Summary
骨骼肌再生是由组织常驻肌肉干细胞驱动的，这些干细胞在许多肌肉疾病（如肌肉萎缩症）中受损，这导致肌肉无法再生。在这里，我们描述了一个协议，允许检查肌肉再生的斑马鱼模型的肌肉疾病。
Abstract
骨骼肌在受伤后具有非凡的再生能力，这是由强制性组织常驻肌肉干细胞驱动的。受伤后，肌肉干细胞被激活，并经历细胞增殖，以产生肌质池，随后分化形成新的肌肉纤维。在许多肌肉浪费条件下，包括肌肉萎缩和老化，这个过程是受损的，导致肌肉无法再生。斑马鱼的肌肉再生过程高度保守，哺乳动物系统为研究肌肉干细胞功能和再生提供了一个极好的系统，在肌肉消耗条件下，如肌肉萎缩症。在这里，我们提出了一种方法来检查肌肉再生在斑马鱼模型的肌肉疾病。第一步涉及使用基因分型平台，允许在引起伤害之前确定幼虫的基因型。在确定基因型后，肌肉被针刺受伤，然后用偏振光显微镜确定肌肉再生的程度。因此，我们提供了一个高吞吐量管道，允许检查肌肉再生的斑马鱼模型的肌肉疾病。
Introduction
骨骼肌占人体质量的30-50%，不仅对运动不可或缺，而且作为关键的代谢和储存器官1。尽管是后体，骨骼肌是高度动态的，并保留巨大的再生能力后受伤。这是由于组织常驻干细胞（也称为卫星细胞）的存在，位于肌瘤的基底拉米纳下，并标有转录因子配对盒蛋白7（pax7）和/或配对盒蛋白3（pax3），等等2，3。受伤后，卫星细胞被激活，并经历细胞增殖，以产生肌质池，随后分化形成新的肌肉纤维。调节卫星细胞激活和强健肌肉修复的高度保存的亲再生信号级联在各种条件下受到影响，如肌病和静止老化4，5。
一个如此多样化的肌病组是肌肉萎缩症，其特点是渐进性肌肉浪费和退化6。这些疾病是关键蛋白质的基因突变的结果，包括肌营养不良素和层压素-2 （LAMA2），负责将肌肉纤维附着在细胞外基质7，8。鉴于与肌肉营养不良有关的蛋白质在维持肌肉结构方面起着如此核心的作用，多年来人们一直认为，这一过程中的失败是导致疾病发病机制的机制。然而，最近的研究已经发现肌肉干细胞的调节缺陷和随后的肌肉再生损伤是肌肉病理学观察到的第二个可能的基础，在肌肉营养不良症10，11。因此，需要进一步研究肌肉干细胞功能和相关利基元素的损伤如何导致肌肉萎缩。
在过去的十年里，斑马鱼（Danio rerio）已经成为疾病建模12的重要脊椎动物模型。这要归功于斑马鱼胚胎的快速外部发育，以及它的光学清晰度，这允许肌肉形成、生长和功能的直接可视化。此外，斑马鱼不仅高度保存肌肉的发育和结构，还表现出高度保存的肌肉再生过程13。因此，斑马鱼是研究肌肉疾病病理生物学，并探索肌肉再生如何影响它的一个很好的系统。为此，我们开发了一种方法，使肌肉疾病斑马鱼模型的骨骼肌再生能够及时研究。这种高通量管涉及一种方法，基因型活胚胎14，随后进行针刺损伤和肌肉再生的程度图像使用极化光显微镜。因此，该技术的利用将揭示肌肉疾病斑马鱼模型中肌肉的再生能力。
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Protocol
斑马鱼的饲养是按照莫纳什大学动物伦理委员会根据繁殖区许可证ERM14481批准的标准操作程序进行的。
1. 使用胚胎基因型平台确定活胚胎的基因型。
- 麻醉受精后3天（dpf）斑马鱼胚胎，在胚胎介质（5 mM NaCl，0.17m KCl，0.33 m CaCl2，0.33m MgSO4） 中加入三甲烷硫酸盐的最终浓度。等待10分钟，以确保鱼完全麻醉，当鱼停止游泳时明显。
- 通过从芯片顶部表面剥开透明保护膜（图1A），准备24室DNA提取芯片。
