Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

סריקת בלוק-פנים טורית מיקרוסקופ אלקטרונים (SBF-SEM) של דגימות רקמה ביולוגית

Published: March 26, 2021 doi: 10.3791/62045
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 3,4, 1,4
1College of Optometry, University of Houston, 2Department of Biology, DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center, Baylor College of Medicine

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה שגרתית לשימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פנים טורי (SBF-SEM), טכניקת הדמיה תלת-ממדית רבת עוצמה. יישום מוצלח של צירי SBF-SEM על קיבוע נאות וטכניקות כתמי רקמות, כמו גם שיקול זהיר של הגדרות הדמיה. פרוטוקול זה מכיל שיקולים מעשיים לממותו של תהליך זה.

Abstract

מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פרצוף בלוק סדרתי (SBF-SEM) מאפשר איסוף של מאות עד אלפי תמונות אולטרה-מבניות הרשומות באופן סדרתי, ומציע תצוגה תלת מימדית חסרת תקדים של מיקרואנטומיה של רקמות. בעוד SBF-SEM ראתה עלייה אקספוננציאלית בשימוש בשנים האחרונות, היבטים טכניים כגון הכנת רקמות נכונה ופרמטרים הדמיה הם בעלי חשיבות עליונה להצלחת מודאליות הדמיה זו. מערכת הדמיה זו נהנית מהאופי האוטומטי של המכשיר, ומאפשרת להשאיר את המיקרוסקופ ללא השגחה במהלך תהליך ההדמיה, עם איסוף אוטומטי של מאות תמונות אפשריות ביום אחד. עם זאת, ללא הכנת רקמות מתאימה אולטרה מובנה הסלולר ניתן לשנות באופן כזה מסקנות שגויות או מטעות עשוי להסיק. בנוסף, תמונות נוצרות על ידי סריקת פני הבלוק של מדגם ביולוגי מוטבע שרף וזה לעתים קרובות מציג אתגרים ושיקולים שיש לטפל בהם. הצטברות אלקטרונים בתוך הבלוק במהלך ההדמיה, המכונה "טעינת רקמות", עלולה להוביל לאובדן ניגודיות ולחוסר יכולת להעריך את המבנה התאי. יתר על כן, בעוד הגדלת עוצמת קרן אלקטרונים / מתח או הפחתת מהירות סריקת קרן יכול להגביר את רזולוציית התמונה, זה יכול להיות גם תופעת לוואי מצערת של פגיעה בלוק שרף ועיוות התמונות הבאות בסדרת ההדמיה. כאן אנו מציגים פרוטוקול שגרתי להכנת דגימות רקמה ביולוגית המשמרת את המבנה התאי ומפחיתה את טעינת הרקמות. כמו כן, אנו מספקים שיקולי הדמיה לרכישה מהירה של תמונות סדרתיות באיכות גבוהה עם נזק מינימלי לגוש הרקמות.

Introduction

בלוק סדרתי פנים סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SBF-SEM) תואר לראשונה על ידי לייטון בשנת 1981 שבו הוא עיצב מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה בתוספת מיקרוטום מובנה אשר יכול לחתוך תמונה חלקים דקים של רקמה מוטבע שרף. למרבה הצער, מגבלות טכניות הגבילו את השימוש בו לדגימות מוליכות, שכן דגימות לא מוליכות כגון רקמה ביולוגית צברו רמות בלתי קבילות של טעינה (הצטברות אלקטרונים בתוך דגימת הרקמה)1. בעוד ציפוי הפנים בלוק בין חתכים עם פחמן התאדה מופחת טעינת רקמות, זה גדל מאוד זמן רכישת הדמיה ואחסון תמונה נשאר בעיה כמו טכנולוגיית המחשב באותו זמן לא היה מספיק כדי לנהל את גדלי הקבצים הגדולים שנוצרו על ידי המכשיר. מתודולוגיה זו נבחנה מחדש על ידי דנק והורסטמן בשנת 2004 באמצעות SBF-SEM המצויד בתא לחץ משתנה2. זה איפשר הכנסת אדי מים לתא ההדמיה אשר מפחית את הטעינה בתוך המדגם, מה שהופך את ההדמיה של דגימות לא מוליך קיימא אם כי עם אובדן רזולוציית תמונה. שיפורים נוספים בשיטות הכנת רקמות והדמיה מאפשרים כעת הדמיה באמצעות ואקום גבוה, והדמיה SBF-SEM כבר לא מסתמכת על אדי מים כדי לפזר טעינה3,4,5,6,7,8,9. בעוד SBF-SEM ראתה עלייה אקספוננציאלית בשימוש בשנים האחרונות, היבטים טכניים כגון הכנת רקמות נכונה ופרמטרים הדמיה הם בעלי חשיבות עליונה להצלחת מודאליות הדמיה זו.

SBF-SEM מאפשר איסוף אוטומטי של אלפי תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים הרשומות באופן סדרתי, עם רזולוציה מישורית קטנה כמו 3-5 ננומטר10,11. רקמה, ספוגה במתכות כבדות ומוטבעת שרף, ממוקמת בתוך מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM) המכיל ultramicrotome מצויד בסכין יהלום. משטח שטוח נחתך עם סכין היהלומים, הסכין נסוגה, ומשטח הבלוק נסרק בתבנית רסטר עם קרן אלקטרונים כדי ליצור תמונה של מבנה רקמות. לאחר מכן הבלוק מועלה סכום שצוין (למשל, 100 ננומטר) בציר z, המכונה "z-step", ומשטח חדש נחתך לפני שהתהליך חוזר על עצמו. בדרך זו בלוק תלת מימדי (3D) של תמונות מופק כמו הרקמה נחתכת. מערכת הדמיה זו נהנית עוד יותר מהאופי האוטומטי של המכשיר, ומאפשרת להשאיר את המיקרוסקופ ללא השגחה במהלך תהליך ההדמיה, עם איסוף אוטומטי של מאות תמונות אפשריות ביום אחד.

בעוד הדמיית SBF-SEM משתמשת בעיקר אלקטרונים backscattered כדי ליצור תמונה של פני הבלוק, אלקטרונים משניים נוצרים במהלך תהליך ההדמיה12. אלקטרונים משניים יכולים להצטבר, לצד אלקטרונים עם קורות אחוריות ופני קרן ראשונית שאינם נמלטים מהחסימה, ומייצרים "טעינת רקמות", מה שעלול להוביל לשדה אלקטרוסטטי מקומי בפני הבלוק. הצטברות אלקטרונים זו יכולה לעוות את התמונה או לגרום אלקטרונים להיפלט מהבלוק ולתרום לאות שנאסף על ידי גלאי backscatter, הפחתת יחס אות לרעש13. בעוד שניתן להפחית את רמת טעינת הרקמות על ידי הפחתת המתח או העוצמה של קרן האלקטרונים, או הפחתת זמן השתהות בקרן, התוצאה היא יחס אות לרעש מופחת14. כאשר נעשה שימוש בקרן אלקטרונים במתח נמוך יותר או בעוצמה נמוכה יותר, או כאשר הקרן רשאית להתעכב בתוך כל מרחב פיקסלים רק לפרק זמן קצר יותר, אלקטרונים פחות מכווצים לאחור נפלטים מהרקמה ונלכדים על ידי גלאי האלקטרונים וכתוצאה מכך אות חלש יותר. דנק והורסטמן התמודדו עם בעיה זו על ידי החדרת אדי מים לתא, ובכך להפחית את המטען בתא ועל פני הבלוק במחיר של רזולוציית תמונה. עם לחץ תא של 10-100 Pa, חלק מקרן האלקטרונים מפוזר תורם רעש תמונה ואובדן רזולוציה, אולם זה גם מייצר יונים בתא הדגימה אשר מנטרל תשלום בתוך בלוק מדגם2. שיטות עדכניות יותר לנטרול מטען בתוך בלוק המדגם להשתמש הזרקת גז מוקדי של חנקן על פני הבלוק במהלך ההדמיה, או החדרת מתח שלילי לשלב SBF-SEM כדי להקטין את האנרגיה מטען קרן בדיקה ולהגדיל את האות שנאסף6,7,15. במקום להציג הטיית במה, לחץ תאי או הזרקת חנקן מקומית כדי להפחית את הצטברות הטעינה על משטח הבלוק, ניתן גם להגדיל את המוליכות של השרף על ידי החדרת פחמן לתערובת השרף המאפשרת הגדרות הדמיה אגרסיביות יותר16. הפרוטוקול הכללי הבא הוא התאמה של פרוטוקול Deerinck et al. שפורסם בשנת 2010 ומכסה שינויים במתודולוגיות הכנת רקמות והדמיה שמצאנו שימושי למזעור טעינת רקמות תוך שמירה על רכישת תמונה ברזולוציה גבוהה3,17,18,19. בעוד שהפרוטוקול שהוזכר לעיל התמקד בעיבוד רקמות ובהסתמעת מתכות כבדות, פרוטוקול זה מספק תובנות לגבי זרימת העבודה של ההדמיה, ניתוח הנתונים והשחזור הטבועה במחקרי SBF-SEM. במעבדה שלנו, פרוטוקול זה הוחל בהצלחה ובאופן שכפול על מגוון רחב של רקמות כולל קרנית ומבני קטעים לפני השימוש, עפעפיים, בלוטות קריליות וקשות יותר, רשתית ועצב הראייה, לב, ריאות ודרכי הנשימה, כליות, כבד, שריר קרמאסטר וקליפת המוח /medulla, ובמגוון מינים כולל עכבר, חולדה, ארנב, שרקן, דגים, מונולאייר ותרביות תאים מרובדות, חזיר, פרימטים לא אנושיים, כמו גם בניאדם 20,21,22,23. בעוד שינויים קטנים עשויים להיות כדאי עבור רקמות ויישומים ספציפיים, פרוטוקול כללי זה הוכיח מאוד לשחזור ושימושי בהקשר של מתקן ההדמיה הליבה שלנו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל בעלי החיים טופלו על פי ההנחיות המתוארות בהצהרת האגודה לחקר הראייה ורפואת העיניים לשימוש בבעלי חיים בראייה ומחקר עיניים ובהנחיות הטיפול בבעלי חיים של מכללת יוסטון לאופטומטריה. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי המוסדות שבהם הם טופלו: עכבר, חולדה, ארנב, שרקן, נהלי פרימטים שאינם אנושיים אושרו על ידי אוניברסיטת יוסטון טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה, נהלי זברה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת DePauw, נהלי חזיר אושרו על ידי ביילור המכללה לרפואה טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה. כל הרקמות האנושיות טופלו בהתאם להצהרת הלסינקי בנוגע למחקר על רקמות אנושיות והתקבל אישור ועדת בדיקה מוסדית מתאימה.

