Summary
Die Regeneration der Skelettmuskulatur wird durch geweberesidente Muskelstammzellen angetrieben, die bei vielen Muskelerkrankungen wie Muskeldystrophie beeinträchtigt sind, was dazu führt, dass sich die Muskeln nicht regenerieren können. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht.
Abstract
Die Skelettmuskulatur hat eine bemerkenswerte Fähigkeit, sich nach einer Verletzung zu regenerieren, die von obligaten Gewebe-ansässigen Muskelstammzellen angetrieben wird. Nach einer Verletzung wird die Muskelstammzelle aktiviert und durchläuft eine Zellproliferation, um einen Pool von Myoblasten zu erzeugen, die sich anschließend zu neuen Muskelfasern differenzieren. Bei vielen Muskelschwundzuständen, einschließlich Muskeldystrophie und Alterung, ist dieser Prozess beeinträchtigt, was dazu führt, dass sich die Muskeln nicht regenerieren können. Der Prozess der Muskelregeneration bei Zebrafischen ist hoch konserviert, wobei Säugetiersysteme ein ausgezeichnetes System zur Untersuchung der Muskelstammzellfunktion und -regeneration bei Muskelschwunderkrankungen wie Muskeldystrophie bieten. Hier stellen wir eine Methode vor, um die Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen zu untersuchen. Der erste Schritt beinhaltet die Verwendung einer Genotypisierungsplattform, die die Bestimmung des Genotyps der Larven ermöglicht, bevor eine Verletzung hervorgeschleudert wird. Nach der Bestimmung des Genotyps wird der Muskel mit einem Nadelstich verletzt, worauf hin die Polarisationslichtmikroskopie verwendet wird, um das Ausmaß der Muskelregeneration zu bestimmen. Wir bieten daher eine Hochdurchsatz-Pipeline, die die Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht.
Introduction
Die Skelettmuskulatur macht 30-50% der menschlichen Körpermasse aus und ist nicht nur für die Fortbewegung unverzichtbar, sondern dient auch als kritisches Stoffwechsel- und Speicherorgan1. Obwohl sie postmitotisch ist, ist die Skelettmuskulatur hochdynamisch und behält nach einer Verletzung eine enorme Regenerationsfähigkeit. Dies wird auf das Vorhandensein von geweberesidenten Stammzellen (auch Satellitenzellen genannt) zurückgeführt, die sich unter der Basallamina von Myofibern befinden und durch die Transkriptionsfaktoren gepaartes Boxprotein 7 (pax7)und/oder gepaartes Boxprotein 3 (pax3)gekennzeichnetsind,unter anderem2,3. Nach einer Verletzung wird die Satellitenzelle aktiviert und durchläuft eine Zellproliferation, um einen Pool von Myoblasten zu erzeugen, die sich anschließend zu neuen Muskelfasern differenzieren. Die hochkonservierte Kaskade von pro-regenerativen Signalen, die die Aktivierung von Satellitenzellen und die robuste Muskelreparatur regulieren, ist unter verschiedenen Bedingungen wie Myopathien und homöostatischem Altern betroffen4,5.
Eine solche vielfältige Gruppe von Myopathien ist die Muskeldystrophie, die durch fortschreitenden Muskelschwund und Degeneration gekennzeichnet ist6. Diese Krankheiten sind die Folge genetischer Mutationen in Schlüsselproteinen, einschließlich Dystrophin und Laminin-α2 (LAMA2), die für die Bindung von Muskelfasern an die extrazelluläre Matrix verantwortlich sind7,8. Angesichts der Tatsache, dass Proteine, die an Muskeldystrophie beteiligt sind, eine so zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Muskelstruktur spielen, wurde viele Jahre lang angenommen, dass ein Versagen in diesem Prozess der Mechanismus war, der für die Krankheitspathogenese verantwortlich war9. Neuere Studien haben jedoch Defekte in der Regulation von Muskelstammzellen und anschließende Beeinträchtigungen der Muskelregeneration als zweite mögliche Grundlage für die bei Muskeldystrophie beobachtete Muskelpathologie identifiziert10,11. Daher sind weitere Studien erforderlich, um zu untersuchen, wie eine Beeinträchtigung der Muskelstammzellfunktion und der damit verbundenen Nischenelemente zur Muskeldystrophie beiträgt.
In den letzten zehn Jahren hat sich zebrafisch (Danio rerio) zu einem wichtigen Wirbeltiermodell für die Krankheitsmodellierung entwickelt12. Dies ist auf die schnelle äußere Entwicklung des Zebrafischembros zurückzuführen, gepaart mit seiner optischen Klarheit, die die direkte Visualisierung von Muskelaufbau, Wachstum und Funktion ermöglicht. Darüber hinaus ist nicht nur die Entwicklung und Struktur der Muskeln bei Zebrafischen hoch konserviert, sie zeigen auch einen hochkonservierten Prozess der Muskelregeneration13. Folglich stellen Zebrafische ein ausgezeichnetes System dar, um die Pathobiologie von Muskelerkrankungen zu untersuchen und zu untersuchen, wie die Muskelregeneration darin beeinflusst wird. Zu diesem Zweck haben wir eine Methode entwickelt, die die rechtzeitige Untersuchung der Skelettmuskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht. Diese Hochdurchsatz-Pipeline beinhaltet eine Methode zur Genotypisierung lebender Embryonen14, nach der eine Nadelstichverletzung durchgeführt wird und das Ausmaß der Muskelregeneration mit Polarisationslichtmikroskopie abgebildet wird. Die Anwendung dieser Technik wird daher die Regenerationsfähigkeit der Muskeln in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen aufdecken.
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Protocol
Die Zebrafischpflege wurde gemäß den Standardarbeitsanweisungen durchgeführt, die vom Tierethikkomitee der Monash University unter der Zuchtkolonielizenz ERM14481 genehmigt wurden.
1. Bestimmung des Genotyps lebender Embryonen unter Verwendung einer Embryo-Genotypisierungsplattform.
- Betäubung 3 Tage nach der Befruchtung (dpf) Zebrafischembryonen durch Zugabe von Tricainmethansulfonat zu einer Endkonzentration von 0,016% (v/v) im Embryomedium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2,0,33 mM MgSO4 in Wasser). Warten Sie 10 Minuten, um sicherzustellen, dass die Fische vollständig betäubt sind, was sich zeigt, wenn die Fische aufhören zu schwimmen.
- Bereiten Sie den 24-Kammer-DNA-Extraktionschip vor, indem Sie den klaren Schutzfilm von der Oberseite des Chips abziehen (Abbildung 1A).
- Schneiden Sie die Spitze einer 20 μL Filterspitze ab, um die Öffnung zu verbreitern. Nehmen Sie damit einen einzelnen Embryo in einem 13 μL Volumen des Embryomediums und laden Sie ihn in die erste Kammer des Chips. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis Embryonen in jede Kammer abgegeben wurden.
HINWEIS: Dieser Schritt sollte in einem Bereich mit minimalen Luftzügen durchgeführt werden, da ein hoher Luftstrom zu einer übermäßigen Verdunstung der Flüssigkeit führen kann, was zu einer verminderten Genotypisierungsempfindlichkeit und zum Überleben der Embryonen führen kann. - Sobald die gewünschte Anzahl von Embryonen auf den DNA-Extraktionschip geladen wurde, laden Sie sie auf die Zebrafisch-Embryo-Genotypisierungsplattform. Dies wird am besten erreicht, indem man zuerst auf einer Seite platziert wird, gefolgt vom Rest.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, zu viel Druck auf die Plattform auszuüben, da dies die darunter liegenden Federn überlasten und beschädigen kann. - Befestigen Sie den magnetischen Plattformdeckel über dem Chip, der die Verdunstung von Embryomedien während des DNA-Extraktionsprotokolls verhindert, und schließen Sie den Plattformdeckel.
- Stellen Sie die Basiseinheit auf 2,4 Volt, 0,051 A und 0,12 W ein und starten Sie das DNA-Extraktionsprotokoll durch Drücken der Taste "ON/OFF". Die Plattform sollte anfangen zu vibrieren, was durch sanftes Berühren des Deckels beurteilt werden kann. Das Protokoll sollte 8 Minuten lang ausgeführt werden.
HINWEIS: Die starke Vibration führt zur Abscheidung von epidermalen Zellen, aus denen genomische DNA extrahiert wird. - Während das Programm läuft, bereiten Sie eine 24-Well-Platte vor, indem Sie 1 ml Embryomedium zu jeder Vertiefung hinzufügen, die notwendig ist, um einzelne Embryonen zu trennen, während nachgeschaltete Genotypisierungstests durchgeführt werden.
- Kennzeichnen Sie zusätzlich 8 Well-Strip-Röhrchen, die zur Sammlung von DNA-Material aus jedem Embryo verwendet werden.
- Drücken Sie nach Abschluss des 8-minütigen Protokolls die ON/OFF-Taste, um die Vibration der Plattform zu stoppen.
- Öffnen Sie den Deckel der Plattform und entfernen Sie vorsichtig den Magnetdeckel, um sicherzustellen, dass nur minimaler Druck auf die Plattform ausgeübt wird.
- Entfernen Sie vorsichtig den DNA-Extraktionschip von der Plattform und legen Sie ihn auf eine ebene Oberfläche.
- Aus der ersten Kammer entfernen Sie 10 μL Embryomedien, die den Embryo umgeben, und legen Sie ihn in die entsprechende Vertiefung des 8-Well-Streifenröhrchens. Das Medium enthält das genetische Material dieses Embryos, das für nachgelagerte Assays verwendet wird.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, den Embryo während der Medienentnahme mit der Pipettenspitze zu berühren, da dies den Embryo schädigen kann. - Mit einer Kunststoffpipette sofort zwei Tropfen frisches Embryomedium in dieselbe Kammer geben. Sammeln Sie den Embryo und bewegen Sie ihn in die erste Vertiefung einer 24-Well-Platte.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.12 und 1.13 für alle verbleibenden Kammern. Nach Abschluss dieser Kann die 24 Well-Platte mit lebenden Embryonen in einen 28 °C-Inkubator gebracht werden.
- Führen Sie geeignete nachgeschaltete Genotypisierungstests durch, um den Genotyp der Embryonen zu bestimmen.
HINWEIS: Die aus der Embryo-Genotypisierungsplattform gewonnene DNA kann erfolgreich durch PCR amplifiziert und für nachfolgende Analysen einschließlich Sequenzierung, Gelelektrophorese oder hochauflösender Schmelzanalyse verwendet werden14. Zur Genotypie des in den repräsentativen Ergebnissen beschriebenen lama2-Stammes wurden PCR, Restriktionsverdauung und Gelelektrophorese verwendet. Da die Konzentration der aus jedem Embryo gewonnenen DNA niedrig ist, wird empfohlen, den größten Teil, wenn nicht sogar das gesamte genetische Material für den nachgelagerten Assay zu verwenden. - Sobald der Genotyp jeder Larve identifiziert wurde, übertragen Sie sie auf 90 mm Petrischalen und legen Sie jeden Genotyp in eine andere Schale. Füllen Sie die Schale mit 25 ml Embryomedium und bewahren Sie sie im 28 °C-Inkubator auf.
2. Muskelverletzung mit einem Nadelstich durchführen
- Sobald die Larven 4 dpf sind, betäuben Sie sie, indem Sie Tricainmethansulfonat zu einer Endkonzentration von 0,016% (v / v) im Embryomedium hinzufügen. Warten Sie 10 Minuten, um sicherzustellen, dass die Fische vollständig betäubt sind, was sich zeigt, wenn die Fische aufhören zu schwimmen.
HINWEIS: Um Verzerrungen zu vermeiden, sollte die Identität des Genotyps für den Prüfer, der die Stiche und nachgelagerten Analysen durchführt, blind sein. - Bereiten Sie während dieser Zeit 24 Brunnenplatten vor, indem Sie jede Vertiefung mit 1 ml frischem Embryomedium füllen, und stellen Sie das Stereomikroskop mit schwarzem Hintergrund und Hochleistungslicht auf, um die Visualisierung der Somite-Grenzen zu erleichtern.
- Übertragen Sie mit einer Kunststoffpipette eine betäubte Larve in eine neue Petrischale.
- Entfernen Sie vorsichtig überschüssiges Embryomedium mit einer Pipette und richten Sie den Fisch unter einem Seziermikroskop so aus, dass sich der Kopf links, der Schwanz rechts, die dorsale Region nach oben und die ventrale Region nach unten befindet (Abbildung 1B).
- Verwenden Sie unter einem Seziermikroskop eine 30-Gauge-Nadel, um einen schnellen, aber präzisen Stich in den Epaxienmuskel oberhalb des horizontalen Myoseptums durchzuführen. Um die Konsistenz in der vorderen und hinteren Position zu gewährleisten, zielen Sie auf 1-2 Somiten ab, die sich oberhalb der Analpore befinden (Abbildung 1B).
HINWEIS: Vermeiden Sie es, das Neuralrohr und Notochord zu stechen, und arbeiten Sie schnell, um das Austrocknen des Fisches während des Prozesses zu vermeiden. - Gießen Sie mit einer Kunststoffpipette einen Tropfen Embryomedium auf den erstochenen Zebrafisch und übertragen Sie ihn vorsichtig in einen Brunnen der 24-Brunnenplatte.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.3 bis 2.6. bis alle Fische erstochen sind.
HINWEIS: Je nach Verarbeitungsgeschwindigkeit und Kompetenz des Ermittlers können mehrere Larven zusammen gestochen werden, solange die Fische während des Prozesses nicht austrocknen. - Sobald alle Larven erstochen wurden, legen Sie die 24-Well-Platte in den 28 °C-Inkubator, bis eine anschließende Bildgebung durchgeführt wird.
3. Bildgebung von Muskelverletzungen und Erholung
- Betäuben Sie die erstochenen Larven 1 Tag nach der Verletzung (1 dpi), indem Sie Tricainmethansulfonat zu einer Endkonzentration von 0,016% (v / v) im Embryomedium hinzufügen. Warten Sie 10 Minuten, um sicherzustellen, dass die Fische vollständig betäubt sind, was sich zeigt, wenn die Fische aufhören zu schwimmen.
HINWEIS: Bei 0 dpi enthält die Wundstelle eine große Menge an Zelltrümmern, was es schwierig macht, das Ausmaß der Muskelverletzung zu quantifizieren (Ergänzende Abbildung 1A-B). Es dauert ungefähr 18-20 Stunden, bis diese Trümmer von der Wundstelle entfernt sind, und als solche ist es zuverlässiger, Larven bei 1 dpi statt bei 0 dpi abbilden, um das Ausmaß der verletzungsbedingten Verletzung zu bestimmen. - Stellen Sie eine saubere und leere Glasbodenschale auf die Bühne des Polarisationsmikroskops und stellen Sie den Hintergrund mit der integrierten Software ein.
HINWEIS: Verwenden Sie keine Kunststoff-Petrischalen, um Doppelbrechungen abbilden, da sie gebrochenes Licht nicht angemessen übertragen. Abhängig vom verwendeten Polarisationsmikroskop können zusätzliche Einstellungen gemäß den Richtlinien des Herstellers erforderlich sein. - Nachdem Sie den Hintergrund eingestellt haben, entfernen Sie die Glasbodenschale aus dem Mikroskoptisch und übertragen Sie den betäubten, erstochenen Fisch mit einer Glaspipette auf die Glasbodenschale.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überschuss an Embryomedium mit einer Pipette und richten Sie den Fisch gemäß 2,5 aus - der Kopf befindet sich links, der Schwanz rechts, die dorsale Region nach oben und die Bauchregion nach unten.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Larven so flach wie möglich montiert sind, da eine ungleichmäßige Montage zu unterschiedlichen Doppelbrechungsdicken über verschiedene Somiten hinweg führt. - Legen Sie die Glasbodenschale mit den betäubten Larven auf das Mikroskopstadium und stellen Sie den Muskel mit polarisiertem Licht ab (Abbildungen 1C & 1D).
HINWEIS: Abhängig von der Art des verwendeten Mikroskops / polarisierten Linsens kann die Fischorientierung auf seiner vorderen hinteren Achse die Gesamtbrechungbeeinflussen 15. Stellen Sie sicher, dass bei der Bildgebung mindestens 5 Somiten auf beiden Seiten der Verletzungsstelle eingeschlossen sind. - Gießen Sie mit einer Kunststoffpipette einen Tropfen Embryomedium, um den Fisch zu rehydrieren, und legen Sie den Fisch in einen Brunnen aus einer 24-Brunnenplatte, die mit Embryomedium gefüllt ist.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Bildgebung so schnell wie möglich durchzuführen, um das Austrocknen der Fische zu verhindern. - Wiederholen Sie die Schritte 3.3. bis 3.6. bis alle Fische abgebildet sind.
- Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, speichern Sie sie in .tiff Format für nachfolgende Analysen.
- Legen Sie den Fisch wieder in den 28 °C-Inkubator, bis eine anschließende Bildgebung mit 3 dpi (7 dpf) durchgeführt wird.
- Wenn die Fische 3 dpi haben, stellen Sie den Fisch gemäß 3,3 bis 3,8 ab.
- Sobald alle Fische abgebildet sind, euthanasieren Sie sie, indem Sie Tricainmethansulfonat zu einer Endkonzentration von 0,2% (v / v) im Embryomedium hinzufügen. Warten Sie mindestens 10 Minuten, um sicherzustellen, dass die Fische eingeschläfert werden, was sich in dem Verlust der Schwimmfähigkeit, dem Pumpen der Kiemenabdeckungen und dem Fehlen einer Flugreaktion nach Berührung zeigt.
4. Quantifizierung der Muskelregeneration
- Öffnen Sie ein 1 dpi-Bild auf einer Bildanalysesoftware wie der frei verfügbaren Image J-Software.
- Zeichnen Sie mit dem Polygonwerkzeug um die Wundstelle herum und messen Sie die Fläche und die mittlere Doppelbrechungsintensität dieses Bereichs (Abbildungen 1C & 1D). Kopieren Sie diese Werte in die Zellen D3 und E3 in der bereitgestellten Vorlage (Ergänzende Tabelle 1).
- Zeichnen Sie zwei zusätzliche Regionen, die jeweils 1-2 unverletzte Somiten umfassen, und messen Sie die Fläche und die mittleren Doppelbrechungsdichten jeder dieser Regionen (Abbildungen 1C & 1D). Kopieren Sie diese Werte in die Zellen D4-D5 und E4-E5 in der bereitgestellten Vorlage (Ergänzende Tabelle 1).
HINWEIS: Während es vorzuziehen ist, die gleichen unverletzten Somiten in den 1 dpi- und 3 dpi-Bildern auszuwählen, kann die sporadische Ablösung von Muskelfasern und die anschließende Verringerung der Doppelbrechung bei Mutanten dies unmöglich machen. Für den Fall, dass die gleichen Somiten aufgrund der Verringerung der Muskelintegrität bei Mutanten nicht bei 1 dpi und 3 dpi ausgewählt werden können, wählen Sie daher zwei verschiedene, aber nicht betroffene Bereiche zu jedem der Zeitpunkte. - Berechnen Sie die normalisierte Doppelbrechung für jeden Bereich, indem Sie die mittlere Doppelbrechungsintensität dieses Bereichs durch die Fläche dividieren, die in Spalte F in der bereitgestellten Vorlage angezeigt wird (Ergänzende Tabelle 1).
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.4 für alle Bilder mit 1 dpi und 3 dpi.
HINWEIS: Bei Verwendung der mitgelieferten Vorlage (Ergänzende Tabelle 1) sollten die Werte für die 1 dpi-Fläche und die mittlere Doppelbrechungsintensität in die Spalten D bzw. E eingefügt werden, und die Werte für die 3 dpi-Fläche und die mittlere Doppelbrechungsintensität sollten in den Spalten J bzw. K eingefügt werden. - Berechnen Sie für jeden Zeitpunkt die durchschnittliche normalisierte Doppelbrechung der beiden unverletzten Regionen. Dieser Wert liefert einen Bezugspunkt für unverletzte Muskeln.
HINWEIS: In der bereitgestellten Vorlage (Ergänzende Tabelle 1) wird dieser Wert in den Spalten G und M für die Bilder mit 1 dpi bzw. 3 dpi berechnet. - Als nächstes bestimmen Sie das Ausmaß der Muskelverletzung bei 1 dpi, indem Sie die normalisierte Doppelbrechung der Verletzungsregion durch die durchschnittliche normalisierte Doppelbrechung der unverletzten Regionen (berechnet in 4.6) dividieren.
HINWEIS: Mit dem oben beschriebenen detaillierten Nadelstichverfahren zeigen Wildtyplarven typischerweise eine normalisierte Doppelbrechung von 48,5 ± 14,3% an der Wundstelle bei 1 dpi, was darauf hindeutet, dass die Doppelbrechung im Vergleich zu unverletzten Somiten um etwa 50% reduziert wurde. Bei Verwendung der Vorlage (Ergänzende Tabelle 1) wird dieser Wert als Prozentsatz in Spalte H berechnet. - Um das Ausmaß der Muskelregeneration zu bestimmen, dividieren Sie die normalisierte Doppelbrechung der Verletzungsregion im 3-dpi-Bild durch die durchschnittliche normalisierte Intensität der unverletzten Regionen in diesem Stadium.
HINWEIS: Bei 3 dpi zeigen Wildtyplarven typischerweise eine normalisierte Doppelbrechung von 60 ± 15,3% an der Wundstelle. Angesichts der Tatsache, dass die normalisierte Doppelbrechung innerhalb der Wundstelle bei 1 dpi 48,5 ± 14,3% betrug (Schritt 4,7), deutet der Anstieg der Doppelbrechung bei 3 dpi auf 60 ± 15,3% auf eine Erholung von etwa 11,5% hin. Bei Verwendung der Vorlage (Ergänzende Tabelle 1) wird dieser Wert als Prozentsatz in Spalte N berechnet. - Halten Sie Fische innerhalb jedes Genotyps getrennt und führen Sie einen gepaarten t-Test durch, bei dem die normalisierte Doppelbrechung der Wundstelle bei 3 dpi (Schritt 4.8) mit der von 1 dpi (Schritt 4.7) verglichen wird. Dies zeigt die Flugbahn der Muskelregeneration, die von jedem Fisch in jedem Genotyp gezeigt wird, und zeigt, ob sich das Ausmaß der Muskelregeneration, das von jedem Genotyp gezeigt wird, signifikant verändert hat.
- Berechnen Sie schließlich den regenerativen Index, indem Sie den in Schritt 4.8 erhaltenen Wert, der das Ausmaß der Muskelregeneration bei 3 dpi ist, durch den in Schritt 4.7 erhaltenen Wert dividieren, der das Ausmaß der Muskelverletzung bei 1 dpi ist. Ein regenerativer Index von 1 zeigt an, dass die Verletzung bei 1 dpi mit 3 dpi vergleichbar ist und dass keine Muskelregeneration stattgefunden hat; Ein Wert über 1 zeigt an, dass sich bei 3 dpi neuer Muskel in der Wundstelle gebildet hat, was darauf hinweist, dass sich der Muskel regeneriert hat; und ein regenerativer Index von weniger als 1 zeigt, dass die Wunde bei 3 dpi schlechter als 1 dpi ist und dass die Muskelregeneration beeinträchtigt ist. Ein t-Test oder eine Einweg-ANOVA kann durchgeführt werden, um das Ausmaß der Muskelregeneration zwischen den verschiedenen Genotypen statistisch zu vergleichen. Bei Verwendung der bereitgestellten Vorlage (Ergänzende Tabelle 1) wird dieser Wert in Spalte O berechnet.
HINWEIS: Es wird empfohlen, das gesamte Experiment in Triplikaten durchzuführen, wobei Fische aus jedem Experiment von verschiedenen biologischen Eltern erhalten wurden, und jedes Experiment an verschiedenen Tagen durchgeführt wurde, um Verzerrungen zu vermeiden.
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Representative Results
Die Fähigkeit, die Doppelbrechung der Skelettmuskulatur zu quantifizieren, bietet eine nicht-invasive, aber stark reproduzierbare Methode, um das Ausmaß von Muskelschäden zu untersuchen und zu vergleichen und die Muskelregeneration in vivo zuuntersuchen. Doppelbrechung resultiert aus der Beugung von polarisiertem Licht durch die pseudokristalline Anordnung der Muskelsarkomere15, und nach Verletzung oder Schädigung des Muskels ist eine Verringerung der Doppelbrechung offensichtlich. Ebenso führt die Aktivierung und Differenzierung von Stammzellen zur Bildung neuer Muskelfasern innerhalb der Verletzungsstelle, wodurch die Doppelbrechungsintensität in dieser Region erhöht wird. Mit diesem System haben wir die Muskelregeneration in einem Zebrafischmodell der angeborenen Muskeldystrophie Typ 1A (MDC1A) untersucht, die durch einen Mangel an Lama216verursacht wird. Ein Gelege von Embryonen aus einer Kreuzung zwischen zwei lama2+/- Zebrafischen wurde entnommen, und bei 3 dpf wurden die Embryonen auf einen DNA-Extraktionschip übertragen (Abbildung 1A) und anschließend mit einer Embryo-Genotypisierungstechnologie genotypisiert. Nach der Identifizierung des Genotyps wurden lama2-/- Larven, die MDC1A16modelliert, und lama2+/+ Geschwister mit einem Nadelstich gemäß Abbildung 1Bverletzt und auf einem Polarisationsmikroskop bei 1 dpi und 3 dpi abgebildet, und die Doppelbrechungsdicken wurden quantifiziert. Während Muskelverletzungen zu einer Verringerung der Doppelbrechungsintensität bei 1 dpi führen (Abbildung 1Ci und Di), führt die erfolgreiche Regeneration des Muskels zu einer erhöhten Doppelbrechung in derselben Region (Abbildung 1Cii und Dii). Es ist auch bemerkenswert, dass, während lama2+/+ Larven eine gleichmäßige Doppelbrechungsintensität aufweisen (Abbildung 1C), aufgrund normaler Muskelmusterung, die Doppelbrechungsintensität im Muskel von lama2-/- ungleichmäßig und sehr sporadisch war (Abbildung 1D), was auf eine verminderte Muskelintegrität zurückzuführen ist.
Mit diesem Ansatz zeigen wir, dass beide Wildtyplarven (lama2+/+; Abbildung 2A) und Larven mit einem Mangel an lama2 (lama2-/-; Abbildung 2B) zeigen eine signifikant erhöhte Doppelbrechungsintensität an der Wundstelle bei 3 dpi im Vergleich zu 1 dpi (Abbildung 2C), was darauf hindeutet, dass sich der Muskel regeneriert hat. Um das regenerative Potenzial von Larven in jedem Genotyp zu vergleichen, wurde der regenerative Index bestimmt, und wir zeigen, dass lama2-/- Larven im Vergleich zu lama2+/+ Larven eine auffällige Zunahme der Muskelregeneration zeigten (Abbildung 2D; Mittelwert in lama2-/- = 1,30 ±- 0,251; Mittelwert in lama2-/- = 1,83 ± 0,439). Um die verbesserte Regeneration bei lama2-/- Larven weiter zu validieren, haben wir den Muskel mit einem Antikörper gegen F-Actin gefärbt (Ergänzende Abbildung 1B-D). Während diese Ergebnisse bestätigen, dass lama2-/- tatsächlich regenerieren, was sich in der Anwesenheit von differenzierten Muskelfasern innerhalb der Wundstelle zeigt, schränkt die Unfähigkeit, denselben Fisch bei 1 dpi und 3 dpi zu untersuchen, die Fähigkeit ein, die regenerative Reaktion zwischen lama2+/+ und lama2-/- Fischen zu quantifizieren und zu vergleichen. Obwohl die mechanistische Grundlage für diese verbesserte Regenerationsfähigkeit bei lama2-/- Larven schwer fassbar bleibt, glauben wir, dass der Verlust von lama2 die Anzahl der aktivierten Stammzellen erhöht, was in der Folge zu einer verbesserten Muskelregeneration führt. Um dies festzustellen, sind jedoch weitere Studien erforderlich. Insgesamt unterstreichen diese Ergebnisse die Fähigkeit der beschriebenen Technik, Veränderungen in der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen zu identifizieren.
Abbildung 1: Überblick über das Genotypisierungs- und Muskelregenerationsprotokoll. (A) Bild eines DNA-Extraktionschips mit 24,3 dpf Zebrafischlarven. (B) Schematische Darstellung der Orientierung, in der die 4 dpf-Larven platziert werden sollten, um den Nadelstich durchzuführen, mit dem Kopf links, dem Schwanz rechts, der dorsalen Region nach oben und der ventralen Region nach unten. Der Nadelstich sollte mit einer 30-Gauge-Nadel durchgeführt werden, die auf 1-2 Somiten des Epaxienmuskels abzielt. Erstellt mit BioRender.com. (C-D) Bilder der Doppelbrechung in einer Lama2+/+ und Lama2-/- Larve bei 1 dpi und 3 dpi. Die in Weiß und Rot dargestellten Regionen spiegeln die Bereiche wider, die zur Quantifizierung der Doppelbrechung in der Wundstelle bzw. in den unverletzten Somiten verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Quantifizierung der Muskelregeneration bei lama2-defizienten Zebrafischlarven. Bilder der Doppelbrechung in lama2+/+ (A) und lama2-/- (B) Larven bei 1 dpi und 3 dpi. Die Wunde bei 3 dpi bei lama2+/+ und lama2-/- Larven ist mit neuen Muskeln gefüllt. (C) Diagramm der normalisierten Doppelbrechung jeder Larve bei 1 dpi und 3 dpi. Die normalisierte Doppelbrechung in der Wundstelle bei lama2+/+ und lama2-/- Larven ist bei 3dpi signifikant erhöht, wie mit einem gepaarten t-Test bestimmt. (D) Regenerativer Index in lama2+/+und lama2-/- wobei letzterer eine erhöhte Muskelregeneration zeigt, wie mit einem t-Test bestimmt. Fehlerbalken stellen REM mit Larven aus drei unabhängigen Experimenten dar (lama2+/+n=28 und lama2-/- n=16). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Untersuchung der Muskelregeneration bei lama2 mangelhaften Larven. Bilder der Doppelbrechung in lama2+/+ (Ai) und lama2-/- (Aii) Larven bei 0 dpi, die das Vorhandensein von Zelltrümmern innerhalb der Wundstelle zeigen. Maximale Projektion konfokaler Bilder des Larvenmerotoms, das für F-Aktin bei 0 dpi (B), 1 dpi (C) und 3 dpi (D) gefärbt ist. Bei 3 dpi ist die Wundstelle von lama2+/+ und lama2-/- Larven durch das Auftreten von F-Aktin-markierten Muskelfasern gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: Vorlage zur Quantifizierung der Muskelregeneration. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die Regeneration der Skelettmuskulatur wird durch obligate geweberesidente Muskelstammzellen angetrieben, deren Funktion bei vielen Muskelerkrankungen wie Muskeldystrophie verändert wird und in der Folge den Prozess der Muskelregeneration behindert. Hier beschreiben wir ein Hochdurchsatzprotokoll zur Untersuchung der Muskelregeneration in lebenden Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen. Der erste Schritt der Pipeline verwendet eine Embryo-Genotypisierungsplattform14, eine benutzerfreundliche und genaue Methode zur Bestimmung des Genotyps lebender Larven, bevor der nachgelagerte Regenerationstest durchgeführt wird. Ein direkter Vorteil davon ist, dass es die Auswahl von Genotypen ermöglicht, die nur von Interesse sind, und / oder eine vergleichbare Anzahl von Fischen innerhalb jeder Genotypgruppe, wodurch die Anzahl der Fische, die durch den Rest des Protokolls verarbeitet werden müssen, erheblich reduziert wird. Es ist jedoch bemerkenswert, dass die Menge an genomischer DNA, die aus dem Embryo-Genotypisierungsgerät gewonnen wird, relativ gering ist, was die nachgelagerten Genotypisierungstests beeinträchtigen kann. Es ist daher wichtig, dass alle Genotypisierungsassays getestet und optimiert werden, bevor sie für das Hauptexperiment verwendet werden. Darüber hinaus ist die Quelle der DNA in erster Linie epidermal, und als solches kann das Embryo-Genotypisierungssystem nicht erfolgreich für Genotyplarven verwendet werden, die gewebespezifische Mutationen aufweisen.
Der zweite Teil des Protokolls demonstriert die Verwendung einer Nadelstichverletzung, einer kostengünstigen und durchsatzfähigen Technik, die nicht nur zu einer hoch reproduzierbaren Verletzungsgröße führt, sondern auch ausreicht, um die Aktivierung von Muskelstammzellen auszulösen, was zu einer Muskelregeneration führt. Ein alternativer Ansatz zur Induktion von Skelettmuskelverletzungen bei Zebrafischen ist die Verwendung der laservermittelten Zellablation13,17,18 . Während dies die Möglichkeit bietet, sich auf bestimmte x-, y- und z-Ebenen zu konzentrieren und anschließend einzelne Muskelzellen anzusprechen, begrenzt die extrem kleine Wundgröße die genaue Quantifizierung der Muskelregeneration, insbesondere in Muskelkrankheitsmodellen, bei denen die Integrität des Muskels bereits beeinträchtigt ist. Wir bevorzugen daher die Verwendung von Nadelstichverletzungen bei der Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafisch-Muskelkrankheitsmodellen.
Um das Ausmaß der Muskelregeneration genau zu quantifizieren, nutzen wir die doppelbrechende Natur der Skelettmuskulatur, die leicht mit einem Standard-Polarisationsmikroskop abgebildet werden kann. Es gibt zwei kritische Punkte, die bei der Verwendung dieses Ansatzes berücksichtigt werden müssen. Erstens kann je nach Art des verwendeten Mikroskops und/oder der polarisierten Linse die Orientierung des Fisches in seiner vorderen hinteren Achse die Gesamtdoppelbrechungsintensiten15beeinflussen, und dies muss bei der Bildgebung berücksichtigt werden. Obwohl die Muskelregeneration um 3 dpi nicht vollständig abgeschlossen ist, reicht das Ausmaß der Regeneration aus, um die Regenerationsfähigkeit in verschiedenen Stämmen zu unterscheiden13 (Abbildung 1). Unsere bisherigen Arbeiten haben gezeigt, dass sich Wildtyplarven mit dem von uns beschriebenen Protokoll nach 14 dpi19vollständig regenerieren, und daher, um festzustellen, ob sich ein Stamm nicht regenerieren kann oder wenn die Muskelregeneration verzögert ist, kann es notwendig sein, die Doppelbrechungsdickenzenzen über 3 dpi hinaus zu untersuchen.
Es muss beachtet werden, dass bei Teleostfischen Muskelwachstum während des gesamten Lebens des Tieres20auftritt, und als solches ist es sehr wichtig, die Doppelbrechungsdichten der Wundstelle mit der von unverletzten Somiten innerhalb desselben Fisches zu normalisieren. Dieser Schritt bietet eine interne Kontrolle und beseitigt Verzerrungen in den Analysen aufgrund von Unterschieden in der Muskelmenge zu den verschiedenen Zeitpunkten oder Unterschieden in den Bildgebungsparametern während verschiedener Sitzungen. Dieser Normalisierungsschritt ist auch unerlässlich, um die Muskelregeneration in Modellen von Muskelerkrankungen genau zu quantifizieren, die von Natur aus Myofibrillen reduziert haben und / oder eine beeinträchtigte Muskelintegrität aufweisen können, wodurch die Gesamtdoppelungsdichte reduziert wird. Während dieses Protokoll Veränderungen in der Regenerationsfähigkeit der Muskeln effektiv aufdecken kann, ist es möglich, dass sie auf indirekte Auswirkungen auf die Stammzellfunktion zurückzuführen sind. Die Muskelregeneration ist ein komplexer Prozess, der Signale von mehreren Zelltypen umfasst, darunter Muskelzellen, Makrophagen, fibro-adepogene Vorläuferzellen und interstitielle Zellen. Es ist möglich, dass die veränderte Regenerationsfähigkeit des Muskels durch Veränderungen in der Biologie eines dieser anderen Zelltypen erklärt werden kann, die anschließend die Funktion der Muskelstammzellen und den Regenerationsprozess beeinflussen. Während dieses Protokoll Veränderungen in der Muskelregeneration in Modellen von Muskelerkrankungen identifizieren kann, müssen nachgeschaltete zelluläre und molekulare Analysen durchgeführt werden, um die Mechanismen zu identifizieren, die für die beobachteten Veränderungen verantwortlich sind.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Regenerationsfähigkeit von Muskeln bei verschiedenen Muskelerkrankungen nicht vollständig verstanden wird, und das Aufkommen neuer Techniken zur Untersuchung der Muskelregeneration in vivo bietet eine Plattform, um solche Fragen anzugehen. Die Methode kann als Grundlage für die Erforschung zellulärer und molekularer Hinweise verwendet werden, die die Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen regulieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Alex Fulcher und Monash Micro Imaging für die Unterstützung bei der Wartung und Einrichtung des Mikroskops. Das Australian Regenerative Medicine Institute wird durch Zuschüsse der Regierung des Bundesstaates Victoria und der australischen Regierung unterstützt. Diese Arbeit wurde durch ein Projektstipendium der Muscular Dystrophy Association (USA) an P.D.C (628882) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
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