- 切割 20 μL 滤芯的尖端以扩大开口。使用此，在 13 μL 的胚胎介质体积中选择单个胚胎并加载到芯片的第一个腔室中。重复此过程，直到胚胎被分配到每个腔室。
注：此步骤应在空气流最少的区域执行，因为高气流可能导致液体过度蒸发，从而降低基因型敏感性和胚胎的存活率。 - 一旦所需的胚胎数量被装载到DNA提取芯片上，将其加载到斑马鱼胚胎基因分型平台上。最好先放在一边，然后放在另一边。
注意：避免在平台上增加太大的压力，因为这可能会过度应力并损坏底层弹簧。 - 在芯片上贴上磁平台盖，防止胚胎介质在DNA提取过程中蒸发，并关闭平台盖。
- 将基座单位设置为 2.4 伏特、0.051 A 和 0.12 W，并通过按下"开/关"按钮启动 DNA 提取协议。平台应开始振动，可以通过轻轻触摸盖子来评估。协议应运行 8 分钟。
注：剧烈的振动导致表皮细胞脱落，从中提取基因组DNA。 - 在程序运行期间，通过向每口井添加 1 mL 的胚胎介质来准备 24 井板，这是在进行下游基因测定分析时分离单个胚胎所必需的。
- 此外，适当标记8井条管，用于收集每个胚胎的DNA材料。
- 在完成 8 分钟协议后，按 下开/关 按钮以停止平台的振动。
- 打开平台的盖子，轻轻取下磁盖，确保将最小压力施加到平台上。
- 小心地从平台上取下DNA提取芯片，并将其放置在平面上。
- 从第一个腔室中取出围绕胚胎的 10 μL 胚胎介质，并将其放入 8 井条管的适当井中。媒体包含该胚胎的遗传物质，用于下游检测。
注意：避免在媒体收集过程中用移液器尖端接触胚胎，因为这会损坏胚胎。 - 使用塑料移液器，立即将两滴新鲜胚胎介质添加到同一腔中。收集胚胎并将其移到 24 井板的第一口井。
- 对于所有剩余的腔室重复步骤 1.12 和 1.13。完成这项工作后，24个含有活胚胎的井板可以移到28°C的孵化器。
- 进行适当的下游基因测定，以确定胚胎的基因型。
注：从胚胎基因分型平台获得的DNA可以通过PCR成功放大，并可用于后续分析，包括测序、凝胶电泳或高分辨率熔化分析14。为了基因型的 喇嘛2 菌株在代表性的结果中描述，PCR，限制消化和凝胶电泳使用。鉴于从每个胚胎获得的DNA浓度较低，建议充分利用为下游检测获得的遗传物质，如果不是全部的话。 - 一旦确定每个幼虫的基因型，将它们转移到90毫米Petri菜，将每个基因型放在不同的菜。将盘中填充 25 mL 胚胎介质，并将其保存在 28 °C 孵化器中。
2. 使用针刺进行肌肉损伤
- 一旦幼虫为4分，通过在胚胎介质中将三甲烷硫酸盐添加到最终浓度为0.016%（v/v）来麻醉它们。等待10分钟，以确保鱼完全麻醉，当鱼停止游泳时明显。
注：为了避免偏见，基因型的身份应被执行刺和下游分析的调查员蒙蔽。 - 在此期间，准备24个井板，每口井加满1兆升的新鲜胚胎介质，并设置具有黑色背景和大功率光的立体显微镜，以方便阴郁边界的可视化。
- 使用塑料移液器，将一只麻醉幼虫转移到一个新的培养皿中。
- 用移液器小心地去除多余的胚胎介质，并在解剖显微镜下，将鱼定向到头部在左边，尾巴在右边，多侧区域向上和腹腔区域向下（图1B）。
- 在解剖显微镜下工作，使用 30 量针对位于水平肌肌上方的腹肌进行快速但精确的刺。为了确保前后位置的一致性，瞄准位于孔隙上方的 1-2 个声质（图 1B）。
注意：避免刺痛神经管和疏通器，并迅速工作，以避免在这个过程中擦干鱼。 - 使用塑料移液器，将一滴胚胎介质倒在被刺伤的斑马鱼身上，并小心地将其转移到24口井盘的井中。