1. עיבוד רקמות

  1. הכינו פתרון מלאי של חיץ 0.4 M נתרן cacodylate על ידי ערבוב אבקת cacodylate נתרן ב ddH2O. ביסודיות לערבב חוצץ ו- pH להתאים את הפתרון 7.3. מאגר זה משמש כדי להפוך את התיקון (הרכב המתואר להלן בשלב 1.3), חוצץ כביסה, כמו גם אוסמיום ופתרונות אשלגן ferrocyanide.
    הערה: קיבעון זלוף הוא לעתים קרובות השיטה הטובה ביותר של קיבעון עבור מחקרי SBF-SEM, כמו קיבעון מתרחשת במהירות בכל הגוף. אם קיבוע זלוף אינו אפשרי בתכנון המחקר שלך, דלג לשלב 1.3.
  2. בצע קיבוע זלוף עם הלחץ הפיזיולוגי המתאים עבור מודל החיה24,25,26. זה נעשה באמצעות זלוף רציף transcardial עם מלוחים הפריני ואחריו קיבוע, כל ממוקם בגובה מסוים (למשל, 100 ס"מ) מעל האורגניזם (מתאים ללחץ הפיזיולוגי של מערכת כלי הדם במודל החיה), עם קיבוע זורם לתוך החדר השמאלי, ויציאה מתוך חתך שנעשה באטריום הימני. רקמה של עניין יהפוך חיוור כמו הדם מוחלף קיבוע, אם כל או חלק של הרקמה שלך לא בלאנש אז הרקמה לא יכול להיות קבוע כראוי ultrastructure לא יכול להישמר.
  3. השתמש סכין גילוח או אזמל חד לקצץ דגימות רקמה לתוך בלוקים לא יותר מ 2 מ"מ x 2 מ"מ x 2 מ"מ. אם דילגו על שלב 1.2, עשו זאת במהירות כדי שניתן יהיה לתקן את הרקמה במהירות האפשרית.
    1. לחלופין, לנתח רקמה תחת קיבוע ולהעביר לתיקון טרי כדי להשלים את תהליך הטבילה. ההרכב הסופי של הקיבעון מורכב 0.1 M נתרן cacodylate מאגר המכיל 2.5% glutaraldehyde ו 2 מ"מ סידן כלורי. אפשר קיבעון להמשיך לפחות 2 שעות בטמפרטורת החדר ומקסימום של לילה ב 4 מעלות צלזיוס. במידת האפשר, השתמשו בצלחת נדנדה/הטיה כדי להתסיס דגימות בעדינות בזמן התיקון.
    2. לחלופין, אם מיקרוגל מהפך זמין, לתקן רקמה בתיקון הנ"ל תחת ואקום ב 150 וואט במשך 4 מחזורים של 1 דקה על, 1 דקה את. קיבוע מיקרוגל היא השיטה המועדפת עבור שלב 1.3 כפי שהוא מתקן במהירות רקמה ושומר על רקמות ultrastructure27.
      הערה: אין לאפשר לרקמות להתייבש במהלך פרוטוקול זה, יש להקפיד להעביר רקמות במהירות מתמיסה אחת לאחרת.
  4. לשטוף רקמה קבועה 5x במשך 3 דקות כל אחד (15 דקות בסך הכל) בטמפרטורת החדר ב 0.1 M נתרן cacodylate מאגר המכיל 2 מ"מ סידן כלורי.
  5. הפוך את פתרון osmium ferrocyanide הבא טרי, רצוי במהלך שלבי הכביסה הקודמים. שלבו תמיסת אוסמיום טטרוקסידים 4% (מוכנה ב-ddH2O) עם נפח שווה של 3% אשלגן פרוציאניד ב-0.2 מ' קמודילאט עם 4 מ"מ סידן כלוריד. לאחר שלב הכביסה הקודם, מניחים את הרקמה בתמיסה זו במשך שעה על קרח בחושך, ובמכסה המנוע האדים.
    הערה: אוסמיום טטרוסיד הוא חומר גבישי צהוב שמגיע באמפולה. כדי ליצור את פתרון אוסמיום טטרוקסיד, לפצח לפתוח את האמפולה, להוסיף ddH2O, sonicate במשך 3-4 שעות בחושך עד הגבישים מומסים לחלוטין. פתרון Osmium tetroxide הוא פתרון צהוב ברור, אם הפתרון הוא שחור אוסמיום הופחת ואין עוד להשתמש בו.
  6. בעוד הרקמה היא דגירה בתמיסת אוסמיום ferrocyanide, להתחיל להכין את פתרון thiocarbohydrazide (TCH). הכן פתרון זה טרי ויש לו זמין בקלות בסוף 1 שעה osmium ferrocyanide תקופת קיבוע. ערבבו 0.1 גרם של תיוקרבוהידראזיד עם 10 מ"ל של ddH2O והניחו פתרון זה בתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה. כדי להבטיח שהפתרון מומס, מערבבים בעדינות כל 10 דקות. לפני השימוש, לסנן פתרון זה באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
  7. לפני הדגירה ב- TCH, לשטוף את הרקמה עם טמפרטורת החדר ddH2O 5x במשך 3 דקות כל אחד (15 דקות בסך הכל).
  8. הנח את הרקמה בתמיסת TCH המסוננת למשך 20 דקות בסך הכל בטמפרטורת החדר (איור 1A-C).
  9. לאחר הדגירה ב- TCH, לשטוף את הרקמה 5x במשך 3 דקות כל אחד (15 דקות בסך הכל) בטמפרטורת החדר ddH2O.
  10. מניחים רקמה ב- ddH2O המכילה 2% אוסמיום טטרוקסיד (לא אוסמיום מופחת עם אשלגן ferrocyanide) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. זה צריך להיעשות במכסה המנוע אדים בחושך כמו אוסמיום ניתן להפחית על ידי אור (למשל, תחת רדיד אלומיניום) (איור 1D-F).
  11. בעקבות דגירה osmium tetroxide, לשטוף רקמה 5x במשך 3 דקות כל (15 דקות בסך הכל) בטמפרטורת החדר ddH2O.
  12. מניחים את הרקמה ב 1% אצטט אורניל מימית (אבקת אצטט אורניל מעורבב ddH2O) לילה במקרר ב 4 מעלות צלזיוס.
  13. רגע לפני הסרת הרקמה מהמקרר, הכינו את תמיסת אספרטט העופרת הטרייה של וולטון. התחל על ידי המסת 0.066 גרם של חנקת עופרת ב 10 מ"ל של 0.03 M פתרון חומצה אספרטית (0.04 גרם חומצה אספרטית ב 10 מ"ל של מים מזוקקים) ולהתאים pH ל 5.5 עם 1 N KOH (0.5611 גרם ב 10 מ"ל של מים מזוקקים).
    התראה: משקע יכול להיווצר בעת התאמת ה- pH. זה לא מקובל.
    1. באמצעות מוט ערבוב, מוסיפים לאט את 1 N KOH dropwise תוך ניטור pH. מחממים מראש את תמיסת אספרטט עופרת ברורה סיים בתנור 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. אם נוצר משקעים לא ניתן להשתמש בפתרון ויש להכין פתרון אחר.
  14. הסר את הרקמה מהמקרר ולשטוף 5x במשך 3 דקות כל (15 דקות בסך הכל) בטמפרטורת החדר ddH2O.
  15. לאחר הכביסה, מניחים את הרקמה בתמיסת אספרטט עופרת מחוממת של וולטון במשך 30 דקות תוך שמירה על הטמפרטורה ב 60 מעלות צלזיוס.
  16. לאחר הדגירה אספרטט להוביל של וולטון, לשטוף את הרקמה 5x במשך 3 דקות כל (15 דקות בסך הכל) בטמפרטורת החדר ddH2O (איור 1G-I).
  17. לייבש את הרקמה באמצעות סדרת אצטון קר כקרח (30%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%, ו 100% אצטון (ב ddH2O היכן שרלוונטי) המאפשר 10 דקות עבור כל שלב בסדרה.
  18. לאחר סדרת התייבשות קר כקרח, מניחים רקמה בטמפרטורת החדר אצטון במשך 10 דקות.
    1. במהלך תקופה זו, לנסח להטביע 812 ACM שף. השתמש במתכון "תערובת קשה" כפי שהוא עמיד יותר לנזק קרן. מערבבים את שרף ביסודיות, ומניחים את הרקמה לתוך Embed 812:acetone (1:3 לערבב) במשך 4 שעות, ואחריו Embed 812:acetone (1:1 לערבב) במשך 8 שעות או לילה, ולבסוף להטביע 812:acetone (3:1 לערבב) לילה. בצעו את שלבי חדירת השחלות האלה בטמפרטורת החדר.
  19. למחרת, למקם את הרקמה ב 100% Embed 812 במשך 4-8 שעות, אז טרי 100% Embed 812 לילה, ולבסוף לתוך טרי 100% Embed 812 במשך 4 שעות. בצעו את שלבי חדירת השחלות האלה בטמפרטורת החדר.
    1. רגע לפני ההטבעה, מניחים כמות קטנה של שרף לתוך מיכל ערבוב ולאט לאט לערבב (מקל עץ יכול לשמש ערבוב) באבקה שחורה פחמן עד שרף רווי עם האבקה אבל הוא עדיין נוזל ולא הופך מגורען. זה צריך להידמות דיו עבה ולהיות מסוגל לאט לטפטף ממקל העץ ללא גושים גלויים.
  20. כוון את דגימות הרקמה בתבנית גומי סיליקון וצלם תמונה כך שכיוון הדגימה בתוך בלוק הרשף יירשם וניתן יהיה להפנות אליו. מכסים את הדגימות שרף רווי שחור פחמן בקצה עובש סיליקון ומניחים את התבנית בתנור במשך ~ 1 שעה ב 65 מעלות צלזיוס.
    1. מניחים את התבנית בשיפוע כדי להכיל את שף בקצה התבנית שבו הוא מכסה את דגימת הרקמה. מקם תווית עם מזהה דגימת ניסוי/רקמה בתבנית בקצה הנגדי של ה-resin (איור 2A).
  21. מוציאים את תבנית הסיליקון מהתנור וממלאים את שארית התבנית בשרף שקוף (ללא פחמן שחור) ומוודאים שהתווית נשארת גלויה. לרפא את שרף חדורים פחמן שחור מספיק כדי לא בקלות לערבב עם שרף ברור.
    1. הכן באר נוספת בתוך התבנית שאינה מכילה רקמה. החל מהבאר הנוספת, מלאו את שארית התבנית עם שף שקוף.
    2. אם שורף חדורים שחור פחמן מתחיל לדמם לתוך שף ברור, מניחים את עובש סיליקון בחזרה לתוך התנור לזמן נוסף (למשל, 15 דקות).
    3. לאחר כל דגימות הרקמה כבר עקף עם שף ברור, מניחים את עובש הסיליקון בחזרה לתוך התנור (שטוח, ללא שיפוע) ב 65 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות כדי להשלים את תהליך הריפוי.

2. חסום הכנה

הערה: השיטה תהיה תלויה באופן הכיוון של הדגימה בבלוק ובאופן שבו יש לבצע את החיתוך. עם זאת, אוריינטציה הרקמה הנפוצה ביותר מוצאת את הרקמה מרוכזת בקצה של בלוק שף, בניצב לקצה הארוך של בלוק שף.

