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Developmental Biology

मांसपेशियों की बीमारी के जेब्राफिश मॉडल में मांसपेशियों के उत्थान की जांच

Published: January 18, 2021 doi: 10.3791/62071
Automatic Translation
1, 1, 1
1Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

Summary

कंकाल मांसपेशी उत्थान ऊतक निवासी मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं, जो मांसपेशियों डिस्ट्रॉफी जैसे कई मांसपेशियों के रोगों में बिगड़ा हुआ है द्वारा संचालित है, और इस तरह के मांसपेशियों को पुनर्जीवित करने में असमर्थता में परिणाम है । यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो मांसपेशियों की बीमारी के जेब्राफिश मॉडल में मांसपेशियों के उत्थान की परीक्षा की अनुमति देता है।

Abstract

कंकाल की मांसपेशी में चोट के बाद पुनर्जीवित करने की उल्लेखनीय क्षमता होती है, जो ऊतक निवासी मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं को बाध्य करने से प्रेरित होती है। चोट के बाद, मांसपेशी स्टेम सेल सक्रिय है और मायोब्लास्ट का एक पूल उत्पन्न करने के लिए सेल प्रसार से गुजरता है, जो बाद में नए मांसपेशी फाइबर बनाने के लिए अंतर करता है। मस्कुलर डिस्ट्रॉफी और वृद्धावस्था सहित कई मांसपेशियों की बर्बादी की स्थिति में, यह प्रक्रिया बिगड़ी है जिसके परिणामस्वरूप मांसपेशियों को पुनर्जीवित करने में असमर्थता होती है। जेब्राफिश में मांसपेशियों के उत्थान की प्रक्रिया को मांसपेशियों की डिस्ट्रॉफी जैसी मांसपेशियों की बर्बादी की स्थितियों में मांसपेशियों के स्टेम सेल समारोह और पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली प्रदान करने वाले स्तनधारी प्रणालियों के साथ अत्यधिक संरक्षित किया जाता है। यहां, हम मांसपेशियों की बीमारी के जेब्राफिश मॉडल में मांसपेशियों के उत्थान की जांच करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। पहले चरण में एक जीनोटाइपिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग शामिल है जो चोट को प्राप्त करने से पहले लार्वा के जीनोटाइप के निर्धारण की अनुमति देता है। जीनोटाइप निर्धारित करने के बाद, मांसपेशियों को सुई चाकू का उपयोग करके घायल कर दिया जाता है, जिसके बाद मांसपेशियों के उत्थान की सीमा निर्धारित करने के लिए ध्रुवीकरण प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाता है। इसलिए हम एक उच्च थ्रूपुट पाइपलाइन प्रदान करते हैं जो मांसपेशियों की बीमारी के जेब्राफिश मॉडल में मांसपेशियों के उत्थान की परीक्षा की अनुमति देता है।

Introduction

कंकाल की मांसपेशी मानव शरीर द्रव्यमान के 30-50% के लिए खातों, और न केवल लोकोमोशन के लिए अपरिहार्य है, लेकिन यह भी एक महत्वपूर्ण चयापचय और भंडारण अंग1के रूप में कार्य करता है । पोस्टमिटोटिक होने के बावजूद, कंकाल की मांसपेशी अत्यधिक गतिशील है और चोट के बाद एक जबरदस्त पुनर्योजी क्षमता को बरकरार रखती है। इसका कारण यह है कि मिओफिबर्स के बेसल लैमिना के नीचे स्थित टिश्यू रेजिडेंट स्टेम सेल (जिसे सैटेलाइट सेल भी कहा जाता है) की उपस्थिति और ट्रांसक्रिप्शन कारकों द्वारा चिह्नित बॉक्स प्रोटीन 7 (पैक्स7)और/या जोड़ा गया बॉक्स प्रोटीन 3 (पैक्स3),अन्य2, 3के बीच । चोट के बाद, उपग्रह कोशिका सक्रिय हो जाती है और मायोब्लास्ट का एक पूल उत्पन्न करने के लिए सेल प्रसार से गुजरती है, जो बाद में नई मांसपेशी फाइबर बनाने के लिए अंतर करती है। उपग्रह कोशिका सक्रियण और मजबूत मांसपेशियों की मरम्मत को विनियमित करने वाले प्रो-पुनर्योजी संकेतों का अत्यधिकसंरक्षितझरना विभिन्न स्थितियों में प्रभावित होता है जैसे कि मायोपैथी और होमोस्टेटिक वृद्धावस्था 4,5।

मायोपैथी का ऐसा ही एक विविध समूह मस्कुलर डिस्ट्रॉफी है, जो प्रगतिशील मांसपेशी बर्बाद करने और6पतन की विशेषता है। ये बीमारियां प्रमुख प्रोटीन में आनुवंशिक उत्परिवर्तनों का परिणाम हैं, जिनमें डिस्ट्रोफिन और लैमिनिन-α2 (लामा2) शामिल हैं, जो बाहीय फाइबर के बाहरी लगाव के लिए जिम्मेदारहैं,जो बाहीय मैट्रिक्स7,8। यह देखते हुए कि मस्कुलर डिस्ट्रॉफी में फंसा प्रोटीन मांसपेशियों की संरचना को बनाए रखने में इस तरह की केंद्रीय भूमिका निभाता है, कई वर्षों तक यह माना जाता था कि इस प्रक्रिया में विफलता रोग रोगजनन9के लिए जिम्मेदार तंत्र था। तथापि, हाल के अध्ययनों में मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं के नियमन में दोषों और मांसपेशियों के उत्थान में बाद में हानि की पहचान की गई है , जो मांसपेशियों की विकृति10,11में देखी गई मांसपेशियों की विकृति के लिए दूसरे संभावित आधार के रूप में है । जैसे, आगे के अध्ययन की जांच करने के लिए कैसे मांसपेशियों स्टेम सेल समारोह और जुड़े आला तत्वों में एक हानि मांसपेशियों डिस्ट्रॉफी के लिए योगदान देता है की जरूरत है ।