- 重复步骤 2.3 到 2.6。直到所有的鱼都被刺伤了
注：只要鱼在加工过程中不干涸，根据调查员的处理速度和熟练程度，可以将几只幼虫刺在一起。 - 一旦所有的幼虫都被刺伤，将24井板放在28°C孵化器中，直到随后进行成像。
3. 肌肉损伤和恢复成像
- 受伤后1天（1分皮），通过在胚胎介质中加入三甲烷硫酸盐，将被刺伤的幼虫麻醉至最终浓度为0.016%（v/v）。等待10分钟，以确保鱼完全麻醉，当鱼停止游泳时明显。
注：在0 dpi，伤口部位包含大量的细胞碎片，这使得很难量化肌肉损伤的程度（补充图1A-B）。从伤口部位清除这些碎片大约需要 18-20 个小时，因此，在 1 dpi 而不是 0 dpi 处对幼虫进行成像以确定所导致的伤害程度更为可靠。 - 将干净空的玻璃底盘放在极化显微镜的舞台上，并使用集成软件设置背景。
注：不要使用塑料培养皿来成像双折射，因为它们不能适当地传输折射光。根据使用的极化显微镜，根据制造商的指南，可能需要额外的设置。 - 设置背景后，从显微镜阶段取出玻璃底盘，并使用玻璃移液器，将麻醉的刺鱼转移到玻璃底盘上。
- 使用移液器小心地去除多余的胚胎介质，并按2.5定向鱼 - 头部在左边，尾巴在右边，双侧区域向上和腹腔区域向下。
注意：确保幼虫尽可能平整地安装，因为不均匀的安装会导致不同阴郁物的不同双弗雷德强度。 - 将玻璃底盘与麻醉幼虫放在显微镜台上，然后使用偏振光成像肌肉（图1C + 1D）。
注：根据使用的显微镜/极化透镜的类型，其前后轴上的鱼方向会影响整体双裂15。在成像时，请确保在损伤部位的两侧至少包含 5 个烟尘。 - 使用塑料移液器，倒一滴胚胎介质来补充鱼水分，并将鱼放在一个装满胚胎介质的24井盘井中。
注意：必须尽快进行成像，以防止鱼干燥。 - 重复步骤 3.3。到 3.6。直到所有的鱼都被成像。
- 当所有图像都获得后，以.tiff格式保存它们，以便进行后续分析。
- 将鱼放回 28 °C 孵化器中，直到在 3 dpi （7 dpf） 处进行后续成像。
- 当鱼是3分，图像鱼按3.3到3.8。
- 一旦所有的鱼都被成像，通过在胚胎介质中加入三甲烷硫酸盐，最终浓度为0.2%（v/v），来安乐死它们。等待至少10分钟，以确保鱼被安乐死，明显丧失游泳能力，抽刺盖，以及触摸后缺乏飞行反应。
4. 肌肉再生的量化
- 在成像分析软件（如可免费获得的图像 J 软件）上打开 1 dpi 图像。
- 使用多边形工具，绘制伤口部位周围，并测量该区域的面积和平均双面强度（图 1C = 1D）。将这些值复制到提供的模板中的单元格 D3 和 E3（补充表 1）。
- 绘制另外两个区域，每个区域跨越 1-2 个未受伤的烟熏，并测量每个区域的面积和平均双侵权强度（图 1C 和 1D）。在提供的模板中将这些值复制到单元格 D4-D5 和 E4-E5（补充表 1）。
注意：虽然最好在 1 dpi 和 3 dpi 图像中选择相同的未受伤的阴郁，但肌肉纤维的零星分离和随后突变体双弗雷德的减少可能会使这一切变得不可能。因此，如果由于突变体中肌肉完整性的降低，在 1 dpi 和 3 dpi 无法选择相同的闷闷不乐时，请在每个时间点选择两个不同但未受影响的区域。 - 通过将该区域的平均双弗雷德强度除以所提供的模板（补充表 1）中 F 列所示的区域，计算每个区域的正常双弗雷德弗。
- 对于所有 1 dpi 和 3 dpi 图像，重复步骤 4.1-4.4。
注：使用提供的模板（补充表1）时，应分别在D列和E列中插入1 dpi区域和平均双面强度值，3 dpi区域和平均双面强度值应分别插入列J和K。 - 对于每个时间点，计算两个未受伤区域的平均正常双伤。此值提供了未受伤肌肉的参考点。
注：在提供的模板（补充表 1）中，此值分别以列 G 和 M 计算，用于 1 dpi 和 3 dpi 图像。 - 接下来，确定 1 dpi 的肌肉损伤程度，将损伤区域的正常双伤除以未受伤区域的平均正常双伤（以 4.6 计算）。
注：使用上述详细的针刺程序，野生型幼虫通常显示正常双弗雷德在伤口部位的48.5±14.3%在1分皮，表明双性耳膜已经减少了约50%，相比没有受伤的苏米特。使用模板（补充表 1）时，此值按 H 列中的百分比计算。 - 为了确定肌肉再生的程度，将损伤区域的正常双伤在 3 dpi 图像中除以现阶段未受伤区域的平均正常强度。
注：在3 dpi，野生型幼虫通常显示正常双弗雷德60±15.3%的伤口部位。鉴于伤口部位内1 dpi的正常双侵权为48.5±14.3%（第4.7步），双伤在3 dpi至60±15.3%的双伤增加表明恢复约11.5%。使用模板（补充表 1）时，此值按 N 列中的百分比计算。 - 将鱼保持在每个基因型内分开，执行配对 t 测试，将伤口部位的正常双面性在 3 dpi（步骤 4.8）与 1 dpi（步骤 4.7）进行比较。这将揭示每个基因型中每条鱼所展示的肌肉再生轨迹，并突出每个基因型所显示的肌肉再生程度是否发生了显著变化。
- 最后，通过将第 4.8 步获得的值（即 3 dpi 的肌肉再生程度）除以第 4.7 步获得的值（即 1 dpi 的肌肉损伤程度）来计算再生指数。再生指数为 1 表示 1 dpi 的损伤与 3 dpi 相媲美，并且肌肉再生尚未发生：高于 1 的值表示在伤口部位形成 3 dpi 新肌肉，突出显示肌肉已再生：和不到 1 的再生指数突出表明， 3 dpi 的伤口比 1 分皮更严重， 肌肉再生受损。可以进行 t 测试或单向 ANOVA，以统计学上比较不同基因型之间的肌肉再生程度。使用提供的模板（补充表 1）时，此值在 O 列中计算。
注：建议用三脚架进行整个实验，从不同的亲生父母那里获得每个实验中的鱼，以及在不同的日子进行的每一个实验，以避免任何偏见。
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Representative Results
能够量化骨骼肌的双裂，提供了一个非侵入性，但高度可重复的方法来检查和比较肌肉损伤水平，并检查肌肉再生在体内。双裂是由于极化光通过肌肉肉瘤15的伪晶体阵列衍射而成，在肌肉受伤或损伤后，双极化明显减少。同样，干细胞的激活和分化导致在损伤部位形成新的肌肉纤维，从而增加该区域内的双性恋强度。利用这个系统，我们检查了先天性肌肉萎缩型1A（MDC1A）斑马鱼模型的肌肉再生，该模型是由喇嘛216缺乏引起的。从两个lama2+ /-斑马鱼之间的十字架上收集了一批胚胎，在 3 dpf 时，胚胎被转移到 DNA 提取芯片 （图 1A），然后使用胚胎基因型技术进行基因型。在确定了基因型后，根据图1B，在极化显微镜上成像，在1分皮和3分皮上成像，并量化了双面强度。 虽然肌肉损伤导致双伤强度降低在1分（图1Ci和Di），肌肉的成功再生导致在同一区域增加双伤（图1Cii和Dii）。值得注意的是，虽然lama2+/+幼虫显示均匀的双面性强度 （图 1C），由于正常的肌肉模式，在 lama2-/-肌肉的双冲突强度是不均匀和高度零星 （图1D），归因于肌肉完整性下降.
使用这种方法，我们揭示了两种野生型幼虫（lama2+/+;图2A），幼虫缺乏喇嘛2（喇嘛2-/-：图2B），显示伤口部位的双伤强度显著增加，为3分皮，而1分皮（图2C），表明肌肉已经再生。比较每个基因型中幼虫的再生潜力， 再生指数确定后，我们发现，与拉玛2+/+ 幼虫相比，拉玛2-/-幼虫的肌肉再生显著增加（图2D;拉玛2 -/-=1.30±-0.251;拉玛2-/-=1.83±0.439）。 为了进一步验证在 lama2-/-幼虫的改善再生， 我们用抗体对 F-Actin （补充图 1B-D）污染肌肉。虽然这些结果证实，lama2-/-确实再生，明显由于伤口部位内存在分化的肌肉纤维，但无法在1分皮和3分皮下检查同一条鱼，限制了对喇嘛2+/+和喇嘛2-/-鱼之间的再生反应进行量化和比较的能力。虽然这种改善拉玛-/-幼虫再生能力的机械基础仍然难以捉摸，但我们认为，lama2的丧失增加了活性干细胞的数量，从而改善了肌肉再生。然而，需要进一步的研究来确定这一点。总的来说，这些结果突出了上述技术识别肌肉疾病斑马鱼模型肌肉再生变化的能力。
图1：基因型和肌肉再生方案概述。（A） 包含24，3 dpf斑马鱼幼虫的DNA提取芯片的图像。（B） 应放置 4 dpf 幼虫进行针刺的方向示意图，头部在左侧，尾部位于右侧，侧面区域向上和腹腔区域向下。针刺应使用30口径针头进行，针对1-2个腹肌。用 BioRender.com 创建。（C-D） 在喇嘛2+/+ 和 喇嘛2-/- 幼虫在1分皮和3分皮的双亲图像。以白色和红色显示的区域分别反映了用于量化伤口位点和未受伤闷闷不乐的双伤区域。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：拉玛2缺乏斑马鱼幼虫肌肉再生的量化。在 lama2+/+ （A） 和喇嘛 2-/- （B） 幼虫在 1 dpi 和 3 dpi 的双弗雷德图像。伤口在3 dpi在两个，喇嘛2+/+和喇嘛2-/-幼虫充满了新的肌肉。（C） 每头幼虫在 1 dpi 和 3 dpi 的正常双弗雷德的图形。在lama2+/+ 和 lama2-/-幼虫的伤口部位的正常双面在 3dpi 显著增加，使用配对 t 测试确定。（D） lama2+/+和 lama2-/-的再生指数显示肌肉再生增加，通过 t 测试确定。错误条表示来自三个独立实验的幼虫SEM（lama2+/+n=28 和lama2-/- n=16）。请单击此处查看此图的较大版本。
补充图1：检查拉玛2缺乏幼虫的肌肉再生。在 lama2+/+ （Ai） 和lama2-/- （Aii） 幼虫在 0 dpi 中出现双裂的图像，表明伤口部位内存在细胞碎片。在 0 dpi （B）、1 dpi （C） 和 3 dpi （D） 上染色的幼虫肌膜的最大投影共聚焦图像。在3 dpi，lama2+/+和喇嘛2-/-幼虫的伤口部位的特点是出现F-actin标记的肌肉纤维。请点击这里下载此文件。
补充表1：肌肉再生量化的模板。请点击这里下载此文件。
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Discussion
骨骼肌再生是由强制性组织常驻肌肉干细胞驱动的，其功能在许多肌肉疾病（如肌肉萎缩症）中改变，从而阻碍肌肉再生的过程。在这里，我们描述了一个高吞吐量协议，以检查肌肉疾病的活斑马鱼模型的肌肉再生。管道的第一步利用胚胎基因分型平台14，这是一个用户友好和准确的方法来确定活幼虫的基因型，然后再进行下游再生测定。其直接好处是，它允许选择仅感兴趣的基因型和/或每个基因型组内可比数量的鱼，从而显著减少了需要通过协议其余部分处理的鱼的数量。然而，值得注意的是，从胚胎基因分型装置获得的基因组DNA数量相对较低，这可能危及下游基因分型测定。因此，在将所有基因测定测试用于主要实验之前，必须进行测试和优化。此外，DNA的来源主要是表皮，因此，胚胎基因分型系统不能成功地用于基因型幼虫显示组织特定的突变。
协议的第二部分演示了针刺损伤的使用，这是一种经济高效和高吞吐量的技术，不仅导致高度可重复的损伤大小，而且还足以触发肌肉干细胞的激活，导致肌肉再生。诱导斑马鱼骨骼肌肉损伤的另一种方法是使用激光介导细胞消融13，17，18。虽然这提供了专注于特定的x，y和z平面，并随后针对单个肌肉细胞的能力，极小的伤口大小诱导限制了肌肉再生的准确量化，特别是在肌肉疾病模型中，其中肌肉的完整性已经受到损害。因此，在检查斑马鱼肌肉疾病模型的肌肉再生时，我们赞成使用针刺损伤。
为了准确量化肌肉再生的程度，我们利用骨骼肌的双面性，使用标准的偏振显微镜很容易成像。使用此方法时需要考虑两个关键点。首先，根据使用的显微镜和/或偏振透镜的类型，鱼在前后轴的方向可能会影响整体双弗雷德强化物15，这需要在成像时考虑。最后，虽然肌肉再生不是完全完成3 dpi，恢复的程度足以使不同菌株13 的再生能力的区分（图1）。我们之前的工作已经证明，使用我们概述的协议，野生型幼虫完全再生后14 dpi19，因此，要确定是否应变不能再生或肌肉再生是否延迟，可能需要检查双性恋强度超过3 dpi。
必须指出，在远程鱼类中，肌肉生长发生在动物20的整个生命，因此，将伤口部位的双性关节强度与同一条鱼内未受伤的闷闷不乐的正常化是非常重要的。此步骤提供内部控制，并消除分析中的偏差，因为不同时间点的肌肉量不同，或不同会话期间成像参数的差异。这种正常化步骤也势在必行，以准确量化肌肉疾病模型中的肌肉再生，这可能本质上减少了肌纤维化和/或显示受损的肌肉完整性，随后减少整体双发强度。此外，虽然此协议可以有效地揭示肌肉再生能力的变化，但有可能是间接影响干细胞功能的结果。肌肉再生是一个复杂的过程，涉及来自多种细胞类型的信号，包括肌肉细胞、巨噬细胞、纤维致病祖体和间质细胞。肌肉再生能力的改变可能是由这些其他细胞类型的生物学变化来解释的，这些变化随后会影响肌肉干细胞功能和再生过程。因此，虽然此协议可以识别肌肉疾病模型中肌肉再生的改变，但需要进行下游细胞和分子分析，以确定对所观察到的变化负责的机制。
总之，各种肌肉疾病中肌肉的再生能力尚不完全了解，而研究 体内 肌肉再生的新技术的出现为解决此类问题提供了平台。该方法可作为探索细胞和分子线索的基础，这些细胞和分子线索可以调节斑马鱼肌肉疾病模型中的肌肉再生。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢亚历克斯·富尔彻博士和莫纳什微成像公司为显微镜维护和设置提供帮助。澳大利亚再生医学研究所得到维多利亚州政府和澳大利亚政府的赠款支持。这项工作是由肌肉萎缩协会（美国）项目赠款资助给P.D.C（628882）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E.
- Emery, A. E. H. Duchenne muscular dystrophy. , Oxford University Press. Oxford; New York. (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), New York, N.Y. (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