  1. ברוב המקרים, הראשון לקצץ את קצה הבלוק כדי לאתר את הרקמה על ידי הצבת בלוק הדגימה בצ'אק microtome עם קצה מחודד תקוע כ 5-6 מ"מ מתוך הצ'אק. לנעול אותו במקום עם בורג להגדיר ומניחים אותו תחת מנורת חום.
  2. לאחר מספר דקות הבלוק יהיה חמרן וקל לקצץ. הנח את הצ'אק במחזיק הסטריאומיקרוסקופ והשתמש בסכין גילוח דו-קצה חדש כדי ליצור חלקים דקים במקביל לפני הבלוק עד שהרקמה נראית לעין. זה נראה בצורה הטובה ביותר על ידי angling אור על פני הבלוק, מדגם הרקמה יהיה פחות רפלקטיבי פרטני בהשוואה לאותם חלקים של שרף כי הם נטולי רקמה. התייעץ עם התמונה שצולמה של דגימות רקמה לפני כניסתה של שרף רווי שחור פחמן לרעיון של איך ואיפה הרקמה ממוקמת.
  3. הניחו מחזיק סיכה אחד בצד למטרות זמירה. מחזיק סיכה זה לעולם לא ממוקם בתא SEM ולכן ניתן לטפל ללא כפפות, זה ייקרא מחזיק סיכה גיזום. כל מחזיק דגימה שנועד להיות ממוקם בתא ההדמיה לא צריך להיות נגע ללא כפפות. זה מונע החדרת שומן ושמן לתוך תא מיקרוסקופ.
  4. מניחים סיכת דגימת אלומיניום במחזיק סיכת החיתוך ומהדקים מעט את הבורג עם הפנים (משטח שטוח) של הסיכה המוחזקת 3-4 מ"מ מעל מחזיק הסיכה.
  5. הפוך כמה עמוק, שריטות חוצה מול הסיכה כדי לספק שטח פנים גדול יותר עבור הדבק המשמש להחזיק את הדגימה במקום. אם נעשה שימוש בפינת אלומיניום, מומלץ מברג פלדה שטוח קטן לשלב זה (איור 2B).
  6. מניחים את הצ'אק המכיל את דגימת הרקמה בחזרה מתחת למנורה החום עד שרף הופך רך חמרן, ולאחר מכן למקם אותו לתוך כלי קיבול צ'אק מתחת סטריאומיקרוסקופ.
  7. שימוש בסכין גילוח בעל קצוות כפולים כדי לחתוך עודף שרסן מחלק בלוק השלם המכיל את דגימת הרקמה. בסופו של דבר גודל בלוק הרקמה המחובר לסיכה יהיה בקוטר של כ -3 מ"מ וגובהו 2-3 מ"מ.
    1. בזהירות לדחוף את סכין הגילוח ישר לתוך בלוק שרף בערך 1-2 מ"מ, ולאחר מכן בזהירות לדחוף את סכין הגילוח אופקית לתוך בלוק שרף בעומק שווה לחתוך הקודם. לעשות את זה לאט ובזהירות רבה, כפי שניתן נזק או לחתוך את החלק של הבלוק המכיל את דגימת הרקמה. כששני החתכים ייפגשו, עודפי החלף ייפרדו מהבלוק. המשך להסיר את השרף עד שנשאר רק שטח מוגבה של 3 מ"מ x 3 מ"מ.
  8. לאחר זמירה ראשונית זו, מניחים את הבלוק (עדיין בצ'אק) מתחת למנורת החום במשך מספר דקות.
  9. ברגע שהצבר הופך רך וחכם, הנח את הבלוק בחזרה מתחת לסטריאומיקרוסקופ. בעזרת סכין גילוח דו-קצה חדש, חותכים את החלק העליון של בלוק השלכה, בערך 1 מ"מ מתחת לחלק הגזום, עם חתך חלק אחד. משטח שטוח עדיף כמו זה יהיה מודבק סיכת הדגימה. היזהר לא לאפשר את המדגם ללכת לאיבוד, כמו שלב זה דורש כוח כלשהו אשר יכול להעביר לחלק הוסר של הבלוק ולגרום לו לעוף משם. מניחים את הדגימה החתוכה והחצוצה בצד.
  10. הנח את מחזיק סיכת החיתוך המכיל את סיכת האלומיניום החתוכה בכלי הקיבול סטריאומיקרוסקופ. החל שכבה דקה של דבק ציאנואקרילאט על פני הסיכה כך שהוא מכסה לחלוטין את הסיכה מבלי ליצור מניסקוס גלוי. להרים את החתיכה הגזוזה של בלוק הרקמה עם מלקחיים ומניחים על פני הסיכה. מרכז את דגימת הרקמה על סיכת הדגימה. לדחוף אותו למטה ולהחזיק אותו במשך כמה שניות. אפשר להגדיר את הדבק למשך מספר דקות.
  11. כאשר הדבק יבש לחלוטין, הנח את מחזיק סיכת החיתוך בחזרה מתחת לסטריאומיקרוסקופ. באמצעות קובץ בסדר, קובץ משם עודף שף כך שאין שף הוא overhanging הסיכה. צורת אשר אמורה להידמות לראש הסיכה העגול.
  12. אתר את הרקמה בחלק המוגבה של בלוק שף שלך, תאורה אלכסונית שימושית לכך. באמצעות סכין גילוח פיפיות, יש לקצץ את החלק המוגבה של השפם המכיל את דגימת הרקמה לאזור שאינו עולה על 1 מ"מ2. במידת האפשר, ניתן לקצץ את פני הבלוק אפילו קטן יותר, זה יפחית את הלחץ על סכין היהלום ולשפר את תוחלת החיים שלה.
    1. הסר כמו עודפי שף ככל האפשר, משאיר את הבלוק קצת יותר בממד אחד. זה נעשה לאט ובזהירות, כפי שהוא אפשרי עבור שף המכיל את דגימת הרקמה להתנתק אם יותר מדי כוח מוחל. בעוד סכין גילוח מומלץ, קובץ מתכת בסדר יכול לשמש לשלב זה.
  13. עם זווית קובץ מתכת עדינה את עודף החלף, באזור שמחוץ לחלק המוגבה המכיל את דגימת הרקמה, כלפי מטה לכיוון קצה הסיכה (איור 2C).
  14. הסר חלקיקי שף ואבק מהמדגם המוכן לפני החלת צבע כסף ואחריו sputtering זהב. מערבבים כסף עם אצטון כך שהוא נוזל הניתן להפצה בקלות, בדומה ללק ציפורניים (אך לא כל כך דק שהוא מטפטף מהמוליך) ומחילים מעיל דק על כל משטח הבלוק לדוגמה. אצטון מתאדה במהירות, ולכן ייתכן שיהיה צורך להוסיף אצטון נוסף כמו צבע כסף מתחיל להתעבות.
    1. אפשר לצבע הכסף להתייבש בן לילה לפני העמסה למיקרוסקופ.
      הערה: שכבת כסף זו חייבת להיות דקה כדי להימנע מהרחבת פני הבלוק מעבר ל- 1 מ"מ x 1 מ"מ, ובעוד שצבע הכסף מעולם לא פגע בסכין היהלום, עדיין מומלץ לשמור על תוחלת החיים של סכין היהלום. האצטון מעורבב עם הכסף חייב להתאדות לחלוטין לפני זהב sputtering או טעינת המדגם לתוך המיקרוסקופ, כדי למנוע החדרת אדי אצטון לתוך תא ההדמיה.
    2. לאחר יישום של צבע כסף, להחיל שכבה דקה של זהב על בלוק המדגם. באמצעות מכשיר sputtering ואקום סטנדרטי מצויד יעד רדיד זהב סטנדרטי, לחץ תא של 200 מיליטור (גז ארגון) ו 40 מיליאמפר פועל במשך 2 דקות יגרום ציפוי זהב 20 ננומטר עבה.
  15. לאחר הציפוי, מניחים את הבלוק רכוב וקצוץ בצינור עם תווית הניסוי המתאימה המצורפת. צור צינורות מותאמים אישית באמצעות פיפטות העברה חד פעמיות.
    1. חותכים את פיפטה העברה ממש מתחת הנורה, משאיר חלק קצר של צינור פיפטה העברה מחובר מתחת לקצה בולבוסי. לקצר את החלק הצינורי שנחתך משם, ולחתוך את קצה פיפטה בחזרה מספיק, כך סיכת דגימת אלומיניום ניתן לדחוף מתכרבל בתוכו.
    2. מניחים את הקצה המכיל את סיכת דגימת האלומיניום בתוך הקצה בולבוסי של פיפטה העברה שונה.
  16. לפני טעינת בלוק רקמה מוכן, בזהירות לקצץ צבע כסף עודף מפני השטח של פני הבלוק.

3. הגדרות SEM להדמיית פני הבלוק

הערה: הגדרות ההדמיה הבאות יוצרו במכשיר המשמש את המחברים, המופיע בטבלת החומרים שסופקה. בעוד מכשיר זה מסוגל הדמיית לחץ משתנה, התוצאות הטובות ביותר נלכדו תחת ואקום גבוה.

  1. זמן השתהות: השתמש 12 μs / px במהלך חתך טורי. כאשר אזור מעניין זוהה, ניתן לרכוש תמונה ברזולוציה גבוהה יותר ב- 32 μs/px.
  2. הגדרות ואקום: השתמש בלחץ אקדח של 9e-008 Pa, לחץ עמודה של 1.1e-004 Pa, ולחץ תא של 9.5e-002 Pa.
  3. זמן לכידה: עם ההגדרות לעיל, לכוד מחסנית תמונות px 2048x2048 בקצב של 50 שניות לתמונה. תמונות ברזולוציה גבוהה יותר של אזורי עניין ניתן ללכוד ב 4096x4096 px בפחות מ 9 דקות לתמונה.
  4. עובי מקטע: השתמש 100-200 ננומטר. פחות אפשרי, אך עשוי לדרוש מתח קרן נמוך יותר, עוצמה או זמן שההתעכבות.
  5. מתח גבוה (HV): השתמש 7-12 kV. בעוד הגדלת המתח מפחיתה את גודל הספוט ומגבירה את הרזולוציה, היא מציגה אפשרות נוספת לנזק לקרן. kV גבוה יותר מגביר את חדירת הקרן שתוצאתה אובדן פרטים. עם זאת, הורדת ה-kV פוגעת ביחס האות לרעש (איור 3)14.
  6. עוצמת קרן (BI): התקן SBF-SEM של המחבר מציע סולם עוצמת קרן הנע בין 1-20. בסולם זה, ערכים של 5-7 מעניקים תמונות איכותיות ללא טעינה מוגזמת ונזק לקרן. ככל שה-BI גבוה יותר ככל שהרזולוציה גדולה יותר, יש סיכוי גדול יותר לטעינה ולנזק לקרן14.
  7. גודל ספוט והגדלת תמונה: קבע את גודל הספוט לפי עוצמת הקרן ורמת המתח. באופן אידיאלי, גודל הספוט לא צריך להיות גדול יותר מגודל הפיקסלים שבו נעשה שימוש. גודל הפיקסל נקבע על-ידי חלוקת שדה הראייה (FOV) במספר הפיקסלים. לדוגמה, FOV של 25 מיקרומטר עם גודל תמונה של 2048x2048 px ייתן 12.2 ננומטר לפיקסל. לכן גודל הספוט צריך להיות לא יותר מ 12.2 ננומטר. איור 4 מראה כיצד HV, BI וגודל ספוט קשורים זה לזה.
  8. מרחק עבודה (WD) - עם הדמיית פני בלוק, מרחק העבודה אינו מתכוונן. זה פשוט גורם של מיקוד. זה יהיה כמעט זהה לכל הבלוקים בתמונה. בעוד מרחק העבודה אינו מתכוונן, הוא ממלא תפקיד קריטי ברזולוציה של התמונה שנלכדה. ככל שמרחק העבודה פוחת, מגבלת הרזולוציה על תמונות שנלכדו גדלה. במקרים מסוימים ניתן יהיה להקטין את מרחק העבודה על ידי ביצוע שינויים בתוך תא ההדמיה, אולם שינויים אלה חייבים להתבצע על פי שיקול דעתו של המשתמש. על מנת להקטין את מרחק העבודה ולהגדיל את רזולוציית התמונה, שחררנו את ברגי המיקרוטום להרכבה על הדלת ומיקמנו מחדש את המיקרוטום כך שהוא נח ~ 2 מ"מ קרוב יותר לגלאי הקרן לאחר שהורט מחדש את הברגים.
  9. רזולוציה - באמצעות ההגדרות לעיל, x & y רזולוציה גבוהה ככל 3.8 ננומטר אפשרי. חשוב לציין כי הרזולוציה מוגבלת על ידי גודל ספוט קרן, כמו גם את רזולוציית הפיקסל של לכידת התמונה (למשל, שדה 20 מיקרומטר של תצוגה שנתפסו בתמונה 2048x2048 פיקסל יש רזולוציה פיקסל של 9.8 ננומטר, גם אם נעשה שימוש בגודל ספוט 3.8 ננומטר). רזולוציית התמונה במישור z תלויה בעובי החתך, אנו מוצאים כי 100-200 ננומטר עובד היטב עם פרוטוקול זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עכבר קרנית
פרוטוקול זה הוחל בהרחבה על הקרנית של העכבר. באמצעות SBF-SEM הדמיה רשת של חבילות microfibril נטול אלסטין (EFMBs) הוצגו להיות נוכח בתוך הקרנית העכבר הבוגר. בעבר האמינו כי רשת זו הייתה נוכחת רק במהלך התפתחות עוברית ותחילת הלידה. SBF-SEM חשף רשת EFMB נרחבת ברחבי הקרנית, עם סיבים בודדים שנמצאו בקוטר של 100-200 ננומטר כאשר נמדדים בהצלבה. כמו כן נמצא כי רשת EFMB זו אורגנה בשכבות נפרדות, עם סיבים הקשורים קשר הדוק עם קרטוציטים, אפילו שוכב בתוך פלישות רדודות על פני השטח keratocyte (איור 5). הגילוי של סיבי EFMB בקרנית הבוגרת הוביל מיקרוסקופ אלקטרונים תיוג אימונוגולד (TEM), פלואורסצנטיות ומחקרים confocal כדי להבין עוד יותר את אופיה של רשת זו23.

