Summary
Регенерация скелетных мышц обусловлена тканевыми мышечными стволовыми клетками, которые нарушаются при многих мышечных заболеваниях, таких как мышечная дистрофия, и это приводит к неспособности мышц к регенерации. Здесь мы опишем протокол, который позволяет идировать регенерацию мышц у рыбок данио моделей мышечных заболеваний.
Abstract
Скелетные мышцы имеют замечательную способность к регенерации после травмы, которая обусловлена облигатными тканевыми резидентными мышечными стволовыми клетками. После травмы мышечная стволовая клетка активируется и подвергается пролиферации клеток для создания пула миобластов, которые впоследствии дифференцируются с образованием новых мышечных волокон. При многих состояниях мышечного истощения, включая мышечную дистрофию и старение, этот процесс нарушается, что приводит к неспособности мышц к регенерации. Процесс регенерации мышц у рыбок данио хорошо сохраняется с системами млекопитающих, обеспечивающими отличную систему для изучения функции и регенерации мышечных стволовых клеток в условиях мышечного истощения, таких как мышечная дистрофия. Здесь мы представляем метод изучения регенерации мышц в моделях мышечных заболеваний рыбок данио. Первый шаг включает в себя использование платформы генотипирования, которая позволяет определить генотип личинок до получения травмы. Определив генотип, мышцу травмируют с помощью игольчатого удара, после чего для определения степени регенерации мышц используется поляризационная световая микроскопия. Таким образом, мы обеспечиваем высокопроизводительный конвейер, который позволяет проводить исследование регенерации мышц в моделях мышечных заболеваний рыбок данио.
Introduction
Скелетные мышцы составляют 30-50% массы тела человека, и не только незаменимы для передвижения, но и служат критическим метаболическим и накопительныморганом1. Несмотря на постмитотическую емкость, скелетные мышцы очень динамичны и сохраняют огромную регенеративную способность после травмы. Это объясняется наличием тканевых резидентных стволовых клеток (также называемых клетками-сателлитами), расположенных под базальной пластинкой миофиберов и отмеченных факторами транскрипции парного коробчатого белка 7 (pax7) и / или парного коробчатого белка 3 (pax3), среди прочих2,3. После повреждения клетка-сателлит активируется и подвергается пролиферации клеток для создания пула миобластов, которые впоследствии дифференцируются с образованием новых мышечных волокон. Высокосохраняющийся каскад прорегенеративных сигналов, регулирующих активацию спутниковых клеток и надежное восстановление мышц, поражается при различных состояниях, таких как миопатии и гомеостатическое старение4,5.
Одной из таких разнообразных групп миопатий является мышечная дистрофия, характеризующаяся прогрессирующим истощением мышц и дегенерацией6. Эти заболевания являются следствием генетических мутаций в ключевых белках, включая дистрофин и ламинин-α2 (LAMA2), отвечающих за прикрепление мышечных волокон к внеклеточному матриксу7,8. Учитывая, что белки, замешанные в мышечной дистрофии, играют такую центральную роль в поддержании мышечной структуры, в течение многих лет считалось, что сбой в этом процессе был механизмом, ответственным за патогенез заболевания9. Однако последние исследования выявили дефекты регуляции мышечных стволовых клеток и последующее нарушение регенерации мышц как вторую возможную основу мышечной патологии, наблюдаемой при мышечной дистрофии10,11. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить, как нарушение функции мышечных стволовых клеток и связанных с ними нишевых элементов способствует мышечной дистрофии.
За последнее десятилетие рыбка данио(Danio rerio)стала важной моделью позвоночных для моделирования заболеваний12. Это объясняется быстрым внешним развитием эмбриона рыбки данио в сочетании с его оптической ясностью, которая позволяет непосредственно визуализировать формирование, рост и функцию мышц. Кроме того, у рыбок данио не только высоко сохраняется развитие и структура мышц, но и высоко консервативный процесс регенерации мышц13. Следовательно, рыбки данио представляют собой отличную систему для изучения патобиологии мышечных заболеваний и изучения того, как в ней влияет регенерация мышц. С этой целью мы разработали метод, позволяющий своевременно изучать регенерацию скелетных мышц у рыбок данио моделей мышечных заболеваний. Этот высокопроизводительный конвейер включает в себя метод генотипирования живых эмбрионов14,после которого выполняется травма иглой и степень регенерации мышц визуализируется с помощью поляризационной световой микроскопии. Таким образом, использование этого метода выявит регенеративную способность мышц в моделях мышечных заболеваний рыбок данио.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход за рыбками данио осуществлялся в соответствии со стандартными операционными процедурами, утвержденными Комитетом по этике животных Университета Монаш по лицензии племенной колонии ERM14481.
1. Определение генотипа живых эмбрионов с использованием платформы генотипирования эмбрионов.
- Обезболивать через 3 дня после оплодотворения (dpf) эмбрионы рыбок данио путем добавления трикаина метансульфоната до конечной концентрации 0,016% (v/v) в эмбриональной среде (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl2,0,33 мМ MgSO4 в воде). Подождите 10 минут, чтобы убедиться, что рыба полностью обезболена, что видно, когда рыба перестает плавать.
- Подготовьте 24-камерный чип для экстракции ДНК, снимая прозрачную защитную пленку с верхней поверхностичипа (рисунок 1A).
- Отрежьте наконечник наконечника фильтра 20 мкл, чтобы расширить отверстие. Используя это, выберите один эмбрион в объеме эмбриональной среды 13 мкл и загрузите его в первую камеру чипа. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока эмбрионы не будут распределены в каждую камеру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап следует выполнять в области с минимальными воздушными сквозняками, так как высокий поток воздуха может вызвать чрезмерное испарение жидкости, что впоследствии приведет к снижению чувствительности генотипирования и выживанию эмбрионов. - После того, как желаемое количество эмбрионов было загружено на чип экстракции ДНК, загрузите его на платформу генотипирования эмбрионов рыбок данио. Этого лучше всего достичь, поместив сначала в одну сторону, а затем в остальную.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте добавления слишком большого давления на платформу, так как это может перенапряжение и повреждение нижележащих пружин. - Прикрепите крышку магнитной платформы к чипу, что предотвратит испарение эмбриональных сред во время протокола экстракции ДНК, и закройте крышку платформы.
- Установите базовый блок на 2,4 вольта, 0,051 А и 0,12 Вт и запустите протокол извлечения ДНК, нажав кнопку «ВКЛ/ВЫКЛ». Платформа должна начать вибрировать, что можно оценить, осторожно прикоснувшись к крышке. Протокол должен быть запущен в течение 8 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сильная вибрация приводит к выбрасывания эпидермальных клеток, из которых извлекается геномная ДНК. - Во время работы программы подготовьте пластину из 24 скважин, добавив 1 мл эмбриональной среды в каждую скважину, что необходимо для разделения отдельных эмбрионов во время проведения анализов генотипирования.
- Кроме того, соответствующим образом маркируют 8 скважин ленточных трубок, которые будут использоваться для сбора материала ДНК у каждого эмбриона.
- По завершении 8-минутного протокола нажмите кнопку ON/OFF, чтобы остановить вибрацию платформы.
- Откройте крышку платформы и осторожно снимите магнитную крышку, обеспечив минимальное давление на платформу.
- Осторожно извлеките чип днк с платформы и поместите его на плоскую поверхность.
- Из первой камеры удалите 10 мкл эмбриональной среды, окружающей эмбрион, и поместите ее в соответствующий колодец 8-скважинной ленточной трубки. Среда содержит генетический материал из этого эмбриона, который будет использоваться для последующих анализов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прикосновения к эмбриону кончиком пипетки во время сбора среды, так как это может повредить эмбрион. - Используя пластиковую пипетку, сразу же добавьте две капли свежей эмбриональной среды в ту же камеру. Соберите эмбрион и переместите его в первую скважину из 24-й пластины.
- Повторите шаги 1.12 и 1.13 для всех остальных камер. По завершении этого 24-скважинная пластина, содержащая живые эмбрионы, может быть перемещена в инкубатор с 28 °C.
- Выполните соответствующие анализы генотипирования для определения генотипа эмбрионов.
ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК, полученная из платформы генотипирования эмбриона, может быть успешно амплифицирована с помощью ПЦР и может быть использована для последующего анализа, включая секвенирование, гель-электрофорез или анализ расплава высокого разрешения14. Для генотипа штамма lama2, описанного в репрезентативных результатах, использовали ПЦР, рестрикционный сбраживание и гель-электрофорез. Учитывая, что концентрация ДНК, полученная из каждого эмбриона, низкая, предлагается использовать большинство, если не весь, генетический материал, полученный для последующего анализа. - Как только генотип каждой личинки будет идентифицирован, перенесите их в чашки Петри 90 мм, поместив каждый генотип в другую чашку. Наполните блюдо 25 мл эмбриональной средой и держите их в инкубаторе с 28 °C.
2. Выполнение мышечной травмы с помощью удара иглой
- Как только личинки нарастут 4 dpf, обезболивают их, добавляя трикаин метансульфонат до конечной концентрации 0,016% (v/v) в эмбриональной среде. Подождите 10 минут, чтобы убедиться, что рыба полностью обезболена, что видно, когда рыба перестает плавать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать предвзятости, идентичность генотипа должна быть ослеплена исследователем, выполняющим удары и последующие анализы. - За это время подготовьте 24 пластины скважины, заполнив каждую скважину 1 мл свежей эмбриональной среды, и установите стереомикроскоп с черным фоном и мощной подсветкой, чтобы облегчить визуализацию границ сомита.
- С помощью пластиковой пипетки переложите одну обезболенную личинку в новую чашку Петри.
- Осторожно удалите лишнюю эмбриональную среду пипеткой, а под рассекающим микроскопом ориентируйте рыбу так, чтобы голова была слева, хвост справа, дорсальная область вверх и вентральная область вниз(рисунок 1B).
- Работая под рассекающим микроскопом, используйте иглу 30-го калибра для выполнения быстрого, но точного удара в епаксиальную мышцу, расположенную над горизонтальным миосектовым. Для обеспечения консистенции в передне-заднем положении стремитесь к 1-2 сомитам, расположенным над анальной порой(рисунок 1В).
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте закалывания нервной трубки и нотохорды и работайте быстро, чтобы избежать высыхания рыбы во время процесса. - Используя пластиковую пипетку, налейте каплю эмбриональной среды на заколотую рыбку данио и аккуратно перенесите ее в колодец из 24-й пластины.
- Повторите шаги 2.3–2.6. до тех пор, пока вся рыба не будет зарезана.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько личинок могут быть заколоты вместе в зависимости от скорости обработки и квалификации исследователя, если рыба не высохнет во время процесса. - После того, как все личинки были заколоты, поместите 24-ябойную пластину в инкубатор с 28 °C до тех пор, пока не будет выполнена последующая визуализация.
3. Визуализация мышечной травмы и восстановления
- Через 1 день после травмы (1 dpi) обезболивают заколотых личинок, добавляя трикаин метансульфонат до конечной концентрации 0,016% (v/v) в эмбриональной среде. Подождите 10 минут, чтобы убедиться, что рыба полностью обезболена, что видно, когда рыба перестает плавать.
ПРИМЕЧАНИЕ: При 0 dpi место раны содержит большое количество клеточного мусора, что затрудняет количественную оценку степени повреждения мышц(дополнительный рисунок 1A-B). Для очистки этого мусора от места раны требуется примерно 18-20 часов, и поэтому более надежно визуазировать личинок при 1 dpi, а не 0 dpi, чтобы определить степень полученных травм. - Поместите чистую и пустую стеклянную посуду на основе дна на ступень поляризационного микроскопа и установите фон с помощью встроенного программного обеспечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте пластиковые чашки Петри для изображения двулучепреломления, так как они не пропускают должным образом преломленный свет. В зависимости от используемого поляризованного микроскопа могут потребоваться дополнительные настройки в соответствии с рекомендациями производителя. - Заставив фон, снимите стеклянную нижнюю посуду со сцены микроскопа и с помощью стеклянной пипетки перенесите обезболенную, заколотую рыбу на стеклянную нижнюю посуду.
- Осторожно удалите избыток эмбриональной среды с помощью пипетки, и ориентируйте рыбу по 2,5 – голова слева, хвост справа, дорсальная область вверх и вентральная область вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что личинки установлены как можно более плоскими, так как неравномерное крепление приводит к различной интенсивности двулучепреломления на разных сомитах. - Поместите стеклянную нижнюю посуду с обезболенные личинки на ступень микроскопа и изобразите мышцу с помощью поляризованного света(рисунки 1C & 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от типа используемого микроскопа/поляризованной линзы ориентация рыбы на ее передне-задней оси может влиять на общее двулучепреломления15. Убедитесь, что при визуализации необходимо включить не менее 5 сомитов по обе стороны от места травмы. - Используя пластиковую пипетку, налейте каплю эмбриональной среды для регидратировать рыбу и поместите рыбу в колодец из 24 язычек, заполненных эмбриональной средой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно выполнить визуализацию как можно быстрее, чтобы предотвратить высыхание рыбы. - Повторите шаги 3.3. до 3.6. до тех пор, пока все рыбы не будут сфотожированы.
- Когда все изображения будут получены, сохраните их в .tiff формате для последующего анализа.
- Поместите рыбу обратно в инкубатор с 28 °C до выполнения последующей визуализации при 3 dpi (7 dpf).
- Когда рыба находится в 3 dpi, изобразите рыбу в соответствии с 3,3 до 3,8.
- После того, как все рыбы были сфовотированы, усыпить их, добавив трикаин метансульфонат до конечной концентрации 0,2% (v / v) в эмбриональной среде. Подождите не менее 10 минут, чтобы убедиться, что рыба усыплена, что проявляется в потере способности плавать, прокачке жаберных крышек и отсутствии реакции полета после прикосновения.
4. Количественная оценка регенерации мышц
- Откройте изображение с разрешением 1 dpi в программном обеспечении для анализа изображений, таком как свободно доступное программное обеспечение Image J.
- Используя полигональный инструмент, рисуйте вокруг места раны и измеряйте площадь и среднюю интенсивность двулучепреломления этойобласти (рисунки 1C и 1D). Скопируйте эти значения в ячейки D3 и E3 в предоставленномшаблоне (Дополнительная таблица 1).
- Нарисуйте две дополнительные области, каждая из которых охватывает 1-2 неповредимых сомита, и измерьте площадь и среднюю интенсивность двулучепреломления каждой из этих областей(рисунки 1C и 1D). Скопируйте эти значения в ячейки D4-D5 и E4-E5 в предоставленномшаблоне (Дополнительная таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя предпочтительно выбирать одни и те же неповреденные сомиты на изображениях 1 dpi и 3 dpi, спорадическая отслойка мышечных волокон и последующее снижение двулучепреломления у мутантов могут сделать это невозможным. Поэтому, если одни и те же сомиты не могут быть выбраны при 1 dpi и 3 dpi из-за снижения целостности мышц у мутантов, выберите две разные, но незатронутые области в каждой из временных точек. - Рассчитать нормализованное двулучепреломления для каждого региона, разделив среднюю интенсивность двулучепреломления этой области на площадь, отображаемую в столбце F в предоставленномшаблоне (Дополнительная таблица 1).
- Повторите шаги 4.1–4.4 для всех изображений с 1 и 3 токи на дюйм.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании предоставленного шаблона(дополнительная таблица 1)значения площади 1 dpi и средней интенсивности двулучепреломления должны быть вставлены соответственно в колонки D и E, а значения площади 3 dpi и средней интенсивности двулучепреломления должны быть вставлены в колонки J и K соответственно. - Для каждой точки времени рассчитайте среднее нормализованное двулучепреломления двух неповредимых областей. Это значение обеспечивает точку отсчета неповредимых мышц.
ПРИМЕЧАНИЕ: В представленномшаблоне (Дополнительная таблица 1)это значение вычисляется в столбцах G и M для изображений с 1 dpi и 3 dpi соответственно. - Далее определяют степень повреждения мышц при 1 dpi, разделив нормализованное двулучепреломления области повреждения на среднее нормализованное двулучепреломления неповредимых областей (рассчитано в 4.6).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используя вышеупомязанную подробную процедуру закола иглой, личинки дикого типа обычно показывают нормализованное двулучепреломление 48,5 ± 14,3% в месте раны при 1 dpi, что указывает на то, что двулучепреломение уменьшилось примерно на 50% по сравнению с непоредимыми сомитами. При использовании шаблона (Дополнительная таблица 1) это значение вычисляется в процентах в столбце H. - Чтобы определить степень регенерации мышц, разделите нормализованное двулучепреломение травмированной области на изображении 3 dpi на среднюю нормализованную интенсивность неповредимых областей на этом этапе.
ПРИМЕЧАНИЕ: При 3 dpi личинки дикого типа обычно показывают нормализованное двулучепреломение 60 ± 15,3% в месте раны. Учитывая, что нормализованное двулучепреломления в месте раны при 1 dpi составило 48,5 ± 14,3% (шаг 4,7), увеличение двулучепреломления при 3 dpi до 60 ± 15,3% указывает на выздоровление примерно на 11,5%. При использовании шаблона (Дополнительная таблица 1) это значение вычисляется в процентах в столбце N. - Держа рыб в пределах каждого генотипа отдельно, выполните парный t-тест, сравнивая нормализованное двулучепреломления раневого участка при 3 dpi (шаг 4.8) с 1 dpi (шаг 4.7). Это выявит траекторию регенерации мышц, отображаемую каждой рыбой в каждом генотипе, и подчеркнет, значительно ли изменилась степень регенерации мышц, отображаемая каждым генотипом.
- Наконец, рассчитайте регенеративный индекс, разделив значение, полученное на шаге 4.8, которое представляет собой степень регенерации мышц при 3 dpi, на значение, полученное на шаге 4.7, которое представляет собой степень мышечной травмы при 1 dpi. Регенеративный индекс 1 указывает на то, что травма при 1 dpi сопоставима с 3 dpi и что регенерация мышц не произошла; значение выше 1 указывает на то, что при 3 dpi в месте раны сформировалась новая мышца, подчеркивая, что мышца восстановилась; и регенеративный индекс менее 1 подчеркивает, что рана при 3 dpi хуже, чем 1 dpi, и что регенерация мышц у нарушена. T-тест или односторонний ANOVA может быть выполнен для статистического сравнения степени регенерации мышц между различными генотипами. При использовании предоставленного шаблона (Дополнительная таблица 1) это значение вычисляется в столбце O.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проводить весь эксперимент в трех отношениях, с рыбами из каждого эксперимента, полученными от разных биологических родителей, и каждый эксперимент, выполняемый в разные дни, чтобы избежать какой-либо предвзятости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Способность количественно оценивать двулучепреломления скелетных мышц обеспечивает неинвазивный, но высоко воспроизводимый метод для изучения и сравнения уровней повреждения мышц и изучения регенерации мышц in vivo. Двулучепреломение является результатом дифракции поляризованного света через псевдокристаллический массив мышечных саркомер15,и после травмы или повреждения мышцы очевидно снижение двулучепреломления. Аналогичным образом, активация и дифференцировка стволовых клеток приводит к образованию новых мышечных волокон в месте повреждения, что впоследствии увеличивает интенсивность двулучепреломления в этой области. Используя эту систему, мы исследовали регенерацию мышц в модели рыбок данио врожденной мышечной дистрофии типа 1A (MDC1A), вызванной дефицитом у Ламы216. Была собрана кладка эмбрионов из помесья между двумя lama2+/- рыбками данио, и при 3 dpf эмбрионы были перенесены на чип экстракции ДНК(рисунок 1A)и впоследствии генотипированы с использованием технологии генотипирования эмбрионов. Идентифицировав генотип, личинки лама2-/-, которые моделируютMDC1A 16,и братья и сестры лама2+/+ были ранены с помощью удара иглой согласно рисунку 1Bи изображены на поляризационном микроскопе при 1 dpi и 3 dpi, а интенсивность двулучепреломления была количественно определена. В то время как мышечная травма приводит к снижению интенсивности двулучепреломления при 1 dpi(рисунок 1Ci и Di),успешная регенерация мышц приводит к увеличению двулучепреломления в той жеобласти (рисунок 1CII и Dii). Также примечательно, что в то время как личинки lama2+/+ демонстрируют равномерную интенсивность двулучепреломления(рисунок 1C),из-за нормального мышечного паттерна, интенсивность двулучепреломления в мышце ламы2-/- была неравномерной и очень спорадической(рисунок 1D),что объяснялось снижением целостности мышц.
Используя этот подход, мы выявляем, что оба диких типа личинок (lama2+/+; Рисунок 2А),а личинки испытывают дефицит lama2 (lama2-/-; Рисунок 2B),показывают значительно повышенную интенсивность двулучепреломления в месте раны при 3 dpi по сравнению с 1 dpi(рисунок 2C),что указывает на то, что мышца регенерировалась. Для сравнения регенеративного потенциала личинок в каждом генотипе был определен регенеративный индекс, и мы показываем, что личинки lama2-/- показали поразительное увеличение регенерации мышц по сравнению с lama2+/+ личинками(рисунок 2D;среднее у lama2-/- = 1,30 ± - 0,251; среднее у lama2-/- = 1,83 ± 0,439). Чтобы дополнительно подтвердить улучшенную регенерацию у личинок lama2-/-, мы окрашивали мышцу антителом против F-актина(дополнительный рисунок 1B-D). Хотя эти результаты подтверждают, что лама2-/- действительно регенерирует, о чем свидетельствует наличие дифференцированных мышечных волокон в месте раны, неспособность исследовать одну и ту же рыбу при 1 dpi и 3 dpi ограничивает способность количественно оценивать и сравнивать регенеративную реакцию между lama2+/+ и lama2-/- рыбами. Хотя механистическая основа для этой улучшенной способности к регенерации у личинок лама2остается неуловимой, мы считаем, что потеря lama2 увеличивает количество активированных стволовых клеток, что впоследствии приводит к улучшению регенерации мышц. Однако для определения этого необходимы дальнейшие исследования. В совокупности эти результаты подчеркивают способность описанной методики выявлять изменения в регенерации мышц в моделях мышечных заболеваний рыбок данио.
Рисунок 1:Обзор протокола генотипирования и регенерации мышц. (A) Изображение чипа для экстракции ДНК, содержащего 24, 3 dpf личинок рыбок данио. (B) Схема ориентации, в которой личинки 4 dpf должны быть размещены для выполнения удара иглой, с головой слева, хвостом справа, дорсальной областью вверх и вентральной областью вниз. Удар иглой следует выполнять с помощью иглы 30-го калибра, нацеленной на 1-2 сомита эпаксиальной мышцы. Создано с помощью BioRender.com. (С-Д) Изображения двулучепреломления у ламы2+/+ и ламы2-/- личинок при 1 dpi и 3 dpi. Области, показанные белым и красным цветом, отражают области, используемые для количественной оценки двулучепреломления в месте раны и неповредимых сомитов соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Количественная оценка регенерации мышц у личинок рыбок данио с дефицитом lama2. Изображения двулучепреломления у лама2+/+ (А) и лама2-/- (В) личинок при 1 dpi и 3 dpi. Рана при 3 dpi у обоих, lama2+/+ и lama2-/- личинок заполнена новыми мышцами. (C) График нормализованного двулучепреломления каждой личинки при 1 dpi и 3 dpi. Нормализованное двулучепреломления в месте раны у личинок лама2+/+ и лама2-/- значительно увеличивается при 3dpi, что определяется с помощью парного t-теста. (D) Регенеративный индекс у лама2+/+и лама2-/- причем последний показывает повышенную регенерацию мышц, определяемую с помощью t-теста. Полосы ошибок представляют собой SEM с личинками из трех независимых экспериментов (lama2+/+n=28 и lama2-/- n=16). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Исследование регенерации мышц у личинок с дефицитом lama2. Изображения двулучепреломления у личинок lama2+/+ (Ai) и lama2-/- (Aii) при 0 dpi, демонстрирующие наличие клеточного мусора в месте раны. Максимальные проекционные конфокальные изображения личиночной миотомы, окрашенной на F-актин при 0 dpi (B), 1 dpi (C) и 3 dpi (D). При 3 dpi раневой участок личинок lama2+/+ и lama2-/- характеризуется появлением F-актиновых меченых мышечных волокон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 1: Шаблон для количественной оценки регенерации мышц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Регенерация скелетных мышц обусловлена облигатными тканевыми резидентными мышечными стволовыми клетками, функция которых изменяется при многих мышечных заболеваниях, таких как мышечная дистрофия, впоследствии препятствуя процессу регенерации мышц. Здесь мы описываем протокол высокой пропускной способности для изучения регенерации мышц в живых моделях мышечных заболеваний рыбок данио. На первом этапе конвейера используется платформа генотипирования эмбрионов14,которая является удобным и точным методом определения генотипа живых личинок перед выполнением анализа регенерации вниз по течению. Прямым преимуществом этого является то, что он позволяет выбрать только генотипы, которые представляют интерес, и / или сопоставимое количество рыб в каждой группе генотипов, что значительно сокращает количество рыб, которые должны быть обработаны через остальную часть протокола. Тем не менее, примечательно, что количество геномной ДНК, полученной из устройства генотипирования эмбриона, относительно низкое, что может поставить под угрозу последующие анализы генотипирования. Поэтому важно, чтобы все анализы генотипирования были протестированы и оптимизированы перед использованием их для основного эксперимента. Кроме того, источником ДНК является в первую очередь эпидермальный, и поэтому система генотипирования эмбриона не может быть успешно использована для генотипирования личинок, демонстрирующих тканеспецифические мутации.
Вторая часть протокола демонстрирует использование травмы иглой,колотой, которая является экономически эффективной и высокопроизводительной техникой, которая не только приводит к высоко воспроизводимому размеру травмы, но и достаточна для активации мышечных стволовых клеток, приводящих к регенерации мышц. Альтернативным подходом к индуцированию повреждения скелетных мышц у рыбок данио является использование лазерной опосредоточенной абляции клеток13,17,18. Хотя это обеспечивает способность фокусироваться на определенных плоскостях x, y и z и впоследствии нацеливаться на отдельные мышечные клетки, чрезвычайно малый размер раны, вызванный точной количественной оценкой регенерации мышц, особенно в моделях мышечных заболеваний, в результате которых целостность мышц уже нарушена. Поэтому мы выступаем за использование травм ножевыми ранениями иглой при изучении регенерации мышц в моделях заболеваний мышц рыбок данио.
Чтобы точно количественно оценить степень регенерации мышц, мы используем двулучепреломляющую природу скелетных мышц, которую можно легко визуализировать с помощью стандартного поляризационного микроскопа. Есть два критических момента, которые необходимо учитывать при использовании этого подхода. Во-первых, в зависимости от типа используемого микроскопа и/или поляризованной линзы, ориентация рыбы в ее передне-задней оси может влиять на общую интенсивность двулучепреломления15,и это необходимо учитывать при визуализации. Наконец, хотя регенерация мышц не полностью завершена на 3 dpi, степень восстановления достаточна для того, чтобы можно было различать регенерационные способности в разных штаммах13 (рисунок 1). Наша предыдущая работа продемонстрировала, что, используя протокол, который мы изложили, личинки дикого типа полностью регенерируют после 14 dpi19,и, следовательно, чтобы определить, не может ли штамм регенерировать или если регенерация мышц задерживается, может потребоваться изучить интенсивность двулучепреломления выше 3 dpi.
Необходимо отметить, что у телеостных рыб рост мышц происходит на протяжении всей жизни животного20,и поэтому очень важно нормализовать интенсивность двулучепреломления места раны, с интенсивностью неповредимых сомитов внутри той же рыбы. Этот шаг обеспечивает внутренний контроль и устраняет предвзятость в анализах из-за различий в количестве мышц в разных временных точках или различий в параметрах визуализации во время разных сеансов. Этот шаг нормализации также необходим для точной количественной оценки регенерации мышц в моделях мышечных заболеваний, которые по своей природе могут уменьшать миофибриллы и / или демонстрировать нарушенную целостность мышц, что впоследствии снижает общую интенсивность двулучепреломления. Кроме того, хотя этот протокол может эффективно выявлять изменения в регенеративной способности мышц, возможно, что они являются результатом косвенного воздействия на функцию стволовых клеток. Регенерация мышц представляет собой сложный процесс, включающий сигналы от нескольких типов клеток, включая мышечные клетки, макрофаги, фиброадепогенные прародители и интерстициальные клетки. Возможно, что измененная способность мышц к регенерации может быть объяснена изменениями в биологии любого из этих других типов клеток, которые впоследствии влияют на функцию мышечных стволовых клеток и регенеративный процесс. Поэтому, хотя этот протокол может идентифицировать изменения в регенерации мышц в моделях мышечных заболеваний, необходимо провести клеточный и молекулярный анализ, чтобы определить механизм (механизмы), ответственный за наблюдаемые изменения.
В заключение, регенеративная способность мышц при различных мышечных заболеваниях до конца не изучена, и появление новых методов изучения регенерации мышц in vivo обеспечивает платформу для решения таких вопросов. Метод может быть использован в качестве основы для исследования клеточных и молекулярных сигналов, которые регулируют регенерацию мышц в моделях мышечных заболеваний рыбок данио.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить доктора Алекса Фулчера и Monash Micro Imaging за помощь в обслуживании и настройке микроскопа. Австралийский институт регенеративной медицины поддерживается грантами правительства штата Виктория и правительства Австралии. Эта работа была профинансирована грантом проекта Ассоциации мышечной дистрофии (США) P.D.C (628882).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E.
- Emery, A. E. H. Duchenne muscular dystrophy. , Oxford University Press. Oxford; New York. (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), New York, N.Y. (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