पिछले एक दशक में, जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)रोग मॉडलिंग12के लिए एक महत्वपूर्ण कशेरुकी मॉडल के रूप में उभरा है । यह जेब्राफिश भ्रूण के तेजी से बाहरी विकास के लिए जिम्मेदार है, इसकी ऑप्टिकल स्पष्टता के साथ मिलकर, जो मांसपेशियों के गठन, विकास और कार्य के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, न केवल जेब्राफिश में अत्यधिक संरक्षित मांसपेशियों का विकास और संरचना है, वे मांसपेशियों के उत्थान की एक अत्यधिक संरक्षित प्रक्रिया भी प्रदर्शित करते हैं13। नतीजतन, जेब्राफिश मांसपेशियों की बीमारियों के रोगविज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं, और यह पता लगाते हैं कि मांसपेशियों के उत्थान में कैसे प्रभावित होता है। इस उद्देश्य के लिए, हमने एक विधि विकसित की है जो मांसपेशियों की बीमारी के जेब्राफिश मॉडल में कंकाल मांसपेशी उत्थान के समय पर अध्ययन करने में सक्षम बनाती है। इस उच्च थ्रूपुट पाइपलाइन में जीवित भ्रूण14जीनोटाइप के लिए एक विधि शामिल है, जिसके बाद सुई-चाकू की चोट की जाती है और मांसपेशियों के उत्थान की सीमा को ध्रुवीकरण प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चित्रित किया जाता है। इसलिए इस तकनीक के उपयोग से मांसपेशियों की बीमारी के जेब्राफिश मॉडल में मांसपेशियों की पुनर्योजी क्षमता का पता चल जाएगा।

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Protocol

प्रजनन कॉलोनी लाइसेंस ईआरएम14481 के तहत मोनाश विश्वविद्यालय पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित मानक परिचालन प्रक्रियाओं के अनुसार जेब्राफिश रखरखाव किया गया था।

1. भ्रूण जीनोटाइपिंग मंच का उपयोग करके जीवित भ्रूण के जीनोटाइप का निर्धारण।

  1. एनेस्थेटाइज 3 दिन बाद निषेचन (डीपीएफ) जेब्राफिश भ्रूण भ्रूण माध्यम (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 m M CaCl2,0.33 mM MgSO4 पानी में) में 0.016% (v/v) की अंतिम एकाग्रता के लिए ट्राइकेन मीथेनसुलफोनेट जोड़कर। यह सुनिश्चित करने के लिए 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें कि मछली पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड हो, स्पष्ट है जब मछली तैराकी बंद कर दे।
  2. चिप(चित्रा 1A)की शीर्ष सतह से स्पष्ट सुरक्षात्मक फिल्म छीलने से 24 चैंबर डीएनए निष्कर्षण चिप तैयार करें ।
  3. खोलने को चौड़ा करने के लिए 20 माइक्रोन फिल्टर टिप की नोक काटें। इसका उपयोग करके, भ्रूण माध्यम के 13 माइक्रोन वॉल्यूम में एक भ्रूण चुनें और चिप के पहले कक्ष में लोड करें। इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि भ्रूण प्रत्येक कक्ष में तिरस्कृत न हो जाए।
    नोट: यह कदम न्यूनतम वायु ड्राफ्ट वाले क्षेत्र में किया जाना चाहिए, क्योंकि उच्च वायु प्रवाह तरल पदार्थ के अत्यधिक वाष्पीकरण का कारण बन सकता है जिसके परिणामस्वरूप भ्रूण की संवेदनशीलता और अस्तित्व कम हो जाता है।
  4. एक बार भ्रूण की वांछित संख्या डीएनए निष्कर्षण चिप पर लोड किया गया है, यह ज़ेब्राफ़िश भ्रूण जीनोटाइपिंग मंच पर लोड । यह सबसे अच्छा एक पक्ष में पहले रखकर हासिल की है, इसके बाद यह बाकी के द्वारा ।
    नोट: मंच पर बहुत अधिक दबाव जोड़ने से बचें क्योंकि यह अंतर्निहित स्प्रिंग्स को अधिक दबाव और नुकसान पहुंचा सकता है।
  5. चिप के ऊपर चुंबकीय मंच ढक्कन प्रत्यय, जो डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल के दौरान भ्रूण मीडिया के वाष्पीकरण को रोकने के लिए, और मंच ढक्कन बंद हो जाएगा ।
  6. बेस यूनिट को 2.4 वोल्ट, 0.051 ए और 0.12 डब्ल्यू में सेट करें और "ऑन/ऑफ" बटन दबाकर डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल शुरू करें। मंच हिल शुरू कर देना चाहिए, जो धीरे से ढक्कन को छूने से मूल्यांकन किया जा सकता है । प्रोटोकॉल को 8 मिनट तक चलाया जाना चाहिए।
    नोट: जोरदार कंपन एपिडर्मल कोशिकाओं, जिसमें से जीनोमिक डीएनए निकाला जाता है की बहा में परिणाम है ।
  7. जबकि कार्यक्रम चल रहा है, प्रत्येक अच्छी तरह से भ्रूण माध्यम के 1 मिलीएल जोड़कर एक 24 अच्छी तरह से थाली तैयार है, जो व्यक्तिगत भ्रूण को अलग करने के लिए आवश्यक है, जबकि डाउनस्ट्रीम जीनोटाइपिंग परख किया जा रहा है ।
  8. इसके अतिरिक्त, उचित रूप से 8 अच्छी तरह से पट्टी ट्यूबों, जो प्रत्येक भ्रूण से डीएनए सामग्री के संग्रह के लिए इस्तेमाल किया जाएगा लेबल ।
  9. 8 मिनट प्रोटोकॉल के पूरा होने पर, मंच के कंपन को रोकने के लिए ऑन/ऑफ बटन दबाएं।
  10. मंच के ढक्कन को खोलें, और धीरे-धीरे चुंबकीय ढक्कन को हटा दें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि मंच पर न्यूनतम दबाव लागू किया जाए।
  11. ध्यान से मंच से डीएनए निष्कर्षण चिप निकालें और इसे एक सपाट सतह पर रखें।
  12. पहले कक्ष से, भ्रूण के आसपास के भ्रूण मीडिया के 10 माइक्रोन को हटा दें और इसे 8-अच्छी तरह से पट्टी ट्यूब के उचित कुएं में रखें। मीडिया में उस भ्रूण से आनुवंशिक सामग्री होती है, जिसका उपयोग डाउनस्ट्रीम परख के लिए किया जाएगा ।
    नोट: मीडिया संग्रह के दौरान पिपेट टिप के साथ भ्रूण को छूने से बचें, क्योंकि यह भ्रूण को नुकसान पहुंचा सकता है।
  13. एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करके, तुरंत एक ही कक्ष में ताजा भ्रूण माध्यम की दो बूंदें जोड़ें। भ्रूण को इकट्ठा करें और इसे 24 अच्छी तरह से प्लेट के पहले कुएं में ले जाएं।
  14. शेष सभी कक्षों के लिए 1.12 और 1.13 चरण दोहराएं। इसके पूरा होने पर जीवित भ्रूण युक्त 24 अच्छी प्लेट को 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ले जाया जा सकता है ।
  15. भ्रूण के जीनोटाइप का निर्धारण करने के लिए उचित डाउनस्ट्रीम जीनोटाइपिंग परख करें।
    नोट: भ्रूण जीनोटाइपिंग प्लेटफॉर्म से प्राप्त डीएनए को पीसीआर द्वारा सफलतापूर्वक परिलक्षित किया जा सकता है और इसका उपयोग अनुक्रमण, जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस, या उच्च-संकल्प पिघल-विश्लेषण14सहित बाद के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। प्रतिनिधि परिणामों में वर्णित लामा2 तनाव को जीनोटाइप करने के लिए पीसीआर, प्रतिबंध पाचन और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग किया गया था। यह देखते हुए कि प्रत्येक भ्रूण से प्राप्त डीएनए की एकाग्रता कम है, यह सबसे अधिक उपयोग करने का सुझाव दिया है, नहीं तो सब, आनुवंशिक सामग्री के बहाव परख के लिए प्राप्त की ।
  16. एक बार प्रत्येक लार्वा के जीनोटाइप की पहचान हो जाने के बाद, उन्हें 90 मिमी पेट्री व्यंजनों में स्थानांतरित करें, प्रत्येक जीनोटाइप को एक अलग डिश में रखें। डिश को 25 एमएल भ्रूण माध्यम से भरें और 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।

2. सुई वार का उपयोग करके मांसपेशियों में चोट का प्रदर्शन करना

  1. एक बार लार्वा 4 डीपीएफ हो जाने के बाद, भ्रूण माध्यम में 0.016% (v/v) की अंतिम एकाग्रता में ट्राइकेन मीथेनसुलफोनेट जोड़कर उन्हें एनेस्थेटाइज करें। यह सुनिश्चित करने के लिए 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें कि मछली पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड हो, स्पष्ट है जब मछली तैराकी बंद कर दे।
    नोट: पूर्वाग्रह से बचने के लिए, जीनोटाइप की पहचान छुरा और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण प्रदर्शन अन्वेषक के लिए अंधा किया जाना चाहिए ।
  2. इस समय के दौरान, ताजा भ्रूण माध्यम के 1 एमएल के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से भरने के द्वारा 24 अच्छी तरह से प्लेटें तैयार करें, और सोमाइट सीमाओं के दृश्य को सुविधाजनक बनाने के लिए काले रंग की पृष्ठभूमि और उच्च शक्ति प्रकाश के साथ स्टीरियोमाइक्रोस्कोप स्थापित करें।
  3. प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करके, एक एनेस्थेटीकृत लार्वा को एक नई पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  4. ध्यान से एक पिपेट के साथ अतिरिक्त भ्रूण माध्यम को हटा दें, और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, मछली को इस तरह उन्मुख करें कि सिर बाईं ओर हो, दाईं ओर पूंछ, पृष्ठीय क्षेत्र ऊपर और वेंट्रल क्षेत्र नीचे(चित्रा 1B)।
  5. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत काम करना, क्षैतिज मायोसेप्टम के ऊपर स्थित एपेक्सियल मांसपेशी में एक त्वरित लेकिन सटीक वार करने के लिए 30 गेज सुई का उपयोग करें। पूर्वकाल-पीछे की स्थिति में स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, गुदा पोर (चित्रा 1B) के ऊपर स्थित1-2सोमाइट्स के लिए लक्ष्य रखें।
    नोट: तंत्रिका ट्यूब और नोटोकॉर्ड छुरा से बचें, और इस प्रक्रिया के दौरान मछली के सूखने से बचने के लिए जल्दी से काम करते हैं ।
  6. एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करके, वार किए गए जेब्राफिश पर भ्रूण माध्यम की एक बूंद डालें और ध्यान से इसे 24 अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें।
  7. चरण 2.3 से 2.6 तक दोहराएं। जब तक सभी मछलियों पर वार नहीं किया गया है।
    नोट: कई लार्वा प्रसंस्करण गति और अन्वेषक की प्रवीणता के आधार पर एक साथ वार किया जा सकता है, जब तक कि मछली प्रक्रिया के दौरान सूखी नहीं होती है।
  8. एक बार जब सभी लार्वा पर वार किया गया है, तो 24 अच्छी प्लेट को 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें जब तक कि बाद में इमेजिंग नहीं की जाती है।

3. मांसपेशियों की चोट और वसूली की इमेजिंग

  1. 1 दिन के बाद चोट (1 डीपीआई) पर, भ्रूण माध्यम में ०.०१६% (v/v) की अंतिम एकाग्रता के लिए ट्राइकेन मीथेनसुलफोनेट जोड़कर वार लार्वा को एनेस्थेटाइज करें । यह सुनिश्चित करने के लिए 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें कि मछली पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड हो, स्पष्ट है जब मछली तैराकी बंद कर दे।
    नोट: 0 डीपीआई में, घाव साइट में बड़ी मात्रा में सेलुलर मलबे होते हैं, जिससे मांसपेशियों की चोट(अनुपूरक चित्रा 1A-B)की सीमा को निर्धारित करना मुश्किल हो जाता है। इस मलबे को घाव स्थल से साफ करने में लगभग 18-20 घंटे लगते हैं, और इस तरह यह चोट की सीमा निर्धारित करने के लिए 0 डीपीआई के बजाय 1 डीपीआई पर छवि लार्वा के लिए अधिक विश्वसनीय है।
  2. ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोप के मंच पर एक साफ और खाली ग्लास बॉटम आधारित डिश रखें और एकीकृत सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पृष्ठभूमि सेट करें।
    नोट: छवि birefringence के लिए प्लास्टिक पेट्री व्यंजन का उपयोग न करें, क्योंकि वे उचित रूप से अपवर्तित प्रकाश संचारित नहीं करते हैं। उपयोग किए गए ध्रुवीकृत माइक्रोस्कोप के आधार पर, निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार अतिरिक्त सेटिंग्स की आवश्यकता हो सकती है।
  3. पृष्ठभूमि सेट करने के बाद, माइक्रोस्कोप चरण से ग्लास बॉटम आधारित डिश को हटा दें, और ग्लास पिपेट का उपयोग करके, एनेस्थेटाइज्ड, वार मछली को ग्लास बॉटम आधारित डिश पर स्थानांतरित करें।
  4. ध्यान से एक पिपेट का उपयोग कर भ्रूण माध्यम की अधिकता को दूर करें, और 2.5 के अनुसार मछली को उन्मुख करें - सिर बाईं ओर है, दाईं ओर पूंछ, पृष्ठीय क्षेत्र ऊपर और वेंट्रल क्षेत्र नीचे।
    नोट: सुनिश्चित करें कि लार्वा को यथासंभव सपाट रखा गया है, क्योंकि विभिन्न सोमाइट्स में विभिन्न बिरफिंग तीव्रता में असमान बढ़ते परिणाम हैं।
  5. माइक्रोस्कोप चरण पर एनेस्थेटाइज्ड लार्वा के साथ ग्लास बॉटम आधारित डिश रखें और ध्रुवीकृत प्रकाश(आंकड़े 1C और 1D)का उपयोग करके मांसपेशियों की छवि बनाएं।
    नोट: माइक्रोस्कोप/ध्रुवीकृत लेंस के प्रकार के आधार पर, इसके पूर्वकाल-पीछे की धुरी पर मछली अभिविन्यास समग्र birefringence15को प्रभावित कर सकते हैं । इमेजिंग करते समय चोट साइट के दोनों ओर कम से कम 5 सोमाइट्स को शामिल करना सुनिश्चित करें।
  6. एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करना, मछली को फिर से हाइड्रेट करने के लिए भ्रूण माध्यम की एक बूंद डालें और मछली को भ्रूण माध्यम से भरी 24 अच्छी तरह से प्लेट के कुएं में रखें।
    नोट: मछली को सूखने से रोकने के लिए जितनी जल्दी हो सके इमेजिंग करना महत्वपूर्ण है।
  7. चरण 3.3 दोहराएं। 3.6 करने के लिए। जब तक सभी मछली चित्रित किया गया है ।
  8. जब सभी छवियों का अधिग्रहण कर लिया गया है, उन्हें बाद के विश्लेषण के लिए .tiff प्रारूप में सहेजें।
  9. मछली को 3 डीपीआई (7 डीपीएफ) पर बाद में इमेजिंग करने तक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस रखो।
  10. जब मछली 3 डीपीआई होती है, तो मछली को 3.3 से 3.8 के अनुसार छवि करें।
  11. एक बार सभी मछलियों को चित्रित किया गया है, भ्रूण माध्यम में ०.२% (v/v) की अंतिम एकाग्रता के लिए ट्राइकेन मीथेनसुलफोनेट जोड़कर उन्हें इच्छामृत्यु । यह सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें कि मछली इच्छामृत्यु हो, तैराकी की क्षमता के नुकसान, गिल कवर के पंप, और स्पर्श के बाद उड़ान प्रतिक्रिया की कमी से स्पष्ट हो।

4. मांसपेशियों के उत्थान का मात्राकरण

  1. एक इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर जैसे स्वतंत्र रूप से उपलब्ध इमेज जे सॉफ्टवेयर पर 1 डीपीआई छवि खोलें।
  2. बहुभुज उपकरण का उपयोग करना, घाव स्थल के चारों ओर आकर्षित, और क्षेत्र को मापने और इस क्षेत्र की birefringence तीव्रता मतलब(आंकड़े 1C और 1D)। इन मूल्यों को प्रदान किए गए टेम्पलेट(अनुपूरक तालिका 1)में कोशिकाओं D3 और E3 को कॉपी करें।
  3. दो अतिरिक्त क्षेत्रों को आकर्षित करें, प्रत्येक 1-2 घायल सोमाइट्स, और क्षेत्र को मापें और इनमें से प्रत्येक क्षेत्र(आंकड़े 1C और 1D)की द्विप्रेमी तीव्रता का मतलब है । इन मूल्यों को प्रदान किए गए टेम्पलेट(अनुपूरक तालिका 1)में कोशिकाओं D4-D5 और E4-E5 को कॉपी करें।
    नोट: हालांकि 1 डीपीआई और 3 डीपीआई छवियों में एक ही घायल सोमाइट्स का चयन करना बेहतर है, मांसपेशियों के रेशों की छिटपुट टुकड़ी और बाद में म्यूटेंट में birefringence में कमी यह असंभव बना सकते हैं । इसलिए, इस घटना में म्यूटेंट में मांसपेशियों की अखंडता में कमी के कारण 1 डीपीआई और 3 डीपीआई में एक ही सोमाइट्स का चयन नहीं किया जा सकता है, प्रत्येक समय बिंदुओं पर दो अलग-अलग लेकिन अप्रभावित क्षेत्रों का चयन करें।
  4. उस क्षेत्र की औसत birefringence तीव्रता को क्षेत्र द्वारा विभाजित करके प्रत्येक क्षेत्र के लिए सामान्यीकृत birefringence की गणना करें - प्रदान किए गए टेम्पलेट(अनुपूरक तालिका 1)में कॉलम एफ में प्रदर्शित।
  5. सभी 1 डीपीआई और 3 डीपीआई छवियों के लिए 4.1-4.4 दोहराएं।
    नोट: प्रदान किए गए टेम्पलेट(अनुपूरक तालिका 1)का उपयोग करते समय, 1 डीपीआई क्षेत्र और मतलब बिरेफ्लेंस तीव्रता मूल्यों को क्रमशः कॉलम डी और ई में डाला जाना चाहिए, और 3 डीपीआई क्षेत्र और मतलब birefring तीव्रता मूल्यों को क्रमशः कॉलम जे और के में डाला जाना चाहिए।
  6. हर समय बिंदु के लिए, दो अघायल क्षेत्रों के औसत सामान्यीकृत birefringence की गणना करें। यह मान अघायल मांसपेशियों का एक संदर्भ बिंदु प्रदान करता है।
    नोट:(अनुपूरक तालिका 1)प्रदान किए गए टेम्पलेट में, इस मूल्य की गणना क्रमशः 1 डीपीआई और 3 डीपीआई छवियों के लिए कॉलम जी और एम में की जाती है।
  7. इसके बाद, चोट क्षेत्र के सामान्यीकृत बिरेफ्लेंस को अघायल क्षेत्रों (4.6 में गणना) के औसत सामान्यीकृत बिरेफ्लेंस द्वारा विभाजित करके, 1 डीपीआई पर मांसपेशियों की चोट की सीमा निर्धारित करें।
    नोट: उपरोक्त विस्तृत सुई चाकू प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, वाइल्डटाइप लार्वा आमतौर पर 1 डीपीआई पर घाव स्थल पर 48.5 ± 14.3% की सामान्यीकृत birefringence दिखाते हैं, यह दर्शाता है कि अघायल सोमाइट्स की तुलना में बिरफिंगेंस लगभग 50% कम हो गया है। टेम्पलेट(अनुपूरक तालिका 1)का उपयोग करते समय, इस मूल्य की गणना कॉलम एच में प्रतिशत के रूप में की जाती है।
  8. मांसपेशियों के उत्थान की सीमा निर्धारित करने के लिए, इस स्तर पर अघायल क्षेत्रों की औसत सामान्यीकृत तीव्रता से, 3 डीपीआई छवि में चोट क्षेत्र के सामान्यीकृत birefringence को विभाजित करें।
    नोट: 3 डीपीआई में, वाइल्डटाइप लार्वा आमतौर पर घाव स्थल पर 60 ± 15.3% की सामान्यीकृत birefringence दिखाते हैं। यह देखते हुए कि 1 डीपीआई पर घाव स्थल के भीतर सामान्यीकृत birefringence 48.5 ± 14.3% (चरण 4.7) था, 3 डीपीआई पर बिरेफिंग में वृद्धि 60 ± 15.3% लगभग 11.5% की वसूली को इंगित करती है। टेम्पलेट(अनुपूरक तालिका 1)का उपयोग करते समय, इस मूल्य की गणना कॉलम एन में प्रतिशत के रूप में की जाती है।
  9. प्रत्येक जीनोटाइप के भीतर मछली को अलग रखते हुए, 1 डीपीआई (चरण 4.7) के साथ 3 डीपीआई (चरण 4.8) पर घाव स्थल के सामान्यीकृत बिरेफ्लेंस की तुलना करते हुए एक युग्मित टी-परीक्षण करें। यह प्रत्येक जीनोटाइप में प्रत्येक मछली द्वारा प्रदर्शित मांसपेशियों के उत्थान के प्रक्षेपवक्र को प्रकट करेगा, और हाइलाइट करेगा कि प्रत्येक जीनोटाइप द्वारा प्रदर्शित मांसपेशियों के उत्थान की सीमा में काफी बदलाव आया है या नहीं।
  10. अंत में, चरण 4.8 में प्राप्त मूल्य को विभाजित करके पुनर्योजी सूचकांक की गणना करें, जो चरण 4.7 में प्राप्त मूल्य द्वारा 3 डीपीआई पर मांसपेशियों के उत्थान की सीमा है, जो 1 डीपीआई पर मांसपेशियों की चोट की सीमा है। 1 का पुनर्योजी सूचकांक इंगित करता है कि 1 डीपीआई पर चोट 3 डीपीआई के बराबर है और मांसपेशियों का पुनर्जनन नहीं हुआ है; 1 से ऊपर एक मूल्य इंगित करता है कि 3 डीपीआई में नई मांसपेशी घाव स्थल में बनी है जिसमें यह रेखांकित किया गया है कि मांसपेशियों ने पुनर्जीवित किया है; और 1 से कम का एक पुनर्योजी सूचकांक इस बात पर प्रकाश डालता है कि 3 डीपीआई पर घाव 1 डीपीआई से भी बदतर है, और बिगड़ा में मांसपेशियों का उत्थान। एक टी-परीक्षण या एक तरह से ANOVA को सांख्यिकीय रूप से विभिन्न जीनोटाइप के बीच मांसपेशियों के उत्थान की सीमा की तुलना करने के लिए किया जा सकता है। प्रदान किए गए टेम्पलेट(अनुपूरक तालिका 1)का उपयोग करते समय, इस मूल्य की गणना कॉलम ओ में की जाती है।
    नोट: किसी भी पूर्वाग्रह से बचने के लिए, विभिन्न जैविक माता-पिता से प्राप्त प्रत्येक प्रयोग से मछली के साथ, और प्रत्येक प्रयोग अलग-अलग दिनों में किए गए प्रत्येक प्रयोग के साथ, ट्रिपलिट्स में पूरे प्रयोग को करने की सिफारिश की जाती है।

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Representative Results

कंकाल की मांसपेशियों के द्विवर्तन को निर्धारित करने की क्षमता मांसपेशियों की क्षति के स्तर की जांच और तुलना करने और वीवो मेंमांसपेशियों के उत्थान की जांच करने के लिए एक गैर-आक्रामक लेकिन अत्यधिक प्रजनन योग्य विधि प्रदान करती है। मांसपेशियों के सर्मोमर15की छद्म-क्रिस्टलीय सरणी के माध्यम से ध्रुवीकृत प्रकाश के विवर्तन से बिरेफिंगेंस परिणाम होता है, और मांसपेशियों को चोट या क्षति के बाद, बिरेफिंग में कमी स्पष्ट होती है। इसी तरह, स्टेम कोशिकाओं की सक्रियता और भेदभाव के परिणामस्वरूप चोट स्थल के भीतर नए मांसपेशी फाइबर का गठन होता है, बाद में इस क्षेत्र के भीतर बिरेफिंगेंस तीव्रता बढ़ रही है। इस प्रणाली का उपयोग करते हुए, हमने लामा 216में कमी के कारण जन्मजात मस्कुलर डिस्ट्रॉफी टाइप 1 ए (एमडीसी1ए) के जेब्राफिश मॉडल में मांसपेशियों के उत्थान की जांच की है। दो लामा 2+/-जेब्राफिश के बीच एक क्रॉस से भ्रूण का एक क्लच एकत्र किया गया था, और 3 डीपीएफ में, भ्रूण को डीएनए निष्कर्षण चिप(चित्रा 1A)में स्थानांतरित कर दिया गया था और बाद में भ्रूण जीनोटाइपिंग तकनीक का उपयोग करके जीनोटाइप किया गया था । जीनोटाइप की पहचान करने के बाद, लामा2-/-लार्वा, जो एमडीसी1ए 16मॉडल, और लामा 2+/+ भाई बहन चित्रा 1 बीके अनुसार सुई चाकू का उपयोग करके घायल हो गए थे, और 1 डीपीआई, और 3 डीपीआई में ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोप पर इमेज्ड थे, और birefringence तीव्रता मात्रा निर्धारित की गई थी । जबकि मांसपेशियों की चोट के परिणामस्वरूप 1 डीपीआई(चित्रा 1Ci और Di) पर बिरेफ्लेंस तीव्रता में कमी आतीहै,मांसपेशियों के सफल उत्थान के परिणामस्वरूप एक ही क्षेत्र में वृद्धि हुई है(चित्र 1Cii और Dii)। यह भी उल्लेखनीय है कि जहां लामा 2+/+ लार्वा सामान्य मांसपेशियों के पैटर्न के कारण एक समान birefringence तीव्रता(चित्रा 1C)प्रदर्शित करते हैं, वहीं लामा2-/-की मांसपेशियों में द्विप्रेमी तीव्रता असमान और अत्यधिक छिटपुट(चित्रा 1D)थी, जिसे कम मांसपेशियों की अखंडता के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था ।

इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम बताते हैं कि दोनों वाइल्डटाइप लार्वा(लामा 2+/+; चित्रा 2A),और लामा 2 में लार्वा की कमी(lama2-/-; चित्रा 2B),1 डीपीआई(चित्रा 2C)की तुलना में 3 डीपीआई पर घाव स्थल में काफी वृद्धि हुई birefringence तीव्रता दिखाते हैं, यह दर्शाता है कि मांसपेशियों को पुनर्जीवित किया गया है। प्रत्येक जीनोटाइप में लार्वा की पुनर्योजी क्षमता की तुलना करने के लिए, पुनर्योजी सूचकांक निर्धारित किया गया था, और हम बताते हैं कि लामा2-/-लार्वा ने लामा 2+/+ लार्वा(चित्रा 2डी;लामा2 में मतलब-/-1.30 ±-0.251; लामा2 में मतलब-/=१.८३ ± ०.४९) की तुलना में मांसपेशियों के उत्थान में उल्लेखनीय वृद्धि प्रदर्शित की । लामा2-/-लार्वा में बेहतर उत्थान को और अधिक मान्य करने के लिए, हमने एफ-ऐक्टिन(अनुपूरक चित्रा 1B-D)के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ मांसपेशियों को दाग दिया । हालांकि इन परिणामों की पुष्टि करते है कि lama2-/-वास्तव में पुनर्जीवित करते हैं, घाव स्थल के भीतर विभेदित मांसपेशी फाइबर की उपस्थिति से स्पष्ट है, 1 डीपीआई और 3 डीपीआई पर एक ही मछली की जांच करने में असमर्थता को मात्रा निर्धारित करने और lama2+/+ और lama2-/-मछली के बीच पुनर्योजी प्रतिक्रिया की तुलना करने की क्षमता को सीमित करता है । हालांकि lama2 में इस बेहतर उत्थान क्षमता के लिए यंत्रवादी आधार-/-लार्वा मायावी रहता है, हम मानते है कि lama2 के नुकसान सक्रिय स्टेम कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है, जो बाद में बेहतर मांसपेशियों के उत्थान में परिणाम है । हालांकि, यह निर्धारित करने के लिए आगे की पढ़ाई की जरूरत है । सामूहिक रूप से, ये परिणाम मांसपेशियों की बीमारी के जेब्राफिश मॉडल में मांसपेशियों के उत्थान में परिवर्तन की पहचान करने के लिए वर्णित तकनीक की क्षमता को उजागर करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1:जेनोटीपिंग और मांसपेशियों के उत्थान प्रोटोकॉल का अवलोकन। (क) डीएनए निष्कर्षण चिप की छवि जिसमें 24, 3 डीपीएफ जेब्राफिश लार्वा होते हैं । (ख) अभिविन्यास की योजनाबद्ध जिसमें 4 डीपीएफ लार्वा को सुई वार करने के लिए रखा जाना चाहिए, बाईं ओर सिर के साथ, दाईं ओर पूंछ, पृष्ठीय क्षेत्र ऊपर और वेंट्रल क्षेत्र नीचे । सुई वार एक 30 गेज सुई का उपयोग कर किया जाना चाहिए, epaxial मांसपेशी के 1-2 somites लक्ष्यीकरण । BioRender.com के साथ बनाया गया। (सी-डी) एक लामा 2+ + + और लामा 2 में birefringence की छवियां-/-1 डीपीआई और 3 डीपीआई पर लार्वा । सफेद और लाल रंग में दिखाए गए क्षेत्र क्रमशः घाव स्थल और अघायल सोमाइट्स में बिरेफिंग को निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले क्षेत्रों को दर्शाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: लामा2 की कमी वाले जेब्राफिश लार्वा में मांसपेशियों के उत्थान का मात्राकरण। लामा2+/+ (ए) में birefringence की छवियां, और लामा2-/-(बी) लार्वा 1 डीपीआई और 3 डीपीआई पर । दोनों में 3 डीपीआई पर घाव, lama2+ + + और lama2-/-लार्वा नई मांसपेशी से भर जाता है । (ग) प्रत्येक लार्वा के सामान्यीकृत बिरिफेंस का ग्राफ 1 डीपीआई और 3 डीपीआई पर। लामा 2+/+ और लामा 2 में घाव स्थल में सामान्यीकृत birefringence 3dpi पर काफी बढ़ जाता है, जैसा कि एक युग्मित टी-परीक्षण का उपयोग करके निर्धारित किया गया है । (घ) लामा 2+/+में पुनर्योजी सूचकांक, और लामा2-/-बाद में मांसपेशियों के उत्थान में वृद्धि दिखाने के साथ, जैसा कि टी-टेस्ट का उपयोग करके निर्धारित किया गया है । त्रुटि सलाखों के तीन स्वतंत्र प्रयोगों से लार्वा के साथ SEM का प्रतिनिधित्व (lama2+/+n =28, और lama2-/-n= 16) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्र 1:लामा2 में मांसपेशियों के उत्थान की जांच 2 कमी लार्वा। लामा 2+/+ (एआई) में birefringence की छवियां, और 0 डीपीआई में लामा2-/-(Aii) लार्वा घाव स्थल के भीतर सेलुलर मलबे की उपस्थिति का प्रदर्शन । 0 डीपीआई (बी), 1 डीपीआई (सी) और 3 डीपीआई (डी) पर एफ-ऐक्टिन के लिए दाग वाले लार्वा मायोटोम की अधिकतम प्रोजेक्शन कॉन्फोकल छवियां। 3 डीपीआई में, लामा 2+/+ और लामा 2-/-लार्वा के घाव स्थल को एफ-ऐक्टिन लेबल मांसपेशी फाइबर की उपस्थिति की विशेषता है । इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 1: मांसपेशियों के उत्थान के परिमाणीकरण के लिए टेम्पलेट। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

कंकाल मांसपेशी उत्थान अनिवार्य ऊतक निवासी मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं, जिसका समारोह मांसपेशियों डिस्ट्रॉफी जैसे कई मांसपेशियों के रोगों में बदल जाता है, बाद में मांसपेशियों के उत्थान की प्रक्रिया में बाधा से प्रेरित है । यहां, हम मांसपेशियों की बीमारी के लाइव जेब्राफिश मॉडल में मांसपेशियों के उत्थान की जांच करने के लिए एक उच्च थ्रूपुट प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। पाइपलाइन का पहला कदम एक भ्रूण जीनोटाइपिंग प्लेटफॉर्म14का उपयोग करता है, जो डाउनस्ट्रीम पुनर्जनन परख करने से पहले जीवित लार्वा के जीनोटाइप को निर्धारित करने के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल और सटीक तरीका है। इसका एक सीधा लाभ यह है कि यह जीनोटाइप के चयन की अनुमति देता है जो केवल ब्याज के हैं, और/या प्रत्येक जीनोटाइप समूह के भीतर मछलियों की तुलनात्मक संख्या, इसलिए शेष प्रोटोकॉल के माध्यम से संसाधित की जाने वाली मछलियों की संख्या को काफी कम करते हैं । हालांकि, यह उल्लेखनीय है कि भ्रूण जीनोटाइपिंग डिवाइस से प्राप्त जीनोमिक डीएनए की मात्रा अपेक्षाकृत कम है, जो डाउनस्ट्रीम जेनोटीपिंग परख से समझौता कर सकता है। इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि मुख्य प्रयोग के लिए इसका उपयोग करने से पहले सभी जीनोटाइपिंग परख का परीक्षण और अनुकूलन किया जाता है। इसके अतिरिक्त, डीएनए का स्रोत मुख्य रूप से एपिडर्मल है, और इस प्रकार, भ्रूण जीनोटाइपिंग प्रणाली का उपयोग ऊतक विशिष्ट उत्परिवर्तनों को प्रदर्शित करने वाले जीनोटाइप लार्वा के लिए सफलतापूर्वक नहीं किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल का दूसरा भाग सुई-चाकू की चोट के उपयोग को दर्शाता है, जो एक लागत प्रभावी और उच्च थ्रूपुट तकनीक है जो न केवल अत्यधिक प्रजनन योग्य चोट आकार में परिणाम देती है, बल्कि मांसपेशियों के प्रजनन कोशिकाओं की सक्रियता को ट्रिगर करने के लिए भी पर्याप्त है जिसके परिणामस्वरूप मांसपेशियों का उत्थान होता है। जेब्राफिश में कंकाल की मांसपेशी की चोट को प्रेरित करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण लेजर मध्यस्थता कोशिका एब्लेशन13,17,18 का उपयोग करना है । हालांकि यह विशिष्ट एक्स, वाई और जेड विमानों पर ध्यान केंद्रित करने और बाद में एकल मांसपेशियों की कोशिकाओं को लक्षित करने की क्षमता प्रदान करता है, बेहद छोटे घाव आकार प्रेरित मांसपेशियों के उत्थान के सटीक मात्राकरण को बढ़ाता है, विशेष रूप से मांसपेशियों की बीमारी मॉडल में जिससे मांसपेशियों की अखंडता पहले से ही समझौता किया जाता है। इसलिए हम जेब्राफिश मांसपेशी रोग मॉडल में मांसपेशियों के उत्थान की जांच करते समय सुई चाकू की चोटों के उपयोग के पक्ष में हैं।

मांसपेशियों के उत्थान की सीमा को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए, हम कंकाल की मांसपेशियों की द्विद्रृंग प्रकृति का लाभ उठाते हैं, जिसे आसानी से मानक ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते समय दो महत्वपूर्ण बिंदुओं पर विचार करने की आवश्यकता है। सबसे पहले, माइक्रोस्कोप और/या ध्रुवीकृत लेंस के प्रकार के आधार पर, इसके पूर्वकाल-पीछे की धुरी में मछली का अभिविन्यास समग्र birefringence तीव्रता15को प्रभावित कर सकता है, और इमेजिंग करते समय इस पर विचार करने की आवश्यकता है । अंत में, हालांकि मांसपेशियों के उत्थान पूरी तरह से 3 डीपीआई द्वारा पूरा नहीं है, वसूली की सीमा विभिन्न उपभेदों13 (चित्रा 1)में उत्थान क्षमताओं के अंतर को सक्षम करने के लिए पर्याप्त है । हमारे पिछले काम ने दिखा दिया है कि हमारे द्वारा उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, वाइल्डटाइप लार्वा 14 डीपीआई19के बाद पूरी तरह से पुनर्जीवित होता है, और इसलिए, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एक तनाव पुनर्जीवित नहीं हो सकता है या यदि मांसपेशियों के उत्थान में देरी हो रही है, तो 3 डीपीआई से परे birefringenceence तीव्रता की जांच करना आवश्यक हो सकता है।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि टेलीओस्ट मछलियों में, मांसपेशियों की वृद्धि जानवर20के जीवन भर होती है, और इस प्रकार, घाव स्थल की द्विप्रभ्य तीव्रता को सामान्य करना बहुत महत्वपूर्ण है, जिसमें एक ही मछली के भीतर अघायल सोमाइट्स होते हैं। यह कदम एक आंतरिक नियंत्रण प्रदान करता है और विभिन्न समय बिंदुओं पर मांसपेशियों की मात्रा में अंतर, या विभिन्न सत्रों के दौरान इमेजिंग मापदंडों में अंतर के कारण विश्लेषण में पूर्वाग्रह को हटा देता है। यह सामान्यीकरण कदम मांसपेशियों की बीमारी के मॉडलों में मांसपेशियों के उत्थान को सही ढंग से निर्धारित करने के लिए भी आवश्यक है, जिससे स्वाभाविक रूप से माइफिब्रिल्स कम हो सकते हैं और/या मांसपेशियों की अखंडता से समझौता किया जा सकता है, बाद में समग्र birefringence तीव्रता को कम करने । इसके अतिरिक्त, जबकि यह प्रोटोकॉल मांसपेशियों की पुनर्योजी क्षमता में परिवर्तन को प्रभावी ढंग से प्रकट कर सकता है, यह संभव है कि वे स्टेम सेल फ़ंक्शन पर अप्रत्यक्ष प्रभाव के परिणामस्वरूप हों। मांसपेशी उत्थान एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें मांसपेशी कोशिकाओं, मैक्रोफेज, फाइब्रो-एडिपोजेनिक जनकों और मध्यवर्ती कोशिकाओं सहित कई कोशिका प्रकारों के संकेत शामिल हैं। यह संभव है कि मांसपेशियों की परिवर्तित क्षमता को पुनर्जीवित करने के लिए शायद इन अन्य सेल प्रकारों में से किसी के जीव विज्ञान में परिवर्तन से समझाया गया है जो बाद में मांसपेशियों के स्टेम सेल कार्य और पुनर्योजी प्रक्रिया को प्रभावित करते हैं। इसलिए, जबकि यह प्रोटोकॉल मांसपेशियों की बीमारी के मॉडल में मांसपेशियों के उत्थान में परिवर्तन की पहचान कर सकता है, डाउनस्ट्रीम सेलुलर और आणविक विश्लेषण किए जाने की आवश्यकता है ताकि देखे गए परिवर्तनों के लिए जिम्मेदार तंत्र (ओं) की पहचान की जा सके।

अंत में, विभिन्न मांसपेशियों की बीमारियों में मांसपेशियों की पुनर्योजी क्षमता पूरी तरह से समझ में नहीं आती है, और वीवो में मांसपेशियों के उत्थान की जांच करने के लिए नई तकनीकों का उद्भव ऐसे सवालों से निपटने के लिए एक मंच प्रदान करता है। विधि का उपयोग सेलुलर और आणविक संकेतों की खोज के लिए एक आधार के रूप में किया जा सकता है जो मांसपेशियों की बीमारी के जेब्राफिश मॉडल में मांसपेशियों के उत्थान को विनियमित करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम माइक्रोस्कोप रखरखाव और सेटअप के साथ सहायता के लिए डॉ एलेक्स फुलचर, और मोनाश माइक्रो इमेजिंग का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । ऑस्ट्रेलियाई पुनर्योजी चिकित्सा संस्थान विक्टोरिया राज्य सरकार और ऑस्ट्रेलियाई सरकार से अनुदान द्वारा समर्थित है । इस काम को पी.डी..C (628882) को मस्कुलर डिस्ट्रॉफी एसोसिएशन (यूएसए) परियोजना अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well plates Thermo Fischer 142475
30 gauge needles Terumo NN-3013R
90 mm Petri Dishes Pacific Laboratory Products PT S9014S20
DNA extraction chips wFluidx ZEG chips
Embryo genotyping platform wFluidx ZEG base unit Zebrafish Embryo Genotyper
Glass pipette Hirschmann 9260101
Glass plate dish WPI FD35-100 Commonly referred to as FluoroDish
Incubator Thermoline Scientific TEI-43L
Plastic pipette Livingstone PTP03-01
Polarizing microscope Abrio N/A

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References

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Montandon, M., Currie, P. D.,… More

Montandon, M., Currie, P. D., Ruparelia, A. A. Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease. J. Vis. Exp. (167), e62071, doi:10.3791/62071 (2021).

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