יישום נוסף של פרוטוקול זה הוביל לגילוי אוכלוסייה לא ידועה בעבר של עצבי קרנית מרכזיים המתמזגים עם תאי אפיתל בסיסיים בגבול הסטרומה-אפיתל(איור 6). בעבר, האמינו כי כל העצבים אינטראקציה עם האפיתל בגבול זה חדר לתוך אפיתל הקרנית ונגח לייצר את plexi תת-basal ואפיתל. במחקר זה, ~ 45% מהעצבים המרכזיים אינטראקציה עם אפיתל הבסיס עבר היתוך תאים ולא חדירה פשוטה. באמצעות שיטות סטריאולוגיות המיושמות על ערכות נתונים SBF-SEM, ניתן היה להראות כי אוכלוסיית עצבים חדשנית זו הייתה ביחס פנים אל נפח בערך מחצית מזה של עצבים חודרים, עולה בקנה אחד עם המראה "נפוח" שלהם (היתוך עצבי - 3.32±0.25, חדירת עצבים - 1.39±0.14, p ≤ 0.05). נוצרו שחזורים תלת מימדיים של חבילות עצבים חודרות ומתמזגות והמיטוכונדריה שלהן, המדגישות את היעדר המיטוכונדריה בחלקים מותכים של חבילות העצבים. הגילוי של היתוך תאי אפיתל עצבי באמצעות SBF-SEM הוביל מחקרים פלואורסצנטיים המאמתים המשכיות קרום בין שני תאים התמזגו21.

הקרנית המרכזית היא רקמת כלי דם, וככאלה כלי הדם הלימביים ההיקפיים הם בעלי חשיבות מיוחדת לבריאות הכללית של הקרנית. קשרי הגומלין בין תאי התא והמבנה האולטרה-מבנה של אזור זה הם מורכבים; עם זאת, היכולת להעריך אינטראקציות תאים אלה וחיבורים אולטרה-מבניים הוגבלה במחקרי פלואורסצנטיות ומדור יחיד של TEM. מסיבה זו, מחסנית תמונות SBF-SEM המכילה כלי דם גפיים, חבילות עצבים ותאים משויכים חולקה ידנית לשחזור תלת-ממדי (איור 7). בתמונה זו הקשר ההדוק בין צמתים אנדותל כלי דם ו pericyte כיסוי, גרגירים בודדים של תא התורן perivascular, הגרעין ואת הקצה המוביל של נויטרופילים זוחלים לאורך פני השטח החיצוניים של דופן כלי הדם, כמו גם צרור עצבי חולף ניתן לראות.

יחד, גוף זה של עבודה מדגים את היכולת של פרוטוקול זה לייצר באיכות גבוהה מיקרוסקופיה אלקטרונים 3D ערכות נתונים ברקמות עשירות מטריצה חוץ תאית אפיתל, כמו גם כלי דם ותאים נלווים.

רשתית פרימטים מסדר גבוה יותר - מקלעת עצבים ורשת כלי דם
שכבת סיבי העצב ברשתית (RNFL) של פרימטים מסדר גבוה יותר מכילה ותלויה ברשת כלי דם נרחבת. לעתים קרובות, מחלות של הרשתית כרוכות בשינויים בשני הפרמטרים של שכבת סיבי העצבים ברשתית, כמו גם את כלי הדם שנמצאו בתוכה. הבנת הקשר בין RNFL לבין רשת כלי הדם שלה ברקמה בריאה ולא פתולוגית היא הצעד הראשון להבנת כל שינוי שעלול להתרחש כתוצאה ממחלה. כדי להבין טוב יותר את הקשר הזה, פרוטוקול SBF-SEM הוחל על רשתית פרימטים מסדר גבוה יותר רגיל ושחזור רשת כלי הדם בוצע ונתונים נפחיים שחולצו משחזור זה (איור 8). זה 4,642,307 מיקרומטר3 אזור של RNFL הכיל מיטת כלי דם 1.207x10-4 μL בנפח, מהווה 2.6% מהנפח הכולל של RNFL. עבודה זו מדגימה את היכולת של פרוטוקול זה לייצר ערכות נתונים מיקרוסקופיות אלקטרונים 3D באיכות גבוהה ברקמה נוירולוגית צפופה.

זברהפיש ולב דניו ענק - שריר מפוסס ופיתוח כלי דם
הן דג הזברה והן הדניו הענק הם מודלים חשובים להתפתחות הלב ולהתחדשותו. מבחינה היסטורית, לב הזברה נחשב מורכב משני מקטעים שריר הלב נפרדים אנטומית מתפקדים יחד בתמיכה בדרישות הפיזיולוגיות של דג הזברה. עם זאת, הממשק בין שתי שכבות חדר אלה לא היה מובן היטב. באמצעות פרוטוקול זה, אזור צומת שלא זוהה בעבר התגלה המורכב מגיליון דק של פיברובלסטים. נמצא כי פתחים בתוך גיליון זה אפשרו לשני מקטעי שריר לב נפרדים לבוא במגע וליצור צמתים מורכבים הידבקויות כולל desmosomes ו fasciaחסידים 22.

פרוטוקול זה נוצל בעבודה נוספת לבחינת רשת כלי הדם של לב דניו הענק המתפתח (איור 9). שיטה זו מאפשרת הערכה תלת מימדית של רשת מיוציטים לבבית המתפתחת ויחסיה עם פיתוח מיקרו-וסקולטורה. יחד, עבודה זו מדגימה את היכולת של פרוטוקול זה כדי לייצר באיכות גבוהה 3D מיקרוסקופיה אלקטרונים ערכות נתונים בשרירים ורקמות vascularized מאוד.

הגדרות תמונה, טעינה ורזולוציה
בעוד קיבעון מתאים וכתמים ממתכת כבדה נחוצים להדמיית SBF-SEM איכותית, חשוב לא פחות הוא השימוש בשרף מוליך והגדרות הדמיה נאותות לשאלות המטופלות. בפרוטוקול זה, השימוש בשחור פחמן משמש על מנת להגדיל את המוליכות של בלוק המדגם ולספק צינור לסיכה הרכבה לפינוי אלקטרונים משניים מפני הבלוק. זה הוכיח יעילות במאבק טעינת רקמות אשר לעתים קרובות משפיל את איכות התמונה ברקמות לא מוכן עם פחמן שחור16. בנוסף, צבע הכסף ו sputtering זהב להחיל על הבלוק מספק מסלול פיזור הצטברות אלקטרונים. מכשירים מסוימים מאפשרים תוספת של מפצה טעינה מוקדי, אשר מפחית את הטעינה על ידי החלת נשיפה של חנקן על פני הבלוק, אולם יש לנו הצלחה דומה עם השימוש בשחור פחמן ואת היישום של צבע כסף זהב sputtering לבלוק15. חוסר מוליכות מדגם יכול להוביל להצטברות אלקטרונים הנראית כטעינת רקמות (איור 1), כמו גם הפרשות הנראות כהסטת תמונה פתאומית ועיוותים המפחיתים באופן דרמטי את איכות התמונה (איור 10B & F). השימוש בשחור פחמן מאפשר הדמיה תחת ואקום גבוה ושימוש בהגדרות תמונה שתוצאתן יחס אות לרעש גבוה ורזולוציית תמונה משופרת. הגדרה אחת כזו שמובילה לשיפור באיכות התמונה היא זמן השתהות הפיקסלים. תהליך ההדמיה SBF-SEM כרוך בסריקת רסטר של קרן אלקטרונים על פני פני השטח מדגם כדי ליצור אלקטרונים backscattered אשר גלאי מיקרוסקופ יכול לאסוף ולפרש כאות. משך הזמן שבו קרן זו רשאית לשכון בתוך השטח של כל פיקסל מוביל לערך פיקסל מדויק יותר המוקצה לכל מיקום פיקסל (איור 3A & B)2. יש איזון שיש להכות בין אות מוגבר לרעש, רזולוציה ונזק טופלו על פני הבלוק עם זאת. הקרן מקרינת ביעילות את פני הבלוק עם אלקטרונים בעלי אנרגיה גבוהה שיכולים להתפרק ולרכך שרף וכתוצאה מכך השפלה של התמונה וסיבוכי חיתוך (איור 10)28. ככל שנדרשת רזולוציית z דקה יותר, כך קשה יותר לשמור על הדמיה ברזולוציה גבוהה. אנו משתמשים בדרך כלל z-צעדים של 100-200 ננומטר, אולם z-צעד גדלים של 25-50 ננומטר דווחו5,29,30,31. עם z-צעדים בגודל זה, פירוק וריכוך של שרף עקב נזק לקרן יכול להוביל לדחיסה של שרף גורם הסכין לפספס חתך או לחתוך את פני הבלוק אבל עם "פטפוט" שבו הסכין מדלג על פני השטח של הבלוק יצירת אדוות להקות13. בעוד שצעדי z קטנים הם אפשרות אטרקטיבית, חשוב לזכור את שאלת המחקר הספציפית בעת בחירת שלב z מתאים. דגימת יתר יכולה להוביל לשיקולי אחסון נתונים משמעותיים, כמו גם לעלייה בזמן הנדרש לייצור שחזורים תלת-ממדיים.

קיבוע רקמות וכתמים
לפני דגירה ממתכת כבדה, יש לתקן רקמות בגלוטארלדהיד. בעוד אנו ממליצים בחום קיבוע מיקרוגל תחת ואקום לשימור רקמות ultrastructure27, אם מיקרוגל כיתה מעבדה אינו זמין מיקרוגל מהפך מסחרי עם הספק משתנה ניתן להחליף32,33,34,35. אם זה נעשה, טיפול נוסף צריך להיות מועסק כדי להבטיח כי עיוות רקמות לא מתרחשת. קיבוע רקמות לא תקין עלול לגרום לשינוי במורפולוגיה של רקמות כפי שניתן לראות באיור 10E. פרוטוקול זה, כמו רוב פרוטוקולי הכתמת SBF-SEM המודרניים, הותאם מהליך הכתם שהותווה על ידי Deerinck בשנת 201017, בהתבסס על כתמי אוסמיום-thiocarbohydrazide-osmium שנוצרו על ידי וילינגהאם ורות'רפורד בשנת 198436. המתכות הכבדות המשמשות בפרוטוקול זה מוסיפות ניגודיות למבנים התאיים בתוך דגימת רקמה (איור 1). הדגירה הראשונית של אוסמיום מתרחשת עם אוסמיום מופחת אשר נקשר לאג"ח C = C בשומנים בלתי רוויים המובילים לכתמי קרום ושומנים37,38. אוסמיום מצטמצם על ידי אשלגן ferrocyanide, אשר מסייע בכתמים של שומנים רוויים וגם פועל כדי לייצב פוספוליפידים39,40. Thiocarbohydrazide מתווסף לאחר מכן כמו mordent שנקשר לאוסמיום מהדגירה הראשונה, מתנהג כגשר שעליו אוסמיום נוסף קשור בשלב מאוחר יותר בפרוטוקול41. אורניל אצטט, שהוא מלח אורניום, הוא חומר מנוגד יעיל עבור שומנים, חומצות גרעין וחלבונים, בעוד ציטראט עופרת משפר את הניגודיות של חלבונים וגליקוגנים. הזיקה המשתנה של סוכנים אלה לרכיבים תאיים משפרת עוד יותר את הניגוד הכולל בתוך רקמות מעל ומעבר לדגירות אוסמיום42.

הדמיית פני הבלוק
איור 11, איור 12, איור 13 מדגימים את ההשפעות המשולבות של מתח, זמן השתהות פיקסלים ועוצמת הקרן. תרגול קונבנציונלי מציע שילוב של מתח נמוך, זמן שהייה קצר ועוצמת קרן נמוכה נחוצים להדמיה אופטימלית ומניעת נזק לקרן לבלוק המדגם. בניגוד להגדרות אלה, איור 11, איור 12, איור 13 ממחישים כי מתחים גבוהים יותר (למשל, 7 kV), זמני שהייה ארוכים יותר (32 מיקרוס/px) ועוצמות קרן גבוהות יותר (הגדרה 6 במקרה שלנו) יכולים לייצר איכות תמונה מעולה על פני הגדרות קונבנציונליות.

SBF-SEM מאפשר איסוף של תמונות מיקרוסקופיה אלקטרונים סדרתי אשר ניתן לאסוף כקבוצה נתונים 3D המורכב voxels. אמנם זהו שימוש רב עוצמה מאוד של SBF-SEM, שיטה זו מאפשרת גם הדמיה מהירה וחוזרת על עצמה של אירועים ביולוגיים נדירים או תאים. ניתן לפקח על רכישת תמונות באמצעות SBF-SEM לאירועים נדירים, והדמיה מושהית כדי לאסוף תמונות הגדלה/רזולוציה גבוהות יותר של אירועים אלה. יתר על כן, ניתן להסיר את הבלוק מתא המיקרוסקופ ואת פני הבלוק חתוכים עבור מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) הדמיה. בדרך זו ניתן לאסוף ערכות נתונים גדולות של אירועים נדירים באמצעות SBF-SEM, כמו גם מוערך בסולם חרדה באמצעות TEM.

Figure 1
איור 1: השוואות SBF-SEM ו- TEM בשלבים שונים בפרוטוקול. פרוטוקול זה מכיל שלבים מרובים שבהם רקמת הדגימה מוכתמת במתכות כבדות. זה משפיע לא רק על ניגודיות רקמות והערכה של מבנים תאיים organelles, אלא גם את רמות הטעינה המתרחשת כאשר הרקמה הוא בתמונה. איור זה מכיל שלוש תצוגות נפרדות של רקמה מוכנה: תצוגת הגדלה נמוכה (A, D &G), תצוגת הגדלה גבוהה (B, E &H), והשוואת TEM של קרנית עכבר מוכנה (C, F & I). ניתן לציין כי תמונות הגדלה גבוהות יותר יכולות לגרום לטעינת רקמות מוגברת, שכן קרן האלקטרונים מרוכזת באזור קטן יותר של רקמה. השורה העליונה (A-C) היא מדגם מייצג מרקמות המעובדות עד להשלמת שלב 1.8, וספגה אשלגן פרוציאניד, אוסמיום טטרוקסיד ותיאוקרבוהידראזיד. החצים בשתי העמודות הראשונות מציגים את ממשק האפיתל-סטרומה כנקודת התייחסות. שים לב לרמת הניגוד הנמוכה בהשוואה לשתי השורות התחתונות, כמו גם לרמות המוגברות של טעינת רקמות. המדגם בשורה האמצעית (D-F) עובד עד להשלמת שלב 1.10 והוא נהנה משלב נוסף של אוסמיום טטרוקסיד, והוא מנוגד יותר בעליל מהמדגם בשורה העליונה. בעוד מבנים סלולריים ניכרים, הטעינה עדיין קיימת. המדגם בשורה התחתונה (G-I) נהנה מפרוטוקול הכתם המלא ויש לו טעינת רקמות מינימלית. הדמיית TEM מגלה רמות ניגודיות רקמות המוענקות על ידי מתכות כבדות הנמצאות בכל שלב (עמודה ימנית): אברונים באנדותל הקרנית (*) מנוגדים יותר ונראה לעין ככל שעיבוד הרקמות ממשיך דרך הפרוטוקול. בנוסף, פרטי קולגן ופיברילין סטרומה הופכים גלויים יותר (ראש חץ) עם השלמת הפרוטוקול. פאנל A, D & G סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. לוח B, E & H סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לוח C, F & I סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר.

Figure 2
איור 2: סכמטי של בלוק רקמה מוטבע, סיכת דגימה והכנה סופית. (A) יש למקם רקמה בכיוון ידוע בקצה עובש השרף והשליש העליון של התבנית המלאה בשרף רווי שחור פחמן. האזור של עובש הרחוק ביותר מן הרקמה צריך להישאר ברור, כך תווית הניסוי ניתן לראות בבירור. (B) משטח סיכה דגימה צריך להיות שרוט כדי לייצר דפוס רשת, זה מאפשר שטח גדול יותר של מגע עבור דבק cyanoacrylate להקשיח בין בלוק דגימה מוכן סיכה. (C)שרף רווי שחור פחמן צריך לעשות שטח רחב של מגע עם ראש סיכת הדגימה, אולם האזור שנחתך על ידי סכין היהלום צריך להיות לא יותר מ 1x1 מ"מ. מומלץ לחדד את הבלוק לכיוון הקצה. זה ממזער את חיתוך הכוחות על סכין היהלום ועל ידי בעל בסיס רחב יותר, הבלוק הוא עמיד יותר להפרדה מן הסיכה במהלך חיתוך. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: השוואה בין הגדרות לכידת תמונה. (A & B) חלוניות A ו- B משווות איכות תמונה ורזולוציה כפונקציה של זמן השתהות פיקסלים. לוח A נוצר באמצעות זמן שהות של 32 מיקרומטר/פיקסל ב- 4 kV וסובל מיחס אות לרעש מופחת כפי שהוא ניכר במראה "הגרעיני" של הכניסה המוגדלת. לוח B נוצר באמצעות זמן השתהות של 100 מיקרומטר/פיקסל ב- 4 kV. הגדלת זמן ההשבתה של הפיקסל מגדילה את יחס האות לרעש וחושפת רמה מוגברת של פרטים תאיים, אולם זמן השתהות מוגבר בפיקסלים עלול להוביל לטעינת רקמות ו/או הצטברות חום שמרככת את הבלוק ומציגה חפצי חיתוך (פטפוט) בעת חיתוך. לוחות C ו- D משווים תמונות שנלכדו בתנאי חשיפה זהים אך עם שני ערכי קרן kV שונים. רקמה בלוחות אלה היה ספוג עם חלקיקי ננו-גולד בגווני זהב כדי להפוך את ההבדלים במעמקי חדירת הקרן ברורים יותר. לוח C נלכד ב 9 kV בעוד פאנל D נתפס ב 21 kV. kV מוגברת יש את היתרון של ניגודיות מוגברת (D), אולם הפרטים הולכים לאיבוד כתוצאה של איסוף אלקטרונים מעומק גדול יותר של רקמה (C). כתוצאה מדגימה של חתך רוחב גדול יותר, מספר גדול יותר של חלקיקים אימונוגולדיים ספציפיים עבור GAP 43 גלויים בעוד תיוג לא ספציפי נשאר זהה וכתוצאה מכך יחס אות לרעש מוגבר. פס קנה מידה של לוח A & B = 2 מיקרומטר. פס קנה המידה של לוח C & D = 1 מיקרומטר.

Figure 4
איור 4: עוצמת קרן, kV וגודל ספוט. (A) בעת יצירת קשר עם דגימת הרקמה, קרן האלקטרונים (כחול בהיר) מניבה נפח אינטראקציה בצורת דמעה, שממנו צורות שונות של אנרגיה מופקות מהאינטראקציה בין אלקטרוני הקרן לבין דגימת הרקמה. צורת הדמעות היא פונקציה של צפיפות רקמות וכתמי מתכת כבדים יחד עם אנרגיית קרן, וזווית ההטיה של קרן האלקטרונים43. בעוד שצילומי רנטגן, אלקטרונים אוגרים ואלקטרונים שלישוניים מיוצרים במהלך הדמיית SBF-SEM, הדאגה העיקרית היא עם אלקטרונים אחוריים (כחול כהה) ומשניים (ירוקים)13. התמונה המופקת באמצעות הדמיית SBF-SEM מופקת על ידי איסוף אלקטרונים מעוכים לאחור. אלקטרונים אלה נובעים מאינטראקציות אלסטיות בין הקרן לבין המדגם, והאות שנאסף תלוי מאוד במספר האטומי של אטומים הקשורים - ומכאן הצורך בכתם מתכתכבדה 44. אלקטרונים משניים מקורם באינטראקציות אינלסטיות בין הקרן לבין המדגם וזיהוי האות שלהם תלוי מאוד בכיוון פני השטח. מכיוון שפני הבלוק שטוחים ב- SBF-SEM, אלקטרונים משניים אינם תורמים באופן משמעותי לאות שנאסף13. למעשה, הצטברות אלקטרונים משנית על פני השטח של הבלוק יכולה להיות מקור עיקרי לטעינה ויש לה השפעה מזיקה על איכות התמונה2. (B) גרף זה מציג את הקשר בין עוצמת הקרן, קרן kV וגודל הספוט. גודל הספוט הוא הרזולוציה המרחבית של הקרן, וקובע את מגבלת הרזולוציה של התמונות המופקות. הנמכת kV מגדילה את גודל הספוט, אך גם מקטינה את עומק ההדמיה ומאפשרת הערכה עדינה יותר של הפרטים. זה יש את ההשפעה של הפחתת האות לגילוי גם כן. הגברת עוצמת הקרן מציעה שיפור ראשוני בגודל הספוט ובזיהוי אותות, אך מגבירה במהירות את רמות טעינת הרקמות. בסופו של דבר, עוצמת הקרן וערכי kV שנבחרו הם תלויים במדגם ונקבעים בצורה האמפירית הטובה ביותר ביחס לשאלה המדעית הנשאלת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: רשת צרור מיקרופיבריל נטולת אלסטין בקרנית העכבר. שחזור תלת מימדי של מיקרופיברילים (לבנים) הקשורים קשר הדוק לקרטוציטים (צהוב, כתום וירוק) בתוך סטרומה הקרנית. ניתן לראות את המיקרופיברילים בסמוך, ובמקרים מסוימים בתוך חריצים רדודים פנימה, קרטוציטים הקרנית (חצים)(A). רשת זו של מיקרופיברילים נטולי אלסטין מאורגנת בשכבות נפרדות בתוך סטרומה הקרנית(B). סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. בלוק התמונה משוחזר הוא 45x45 מיקרומטר בציר x &y, ו 30 מיקרומטר בציר z עם voxel ברזולוציה של 22x22x100 ננומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: שחזור עצבי הקרנית העוברים דרך בזלת למינה בגבול הסטרומה-אפיתל. עצב זה ניתן לראות bifurcate לפני החדירה. לאחר חדירה לתוך הכינוי, שני ענפי העצבים עברו השלכות. המיטוכונדריה (צהוב) נראים בחלקים סטרומה ואפיתל של צרור העצבים. סרגל קנה מידה = 2.5 מיקרומטר. בלוק התמונה משוחזר הוא 25x25 מיקרומטר בציר x &y, ו 14 מיקרומטר בציר z עם רזולוציית voxel של 12x12x100 ננומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: כלי דם לימביים ותאים משויכים בקרנית העכבר ההיקפית. תמונה בודדת (A) מבלוק תמונה תלת-ממדית (B) ניתן לראות שדרכו כלי שיט, צרור עצבים ותאים משויכים נעים. לוח C מציג כלי משוחזר (אדום) עם פריטיט (אפור) משויך כרוך סביבו מכסה את צמתים תא אנדותל. צרור עצבים (כחול) דו-קוטבי בסמיכות לכלי זה כשהוא נע דרך הרקמה. ניתן לראות נויטרופילים (צהובים) במקביל לציר הארוך של הכלי, כאשר הגרעין הפולימורפי שלו נראה בתוך גוף התא שלו והאורופוד הנגרר נראה כמו בליטה לכיוון ימין התמונה. תא תורן (מגנטה) נראה בחלק התחתון של הכלי. פאנל D מבודד תא תורן זה, שבו גרגיריו (ירוק) ניתן לראות בקלות רבה יותר כיסוי הגרעין (סגול) בתוך התא. פאנל E מדגיש את המבנים התאיים מכוסים בשחזורים התאיים, עם גרעיני אנדותל המסומנים בכחול, ומיקרו-חלקיקים דבקים הנראים בלומן כלי השיט (כתום). החצים מראים גבולות תא בין תאי אנדותל, אשר ניתן לראות עוד יותר כמו רכסים מוגבהים המשתרעים לאורך התאים בצד הזוהר של הכלי. פס קנה מידה A = 2 מיקרומטר. בלוק התמונה המשמש לשחזור תאים אלה הוא μm 30x30 בציר x &y, ו 42.5 מיקרומטר בציר z עם רזולוציית voxel של 14.6x14.6x100 ננומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: רשת כלי דם משוחזרת של שכבת סיבי הרשתית הלא אנושית של הפרימטים. (A)תמונה 200x200 מיקרומטר SBF-SEM של הרשתית הפרימט נלקח ב 8192x8192 px. המיקום שנדגם הוא ~ 500 מיקרון משולי שפת הזמן הנחותים של עין בריאה ללא פתולוגיה. סדרת התמונות ששוחזרה בלוחות C & D נלכדה ב- 2048x2048 px, כאשר ההדמיה הושהתה כך שניתן יהיה לדמיין אזורים בעלי עניין ב- 8192x8192 px. לוח ב' הוא האזור בעל השכבות בחלונית A, שנלקח ישירות מהתמונה המקורית. שימו לב למספר הגדול של האקסונים והמיטוכונדריה שלהם. (C)סעיף אורתוסליק דרך נפח רקמת μm 200x200x200 של שכבת סיבי עצב זמן נחותה של עין השליטה, עם כלי דם מפולחים. (D)הקרנת Z של כלי הדם של שכבת סיבי העצב. סידרה זו מדגימה את הרזולוציה האפשרית בשדה גדול באמצעות מתודולוגיה זו. פס קנה מידה A = 20 מיקרומטר. פס קנה מידה של לוח B = 2 מיקרומטר. רזולוציית voxel סדרת תמונות היא 97.6x97.6x500 ננומטר. אזור הרזולוציה של פיקסל הריבית הוא 24.4x24.4 ננומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: פילוח ועיבוד נפח תלת-ממדי של כלי דם בלב הקומפקטי הענק דניו(Devario malabaricus). (A) מיקרוגרף דו מימדי בערימת תמונות, המציג את הפרופיל של כלי דם מרכזי בגודל (חץ) ונוקט אנדותל (ראש חץ), עם מיוציטים לבביים מקיפים עשירים במיטוכונדריה וסרקומרים מאורגנים היטב (*). (B)מיקרוגרף דו מימדי של מחסנית התמונה עם כלי בגודל נימי (חץ). (C) תחזיות Biorthogonal של מחסנית מיקרוגרף מראה נימי בלוח B מוקרן דרך פרוסה אורתוגונלית אחת. (D)עיבוד תלת מימדי של תאי אנדותל מקוטעים המצפים את כלי השיט המשוחזר. מאויר בירוק, אדום, כחול וסגול הם ארבעה תאי אנדותל נפרדים; תא האנדותל המתואר בכחול ניתן לראות בהצלבה בחלונית B (חץ), בעוד שתאי האנדותל המתוארים באדום (חץ) וירוק (ראש חץ) נראים בהצלבה בלוח A. לוחות A & סרגל קנה מידה B = 2 מיקרומטר. בלוק התמונה ששוחזר הוא 30x30 מיקרומטר בציר x &y, ו 16 מיקרומטר בציר z עם רזולוציית voxel של 14.6x14.6x100 ננומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 10
איור 10: סיבוכי הדמיה וחפצים. (A) האופי הגלי והמעוות של תמונה זו הוא תוצאה של הדמיה באמצעות זמן שהייה בפיקסל שהוא ארוך מדי. זה מחמם את בלוק שורף, משאיר את הפנים בלוק רך גומי אשר וכתוצאה מכך תמונה מעוותת בעת חיתוך. (B) תמונה זו מכילה שורה של חפצים. כוכבית מציין עיוות גלי שנגרם על ידי הדמיה קודמת בהגדלה גבוהה יותר דומה פאנל A, ריכוז הקרן על אזור קטן יותר עם זמן להתעכב פיקסל ארוך יותר ריכך את שרף באזור זה של עניין. בעוד שתמונת ההגדלה הגבוהה יותר שנאספה הייתה נקייה מחפצים, הדבר עלול להוביל לסדרת תמונות עוקבת שבה המדגם שבבסיס אזור העניין נראה מעוות. פאנל זה גם מדגים את הנושא של הצטברות פסולת על פני הבלוק (חץ) במהלך ההדמיה, גם מסומן על ידי החץ בלוח E. אם זה הופך לבעיית הדמיה מתמשכת, יהיה צורך לשבור את הוואקום, לפתוח את התא ולפוצץ פסולת שהצטברה על סכין היהלומים וסביב הדגימה. הפרשות קטנות של אלקטרונים מפני הבלוק יכולות להוביל לשינויי הניגודיות המהירים ולקווים המסומנים על ידי ראש החץ הלבן. (C) תמונה זו ממחישה שריטות סכין על פני הבלוק. זה יכול להתרחש עקב סכין פגומה, או הצטברות פסולת על קצה הסכין. (D)החפץ המסומן (חץ) הוא תוצאה של קרן האלקטרונים המתמקדת (ללא חתך) בפני הבלוק לתקופה ממושכת כאשר הדגימה עדיין בתא ההדמיה. (ה)קיבעון לא תקין של רקמה יכול להוביל להפרדת מבנים תאיים ורקמת חיבור (*). (F) אם כמות גדולה של טעינה מתרחשת בלוק הרקמה או ההברכה שלך, הצטברות ופריקה לאחר מכן יכול להתרחש מה שמוביל את התמונה "דילוג" כפי שניתן לראות בתמונה זו. שים לב לעיוות של הרקמה בתמונה בנקודות דילוג (חצים) אלה. פאנל פס קנה מידה = 1 מיקרומטר. פס קנה מידה של לוח B = 2 מיקרומטר. פס קנה מידה של לוח C = 5 מיקרומטר. פס קנה מידה של לוח D = 2 מיקרומטר. סרגל קנה המידה של פאנל E = 25 אום. פס קנה מידה של לוח F = 50 אום. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 11
איור 11: רקמת הדמיה ב- 3 kV באמצעות זמני השתהות שונים של פיקסלים ועוצמות קרן. כל התמונות היו איסוף באמצעות קרן 3 kV, עוצמת הקרן היא בקנה מידה ספציפי למכשיר הנע בין 1 ל 20. השדה בתמונה הוא של לומן כלי הדם המכיל תאי דם לבנים ואדומים. ב- kV נמוך זה קשה להעריך את הפרטים הסלולריים. להגדלת זמן השתהות בפיקסלים הייתה השפעה מועטה. הגברת עוצמת הקרן ל-6 ניגודיות תמונה משופרת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 12
איור 12: רקמת הדמיה ב- 7 kV באמצעות זמני השתהות שונים של פיקסלים ועוצמות קרן. כל התמונות נאספו באמצעות קרן 7 kV, עוצמת הקרן היא בקנה מידה ספציפי למכשיר הנע בין 1 ל 20. השדה בתמונה הוא של לומן כלי הדם המכיל תאי דם לבנים ואדומים. ב 7 kV, הגדלת עוצמת הקרן וזמן להתעכב פיקסל תרם הדמיה באיכות גבוהה יותר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 13
איור 13: רקמת הדמיה ב-12 קילוואט-וי באמצעות זמני השתהות שונים של פיקסלים ועוצמות קרן. כל התמונות נאספו באמצעות קרן 12 kV, עוצמת הקרן היא בקנה מידה ספציפי למכשיר הנע בין 1 ל 20. השדה בתמונה הוא של לומן כלי הדם המכיל תאי דם לבנים ואדומים. ב- 12 kV, ההדמיה ממוטבת על-ידי התאמת זמן השתהות הפיקסלים ועוצמת הקרן. הטעינה מצטמצמת/נעדרת בזמני השתהות קצרים יותר של פיקסלים, בעוד שהפרטים הסלולריים וניגודיות התמונה הם הטובים ביותר עם זמן השתהות ארוך יותר של פיקסלים ועוצמת קרן גבוהה יותר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מטרת נייר שיטות זה היא להדגיש את הכנת הרקמות ואת מתודולוגיית ההדמיה שאיפשרה למעבדה שלנו ללכוד באופן אמין תמונות מיקרוסקופיות אלקטרונים סדרתיות ברזולוציה גבוהה, ולהצביע על צעדים קריטיים שמובילים לתוצאה זו, כמו גם מלכודות פוטנציאליות שעלולות להתרחש בעת ביצוע הדמיית SBF-SEM. הצלחה בשימוש בפרוטוקול זה דורשת קיבוע נכון של רקמות, הפריה של מתכות כבדות לתוך המדגם, שינויים של שף ההטבעה כדי להפחית את הטעינה, כמו גם הבנה של הגדרות המיקרוסקופ וההדמיה המשמשות לאיסוף תמונות. המקסימום, "איכות פנימה, איכות החוצה" היא אקסיומה מתאימה להדמיית SBF-SEM. כמו המטרה של SBF-SEM לעתים קרובות הוא הערכה או כימות של פרט אולטרה מבני, טיפול נוסף חייב להינתן אסטרטגיית קיבעון על מנת להבטיח כי עיוות רקמה לא יתרחש. אם הרקמה מתעוותת בשלב כלשהו בהכנת דגימות (כלומר, עוברת נפיחות, התכווצות או שיבוש של מורפולוגיה תאית), שחזור רקמות וכימות לא יניבו נתונים מדויקים. יתר על כן, השימוש בהגדרות דימות שגויות עלול להוביל לאובדן נתונים שלא ניתן ללכוד מחדש מכיוון שהדמיית SBF-SEM היא תהליך הרסני. בנוסף, יש להשתמש בזהירות בעת טעינת דגימת רקמה כמו סכין יהלום עדין יכול להיפגע על ידי הכנת מדגם חפוז או שגוי. הדבר עלול לגרום לשבבים או לשברים בסכין, מה שעלול להשאיר סימני שריטות גלויים בתמונות (איור 10C). סכין היהלום יכולה להיפגע גם על ידי מבנים מסוידים, גרגירים קשים, או זכוכית מוטבעת בטעות (למשל, מאמפולים מגיבים).

בעוד שרוב הספרות SBF-SEM עד כה משתמש מתחי האצת קרן בטווח של 1 עד 3 kV לצד פיקסל להתעכב פעמים קרוב יותר 1-5 מיקרוס / px (איור 11)45,46,47,48,49הפרוטוקול הנוכחי משתמש במתחי האצה של 7-12 kV וזמן השתהות פיקסלים של 12 מיקרומטר / px להדמיה טורית ו- 32 מיקרומטר / px לאזורי הדמיה מעניינים (איורים 12 ו-13). הגדרות אלה, יחד עם עובי פרוסה של 100-200 ננומטר מאפשר הדמיה באיכות גבוהה וברזולוציה גבוהה של מגוון רחב של רקמה ביולוגית. מתח האצה מוגבר מאפשר עלייה בניגוד, ברזולוציה, כמו גם ביחס אות לרעש. זמן השתהות מוגבר מגדיל עוד יותר את הרזולוציה ואת יחס האות לרעש, בעוד עובי פרוסה מוגבר מוביל לירידה בטעינה על משטח הבלוק במהלך חתך ונלחם נזק הנגרמת על ידי קרן בתמונות הבאות14. בעוד ששיטת הדמיה זו עשויה להיות שונה מהמוסכמה, התמונות וערכות הנתונים המופקות מדברות בעד עצמן. אם היינו צריכים לשער את הסיבה להצלחה זו, ייתכן שהיא תוצאה של השילוב הייחודי שלנו של ערכי kV גבוהים, זמני התעכבות פיקסל ארוכים יותר והכנת בלוקים. הגדלת הדימות kV גורמת לנפח אינטראקציה מוגבר בין קרן האלקטרונים לדגימה. נפח אינטראקציה זה הוא גם עמוק יותר, כמו גם רחב יותר וכתוצאה מכך עלייה תיאורטית במספר האלקטרונים שזוהו שמקורם עמוק יותר בתוך בלוק המדגם, או מחתך רחב יותר של רקמה כמו גודל נקודה דמעה עולה בקוטר. מכיוון ש-SBF-SEM מתעניין בפרטי פני השטח של הבלוק, התוצאה היא ירידה תיאורטית ביחס האות לרעש. עם זאת, הגידול ב- kV גם דוחף אלקטרונים עמוק יותר לתוך המדגם שבו הם נוטים פחות לברוח הבלוק ולתרום האלקטרונים שנאספו על ידי הגלאי. עם היתרון הנוסף של אות מוגבר באמצעות זמני שהייה ארוכים יותר של פיקסלים ועוצמת קרן גבוהה יותר, ייתכן ששיטת הדמיה זו גורמת לעלייה גדולה יותר באותות מפני השטח של הדגימה ביחס לרעש שמקורו בעוצמת האינטראקציה. בנוסף, מוליכות מדגם מוגברת הציג עם פחמן שחור, כמו גם כסף וציפוי זהב מסייע לשפר את הצטברות תשלום אשר מתרחשת כעת עמוק יותר בתוך הבלוק ועוד מן הבלוק פנים. אכן איור 11, איור 12, איור 13 להראות כי כמו kV הוא טעינה מדגם מוגבר מתחיל להצטמצם כפי שהוא פוטנציאל דחף עמוק יותר לתוך הבלוק. דגימות שצולמו בהגדלה נמוכה ניתן ללכוד עם ניגודיות נאותה באמצעות ההגדרות הרגילות, אולם תמונות אלה לעתים קרובות חסרים פירוט על בדיקה מקרוב. הנתונים שלנו מראים בבירור כי בעת שימוש בהגדלה גבוהה יחסית כאשר המטרה היא פירוט סלולרי, הגדלת ההגדרות הקונבנציונליות יכולה להניב תוצאות יוצאות דופן. מאמר 2020 של P. Goggin, et al מספק טבלה שימושית המתארת את ההשפעה של שינוי הגדרות ההדמיה על איכות התמונה הסופית, והיא התייחסות מועילה להתייעץ אם אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור רקמות חדשניות הופכת להיות הכרחית14. עובי פרוסת 100-200 ננומטר המומלץ בפרוטוקול זה הוא היתרון הנוסף של מתן אפשרות לאיסוף ערכות נתונים SBF-SEM גדולות בקצב מהיר. בעת איסוף תמונות ב 12μs / px למשל, הדמיה דרך עומק 100 מיקרומטר ב 2048x2048 px דורש ~ 14 שעות תוך חתך ב 100nm / סעיף אבל ידרוש ~ 56 שעות אם חתך ב 25nm / סעיף. בעוד x, רזולוציית y נשארת ללא שינוי כתוצאה מעובי המקטע, לא מביאה בחשבון את היכולת הנוספת לתמונה באמצעות ערכי kV גבוהים יותר וזמני השתהות פיקסלים שמגיעים עם מקטעים גדולים יותר, חשוב לציין שהרזולוציה לאורך ציר z אכן סובלת. אובדן רזולוציית z הוא שיקול חשוב ויש להרהר בו כאשר מחליטים כיצד יש לכוון את הרקמה בבלוק הרזום וביחס למישור ההדמיה, ויש לו פוטנציאל למנוע את המחקר של תכונות תאים קטנות יותר או אינטראקציות (למשל, נדודי סינפטיים או תכונות תאיות בקנה מידה של עשרות ננומטר). עם זאת, בנוסף לזמן הדמיה מהיר, לפרוטוקול זה יש יתרונות נוספים בכך שהוא מייצר במהירות ערכות נתונים אידיאליות לניתוח סטריאולוגי, כמו גם לחקר אירועים ביולוגיים נדירים או תאים. עובי חלק גדול יותר יכול גם לסייע בשחזור ידני של תלת-ממד, שכן אזור של 100 מיקרומטר הנקטע ב- 100 ננומטר/סעיף ידרוש פילוח ידני של 1,000 תמונות בעוד שאותו אזור הנקטע ב- 25 ננומטר/סעיף ידרוש פילוח ידני של 4,000 תמונות.

SBF-SEM יש את היתרון של יצירת ערכות נתונים גדולות בתקופה קצרה יחסית. בעוד שניתוח נתונים יכול להתבצע בשיטות כמותיות כגון סטריאולוגיה, אשר יידונו להלן, זה יכול להיות לעתים קרובות אינפורמטיבי כדי ליצור שחזורים 3D באמצעות פילוח תמונה. מחסנית תמונה שנוצרה באמצעות SBF-SEM יכולה להיחשב כאוסף של voxels, בעוד פילוח הוא התהליך של הקצאת voxels אלה לאובייקטים המוגדרים על ידי המשתמש ובכך ליצור ייצוגים תלת-ממדיים של מבני רקמות. שחזורים אלה מספקים לעתים קרובות נקודת מבט בלתי נראית עד כה על מבנה רקמות ואינטראקציה בין תאים (איור 5, איור 6, איור 7, איור 8, איור 9). יתר על כן, לאחר שחזורים נוצרו ניתן להשתמש בנתונים הטבועים בשחזורים כדי לחלץ שפע של מידע מרקמה מקוטעת. פרמטרים החל משטח הפנים, נפח, אורך ומרחק, כמו גם נתונים זוויתיים זמינים כל פעם שחזור נוצר50,51. אמנם זה יכול להיות שימושי מאוד, במיוחד כאשר יחד עם קטעי וידאו ותמונות שנמשכו מערכות נתונים משוחזרות, הזמן הנדרש עבור פילוח ידני הוא שיקול חשוב בעת ניסיון לשער נתונים מערכות נתונים SBF-SEM. יש כיום שורה של תוכנות חופשיות וניתן לרכישה הזמינות עבור פילוח ידני וחצי ידני של מחסניות תמונות SBF-SEM. אפשרות אחת חינם עבור תוכנה לשחזור היא חבילת עיבוד תמונה פיג'י עבור ImageJ, תוכנית עיבוד תמונה קוד פתוח, אשר מכיל תוסף עורך פילוח המאפשר פילוח ידני52,53. בנוסף, התוכנה Reconstruct מציעה אפשרות פילוח חינמית חלופית54 (איור 8). בעוד שאפשרויות שעשויות להיות יקרות, אפשרויות הניתנות לריכוך מכילות לעתים קרובות ערכות תכונות חזקות יותר, כגון תהליכי פילוח חצי אוטומטיים או חבילות יצירת סרטים ותמונה. אפשרות אחת כזו שימשה ליצירת השחזורים שנמצאו באיור 5, איור 6, איור 7 ואיור 9 (פרטים זמינים בטבלת החומרים). בנוסף, כלים זמינים ליצירה, ניתוח ועיבוד של שחזורים תלת-ממדיים מבוססי ניגודיות באמצעות מציאות מדומה עם פוטנציאל להאיץ מאוד את תהליך השחזור20,55. אמנם לא תמיד זמין עבור כל היישומים, שורה של כלי תוכנה זמינים עבור פילוח ידני בסיוע מחשב אשר יש פוטנציאל להפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש עבור פילוח56,57,58. ללא קשר לתוכנה המשמשת, מחשבה תחילה ניכרת והבנה של השאלה נענית, או פער בידע שיש למלא, על ידי שחזורים סדרתיים צריך להקדים פילוח, כמו התהליך הוא מייגע וזמן אינטנסיבי.

הייצור של שחזורים תלת מימדיים מגיע עם שיקולים משלו. עם כוח עיבוד גדול יותר של ערכות נתונים יכול להיות גורם מגביל, ולכן מיטוב השימוש במשאבי מערכת יכול להיות קריטי לשמירה על זרימת עבודה פרודוקטיבית ולהאצת תהליך השחזור והעיבוד. בשעת עיבוד שחזור תלת-ממדי, רוב התוכנות ממירות ערימות תמונה מקוטעות למשטח המורכב ממשולשים מחוברים זה לזה. אם פרוייקט שחזור גדול או מורכב, עיבוד משולשים אלה עשוי לדרוש כוח מחשוב רב. בעת עבודה על שחזור תלת-ממדי, מומלץ להגביל את מספר המשולשים שבהם תוכנת השחזור יכולה להשתמש כדי להמיר את התמונות המפולגות למשטחים משוחזרים. אפשרות זו יכולה להיות שימושית לניטור ההתקדמות של שחזור תלת-ממדי במהלך תהליך הפילוח. לאחר השלמת הפילוח, ניתן להסיר את מגבלת המשולש לפני עיבוד תמונות או סרטונים של שחזורים. לחלופין, ואם תוכנת השחזור מאפשרת זאת, מצאנו הצלחה בניטור התקדמות השחזור באמצעות עיבוד נפח ולא באמצעות יצירת פני השטח. עיבוד אמצעי אחסון, אמנם לא מתאים לתמונות או קטעי וידאו המיועדים לפרסום או להצגה, אך דורש הרבה פחות כוח עיבוד וככאלה יכול להיות מועיל במתן חוויה חלקה בעת שחזור והכנת תמונות וסרטוני וידאו של שחזורים. בנוסף, מומלץ למחלק באופן ידני ערכת נתונים SBF-SEM כדי להגדיר כל אובייקט שיש לשחזר באמצעות מזהה ייחודי משלו. אם שדה של תאי אפיתל משוחזר למשל, במקום להקצות את כל תאי האפיתל לקבוצת voxel בשם "אפיתל", כל תא אפיתל צריך להיות מוקצה כינוי משלו (כלומר, Epi1, Epi2, Epi3, וכו '). זה מאפשר חופש גדול יותר כאשר השחזור יושלם, שכן ניתן לכלול או להוציא כל תא מהעיבוד הסופי, להקצות צבעים או שקפים שונים, או להסיר או להציג בנפרד אם וידאו מופק. יתר על כן, הדבר מאפשר לאסוף מדדים כגון שטח פנים או אמצעי אחסון מכל אובייקט משוחזר ולא מקבוצת האובייקטים כולה.

כלי רב עוצמה נוסף לחילוץ נתונים כמותיים מערימות תמונות SBF-SEM הוא הנוהג של סטריאולוגיה. סטריאולוגיה מנצלת את היחסים המתמטיים הטבועים בין אובייקטים תלת מימדיים לבין הייצוגים הדו-ממדיים שלהם (כלומר, מיקרוגרפים של אלקטרונים). ערכות נתונים SBF-SEM הן אידיאליות ליישום סטריאולוגיה, שכן שיטה זו לחילוץ מידע תלת-ממדי מערכות נתונים גדולות היא הרבה פחות זמן ועתיר עבודה בהשוואה לשחזור מפולח. סטריאולוגיה מורכבת בדרך כלל מיישום רשתות גיאומטריות על תמונות אקראיות שנדגמו באופן אחיד, ונוצלה בהרחבה במהלך 50 השנים האחרונות על מנת לייצר הערכות מדויקות ובלתי משוחדות של מספר התא / organelle, אורך, שטח הפנים, ונפח21,59,60,61,62,63. בעוד שחזורים תלת מימדיים יכולים להיות מרשימים ולספק פרספקטיבה חדשנית על רקמות ביולוגיות, זה לעתים קרובות מהיר יותר, מדויק יותר, לשחזור, ותורם עבור גדלי מדגם גדולים להשתמש בגישה סטריאולוגית מיצוי נתונים. אמנם ישנם מאמרים רבים דנים היישום המעשי שלסטריאולוגיה 64,65,66, מספר ספרי לימוד מספקים שימושי, סקירות מעמיקות של המתודולוגיה, כמו גם לספק מספר רשתות סטריאולוגיות אשר ניתן להחיל על המחקר של רקמות ultrastructure67,68,69.

SBF-SEM היא שיטת הדמיה רבת עוצמה המאפשרת הערכה תלת מימדית של מבנה רקמות. בעוד היכולת ליצור ערכות נתונים תלת-ממדיות עם רזולוציית SEM מציבה שאלות שלא ניתן היה לספק בעבר בהישג ידנו, הכנת רקמות נכונה והבנה של הדמיית SBF-SEM היא בעלת חשיבות עליונה להצלחת מחקרים המשתמשים בשיטת מיקרוסקופיה זו. תקוותנו היא שהיישום של פרוטוקול זה למחקרים עתידיים יוביל לתובנה גדולה יותר ויותר על המסתורין הביולוגי המקיף אותנו, וימשיך לדחוף אותנו עוד יותר אל גבולות הידע האנושי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לד"ר סם הנלון, אוולין בראון ומרגרט גונדו על הסיוע הטכני המצוין שלהם. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01 EY-018239 ו P30 EY007551 (המכון הלאומי לבריאות הילד), בין השאר על ידי קרן האריה למראה, ובחלקו על ידי NIH 1R15 HD084262-01 (המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/16 x 3/8 Aluminum Rivets Industrial Rivet & Fastener Co. 6N37RFLAP/1100 Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver Wiha Quality Tools 27225
Acetone Electron Microscopy Sciences RT 10000 Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid Sigma-Aldrich A8949
Calcium Chloride FisherScientific C79-500
Conductive Silver Paint Ted Pella 16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target Denton Vacuum N/A This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors Fisher Scientific 50-949-411
Embed 812 Electron Microscopy Sciences 14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM Gatan & Tescan N/A This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) Electron Microscopy Sciences 72630-05
Gluteraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
Gorilla Super Glue - Impact Tough NA NA Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black HM Royal EC-600JD Refered to as carbon black in text.
KOH FisherScientific 18-605-593
Lead Nitrate Fisher Scientific L62-100
Microwave Pelco BioWave Pro This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 201030
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Silicone Embedding Mold Ted Pella 10504
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences 12300
Samco Transfer Pipette ThermoFisher Scientific 202 Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files Electron Microscopy Sciences 62115
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich 223220
Uranyl Acetate Polysciences, Inc. 21447-25
Reconstruction Software
Amira Software Thermo Scientific N/A Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ) ImageJ.net N/A TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB) University of Helsinki, Institute of Biotechnology N/A
Reconstuct Software Neural Systems Lab N/A
SuRVoS Workbench Diamond Light Source & The University of Nottingham N/A
SyGlass IstoVisio, Inc. N/A Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).
  2. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  3. He, Q., Hsueh, M., Zhang, G., Joy, D. C., Leapman, R. D. Biological serial block face scanning electron microscopy at improved z-resolution based on Monte Carlo model. Scientific Reports. 8 (1), 12985 (2018).
  4. Zankel, A., Wagner, J., Poelt, P. Serial sectioning methods for 3D investigations in materials science. Micron. 62, 66-78 (2014).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43 (5), 612-620 (2012).
  7. Bouwer, J. C., et al. Deceleration of probe beam by stage bias potential improves resolution of serial block-face scanning electron microscopic images. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2 (1), 11 (2017).
  8. Kizilyaprak, C., Longo, G., Daraspe, J., Humbel, B. M. Investigation of resins suitable for the preparation of biological sample for 3-D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 189 (2), 135-146 (2015).
  9. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  10. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: an ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  11. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  12. Piňos, J., Mikmeková, Š, Frank, L. About the information depth of backscattered electron imaging. Journal of Microscopy. 266 (3), 335-342 (2017).
  13. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
  14. Goggin, P., et al. Development of protocols for the first serial block-face scanning electron microscopy (SBF SEM) studies of bone tissue. Bone. 131, 115107 (2020).
  15. Deerinck, T. J., et al. High-performance serial block-face SEM of nonconductive biological samples enabled by focal gas injection-based charge compensation. Journal of Microscopy. 270 (2), 142-149 (2018).
  16. Nguyen, H. B., et al. Conductive resins improve charging and resolution of acquired images in electron microscopic volume imaging. Scientific Reports. 6, 23721 (2016).
  17. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. National Center for Microscopy and Imaging Research. 6 (8), (2010).
  18. Deerinck, T. J., et al. Enhancing Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Enable High Resolution 3-D Nanohistology of Cells and Tissues. Microscopy and Microanalysis. 16, 1138-1139 (2010).
  19. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  20. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy: A provocative technique to define 3-dimensional ultrastructure of microvascular thrombosis. Thrombosis Research. 196, 519-522 (2020).
  21. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy reveals neuronal-epithelial cell fusion in the mouse cornea. PLoS One. 14 (11), 0224434 (2019).
  22. Lafontant, P. J., et al. Cardiac Myocyte Diversity and a Fibroblast Network in the Junctional Region of the Zebrafish Heart Revealed by Transmission and Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. PLoS One. 8 (8), 72388 (2013).
  23. Hanlon, S. D., Behzad, A. R., Sakai, L. Y., Burns, A. R. Corneal stroma microfibrils. Experimental Eye Research. 132, 198-207 (2015).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  25. Davenport, A. T., Grant, K. A., Szeliga, K. T., Friedman, D. P., Daunais, J. B. Standardized method for the harvest of nonhuman primate tissue optimized for multiple modes of analyses. Cell Tissue Bank. 15 (1), 99-110 (2014).
  26. Schuster, A., et al. An isolated perfused pig heart model for the development, validation and translation of novel cardiovascular magnetic resonance techniques. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 12 (1), 53 (2010).
  27. Hanlon, S. D., Patel, N. B., Burns, A. R. Assessment of postnatal corneal development in the C57BL/6 mouse using spectral domain optical coherence tomography and microwave-assisted histology. Experimental Eye Research. 93 (4), 363-370 (2011).
  28. Longiéras, N., Sebban, M., Palmas, P., Rivaton, A., Gardette, J. L. Multiscale approach to investigate the radiochemical degradation of epoxy resins under high-energy electron-beam irradiation. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 44 (2), 865-887 (2006).
  29. Hashimoto, T., Thompson, G. E., Zhou, X., Withers, P. J. 3D imaging by serial block face scanning electron microscopy for materials science using ultramicrotomy. Ultramicroscopy. 163, 6-18 (2016).
  30. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: A novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801 (2009).
  31. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  32. Katoh, K. Microwave-Assisted Tissue Preparation for Rapid Fixation, Decalcification, Antigen Retrieval, Cryosectioning, and Immunostaining. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2016, 7076910 (2016).
  33. Login, G. R., Dvorak, A. M. A review of rapid microwave fixation technology: its expanding niche in morphologic studies. Scanning. 15 (2), 58-66 (1993).
  34. Jamur, M. C., Faraco, C. D., Lunardi, L. O., Siraganian, R. P., Oliver, C. Microwave fixation improves antigenicity of glutaraldehyde-sensitive antigens while preserving ultrastructural detail. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 307-311 (1995).
  35. Leong, A. S., Sormunen, R. T. Microwave procedures for electron microscopy and resin-embedded sections. Micron. 29 (5), 397-409 (1998).
  36. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  37. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  38. Belazi, D., Solé-Domènech, S., Johansson, B., Schalling, M., Sjövall, P. Chemical analysis of osmium tetroxide staining in adipose tissue using imaging ToF-SIMS. Histochemistry and Cell Biology. 132 (1), 105-115 (2009).
  39. Rivlin, P. K., Raymond, P. A. Use of osmium tetroxide-potassium ferricyanide in reconstructing cells from serial ultrathin sections. Journal of Neuroscience Methods. 20 (1), 23-33 (1987).
  40. Aguas, A. P. The use of osmium tetroxide-potassium ferrocyanide as an extracellular tracer in electron microscopy. Stain Technology. 57 (2), 69-73 (1982).
  41. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  42. Watson, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. II. Application of solutions containing lead and barium. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 4 (6), 727-730 (1958).
  43. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy. Scanning Microscopy in Nanotechnology. , 1-40 (2006).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Buchacker, T., et al. Assessment of the Alveolar Capillary Network in the Postnatal Mouse Lung in 3D Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Frontiers in Physiology. 10, 1357 (2019).
  46. Keeling, E., et al. 3D-Reconstructed Retinal Pigment Epithelial Cells Provide Insights into the Anatomy of the Outer Retina. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), (2020).
  47. Shang, P., et al. Chronic Alcohol Exposure Induces Aberrant Mitochondrial Morphology and Inhibits Respiratory Capacity in the Medial Prefrontal Cortex of Mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 561173 (2020).
  48. Pfeifer, C. R., et al. Quantitative analysis of mouse pancreatic islet architecture by serial block-face SEM. Journal of Structural Biology. 189 (1), 44-52 (2015).
  49. Wilke, S. A., et al. Deconstructing complexity: serial block-face electron microscopic analysis of the hippocampal mossy fiber synapse. Journal of Neuroscience. 33 (2), 507-522 (2013).
  50. Cocks, E., Taggart, M., Rind, F. C., White, K. A guide to analysis and reconstruction of serial block face scanning electron microscopy data. Journal of Microscopy. 270 (2), 217-234 (2018).
  51. Borrett, S., Hughes, L. Reporting methods for processing and analysis of data from serial block face scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 263 (1), 3-9 (2016).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  54. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, Pt 1 52-61 (2005).
  55. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality Head-mounted displays. arXiv . , arXiv:1804.08197 (2018).
  56. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  57. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  58. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198 (1), 43-53 (2017).
  59. Anderson, H. R., Stitt, A. W., Gardiner, T. A., Archer, D. B. Estimation of the surface area and volume of the retinal capillary basement membrane using the stereologic method of vertical sections. Analytical & Quantitative Cytology & Histology. 16 (4), 253-260 (1994).
  60. Gibbons, C. H., Illigens, B. M., Wang, N., Freeman, R. Quantification of sweat gland innervation: a clinical-pathologic correlation. Neurology. 72 (17), 1479-1486 (2009).
  61. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec. 292 (1), Hoboken. 113-122 (2009).
  62. Mahon, G. J., et al. Chloroquine causes lysosomal dysfunction in neural retina and RPE: implications for retinopathy. Current Eye Research. 28 (4), 277-284 (2004).
  63. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. Journal of Microscopy. 150, Pt 2 117-136 (1988).
  64. Weibel, E. R. Stereological methods in cell biology: where are we--where are we going. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (9), 1043-1052 (1981).
  65. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  66. Kristiansen, S. L., Nyengaard, J. R. Digital stereology in neuropathology. Apmis. 120 (4), 327-340 (2012).
  67. Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology. 2nd edn. , Garland Science/BIOS Scientific Publishers. (2005).
  68. Reith, A., Mayhew, T. M. Stereology and Morphometry in Electron Microscopy: Problems and Solutions. , Hemisphere Publishing Corporation. (1988).
  69. Mouton, P. R. Principles and practices of unbiased stereology: an introduction for bioscientists. , Johns Hopkins University Press. (2002).

Tags

ביולוגיה גיליון 169 מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת בלוק-פנים סדרתי SBF-SEM 3D-EM 3D-שחזור הכנת רקמות הכנת דגימה מקטעים טוריים מבנה אולטרה ברזולוציה גבוהה הדמיה נפחית ביולוגי נפח גדול
סריקת בלוק-פנים טורית מיקרוסקופ אלקטרונים (SBF-SEM) של דגימות רקמה ביולוגית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Courson, J. A., Landry, P. T., Do,… More

Courson, J. A., Landry, P. T., Do, T., Spehlmann, E., Lafontant, P. J., Patel, N., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples. J. Vis. Exp. (169), e62045, doi:10.3791/62045 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter