också effekten att minska den detekterbara signalen. Ökande strålintensitet ger en initial förbättring av spotstorlek och signaldetektering, men ökar snabbt nivåerna av vävnadsladdning. I slutändan är de valda strålintensitets- och kV-värdena provberoende och bäst bestämda empiriskt i förhållande till den vetenskapliga fråga som ställs. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Elastinfritt mikrofibrilpaketnätverk i musmajonhinnan. 3D-rekonstruktion av mikrofibriller (vit) nära förknippade med keratocyter (gula, orange & gröna) i hornhinnans stroma. Mikrofibrilerna kan ses intill, och i vissa fall inom grunda spår i, hornhinnans keratocyter (pilar) (A). Detta nätverk av elastinfria mikrofibriller är organiserade i distinkta lager inom hornhinnans stroma (B). Skalstång = 2 μm. Bildblocket rekonstruerat är 45x45 μm i x & y-axeln och 30 μm i z-axeln med voxel en upplösning på 22x22x100 nm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Rekonstruktion av hornhinnans nerver som passerar genom basal lamina vid den stromal-epitelial gränsen. Denna nerv kan ses för att bifurcate före penetration. Efter att ha trängt in i epitel genomgick båda nervgrenarna förgreningar. Mitokondrier (gula) är synliga i de stromala och epitelial delarna av nervbunten. Skalstång = 2,5 μm. Bildblocket rekonstruerat är 25x25 μm i x & y-axeln och 14 μm i z-axeln med en voxelupplösning på 12x12x100 nm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7: Limbal vaskulatur och tillhörande celler i den perifera mus hornhinnan. En enda bild (A) från ett 3D-bildblock (B) kan ses genom vilken ett kärl, nervbunt och tillhörande celler färdas. Panel C visar ett rekonstruerat kärl (rött) med en tillhörande pericyte (grå) lindad runt den som täcker endotelcellskorsningarna. En nervbunt (blå) bifurcates i närheten av detta kärl när det reser genom vävnaden. En neutrofil (gul) kan ses parallellt med kärlets långa axel, med dess polymorfa kärna synlig i sin cellkropp och den efterföljande uropoden synlig som en utskjutning mot bildens högra sida. En mastcell (magenta) är synlig på undersidan av fartyget. Panel D isolerar denna mastcell, där dess granulat (grön) lättare kan ses överlägga kärnan (lila) i cellen. Panel E belyser de cellulära strukturerna överlagrade på cellrekonstruktionerna, med endotelkärnor betecknar i blått och vidhäftande mikropartiklar synliga i kärlets lumen (orange). Pilar visar cellcellskantlinjer mellan endotelceller, vilket ytterligare kan ses som upphöjda åsar som sträcker sig längs cellerna på fartygets luminala sida. Panel A skalstång = 2 μm. Bildblocket som används för att rekonstruera dessa celler är 30x30 μm i x & y-axeln och 42,5 μm i z-axeln med en voxelupplösning på 14,6x14,6x100 nm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 8
Figur 8: Rekonstruerat kärlnätverk av det icke-mänskliga primatretinala nervfiberskiktet. (A) En 200x200 μm SBF-SEM bild av primat näthinnan tas på 8192x8192 px. Platsen som provtas är ~ 500 mikron från den sämre temporala fälgmarginalen i ett friskt öga utan patologi. Bildserien rekonstruerad i panelerna C & D togs på 2048x2048 px, med avbildning pausad så att regioner av intresse kunde avbildas på 8192x8192 px. Panel B är det inlagrade området på panel A, taget direkt från originalbilden. Notera det stora antalet axoner och deras mitokondrier. C)Orthoslice sektion genom en 200x200x200 μm vävnad volym av ett kontroll öga sämre temporala nerv fiber lager, med vaskulatur segmenterad. (D) Z-projektion av nervfiberskiktet vaskulatur. Den här serien illustrerar den möjliga upplösningen inom ett stort område med hjälp av denna metodik. Panel A skalstång = 20 μm. Panel B skalstång = 2 μm. Bildserie voxelupplösning är 97,6x97,6x500 nm. Pixelupplösning för region av intresse är 24,4x24,4 nm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 9
Figur 9:Segmentering och 3D-volymrendering av fartyg i det gigantiska danio(Devario malabaricus)kompakta hjärtat. (A) Tvådimensionell mikrograf i en bildstack, som visar profilen för ett centralt venulärt kärl (pil) och en endotelkärna (pilspets), med omgivande hjärt myocyter rika på mitokondrier och välorganiserade sarkomerer (*). (B) Tvådimensionell mikrograf av bildstacken med ett kapillärstort kärl (pil). C)Biorthogonala projektioner av mikrografstacken som visar kapillären i panel B som projiceras genom en orthogonal skiva. D)3D-rendering av segmenterade endotelceller som fodrar det rekonstruerade kärlet. Illustrerad i grönt, rött, blått och lila är fyra separata endotelceller; Den endotelcell som avbildas i blått kan ses i tvärsnitt i panel B (pil), medan endotelcellerna avbildade i rött (pil) och grönt (pilspets) ses i tvärsnitt i panel A. Panel A & B-skalstång = 2 μm. Bildblocket rekonstruerat är 30x30 μm i x & y-axeln och 16 μm i z-axeln med en voxelupplösning på 14,6x14,6x100 nm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 10
Bild 10: Bildkomplikationer och artefakter. (A) Den vågiga och förvrängda karaktären hos denna bild är resultatet av avbildning med hjälp av en pixelboendetid som är för lång. Detta värmer hartsblocket och lämnar blockansiktet mjukt och gummiaktigt vilket resulterar i en förvrängd bild vid skärning. (B) Den här bilden innehåller en mängd artefakter. Asterisken indikerar en vågig förvrängning orsakad av tidigare avbildning vid en högre förstoring och liknar panel A, koncentrera strålen på en mindre region med längre pixel uppehållstid har mjuknat hartset i denna region av intresse. Medan den högre förstoringsbilden som samlades in var fri från artefakter, kan detta leda till en efterföljande serie bilder där exemplet som ligger till grund för intresseområdet verkar förvrängt. Denna panel illustrerar också frågan om skräpackumulering på blockyttan (pilen) under avbildning, även den betecknad av pilen i panel E. Om detta blir ett ihållande bildproblem kommer det att vara nödvändigt att bryta vakuumet, öppna kammaren och blåsa bort skräp som ackumulerats på diamantkniven och runt provet. Små urladdningar av elektroner från block-face kan leda till snabba kontrastförändringar och linjer som betecknas av den vita pilspetsen. (C) Denna bild illustrerar knivrepor på blockytan. Detta kan inträffa på grund av en skadad kniv eller skräpansamling på knivens kant. D)Den artefakt som betecknas (pil) är ett resultat av elektronstrålen som är inriktad på (utan att dela upp) blockansiktet under en längre tid med provet kvar i bildkammaren. (E) Felaktig fixering av vävnad kan leda till separation av cellulära strukturer och bindväv (*). (F) Om en stor mängd laddning sker i vävnads- eller hartsblocket kan efterföljande ackumulering och urladdning ske som leder till att bilden "hoppar" som det ser ut på bilden. Notera förvrängningen av vävnaden i bilden vid dessa överhoppningspunkter (pilar). Panel A skalstång = 1 μm. Panel B-skalstång = 2 μm. Panel C-skalstång = 5 μm. Panel D-skalstång = 2 μm. Panel E-skalstång = 25 um. Panel F skalstång = 50 um. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 11
Bild 11:Bildvävnad vid 3 kV med olika pixeluppträckningstider och strålintensiteter. Alla bilder samlades med en 3 kV-stråle, strålintensiteten är på en enhetsspecifik skala från 1 till 20. Fältet som avbildas är av kärllummen som innehåller vita och röda blodkroppar. Vid denna låga kV är det svårt att uppskatta cellulära detaljer. Att öka pixeltiden hade liten effekt. Öka strålintensiteten till 6 förbättrad bildkontrast. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 12
Bild 12:Bildvävnad vid 7 kV med olika pixeluppträckningstider och strålintensiteter. Alla bilder samlades in med en 7 kV-stråle, strålintensiteten är på en enhetsspecifik skala från 1 till 20. Fältet som avbildas är av kärllummen som innehåller vita och röda blodkroppar. Vid 7 kV bidrog ökad strålintensitet och pixelupprägningstid till avbildning av högre kvalitet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 13
Bild 13:Bildvävnad vid 12 kV med olika pixeluppträckningstider och strålintensiteter. Alla bilder samlades in med en 12 kV-stråle, strålintensiteten är på en enhetsspecifik skala från 1 till 20. Fältet som avbildas är av kärllummen som innehåller vita och röda blodkroppar. Vid 12 kV optimeras avbildningen genom att pixel uppehållstiden och strålintensiteten justeras. Laddningen reduceras/saknas vid kortare pixeldrvartaltider medan cellulära detaljer och bildkontrast är bäst med längre pixelupptringstid och högre strålintensitet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Syftet med detta metodpapper är att belysa vävnadsberednings- och bildbehandlingsmetoden som har gjort det möjligt för vårt labb att på ett tillförlitligt sätt fånga högupplösta seriella elektronmikroskopibilder och att peka på kritiska steg som leder till detta resultat samt potentiella fallgropar som kan uppstå vid utförandet av SBF-SEM-avbildning. Framgång med detta protokoll kräver korrekt fixering av vävnad, impregnering av tungmetaller i provet, modifieringar av inbäddningshartset för att minska laddningen, samt en förståelse för mikroskop- och bildinställningar som används för att samla in bilder. Maximen "quality in, quality out" är ett lämpligt axiom för SBF-SEM imaging. Eftersom målet med SBF-SEM ofta är uppskattning eller kvantifiering av strukturella detaljer, måste extra försiktighet ges till fixeringsstrategi för att säkerställa att vävnadsförvrängning inte uppstår. Om vävnaden vid någon tidpunkt vid beredningen av prover (dvs. genomgår svullnad, krympning eller störning av cellulär morfologi), kommer vävnadsrekonstruktion och kvantisering inte att ge korrekta data. Dessutom kan användningen av felaktiga bildinställningar leda till förlust av data som inte kan återerövras eftersom SBF-SEM-avbildning är en destruktiv process. Dessutom måste försiktighet användas vid lastning av ett vävnadsprov eftersom den känsliga diamantkniven kan skadas av hastigt eller felaktigt provberedning. Detta kan resultera i chips eller brott i kniven, vilket kan lämna synliga skrapmärken i bilder (Figur 10C). Diamantkniven kan också skadas av förkalkade konstruktioner, hårda granulat eller oavsiktligt inbäddat glas (t.ex. från reagens ampuller).

Medan majoriteten av SBF-SEM-litteraturen hittills använder strålaccelerationsspänningar i intervallet 1 till 3 kV tillsammans med pixelboende gånger närmare 1-5 μs/px (Figur 11)45,46,47,48,49använder det nuvarande protokollet accelerationsspänningar på 7-12 kV och en pixelupptrågare på 12 μs/px för seriell avbildning och 32 μs/px för bildregioner av intresse (Siffrorna 12 & 13). Dessa inställningar, tillsammans med en skiva tjocklek på 100-200 nm möjliggör högkvalitativ och högupplöst bildbehandling av ett brett utbud av biologisk vävnad. Ökad accelerationsspänning möjliggör en ökning av kontrast, upplösning samt signal-till-brusförhållande. Ökad uppehållstid ökar upplösningen och signal-till-brus-förhållandet ytterligare, medan ökad skärtjocklek leder till minskad laddning på blockytan under sektionering och bekämpar strålinducerade skador i efterföljande bilder14. Även om den här avbildnings metoden kan skilja sig från konventionen, talar de bilder och data uppsättningar som produceras för sig själva. Om vi var tvungna att spekulera om orsaken till denna framgång är det möjligt att det är ett resultat av vår unika kombination av höga kV-värden, längre pixelboendetider och blockförberedelser. Ökad avbildning kV resulterar i en ökad interaktionsvolym mellan elektronstrålen och provet. Denna interaktionsvolym är både djupare och bredare vilket resulterar i en teoretisk ökning av antalet elektroner som detekteras som kommer från djupare inom provblocket, eller från ett bredare tvärsnitt av vävnad när fläckstorleken teardrop ökar i diameter. Eftersom SBF-SEM är intresserad av blockets ytdetaljer resulterar detta i en teoretisk minskning av signal-till-brusförhållandet. Ökningen av kV driver dock också elektroner djupare in i provet där de är mindre benägna att fly från blocket och bidra till de elektroner som samlas in av detektorn. Med den extra fördelen av en ökad signal via längre pixeldravningstider och högre strålintensitet är det möjligt att denna bildmetod resulterar i en större ökning av signalen från provytan i förhållande till buller som härrör från interaktionsvolymen. Dessutom bidrar den ökade provledningsförmågan som införs med kolsvart samt silver- och guldbeläggning till att förbättra laddningsuppbyggnaden som nu sker djupare inom blocket och längre från block-face. verkligen Figur 11, Figur 12, Figur 13 visa att när kV ökar börjar provladdningen minska eftersom den potentiellt skjuts djupare in i blocket. Prover som avbildas vid låg förstoring kan tas med tillräcklig kontrast med hjälp av de konventionella inställningarna, men dessa bilder saknar ofta detaljer vid noggrann inspektion. Våra data visar tydligt att när man använder relativt hög förstoring där målet är cellulär detalj, kan en ökning av de konventionella inställningarna ge exceptionella resultat. 2020-artikeln av P. Goggin, et al ger en användbar tabell som beskriver effekten av att ändra bildinställningar på slutlig bildkvalitet och är en användbar referens att konsultera om optimering av protokollet för nya vävnader blir nödvändigt14. Den tjocklek på 100–200 nm som rekommenderas i detta protokoll har den extra fördelen att den tillåter insamling av stora SBF-SEM-datauppsättningar i snabb takt. När du samlar in bilder vid 12 μs/px till exempel kräver avbildning genom ett 100 μm djup vid 2048x2048 px ~ 14 timmar medan du delar upp vid 100nm / avsnitt men skulle kräva ~ 56 timmar om det är sektionerat vid 25nm / avsnitt. Även om x,y-upplösningen förblir oförändrad som ett resultat av avsnittstjockleken, utan att ta hänsyn till den extra förmågan att avbilda med högre kV-värden och pixelboende tider som kommer med större sektioner, är det viktigt att notera att upplösningen längs z-axeln lider. Förlusten av z-upplösning är en viktig faktor och bör övervägas när man bestämmer hur vävnad ska orienteras i hartsblocket och i förhållande till bildplanet, och har potential att utesluta studier av mindre cellfunktioner eller interaktioner (t.ex. synaptiska invaginationer eller intracellulära funktioner på skalan av tiotals nanometer). Men förutom snabb avbildningstid har detta protokoll ytterligare ytterligare fördelar genom att det snabbt producerar idealiska datamängder för stereologisk analys samt studier av sällsynta biologiska händelser eller celler. Större sektionstjocklek kan också hjälpa till vid manuell 3D-rekonstruktion, eftersom en 100 μm-region sektion 100 nm/sektion skulle kräva manuell segmentering av 1 000 bilder medan samma region sektionerad vid 25 nm/sektion skulle kräva manuell segmentering av 4 000 bilder.

SBF-SEM har fördelen att generera stora datamängder på relativt kort tid. Medan dataanalys kan utföras med kvantitativa metoder som stereologi, som kommer att diskuteras nedan, kan det ofta vara informativt att skapa 3D-rekonstruktioner via bildsegmentering. En bildstack som skapats med SBF-SEM kan betraktas som en samling voxels, medan segmentering är processen att tilldela dessa voxels till användardefinierade objekt och därigenom skapa 3D-representationer av vävnadsstrukturer. Dessa rekonstruktioner ger ofta ett hittills osynligt perspektiv på vävnadss ultrastruktur och cellcellsinteraktion(figur 5, figur 6, figur 7, figur 8, figur 9). När rekonstruktioner har skapats är det dessutom möjligt att använda data som är inneboende i rekonstruktionerna för att extrahera en mängd information från segmenterad vävnad. Parametrar som sträcker sig från yta, volym, längd och avstånd, samt vinkeldata är alla lättillgängliga när en rekonstruktion har skapats50,51. Även om detta kan vara oerhört användbart, särskilt när det är parat med videor och bilder som hämtats från rekonstruerade datauppsättningar, är den tid som krävs för manuell segmentering en viktig faktor när du försöker extrapolera data från SBF-SEM-datauppsättningar. Det finns för närvarande en mängd både gratis och köpbar programvara tillgänglig för manuell och semi-manuell segmentering av SBF-SEM-bildstaplar. Ett gratis alternativ för rekonstruktionsprogram är bildbehandlingspaketet Fiji för ImageJ, ett bildbehandlingsprogram med öppen källkod, som innehåller ett segmenteringsredigerarplugin som möjliggör manuell segmentering52,53. Dessutom erbjuder programvaran Reconstruct ett alternativt gratis segmenteringsalternativ54 (Figur 8). Även om det kan vara dyrt innehåller köpbara alternativ ofta mer robusta funktionsuppsättningar, till exempel halvautomatiska segmenteringsprocesser eller sviter för film- och bildskapande. Ett sådant alternativ användes för att skapa de rekonstruktioner som finns i figur 5, figur 6, figur 7 och figur 9 (Uppgifter finns i materialförteckningen). Dessutom finns verktyg tillgängliga för att skapa, analysera och återge kontrastbaserade 3D-rekonstruktioner med virtuell verklighet med potential att kraftigt påskynda återuppbyggnadsprocessen20,55. Även om det inte alltid är tillgängligt för alla applikationer, är en mängd programvaruverktyg tillgängliga för datorassisterad manuell segmentering som har potential att kraftigt minska den tid som krävs för segmentering56,57,58. Oavsett vilken programvara som används bör betydande förutfattaddom och förståelse för den fråga som besvaras, eller kunskapslucka som ska fyllas, genom seriella rekonstruktioner föregå segmentering, eftersom processen är mödosam och tidsintensiv.

Produktionen av 3D-rekonstruktioner kommer med sina egna överväganden. Med större data uppsättningar kan bearbetnings kraft vara en begränsande faktor, och därför kan optimering av användningen av system resurser vara avgörande för att upprätthålla ett produktivt arbetsflöde och påskynda återuppbyggnads- och renderingsprocessen. När du återger en 3D-rekonstruktion konverterar de flesta program segmenterade bildstaplar till en yta som består av sammankopplade trianglar. Om ett återuppbyggnadsprojekt är stort eller invecklat kan återgivningen av dessa trianglar kräva en hel del datorkraft. När du arbetar med en 3D-rekonstruktion kan det vara bra att begränsa antalet trianglar som rekonstruktionsprogramvaran kan använda för att konvertera de segmenterade bilderna till rekonstruerade ytor. Detta kan vara användbart för att övervaka framstegen för en 3D-rekonstruktion under segmenteringsprocessen. När segmenteringen är klar kan triangelgränsen tas bort innan du återger bilder eller videor av rekonstruktioner. Alternativt, och om rekonstruktionsprogramvaran tillåter det, har vi funnit framgång med att övervaka framstegen med en rekonstruktion med hjälp av volymrendering snarare än ytgenerering. Volymåtergivning, även om den inte är lika lämplig för bilder eller videor avsedda för publicering eller presentation, kräver mycket mindre processorkraft och kan därför vara till hjälp för att ge en smidig upplevelse när du rekonstruerar och förbereder bilder och videor av rekonstruktioner. Dessutom är det bästa praxis när du segmenterar en SBF-SEM-datauppsättning manuellt för att definiera varje objekt som ska rekonstrueras med sin egen unika identifierare. Om ett fält av epitelceller rekonstrueras till exempel, i stället för att tilldela alla epitelceller till en voxelgrupp med titeln "epitel", bör varje epitelcell tilldelas sin egen moniker (dvs. Epi1, Epi2, Epi3, etc.). Detta ger större frihet när rekonstruktionen är klar, eftersom varje cell antingen kan inkluderas eller uteslutas från den slutliga renderingen, tilldelas olika färger eller genomskinligheter eller tas bort eller introduceras individuellt om en video produceras. Dessutom gör detta att mått som yta eller volym kan samlas in från varje rekonstruerat objekt i stället för objektgruppen som helhet.

Ett annat otroligt kraftfullt verktyg för att extrahera kvantitativa data från SBF-SEM-bildstaplar är praxis för stereologi. Stereologi drar nytta av de inneboende matematiska relationerna mellan tredimensionella objekt och deras tvådimensionella representationer (dvs. elektronmikrografer). SBF-SEM-datauppsättningar är idealiska för tillämpning av stereologi, eftersom denna metod för att extrahera 3D-information från stora datamängder är betydligt mindre tids- och arbetsintensiv jämfört med segmenterad rekonstruktion. Stereologi består i allmänhet av att applicera geometriska rutnät på slumpmässiga, enhetligt provtamplade bilder och har använts i stor utsträckning under de senaste 50 åren för att producera exakta och opartiska uppskattningar av cell/ organellnummer, längd, yta och volym21,59,60,61,62,63. Medan 3D-rekonstruktioner kan vara imponerande och ge ett nytt perspektiv på biologiska vävnader, är det ofta snabbare, mer exakt, reproducerbart och gynnsamt för stora provstorlekar att använda en stereologisk metod för datautvinning. Medan det finns många papper som diskuterar den praktiska tillämpningen avstereologi 64,65,66, ger ett antal läroböcker användbara, djupgående översikter av metoden samt ger ett antal stereologiska rutnät som kan tillämpas på studien av vävnad ultrastruktur67,68,69.

SBF-SEM är en kraftfull bildmetod som möjliggör tredimensionell uppskattning av vävnadss ultrastruktur. Medan förmågan att skapa 3D-datamängder med SEM-upplösning sätter tidigare obesvarade frågor inom räckhåll, är korrekt vävnadsberedning och förståelse för SBF-SEM-avbildning av största vikt för framgången för studier som använder denna mikroskopimetod. Vi hoppas att tillämpningen av detta protokoll på framtida studier kommer att leda till större och större insikt i de biologiska mysterier som omger oss och fortsätta att driva oss längre in i gränserna för mänsklig kunskap.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown och Margaret Gondo för deras utmärkta tekniska hjälp. Denna forskning stöddes delvis av National Institutes of Health (NIH) R01 EY-018239 och P30 EY007551 (National Eye Institute), delvis av Lion's Foundation for Sight, och delvis av NIH 1R15 HD084262-01 (National Institute of Child Health & Human Development).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/16 x 3/8 Aluminum Rivets Industrial Rivet & Fastener Co. 6N37RFLAP/1100 Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver Wiha Quality Tools 27225
Acetone Electron Microscopy Sciences RT 10000 Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid Sigma-Aldrich A8949
Calcium Chloride FisherScientific C79-500
Conductive Silver Paint Ted Pella 16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target Denton Vacuum N/A This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors Fisher Scientific 50-949-411
Embed 812 Electron Microscopy Sciences 14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM Gatan & Tescan N/A This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) Electron Microscopy Sciences 72630-05
Gluteraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
Gorilla Super Glue - Impact Tough NA NA Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black HM Royal EC-600JD Refered to as carbon black in text.
KOH FisherScientific 18-605-593
Lead Nitrate Fisher Scientific L62-100
Microwave Pelco BioWave Pro This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 201030
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Silicone Embedding Mold Ted Pella 10504
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences 12300
Samco Transfer Pipette ThermoFisher Scientific 202 Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files Electron Microscopy Sciences 62115
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich 223220
Uranyl Acetate Polysciences, Inc. 21447-25
Reconstruction Software
Amira Software Thermo Scientific N/A Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ) ImageJ.net N/A TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB) University of Helsinki, Institute of Biotechnology N/A
Reconstuct Software Neural Systems Lab N/A
SuRVoS Workbench Diamond Light Source & The University of Nottingham N/A
SyGlass IstoVisio, Inc. N/A Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).
  2. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  3. He, Q., Hsueh, M., Zhang, G., Joy, D. C., Leapman, R. D. Biological serial block face scanning electron microscopy at improved z-resolution based on Monte Carlo model. Scientific Reports. 8 (1), 12985 (2018).
  4. Zankel, A., Wagner, J., Poelt, P. Serial sectioning methods for 3D investigations in materials science. Micron. 62, 66-78 (2014).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43 (5), 612-620 (2012).
  7. Bouwer, J. C., et al. Deceleration of probe beam by stage bias potential improves resolution of serial block-face scanning electron microscopic images. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2 (1), 11 (2017).
  8. Kizilyaprak, C., Longo, G., Daraspe, J., Humbel, B. M. Investigation of resins suitable for the preparation of biological sample for 3-D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 189 (2), 135-146 (2015).
  9. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  10. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: an ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  11. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  12. Piňos, J., Mikmeková, Š, Frank, L. About the information depth of backscattered electron imaging. Journal of Microscopy. 266 (3), 335-342 (2017).
  13. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
  14. Goggin, P., et al. Development of protocols for the first serial block-face scanning electron microscopy (SBF SEM) studies of bone tissue. Bone. 131, 115107 (2020).
  15. Deerinck, T. J., et al. High-performance serial block-face SEM of nonconductive biological samples enabled by focal gas injection-based charge compensation. Journal of Microscopy. 270 (2), 142-149 (2018).
  16. Nguyen, H. B., et al. Conductive resins improve charging and resolution of acquired images in electron microscopic volume imaging. Scientific Reports. 6, 23721 (2016).
  17. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. National Center for Microscopy and Imaging Research. 6 (8), (2010).
  18. Deerinck, T. J., et al. Enhancing Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Enable High Resolution 3-D Nanohistology of Cells and Tissues. Microscopy and Microanalysis. 16, 1138-1139 (2010).
  19. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  20. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy: A provocative technique to define 3-dimensional ultrastructure of microvascular thrombosis. Thrombosis Research. 196, 519-522 (2020).
  21. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy reveals neuronal-epithelial cell fusion in the mouse cornea. PLoS One. 14 (11), 0224434 (2019).
  22. Lafontant, P. J., et al. Cardiac Myocyte Diversity and a Fibroblast Network in the Junctional Region of the Zebrafish Heart Revealed by Transmission and Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. PLoS One. 8 (8), 72388 (2013).
  23. Hanlon, S. D., Behzad, A. R., Sakai, L. Y., Burns, A. R. Corneal stroma microfibrils. Experimental Eye Research. 132, 198-207 (2015).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  25. Davenport, A. T., Grant, K. A., Szeliga, K. T., Friedman, D. P., Daunais, J. B. Standardized method for the harvest of nonhuman primate tissue optimized for multiple modes of analyses. Cell Tissue Bank. 15 (1), 99-110 (2014).
  26. Schuster, A., et al. An isolated perfused pig heart model for the development, validation and translation of novel cardiovascular magnetic resonance techniques. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 12 (1), 53 (2010).
  27. Hanlon, S. D., Patel, N. B., Burns, A. R. Assessment of postnatal corneal development in the C57BL/6 mouse using spectral domain optical coherence tomography and microwave-assisted histology. Experimental Eye Research. 93 (4), 363-370 (2011).
  28. Longiéras, N., Sebban, M., Palmas, P., Rivaton, A., Gardette, J. L. Multiscale approach to investigate the radiochemical degradation of epoxy resins under high-energy electron-beam irradiation. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 44 (2), 865-887 (2006).
  29. Hashimoto, T., Thompson, G. E., Zhou, X., Withers, P. J. 3D imaging by serial block face scanning electron microscopy for materials science using ultramicrotomy. Ultramicroscopy. 163, 6-18 (2016).
  30. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: A novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801 (2009).
  31. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  32. Katoh, K. Microwave-Assisted Tissue Preparation for Rapid Fixation, Decalcification, Antigen Retrieval, Cryosectioning, and Immunostaining. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2016, 7076910 (2016).
  33. Login, G. R., Dvorak, A. M. A review of rapid microwave fixation technology: its expanding niche in morphologic studies. Scanning. 15 (2), 58-66 (1993).
  34. Jamur, M. C., Faraco, C. D., Lunardi, L. O., Siraganian, R. P., Oliver, C. Microwave fixation improves antigenicity of glutaraldehyde-sensitive antigens while preserving ultrastructural detail. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 307-311 (1995).
  35. Leong, A. S., Sormunen, R. T. Microwave procedures for electron microscopy and resin-embedded sections. Micron. 29 (5), 397-409 (1998).
  36. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  37. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  38. Belazi, D., Solé-Domènech, S., Johansson, B., Schalling, M., Sjövall, P. Chemical analysis of osmium tetroxide staining in adipose tissue using imaging ToF-SIMS. Histochemistry and Cell Biology. 132 (1), 105-115 (2009).
  39. Rivlin, P. K., Raymond, P. A. Use of osmium tetroxide-potassium ferricyanide in reconstructing cells from serial ultrathin sections. Journal of Neuroscience Methods. 20 (1), 23-33 (1987).
  40. Aguas, A. P. The use of osmium tetroxide-potassium ferrocyanide as an extracellular tracer in electron microscopy. Stain Technology. 57 (2), 69-73 (1982).
  41. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  42. Watson, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. II. Application of solutions containing lead and barium. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 4 (6), 727-730 (1958).
  43. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy. Scanning Microscopy in Nanotechnology. , 1-40 (2006).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Buchacker, T., et al. Assessment of the Alveolar Capillary Network in the Postnatal Mouse Lung in 3D Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Frontiers in Physiology. 10, 1357 (2019).
  46. Keeling, E., et al. 3D-Reconstructed Retinal Pigment Epithelial Cells Provide Insights into the Anatomy of the Outer Retina. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), (2020).
  47. Shang, P., et al. Chronic Alcohol Exposure Induces Aberrant Mitochondrial Morphology and Inhibits Respiratory Capacity in the Medial Prefrontal Cortex of Mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 561173 (2020).
  48. Pfeifer, C. R., et al. Quantitative analysis of mouse pancreatic islet architecture by serial block-face SEM. Journal of Structural Biology. 189 (1), 44-52 (2015).
  49. Wilke, S. A., et al. Deconstructing complexity: serial block-face electron microscopic analysis of the hippocampal mossy fiber synapse. Journal of Neuroscience. 33 (2), 507-522 (2013).
  50. Cocks, E., Taggart, M., Rind, F. C., White, K. A guide to analysis and reconstruction of serial block face scanning electron microscopy data. Journal of Microscopy. 270 (2), 217-234 (2018).
  51. Borrett, S., Hughes, L. Reporting methods for processing and analysis of data from serial block face scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 263 (1), 3-9 (2016).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  54. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, Pt 1 52-61 (2005).
  55. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality Head-mounted displays. arXiv . , arXiv:1804.08197 (2018).
  56. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  57. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  58. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198 (1), 43-53 (2017).
  59. Anderson, H. R., Stitt, A. W., Gardiner, T. A., Archer, D. B. Estimation of the surface area and volume of the retinal capillary basement membrane using the stereologic method of vertical sections. Analytical & Quantitative Cytology & Histology. 16 (4), 253-260 (1994).
  60. Gibbons, C. H., Illigens, B. M., Wang, N., Freeman, R. Quantification of sweat gland innervation: a clinical-pathologic correlation. Neurology. 72 (17), 1479-1486 (2009).
  61. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec. 292 (1), Hoboken. 113-122 (2009).
  62. Mahon, G. J., et al. Chloroquine causes lysosomal dysfunction in neural retina and RPE: implications for retinopathy. Current Eye Research. 28 (4), 277-284 (2004).
  63. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. Journal of Microscopy. 150, Pt 2 117-136 (1988).
  64. Weibel, E. R. Stereological methods in cell biology: where are we--where are we going. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (9), 1043-1052 (1981).
  65. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  66. Kristiansen, S. L., Nyengaard, J. R. Digital stereology in neuropathology. Apmis. 120 (4), 327-340 (2012).
  67. Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology. 2nd edn. , Garland Science/BIOS Scientific Publishers. (2005).
  68. Reith, A., Mayhew, T. M. Stereology and Morphometry in Electron Microscopy: Problems and Solutions. , Hemisphere Publishing Corporation. (1988).
  69. Mouton, P. R. Principles and practices of unbiased stereology: an introduction for bioscientists. , Johns Hopkins University Press. (2002).

Tags

Biologi utgåva 169 Seriell block-face scanning elektronmikroskopi SBF-SEM 3D-EM 3D-rekonstruktion vävnadsberedning provberedning seriella sektioner ultrastruktur högupplöst volymetrisk avbildning biologisk stor volym
Seriell block-face scanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) av biologiska vävnadsprover
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Courson, J. A., Landry, P. T., Do,… More

Courson, J. A., Landry, P. T., Do, T., Spehlmann, E., Lafontant, P. J., Patel, N., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples. J. Vis. Exp. (169), e62045, doi:10.3791/62045 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter