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Biology

Monocouche épithéliale dérivée d’organoïdes : un modèle in vitro cliniquement pertinent pour la fonction de barrière intestinale

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62074
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Foundation Hubrecht Organoid Technology (HUB)

Summary

Ici, nous décrivons la préparation de monocouches épithéliales intestinales dérivées d’organoïdes humains pour étudier la fonction de barrière intestinale, la perméabilité et le transport. Comme les organoïdes représentent la réponse originale du tissu épithélial aux stimuli externes, ces modèles combinent les avantages de l’extensibilité des lignées cellulaires et la pertinence et la complexité des tissus primaires.

Abstract

Dans le passé, les systèmes modèles épithéliaux intestinaux étaient limités aux lignées cellulaires transformées et aux tissus primaires. Ces systèmes modèles ont des limites inhérentes car les premiers ne représentent pas fidèlement la physiologie tissulaire originale et la disponibilité de la seconde est limitée. Par conséquent, leur application entrave la recherche fondamentale et la recherche sur le développement de médicaments. Les organoïdes à base de cellules souches adultes (ci-après appelés organoïdes) sont des miniatures de tissu épithélial normal ou malade dont ils sont dérivés. Ils peuvent être établis très efficacement à partir de différentes régions du tractus gastro-intestinal (GI), ont une extensibilité à long terme et simulent des réponses spécifiques aux tissus et aux patients aux traitements in vitro. Ici, l’établissement de monocouches épithéliales dérivées d’organoïdes intestinaux a été démontré ainsi que des méthodes pour mesurer l’intégrité de la barrière épithéliale, la perméabilité et le transport, la sécrétion de protéines antimicrobiennes, ainsi que l’histologie. De plus, les monocouches dérivées d’organoïdes intestinaux peuvent être enrichies de cellules souches proliférantes et de cellules amplifiant le transit, ainsi que de cellules épithéliales différenciées clés. Par conséquent, ils représentent un système modèle qui peut être adapté pour étudier les effets des composés sur les cellules cibles et leur mode d’action. Bien que les cultures organoïdes soient techniquement plus exigeantes que les lignées cellulaires, une fois établies, elles peuvent réduire les défaillances dans les derniers stades du développement de médicaments car elles représentent vraiment la complexité in vivo de l’épithélium et l’hétérogénéité interpatiente.

Introduction

L’épithélium intestinal agit comme une barrière physique entre le contenu luminal des intestins et le tissu sous-jacent. Cette barrière comprend une seule couche épithéliale d’entérocytes principalement absorbants qui sont reliés par des jonctions serrées, qui établissent de fortes connexions intercellulaires entre les cellules adjacentes. Ces cellules forment une muqueuse épithéliale polarisée qui sépare les côtés apical (lumen) et basolatéral de l’intestin, tout en régulant simultanément le transport paracellulaire des nutriments et des métabolites digérés. En plus des entérocytes, d’autres cellules épithéliales importantes telles que le gobelet, le Paneth et les cellules entéroendocrines contribuent également à l’homéostasie intestinale en produisant du mucus, des peptides antimicrobiens et des hormones, respectivement. L’épithélium intestinal est constamment reconstitué en divisant les cellules souches du récepteur 5 positif (LGR5+) couplées à la protéine G riches en leucine et contenant des protéines G dans le fond des cryptes intestinales produisant des cellules amplifiant le transit (TA) qui migrent vers le haut et se différencient en d’autres types de cellules1. La perturbation de l’homéostasie épithéliale intestinale par des facteurs génétiques et environnementaux, tels que l’exposition à des allergènes alimentaires, des composés médicinaux et des agents pathogènes microbiens, entraîne une perturbation de la fonction de barrière intestinale. Ces affections causent plusieurs maladies intestinales, y compris les maladies inflammatoires de l’intestin (MII), la maladie cœliaque et la toxicité gastro-intestinale induite par les médicaments2.

Les études sur l’épithélium intestinal sont réalisées à l’aide de plusieurs systèmes de plate-forme in vitro tels que des inserts membranaires, des systèmes d’organes sur puce, des chambres d’Ussing et des anneaux intestinaux. Ces plates-formes conviennent à l’établissement de monocouches épithéliales polarisées avec accès aux côtés apical et basolatéral de la membrane, en utilisant des lignées cellulaires transformées ou des tissus primaires comme modèles. Bien que les lignées cellulaires transformées, telles que les lignées cellulaires colorectales (adéno)carcinomes Caco-2, T84 et HT-29, soient capables de se différencier en entérocytes intestinaux polarisés ou en cellules productrices de mucus dans une certaine mesure, elles ne sont pas représentatives de l’épithélium in vivo car plusieurs types de cellules sont manquants et divers récepteurs et transporteurs sont exprimés de manière aberrante3 . De plus, comme les lignées cellulaires sont dérivées d’un seul donneur, elles ne représentent pas l’hétérogénéité interpatiente et souffrent d’une complexité et d’une pertinence physiologique réduites. Bien que les tissus primaires utilisés dans les chambres d’Ussing et comme anneaux intestinaux soient plus représentatifs de la situation in vivo, leur disponibilité limitée, leur viabilité à court terme et leur manque d’extensibilité les rendent impropres comme milieu pour les études à haut débit (HT).

Les organoïdes sont des cultures épithéliales in vitro établies à partir de différents organes tels que l’intestin, les reins, le foie, le pancréas et les poumons. Il est prouvé qu’ils ont une extensibilité stable à long terme ainsi qu’une stabilité génétique et phénotypique et sont donc des miniatures biologiques représentatives de l’épithélium de l’organe d’origine avec des réponses fidèles aux stimuli externes 4,5,6,7,8,9. Les organoïdes sont efficacement établis à partir de tissus normaux, malades, enflammés ou cancéreux réséqués ou biopsiés, représentant des réponses hétérogènes spécifiques au patient10,11,12,13,14,15,16. Cet article montre comment établir des monocouches épithéliales intestinales dérivées de cultures organoïdes. Des monocouches ont été établies avec succès à partir de cultures organoïdes de l’intestin grêle, du côlon et du rectum. Ce modèle crée une opportunité d’étudier le transport et la perméabilité des cellules épithéliales aux médicaments ainsi que leurs effets toxicologiques sur l’épithélium. De plus, le modèle permet la co-culture avec des cellules immunitaires et des bactéries pour étudier leurs interactions avec l’épithélium intestinal 17,18,19. En outre, ce modèle peut être utilisé pour étudier les réponses aux thérapies d’une manière spécifique au patient et initier des efforts de dépistage pour rechercher la prochaine vague de thérapies axées sur la barrière épithéliale. Une telle approche pourrait être étendue à la clinique et ouvrir la voie à des traitements personnalisés.

Bien que les monocouches épithéliales de ce protocole soient préparées à partir d’organoïdes intestinaux normaux humains, le protocole peut être appliqué et optimisé pour d’autres modèles organoïdes. Les monocouches organoïdes épithéliales sont cultivées dans un milieu d’expansion organoïde intestinal contenant Wnt pour soutenir la prolifération des cellules souches et représenter la composition cellulaire de la crypte intestinale. Les organoïdes intestinaux peuvent être enrichis pour avoir différents destins épithéliaux intestinaux, tels que les entérocytes, Paneth, gobelet et cellules entéroendocrines, en modulant les voies Wnt, Notch et du facteur de croissance épidermique (EGF). Ici, après l’établissement de monocouches en milieu d’expansion, elles sont entraînées vers des cellules épithéliales intestinales plus différenciées, comme décrit précédemment 20,21,22,23,24,25. À des fins de criblage, en fonction du mode d’action du composé d’intérêt, de ses cellules cibles et des conditions expérimentales, les monocouches peuvent être dirigées vers la composition cellulaire de choix pour mesurer les effets du composé avec des lectures fonctionnelles pertinentes.

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Protocol

1. Préparer les réactifs pour la culture

REMARQUE: Effectuez toutes les étapes à l’intérieur d’une armoire de biosécurité et suivez les directives standard pour travailler avec des cultures cellulaires. La lumière ultraviolette est utilisée pendant 10 minutes avant de démarrer l’armoire de biosécurité. Avant et après utilisation, la surface de l’armoire de biosécurité est nettoyée avec un papier de soie trempé dans de l’éthanol à 70%. Pour faciliter la formation de gouttes tridimensionnelles de matrice extracellulaire (ECM), gardez un stock préavertissé de plaques de 96, 24 et 6 puits prêtes dans l’incubateur à 37 ° C.

  1. Préparation du milieu basal
    1. Préparer le milieu basal (BM) dans un milieu Eagle modifié de 500 mL d’Advanced Dulbecco avec le milieu F-12 (Ad-DF) du mélange nutritif de jambon en ajoutant 5 mL de glutamine de 200 mM, 5 mL d’acide 4-(2-hydroxyétrolethanesulfonique (HEPES) et 5 mL de solutions de pénicilline/streptomycine (stylo/streptocoque) (10 000 U/mL ou 10 000 μg/mL). Celui-ci peut être conservé au réfrigérateur à 4 °C pendant au moins 4 semaines.
  2. Sources Wnt
    1. Préparer le milieu conditionné Wnt3a (Wnt3aCM) selon la méthode26 décrite précédemment.
      REMARQUE: Récemment, un Wnt de substitution de nouvelle génération (NGS-Wnt), qui soutient également l’expansion des organoïdes intestinaux humains, a été généré27.
  3. Préparation du milieu de base organoïde intestinal
    REMARQUE: Utilisez tous les facteurs de croissance et réactifs conformément aux recommandations du fabricant. Utilisez de petites aliquotes et évitez les cycles de gel-dégel; les facteurs de croissance fonctionnels sont essentiels à la réussite de la culture organoïde.
    1. Préparer 2x milieu de base organoïde intestinal concentré (2x IBM) en complétant BM avec 1 μM A83-01, 2,5 mM de N-acétylcystéine, 2x supplément de B27, 100 ng/mL de facteur de croissance épidermique humain (hEGF), 10 nM de gastrine, 200 ng/mL hNoggin et 100 μg/mL d’une formulation antimicrobienne pour les cellules primaires (voir la Table des matières).
    2. Aliquotez les 2x IBM et congelez à -20 °C jusqu’à 4 mois. Au besoin, décongeler une aliquote pendant la nuit à 4 °C ou pendant plusieurs heures à température ambiante (RT).
    3. Pour préparer le milieu d’expansion organoïde intestinal (IEM), complétez 2x IBM avec 50% Wnt3aCM ou 50% BM et 0,5 nM NGS-Wnt, 250 ng / mL humain Rspondin-3 (hRspo3), 10 mM de nicotinamide et 10 μM SB202190.
  4. Préparation du milieu de différenciation organoïde intestinale
    1. Préparer le milieu de différenciation des entérocytes (eDM) en complétant 2x IBM avec 50% de BM, 250 ng / mL hRspo3 et 1,5 μM Wnt inhibiteur de la voie (IWP-2). Conservez l’eDM à 4 °C jusqu’à 10 jours.
    2. Préparez le milieu de différenciation combinée (cDM) en complétant 2x IBM avec 40% BM et 10% Wnt3aCM ou 50% BM et 0,1 nM NGS-Wnt, 250 ng / mL hRspo3, 10 μM DAPT et 100 nM PD0325901. Conserver le cDM à 4 °C jusqu’à 10 jours.
  5. Manipulation de la matrice extracellulaire (ECM)
    REMARQUE: Préparer la matrice extracellulaire (ECM) (voir le tableau des matériaux) conformément à la recommandation du fabricant.
    1. Décongeler l’ECM pendant la nuit sur la glace; transférer l’ECM de la bouteille dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette de 5 mL, les deux pré-refroidies à -20 °C. Recongeler les aliquotes une seule fois à -20 °C. Une fois décongelé, conservez l’ECM au réfrigérateur à 4 °C pendant 7 jours. Incuber pendant au moins 30 min sur de la glace avant utilisation.
      REMARQUE: Mélangez correctement l’ECM et assurez-vous qu’il fait froid avant d’intégrer des cryptes ou des organoïdes.

2. Cultures organoïdes

  1. Établissement de cultures à partir d’organoïdes congelés
    REMARQUE: Laissez BM atteindre RT et gardez une aliquote de 12 mL, chauffée à 37 ° C, prête avant de commencer la procédure de décongélation d’un cryovial contenant des organoïdes congelés.
    1. Décongeler rapidement le cryovial organoïde en agitant dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’il ne reste qu’un morceau de glace. Ajouter immédiatement 500 μL de BM chaud goutte à goutte au cryovial, et pipeter de haut en bas plusieurs fois pour diluer le milieu de congélation et mélanger le contenu avec soin.
    2. À l’aide d’une pipette P1000, transférer les organoïdes dans un tube conique de 15 mL et ajouter 1 mL de BM chaud tout en mélangeant doucement le fond du tube. Pipet de haut en bas plusieurs fois pour diluer le milieu de congélation et mélanger le contenu avec soin.
    3. Ajouter jusqu’à 12 mL de BM chaud goutte à goutte au tube conique de 15 mL contenant les organoïdes, et pipeter de haut en bas avec une pipette stérile de 10 mL pour remettre en suspension doucement les organoïdes.
    4. Centrifuger la suspension organoïde pendant 5 min à 85 × g et 8 °C. Jeter soigneusement le surnageant sans perturber la pastille et remettre en suspension les organoïdes dans 30 % v/v d’IEM complété par 10 μM Y27632 ou d’autres inhibiteurs de la sérine/thréonine kinase formant des bobines enroulées associées aux rhos associés.). Placez le tube sur de la glace.
    5. Ajouter 70% v/v d’ECM dans le tube conique de 15 mL contenant les organoïdes. Mélanger la suspension organoïde en maintenant le tube conique de 15 mL sur la glace et ensemencer 5 μL de la suspension pour vérifier la densité (Figure 1A). Continuer le placage si la densité est appropriée; si la densité est trop élevée, ajoutez plus de solution IEM/ECM dans le même rapport de 30-70% v/v, respectivement.
    6. Dans chaque puits d’une plaque préaverdie de 24 puits, semer 50 μL de la suspension organoïde en pipetant 5 gouttes séparées de 10 μL (figure 1B). Tournez la plaque à l’envers et laissez-la dans l’armoire de biosécurité pendant 5 min. Transférez la plaque encore à l’envers dans l’incubateur à 37 °C et laissez-la encore 30 min.
    7. Ajouter 500 μL d’IEM avec 10 μM d’inhibiteur de ROCK à chaque puits et transférer la plaque à l’incubateur. Imagez une goutte régulièrement pour surveiller la croissance et actualisez l’IEM tous les 2-3 jours en aspirant l’ancien milieu et en ajoutant 500 μL d’IEM frais.
    8. Passage des organoïdes une fois qu’ils se sont remis correctement de la décongélation et qu’ils ont atteint la bonne taille pour être traités (figure 1C), comme décrit à la section 2.2.
  2. Passage d’organoïdes intestinaux
    REMARQUE: Refroidir l’ECM sur la glace pendant au moins 30 min et maintenir l’IEM à RT pendant au moins 1 h avant utilisation.
    1. Utilisez le milieu d’un puits de culture pour briser les dômes organoïdes à l’aide d’une pointe filtrante à faible rétention de 1250 μL et transférez le contenu du puits dans un tube conique étiqueté de 15 mL. Lavez le puits avec 1 mL de BM et transférez-le dans le même tube conique de 15 mL.
    2. Répétez les étapes 2.2.1 et 2.2.2 avec tous les autres puits (un maximum d’une demi-plaque ou 600 μL de gouttes ECM peut être lavé et ajouté à un tube conique de 15 mL).
    3. Ajouter BM pour remplir le tube jusqu’à 12 mL et pipeter de haut en bas 10x à l’aide d’une pipette de 10 mL. Centrifuger à 85 × g pendant 5 min à 8 °C.
    4. Avant de retirer le BM, vérifiez au microscope si tous les organoïdes sont agglomérés au fond du tube conique de 15 mL (Figure 1D). S’il n’y a pas d’ECM superposant la pastille organoïde ou si la couche ECM est propre ou ne contient que des débris, des cellules individuelles ou très peu d’organoïdes par rapport aux organoïdes agglomérés, aspirez le surnageant et pipetez l’ECM en superposant la pastille organoïde très soigneusement à l’aide d’une pipette P200.
      REMARQUE: Les organoïdes peuvent être piégés dans l’ECM et ne sédimentent pas sous forme de granulés compacts en raison de la faible force de centrifugation. Si l’ECM contient des organoïdes, centrifuger à nouveau le tube à 450 × g pendant 5 min à 8 °C et retirer soigneusement le surnageant comme décrit au point 2.2.4. S’il existe plusieurs tubes coniques de 15 mL, ils peuvent être regroupés après l’étape 2.2.4.
    5. Ajouter 1 mL de BM à chaque pastille (d’un volume de 50 à 200 μL, selon la culture organoïde et la densité) et remettre en suspension avec précaution. Pipet les organoïdes de haut en bas au moins 5x pour les cisailler, en évitant la formation de mousse. Vérifiez au microscope si les organoïdes sont perturbés (Figure 2A). Si les organoïdes sont perturbés, passez à l’étape 2.2.7; si les organoïdes ne sont pas perturbés, pipetez-les encore 5x. Cette fois, touchez la paroi du tube en plastique avec la pointe de la pipette pour exercer plus de force mécanique pour perturber les organoïdes.
      REMARQUE : Le cisaillement mécanique des organoïdes kystiques (Figure 1C) et bourgeonnants (Figure 1E) est possible avec une pointe de pipette en plastique de 200 μL ou 10 μL montée sur une pointe de filtre à faible rétention de 1250 μL (Figure 1F), en fonction du volume requis pour perturber les organoïdes. L’utilisation d’une pipette en verre rétréci (figure 1F) est recommandée lorsque plus de 200 μL d’ECM contenant les organoïdes sont traités (un puits d’une plaque de 6 puits ou 4 puits d’une plaque de 24 puits).
    6. Vérifiez à nouveau au microscope si les organoïdes sont perturbés. En cas de perturbation, passez à l’étape suivante; sinon, pipetez les organoïdes jusqu’à 20x, en vérifiant régulièrement les organoïdes au microscope. Si les organoïdes ne sont toujours pas perturbés, ajoutez 25% de réactif de dissociation cellulaire v/v 1 (voir le tableau des matériaux) à la suspension, incubez au bain-marie à 37 °C pendant 2 min et pipetez les organoïdes jusqu’à 20x, en vérifiant régulièrement les organoïdes au microscope pour vous assurer qu’ils ne sont pas digérés en cellules individuelles.
    7. Ajouter jusqu’à 12 mL de BM au tube conique de 15 mL et laver la pastille organoïde en pipetant de haut en bas. Centrifuger à 85 × g pendant 5 min à 8 °C. Jetez le surnageant et ajustez la concentration finale à 70 % v/v ECM en ajoutant IEM et ECM à la pastille organoïde.
    8. Commencez à réutiliser la pastille organoïde avec le double du volume d’IEM/ECM collecté pour le passage, et ensemencez 5 μL de la suspension pour vérifier la densité. Poursuivre le placage si la densité est appropriée (figure 2B); ajouter plus de solution IEM/ECM si la densité est trop élevée. Ajouter 200 μL de suspension à chaque puits d’une plaque préavertissée de 6 puits, en faisant des gouttes séparées de 10 μL de volume.
    9. Tournez la plaque à l’envers et laissez-la dans l’armoire de biosécurité pendant 5 min. Transférez la plaque encore à l’envers dans l’incubateur à 37 °C, en la laissant encore 30 min. Ajouter 2 mL d’IEM avec un inhibiteur de ROCK de 10 μM à chaque puits et transférer la plaque à l’incubateur.
    10. Imagez une goutte régulièrement pour surveiller la croissance et actualisez l’IEM tous les 2-3 jours en aspirant l’ancien milieu et en ajoutant 2 mL d’IEM frais.
  3. Passage d’organoïdes intestinaux pour la préparation de monocouches épithéliales
    1. Passage des organoïdes 3 jours avant le prélèvement pour la préparation monocouche en suivant le même protocole de passage décrit à la rubrique 2.2, à une exception près. À l’étape 2.2.7, remettre en suspension les organoïdes dans 1 à 1,5 fois le volume de départ de l’IEM/ECM pour avoir une densité et un potentiel d’expansion plus élevés lorsqu’ils sont récoltés pour la préparation monocouche (Figure 3A).

3. Préparation monocouche épithéliale

  1. Cultiver des monocouches épithéliales sur des inserts membranaires à 24 et 96 puits avec une variété de types de plaques disponibles (tableau 1). Utilisez des inserts à membrane de système à haut débit (HTS) pour les deux tailles, car ils contiennent un plateau intégré avec les inserts à membrane et une plaque réceptrice. Pour le format à 24 puits, l’utilisation de plaques avec des inserts à membrane amovibles séparés est également possible.
    REMARQUE: Différents types de membranes (polyéthylène téréphtalate (PET) ou polycarbonate) et tailles de pores (0,4-8,0 μm) sont disponibles et peuvent être utilisés en fonction des besoins expérimentaux. Les monocouches ne peuvent être imagées par champ clair que lorsque des inserts avec des membranes PET sont utilisés. Les membranes étanches à la lumière bloquent les fuites de lumière fluorescente du compartiment apical vers le compartiment basolatéral et peuvent être envisagées lorsque le transport dynamique ou la perméabilité des substrats marqués par fluorescence sont étudiés. Le protocole actuel utilise des inserts membranaires à 24 puits; les adaptations pour les inserts membranaires à 96 puits sont décrites à la rubrique 5. Selon la densité, la morphologie et la taille des organoïdes (figure 3A), 6 puits d’une plaque de 6 puits (comme ensemencé à la section 2.3) suffisent pour ensemencer une plaque complète de 24 puits d’inserts membranaires.
  2. Inserts de membrane de revêtement avec ECM
    REMARQUE: S’il y a des doutes sur le fait d’avoir suffisamment de cellules, enduire les inserts après avoir compté les cellules. Il s’agit d’éviter un revêtement inutile et la perte des inserts de membrane coûteux.
    1. Placez les inserts de membrane dans la plaque de support de l’armoire de biosécurité. Diluer l’ECM 40x dans la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) glacée de Dulbecco avec Du2+ et Mg2+, et pipeter 150 μL de l’ECM dilué dans le compartiment apical de chaque insert. Incuber la plaque à 37 °C pendant au moins 1 h.
  3. Préparation des cellules pour l’ensemencement
    1. Aliquotes préwarm du réactif de dissociation cellulaire 2 au bain-marie (37 °C). Préparer 2 mL de réactif pour chaque puits d’une plaque de 6 puits.
    2. Transférer la plaque de culture contenant les organoïdes (préparés à la section 2.3) de l’incubateur à l’armoire de biosécurité. Traiter les organoïdes, comme décrit aux étapes 2.2.1.-2.2.4. Ne regroupez pas plusieurs tubes en un seul tube.
    3. Remplissez le tube, contenant des organoïdes à partir d’un maximum de 3 puits d’une plaque de 6 puits, jusqu’à 12 mL avec DPBS (sans Ca2+ et Mg2+), et pipetez de haut en bas 10x à l’aide d’une pipette de 10 mL. Centrifuger à 85 × g pendant 5 min à 8 °C, et aspirer le surnageant sans perturber la pastille organoïde.
    4. Ajouter 2 mL du réactif de dissociation cellulaire préavertissé 2 par puits d’une plaque de 6 puits utilisée comme matériau de départ et remettre en suspension. Incuber les tubes en diagonale ou horizontalement pendant 5 min au bain-marie à 37 °C, pour éviter l’enfoncement des organoïdes au fond du tube.
    5. Pipet de haut en bas 10x à l’aide d’une pipette en plastique stérile de 5 mL ou d’une pipette P1000, en fonction du volume total du réactif de dissociation cellulaire. Vérifiez la suspension organoïde au microscope pour voir si un mélange de cellules individuelles et de quelques amas cellulaires constitués de 2 à 4 cellules s’est formé (Figure 3B). Si nécessaire, poursuivre la digestion en répétant les étapes 3.3.4-3.3.5 (ne pas augmenter le volume du réactif de dissociation cellulaire) jusqu’à ce que le mélange ressemble à la figure 3B.
      REMARQUE: Évitez de digérer complètement les organoïdes en cellules individuelles. Il est nécessaire d’avoir quelques petits groupes de cellules (c’est-à-dire des groupes de 2 à 4 cellules).
    6. Arrêter la dissociation cellulaire en ajoutant jusqu’à 12 mL de BM, y compris un inhibiteur de ROCK de 10 μM , à la suspension cellulaire. Centrifuger à 450 × g pendant 5 min à 8 °C, et aspirer le surnageant sans perturber la pastille de cellule. Lorsque vous manipulez la même culture organoïde dans plusieurs tubes coniques de 15 mL, regroupez les pastilles cellulaires et remettez-les en suspension dans 12 mL de BM.
    7. Filtrer la suspension cellulaire à travers une passoire de 40 μm préhumidifiée avec du BM et récolter l’écoulement dans un tube conique de 50 mL. Lavez la passoire avec 10 mL de BM et récoltez l’écoulement dans le même tube conique de 50 mL.
    8. Transférer la suspension de cellules tendues dans deux nouveaux tubes coniques de 15 mL. Centrifuger à 450 × g pendant 5 min à 8 °C, et aspirer le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Remettre en suspension les cellules dans 4 mL d’IEM complété par un inhibiteur de ROCK de 10 μM par plaque de culture complète utilisée comme matériau de départ.
    9. Mélangez une petite quantité de suspension cellulaire dans un rapport de 1: 1 avec du bleu de trypan pour compter. Comptez les cellules vivantes, et non bleues (Figure 3C), et calculez le nombre total de cellules vivantes. En petits amas, comptez chaque cellule individuelle.
    10. Préparer une suspension cellulaire contenant 3 × 106 cellules vivantes par mL d’IEM complétée par un inhibiteur de ROCK de 10 μM.
  4. Ensemencement de cellules sur inserts de membrane en polyester
    1. Aspirez soigneusement le DPBS des inserts revêtus d’ECM (étape 3.2.1), tout en conservant la plaque horizontalement. Pipeter 800 μL d’IEM complété par un inhibiteur de ROCK dans chaque compartiment basolatéral. Pipeter 150 μL de la suspension cellulaire préparée à l’étape 3.3.10 sur la membrane revêtue d’ECM dans le compartiment apical goutte à goutte. Par assiette, assurez-vous d’avoir au moins un puits « vierge » avec BM seulement.
    2. Une fois que les cellules ont sédimenté sur la membrane, mesurez la résistance électrique transépithéliale (TEER), comme décrit à la section 4.1, et imagez les inserts membranaires à l’aide d’un microscope. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2. Mesurez TEER tous les jours et acquérez régulièrement des images pour surveiller la formation de monocouches (Figure 4A-D).
  5. Monocouches rafraîchissantes
    REMARQUE: Rafraîchissez le milieu tous les 2-3 jours, en respectant l’ordre suivant pour maintenir une pression hydrostatique positive au-dessus des cellules et empêcher les cellules d’être poussées hors de la membrane. Tout en rafraîchissant le milieu, assurez-vous que la monocouche, qui est visible lors de l’aspiration du milieu, n’est pas endommagée par la pointe de la pipette.
    1. Retirer le milieu des compartiments basolatéraux de la plaque contenant les inserts membranaires. Ensuite, aspirez soigneusement le milieu des compartiments apicals des inserts membranaires.
    2. Ajouter 150 μL d’IEM frais goutte à goutte dans chaque compartiment apical, puis ajouter 800 μL d’IEM frais à chaque compartiment basolatéral.
  6. Enrichissement de la monocouche pour les types de cellules épithéliales intestinales souhaitées
    1. Laisser la monocouche devenir confluente dans l’IEM, correspondant à une valeur TEER d’environ 100 Ω·cm² (calculée à l’étape 4.1.1.4). Vérifiez au microscope si les monocouches se sont complètement formées (figure 4D) et s’il n’y a pas de trous (comme on le voit à la figure 4B, C).
    2. Retirez soigneusement l’IEM des compartiments basolatéral et apical des inserts membranaires et remplacez-le par de l’eDM ou du cDM comme préparé à la section 1.4. Cultivez la monocouche pendant encore 3-4 jours dans le milieu de différenciation spécifique pour enrichir les cellules organoïdes avec le type de cellule spécifique souhaité. Actualisez le milieu tous les 2-3 jours, comme décrit à la rubrique 3.4.
    3. Mesurez LE TEER quotidiennement et acquérez des images régulièrement si vous le souhaitez (Figure 5A-C).
      REMARQUE: La valeur TEER qui indique une monocouche enrichie entièrement organisée varie selon la culture organoïde; en règle générale, les valeurs TEER augmentent jusqu’à 600 et peuvent augmenter jusqu’à 1000 Ω·cm2 (comme calculé à l’étape 4.1.1.4) après 3 jours dans les milieux de différenciation et sont stables pendant 3-5 jours.

4. Lectures de tests monocouches épithéliales

  1. Mesure de la résistance électrique transépithéliale (TEER)
    REMARQUE: Les mesures TEER sont largement acceptées comme méthode d’analyse de la dynamique des jonctions serrées et de l’intégrité de la fonction de barrière dans les modèles biologiques de barrières physiologiques, tels que les monocouches épithéliales28,29. L’augmentation du TEER après différenciation en raison de l’interaction cellulaire accrue aux jonctions serrées peut être mesurée à l’aide d’un compteur TEER manuel ou d’un robot de mesure TEER automatisé.
    1. Mesure de TEER à l’aide d’un compteur TEER manuel
      1. Nettoyez l’électrode avec de l’éthanol à 70 % et laissez-la sécher à l’air libre à l’intérieur de l’armoire de biosécurité. Placez l’électrode dans un tube contenant du BM. Connectez l’électrode au compteur TEER manuel. Tournez le commutateur Fonction pour mesurer en Ohms (Ω). Allumez l’interrupteur d’alimentation.
      2. Placez l’électrode courte dans le compartiment apical de l’insert, tandis que l’électrode longue est positionnée dans le compartiment basolatéral (figure 6A). Évitez de toucher la monocouche.
      3. Mesurez la résistance dans le puits à blanc (Rblanc), puis mesurez les échantillons restants (échantillon R)de la même manière. Lavez l’électrode avec BM entre des échantillons de conditions différentes. Nettoyez d’abord l’électrode avec de l’eau de demi, puis avec de l’éthanol à 70% et laissez-la sécher à l’air.
      4. Calculer le TEER (Ω·cm2): [Échantillon R (Ω) - Rblanc (Ω)] × surface de la membrane (cm2) (tableau 1 et figure 6B).
    2. Mesure de TEER à l’aide d’un robot de mesure TEER automatisé (Table des matériaux)
      1. Effectuez des mesures TEER automatisées lors de l’utilisation de systèmes HTS pour des plaques HTS de 96 et 24 puits contenant des inserts membranaires. Utilisez différentes électrodes pour la mesure TEER pour les deux types (inserts à membrane HTS 24 et 96). Pour mesurer TEER à l’aide d’un robot de mesure TEER automatisé, suivez les instructions du fabricant.
  2. Mesure de l’intégrité et de la perméabilité de la barrière épithéliale
    REMARQUE: Ce protocole introduit la perméabilité jaune lucifer du compartiment apical au compartiment basolatéral comme indication de l’intégrité monocouche. Cette section décrit la mesure de fluorescence dans le compartiment basolatéral après une étape d’incubation de 1 h pour évaluer la perméabilité monocouche et donc l’intégrité de la barrière. Cette mesure est un test de point final et est particulièrement utile lors de l’essai des composés pour leur effet sur l’intégrité de la barrière.
    1. Décongelez Lucifer Yellow sur la glace et laissez BM s’équilibrer à RT. Pour une plaque de 24 puits d’inserts membranaires, préparer 5 mL de solution de travail de 60 μM de jaune de lucifer dans du BM.
      REMARQUE: Lucifer Yellow est sensible à la lumière. Préparez les dilutions dans des tubes stériles sombres de 1,5 mL et effectuez toutes les étapes avec le voyant de l’armoire de biosécurité éteint.
    2. Retirez soigneusement le milieu des compartiments basolatéral et apical des inserts membranaires, comme décrit à l’étape 3.5.1. Si vous le souhaitez, grattez une monocouche non traitée à l’aide d’une pointe de pipette comme contrôle positif de la fuite de jaune Lucifer à travers une barrière endommagée.
    3. Ajouter 150 μL de BM avec 60 μM de jaune de lucifer à chaque compartiment apical et ajouter 800 μL de BM sans jaune de lucifer à chaque compartiment basolatéral. Placer la plaque sur un agitateur à 37 °C, 50 tr/min pendant 60 min.
    4. En attendant, préparez une courbe standard de Lucifer Yellow en BM en commençant par la solution de travail préparée à l’étape 4.2.1. Diluer 1:3 à chaque étape jusqu’à ce qu’une concentration de 3 nM soit atteinte. Inclure un contrôle négatif (BM uniquement).
    5. Transférer 100 μL de chaque étalon en triple exemplaire sur une plaque transparente de 96 puits. Après 60 min d’incubation, retirez les inserts membranaires et transférez 100 μL de chaque puits basolatéral (étape 4.2.3) en triple exemplaire sur la plaque transparente de 96 puits. Mesurer la fluorescence de la plaque à l’aide d’un lecteur de plaque à une longueur d’onde d’excitation de 430 nm et à une longueur d’onde d’émission de 530 nm.
    6. Après avoir corrigé la valeur de contrôle négative (BM uniquement), utilisez les valeurs de courbe standard pour calculer la concentration de jaune de Lucifer dans le compartiment basolatéral (concentration finale du récepteur (μM)).
    7. Calculer le coefficient de perméabilité apparente (application P) selon la formule suivante (Figure 6C) :
      Equation 1
    8. Pour une plaque de 24 puits contenant des inserts membranaires, utilisez la formule suivante :
      Equation 2
  3. Fixation de monocouches et préparation de blocs de paraffine pour l’histologie
    REMARQUE: Les monocouches épithéliales peuvent être utilisées pour la coloration histologique pour l’évaluation de leur composition cellulaire, de leur polarité et de l’expression de différentes protéines d’intérêt telles que les protéines jonctionnelles, la prolifération ou les marqueurs de différenciation. Cette section décrit la préparation de blocs de paraffine pour la coloration histologique.
    1. Retirez soigneusement le milieu des compartiments basolatéral et apical des inserts membranaires, comme décrit aux étapes 3.5.1.
    2. Lavez les monocouches en ajoutant 150 μL de DPBS (sans Ca2+ et Mg2+) à chaque compartiment apical et 800 μL à chaque compartiment basolatéral. Aspirer soigneusement le DPBS à nouveau, d’abord à partir du compartiment basolatéral, puis du compartiment apical.
      REMARQUE: Le compartiment basolatéral restera vide à partir de cette étape.
    3. Dans une hotte, ajouter 150 μL de paraformaldéhyde à 4 % à chaque compartiment apical et incuber pendant 30 min à TA.
      REMARQUE: À partir de cette étape, effectuez toutes les actions de cette section à l’intérieur d’une hotte, car le paraformaldéhyde est toxique.
    4. Aspirer soigneusement le fixateur des compartiments apicals des inserts membranaires et l’éliminer sous forme de déchets halogènes liquides.
      REMARQUE: À partir de cette étape, éliminer tous les déchets liquides en tant que déchets halogènes liquides.
    5. Lavez les monocouches en ajoutant 200 μL de DPBS (sans Ca2+ et Mg2+) à chaque compartiment apical, et aspirez à nouveau soigneusement le DPBS. Répétez cette étape une fois de plus.
    6. Ajouter 200 μL d’alcool éthylique (EtOH) à 25 % dans chaque compartiment apical et incuber pendant 15 min à TA. Après 15 min, aspirer soigneusement les 25% d’EtOH des compartiments apicaux des inserts membranaires. Répéter avec une solution d’EtOH à 50%, puis avec une solution d’EtOH à 70%.
    7. Ajouter 200 μL de 70 % d’EtOH dans chaque compartiment apical et envelopper la plaque de parafilm. Conservez-le à 4 °C jusqu’à nouvel usage.
    8. Aspirez soigneusement l’EtOH à 70% et utilisez un scalpel pour couper soigneusement les membranes monocouches des inserts. Couper du côté basolatéral, autour du bord de l’insert.
    9. Préparez des blocs de paraffine en suivant la procédure standard.
      1. Lorsque la paraffine est encore chaude, prenez la monocouche de la paraffine avec une pince à épiler et placez-la sur une surface prérefroidie.
      2. Veillez à ne pas endommager la monocouche. Coupez la monocouche en deux à l’aide d’une lame à un seul bord.
      3. Lorsque la paraffine au bas de la cassette commence à se solidifier, utilisez une pince chauffante pour placer les deux parties monocouches dans la paraffine, l’une à côté de l’autre avec le côté droit vers le bas et dans une direction verticale pour vous assurer que la monocouche sera verticale dans le coupé.
    10. Lorsque les blocs de paraffine sont prêts, coupez les blocs à l’aide d’un microtome et faites des lames de sections de 4 μm d’épaisseur en suivant la procédure standard. Assurez-vous que les monocouches se retrouvent verticalement dans le coupé.
    11. Effectuer des colorations histologiques comme décrit précédemment 7,9. Utilisez l’hématoxyline et l’éosine (H & E), Ki67, mucine-2 (MUC2) et Alcian Blue pour montrer la morphologie générale, les cellules prolifératives, la production de mucus et les cellules de gobelet, respectivement (Figure 6E).
      REMARQUE: Des marqueurs de différenciation supplémentaires, tels que le lysozyme pour les cellules de Paneth, peuvent également être utilisés. Ce marqueur n’est pas présenté à la figure 6E car les cellules de Paneth sont présentes dans l’épithélium de l’intestin grêle plutôt que dans l’épithélium du côlon.
  4. Mesure des protéines sécrétées dans un surnageant moyen
    1. Mesurer les niveaux de lysozyme dans le surnageant apical des monocouches iléales (voir la figure 6D) à l’aide du kit répertorié dans la Table des matériaux. Si vous le souhaitez, mesurez les niveaux de différentes cytokines et d’autres protéines d’intérêt.
  5. Analyse de l’expression génique
    1. Quantifier les effets des milieux de différenciation sur l’expression des gènes marqueurs des cellules épithéliales à l’aide de la réaction en chaîne quantitative transcription inverse-polymérase (qRT-PCR).
      1. Lyser les monocouches dans 350 μL de tampon de lyse d’ARN suivi d’une isolation d’ARN selon les instructions du fabricant. Effectuer la synthèse de l’ADNc et les qPTR, comme décrit précédemment 7,9, à l’aide des kits de synthèse d’ADNc, du mélange maître et des oligonucléotides énumérés dans la Table des matériaux.

5. Mise à l’échelle vers des plaques de 96 puits contenant des inserts à membrane

REMARQUE: Préparer des monocouches épithéliales pour des dépistages de médicaments à haut débit ou des conditions de milieu multiples à l’aide de plaques HTS 96 puits contenant des inserts membranaires.

  1. Adaptations lors de la préparation de monocouches au format 96 puits
    1. Suivez toutes les étapes décrites dans le présent protocole pour les plaques à 24 puits contenant des inserts membranaires, en changeant les volumes et les numéros de cellule par ceux décrits dans le tableau 1. Pour la préparation de monocouches sur des plaques à 96 puits avec des inserts à membrane, procédez comme décrit à la section 3 avec les différences suivantes.
      1. Environ 9 puits d’une plaque de culture de 6 puits avec une densité organoïde représentée à la figure 3A sont nécessaires pour ensemencer une plaque complète de 96 puits avec des inserts membranaires. À l’étape 3.2.1, prélaquez les membranes avec 67 μL d’ECM dilué 40x dans du DPBS (avec Ca2+ et Mg2+).
      2. À la section 3.5, transférer d’abord la plaque intégrale des inserts membranaires sur une autre plaque de 96 puits pour permettre un rafraîchissement moyen des compartiments apical et basolatéral.

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Representative Results

La figure 1A montre une image représentative en champ clair d’organoïdes intestinaux après les avoir décongelés d’un cryovial. Il est important de décongeler les organoïdes à haute densité pour assurer une récupération optimale. Les organoïdes sont plaqués dans des plaques de 24 ou 6 puits dans des dômes ECM d’environ 10 μL (Figure 1B). La plupart des organoïdes intestinaux normaux ont une morphologie kystique. Après avoir récupéré du processus de décongélation, les organoïdes atteignent une taille plus grande et sont prêts à être passés après 3 à 7 jours selon la culture organoïde (Figure 1C). Après le prélèvement des organoïdes et le lavage de l’ECM (Figure 1D), les organoïdes peuvent être perturbés à une petite taille par cisaillement mécanique. Selon la morphologie des organoïdes ( kystique Figure 1C, Bourgeonnement Figure 1E), les organoïdes peuvent être perturbés à l’aide de pipettes en plastique ou en verre (Figure 1F). Les organoïdes sont perturbés dans une suspension (Figure 2A), qui doit être régulièrement surveillée au microscope. Il est important d’éviter de les rendre trop petits, car des groupes de cellules doivent rester ensemble pour assurer la croissance des organoïdes. La figure 2B montre les organoïdes dans les gouttes ECM juste après le passage. En général, les organoïdes kystiques sont plaqués à une densité relativement élevée tandis que les organoïdes bourgeonnants sont plaqués dans une faible densité; cependant, cela peut différer entre les différentes cultures organoïdes.

Lorsque vous passez des organoïdes pour la préparation de monocouches, assurez-vous de les plaquer à une densité élevée et laissez-les pousser pendant trois jours afin qu’ils soient dans des conditions de dilatation optimales. Les organoïdes peuvent être prélevés pour la préparation de monocouches lorsqu’ils sont comparables à la figure 3A en taille et en densité, où 6 puits d’une plaque de 6 puits, contenant chacun 200 μL de dômes organoïdes, sont généralement suffisants pour ensemencer une plaque complète de 24 puits d’inserts membranaires. Après la préparation d’une suspension unicellulaire avec le réactif de dissociation cellulaire, des cellules individuelles et de petits amas de cellules doivent être visibles (figure 3B), et les cellules vivantes peuvent être comptées (figure 3C). Les flèches indiquent les cellules mortes colorées avec du bleu trypan, qui doivent être exclues du comptage. Les cellules individuelles et les petites touffes sont ensuite ensemencées dans les inserts membranaires, comme on le voit à la figure 4A. La formation de monocouches est visible après 1 à 3 jours (Figure 4B, C), et les monocouches seront généralement confluentes après 3 à 6 jours selon la culture organoïde (Figure 4D). Les monocouches restent dans un milieu d’expansion jusqu’à ce qu’elles soient confluentes, après quoi elles peuvent être enrichies, entre autres, d’entérocytes ou de cellules de gobelet utilisant différents milieux d’enrichissement. La figure 5A montre une monocouche qui a été cultivée pendant 8 jours en milieu d’expansion (IEM). Lorsqu’elles sont enrichies en entérocytes (eDM), une structure est observée, comme dans la figure 5B, tandis que les monocouches exposées à un milieu combiné (cDM) présentent une structure plus lisse (Figure 5C).

La formation de monocouches peut être suivie quantitativement par la mesure de TEER (Figure 6A). Une monocouche complètement confluente a une valeur TEER de ~100 Ω·cm2, qui passe à ~1000 Ω·cm2 lorsqu’elle est exposée à l’un ou l’autre milieu de différenciation (Figure 6B). Les monocouches dans toutes les conditions moyennes présentent une faible perméabilité apparente (application P) au jaune lucifer (0,45 kDa). La sécrétion de lysozyme par les monocouches iléales cultivées en IEM était supérieure à celle des monocouches cultivées en IEM jusqu’à confluent et pendant 4 jours supplémentaires en eDM ou cDM (noté + eDM ou cDM ultérieur) (Figure 6D). Les monocouches cultivées en IEM, IEM + eDM ultérieur ou IEM + cDM ultérieur présentent une morphologie différente, comme on peut l’observer avec la coloration H & E (Figure 6E). Alors que les monocouches épithéliales dérivées organoïdes du côlon dans les milieux IEM et CDM ont une surface apicale lisse, les monocouches différenciées des entérocytes présentent une morphologie apicale invaginée en l’absence de cellules prolifératives Wnt. Ki67 positives ne peuvent être détectées que dans des conditions d’expansion. Le bleu Alcian et le MUC2 colorent le mucus produit par les cellules de gobelet, qui est visualisé dans les monocouches différenciées dans l’eDM et plus en évidence dans le cDM lorsque la signalisation Wnt, Notch et EGF est inhibée, respectivement (Figure 6E). Lors de la différenciation, les cellules prolifératives diminuent tandis que l’expression des gènes marqueurs des gobelets et des entérocytes augmente par rapport à celle observée dans les conditions IEM, comme le montrent respectivement la quantification de l’expression génique LGR5, MUC2 et ALPI par qRT-PCR (Figure 6F).

Figure 1
Figure 1 : Établissement d’une culture organoïde intestinale à partir d’organoïdes congelés. (A) Image représentative en champ clair d’une culture organoïde intestinale après décongélation. B) Dômes ECM (50 μL) ensemencés dans chaque puits d’une plaque de culture de 24 puits. (C) Image représentative d’une culture organoïde intestinale normale prête à être transmise. (D) Image représentative sur la façon de vérifier la présence d’ECM dans un tube de 15 mL contenant des organoïdes au microscope optique. (E) Image représentative d’une culture organoïde intestinale bourgeonnante prête à être transmise. (F) Une pointe de pipette en plastique de 10 μL montée sur une pointe de filtre à faible rétention de 1250 μL (à gauche) et une pipette en verre rétrécie (à droite) pour le cisaillement mécanique des organoïdes. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviation : ECM = matrice extracellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Traitement des organoïdes intestinaux pour l’entretien ou la préparation de monocouches. (A) Image représentative des organoïdes intestinaux après perturbation mécanique. (B) Image représentative d’une culture organoïde intestinale ensemencée après le passage. Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Préparation de cellules individuelles à partir d’organoïdes intestinaux pour la préparation monocouche. (A) Organoïdes intestinaux prêts à être prélevés pour la préparation monocouche. (B) Cellules simples et petits amas de cellules après préparation d’une seule cellule. (C) Cellules simples visibles et petits amas pendant le comptage dans une chambre à grille. Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Formation de monocouches après l’ensemencement de cellules individuelles sur des membranes. (A) Cellules uniques juste après l’ensemencement sur des membranes. En moyenne, (B) la monocouche est confluente à environ 50% 1-3 jours après l’ensemencement, (C) ~ 90% confluente au jour 3-5, et (D) la monocouche complète s’est formée vers le jour 4-7. Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Enrichissement de types de cellules spécifiques dans la monocouche. (A) Monocouche après 8 jours dans l’IEM. (B) Monocouche enrichie en entérocytes après 4 jours en IEM et 4 autres jours en eDM. (C) Monocouche enrichie en cellules de gobelet et autres types de cellules après 4 jours en IEM et 4 autres jours en MDP. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations: IEM = milieu d’expansion organoïde intestinal; eDM = milieu de différenciation des entérocytes; cDM = milieu de différenciation des combinaisons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Diverses lectures possibles à l’aide de monocouches organoïdes épithéliales. (A) Électrode dans l’insert membranaire pour mesurer le TEER. (B) Les valeurs TEER augmentent dans le temps avec une valeur d’environ 100 Ω·cm2 lorsque la monocouche atteint la confluence. Après avoir enrichi les monocouches avec des entérocytes ou une combinaison de différentes cellules épithéliales, TEER augmente à 1000 Ω·cm2 ou plus. (C) Les monocouches dans toutes les conditions moyennes (IEM + 4 jours IEM/eDM/cDM) sont imperméables au jaune Lucifer. (D) L’expression du lysozyme est plus élevée dans les monocouches d’iléon lorsqu’elles sont cultivées dans un milieu d’expansion que dans l’un ou l’autre type de milieu de différenciation (IEM + 4 jours IEM/eDM/cDM). (E) Les monocouches du côlon présentent des morphologies différentes lorsqu’elles sont exposées à différentes conditions de milieu (IEM + 4 jours IEM / eDM / cDM) telles que visualisées par les taches H & E, Ki67, Alcian Blue et MUC2. Comme prévu, les monocouches cultivées en milieu d’expansion sont très prolifératives, comme le montre la coloration Ki67. Les monocouches différenciées par eDM montrent un épithélium cylindrique sans cellules prolifératives. Les monocouches exposées au MDP ne sont pas non plus prolifératives et développent plus de cellules de gobelet. Barre d’échelle = 100 μm. (F) Cellules souches (LGR5), cellules gobelets (MUC2) et expression du gène marqueur des entérocytes (ALPI) dans les monocouches du côlon par qRT-PCR. Abréviations : TEER = résistance électrique transépithéliale ; IEM = milieu d’expansion organoïde intestinal; eDM = milieu de différenciation des entérocytes; cDM = milieu de différenciation des combinaisons; Papp = coefficient de perméabilité apparente; LGR5 = récepteur 5 couplé à la protéine G riche en leucine contenant des protéines G; H&E = hématoxyline et éosine; AB = Bleu Alcian; MUC2 = mucine-2; ALPI = phosphatase alcaline intestinale; qRT-PCR = réaction en chaîne quantitative par polymérase à transcription inverse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Inserts à membrane
Plaques de 24 puits Plaques de 96 puits
Surface de la membrane (cm2) 0.33 0.143
Volume apical (μL) 150 100
Volume basolatéral (μL) 800 300
# Cellules à ensemencer par puits 450,000 200,000
Plaques HTS avec inserts à membrane ANIMAL DOMESTIQUE ANIMAL DOMESTIQUE
Plaques avec inserts séparés ANIMAL DOMESTIQUE NA
Plaques étanches à la lumière avec inserts à membrane
Les électrodes sont différentes pour les deux formats Reportez-vous à la Table des matériaux

Tableau 1

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Discussion

Ce protocole décrit la manipulation générale et le maintien des organoïdes intestinaux ainsi que la préparation et les applications possibles de monocouches épithéliales dérivées de ces organoïdes. À ce jour, des monocouches ont été préparées avec succès à partir du duodénum, de l’iléon et de différentes régions d’organoïdes du côlon dérivés de tissus intestinaux normaux ainsi que précédemment et activement enflammés (données non publiées). L’application de monocouches organoïdes dérivées du patient facilite l’étude de la fonction barrière d’une manière spécifique à la maladie et au patient, ainsi que l’étude des réponses spécifiques au patient à une variété de traitements médicamenteux. Bien que les lignées cellulaires puissent former des monocouches différenciées et polarisées contenant des entérocytes intestinaux et des cellules ressemblant à des gobelets, de nombreuses enzymes et transporteurs différents sont exprimés de manière aberrante dans ces lignées cellulaires, ce qui réduit la complexité et la pertinence physiologique 3,30. La culture organoïde est techniquement plus exigeante et laborieuse que la culture cellulaire; cependant, les organoïdes sont plus représentatifs de la situation in vivo, tandis que les lignées cellulaires ont échoué à plusieurs reprises à représenter les réponses tissulaires dans des configurations complexes.

Bien que les modèles primaires à base de tissus puissent être représentatifs de l’itération in vivo, ils nécessitent l’utilisation d’animaux d’essaiou l’accès au matériel humain, ce qui est associé à une disponibilité limitée et à des contraintes éthiques. De plus, le tissu primaire n’a pas ou peu d’extensibilité et n’est pas stable dans des périodes expérimentales prolongées. La technologie organoïde nécessite une quantité limitée de tissu primaire pour établir des cultures en expansion à long terme génétiquement et physiologiquement stables tout en représentant la complexité du tissu épithélial et l’hétérogénéité du patient. Différentes lignées cellulaires, telles que Caco-2, sont souvent utilisées pour préparer des monocouches épithéliales. Les cellules Caco-2 prennent 21 jours pour établir une monocouche épithéliale polarisée qui peut être utilisée pour n’importe quelle expérience30. Les monocouches épithéliales dérivées d’organoïdes sont préparées à partir de cellules organoïdes individuelles comme décrit dans le protocole actuel et, après 3 à 6 jours, forment un épithélium polarisé qui peut être différencié davantage pour les enrichir en entérocytes ou en cellules de gobelet.

Les monocouches sont un modèle statique dépourvu d’écoulement microfluidique ou d’étirement mécanique comme on le voit dans les organes sur puce. Ils offrent cependant la possibilité de co-cultiver avec des cellules immunitaires (autologues), ainsi qu’avec des bactéries ou des parasites 17,18,19,31. Les organoïdes conviennent à la préparation monocouche lorsqu’ils sont dans leur phase d’expansion; pour les organoïdes intestinaux, c’est généralement 3 jours après le passage. La dissociation des organoïdes en cellules individuelles doit être effectuée rapidement pour éviter une exposition à long terme aux enzymes digestives. Pour augmenter la survie des cellules souches après la préparation d’une suspension unicellulaire, l’inhibiteur de la protéine kinase rho-associée (inhibiteur de ROCK), Y27632, est ajouté aux cellules pour prévenir la mort cellulaire induite par l’anoikis32. De plus, il est essentiel de cultiver les monocouches sur une membrane prélaquée d’ECM pour s’assurer qu’elles conservent leurs caractéristiques organoïdes et leur polarisation. Pour les tests de dépistage fonctionnel qui quantifient les réponses des cellules épithéliales du tractus gastro-intestinal aux stimuli externes, il est important que les cultures organoïdes représentent la complexité cellulaire requise en fonction du type de test à développer et des lectures éventuelles.

Les organoïdes intestinaux représentent différents types de cellules épithéliales présentes in vivo, tels que les cellules souches, TA, entérocytes, Paneth, gobelet et entéroendocriniens 4,5, et sont préparés et entretenus à l’aide d’un milieu organoïde défini préparé comme décrit dans ce protocole. La différenciation des entérocytes peut être favorisée en cultivant des organoïdes pendant quatre jours supplémentaires en utilisant des conditions de culture qui inhibent doublement la voie Wnt, par l’élimination des molécules / activateurs Wnt et l’ajout de l’inhibiteur du porc-épic, IWP-2 (milieu de différenciation du côlon entérocytaire, eDM). Comme les cellules gobelets productrices de mucus sont également essentielles à l’homéostasie de la fonction barrière, une deuxième condition de culture vise à produire une population cellulaire plus hétérogène contenant des cellules souches, des entérocytes et des gobelets, dans laquelle les voies Notch et EGF sont inhibées tandis que la signalisation Wnt est maintenue partiellement active en réduisant Wnt3aCM à 10% (ou 0,1 nM pour NGS-Wnt) au lieu de 50% (0,5 nM NGS-Wnt) utilisé dans IEM. Contrairement à l’eDM, qui enrichit pour la différenciation des entérocytes, cette deuxième condition soutient la présence de plusieurs types de cellules et est donc appelée milieu de différenciation combinée (CDM).

Les applications des monocouches dérivées d’organoïdes comprennent la surveillance de l’intégrité de la barrière épithéliale ainsi que l’examen de la jonction serrée et de l’expression du transporteur. L’intégrité, la perméabilité et le transport des barrières peuvent être analysés à l’aide des lectures introduites dans ce protocole. Alors que TEER mesure la conductance ionique à travers les jonctions serrées, le test de perméabilité mesure le débit d’eau et donc la perméabilité paracellulaire à travers les jonctions serrées28,29. L’intégrité de la barrière épithéliale, la perméabilité et la fonctionnalité de transport des monocouches peuvent être évaluées en mesurant le trafic de différents substrats fluorescents ou radioactifs à travers les compartiments apical et basolatéral des inserts membranaires. Les mesures TEER permettent de quantifier l’intégrité de la barrière, montrant une augmentation des valeurs lors de la différenciation vers les entérocytes polarisés et les cellules de gobelet, et une diminution après avoir induit une lésion des monocouches.

Le test de perméabilité Lucifer Yellow peut être utilisé pour l’évaluation initiale de l’intégrité de la barrière ainsi que pour la confirmation d’une intégrité réduite après avoir causé une blessure aux monocouches. Ce protocole introduit la perméabilité du jaune de Lucifer du compartiment apical au compartiment basolatéral comme indication de l’intégrité monocouche. De même, d’autres réactifs marqués par fluorescence, tels que le dextran de 4 ou 40 kDa, peuvent être utilisés pour évaluer l’augmentation de la perméabilité paracellulaire résultant d’agents induisant des dommages à la barrière. Des substrats marqués par fluorescence, tels que la rhodamine 123, peuvent être utilisés pour mesurer l’activité de différents transporteurs, tels que la P-glycoprotéine-1. Le test de fluorescence décrit dans ce protocole permet de mesurer les niveaux de protéines, telles que le lysozyme, qui sont sécrétées dans le compartiment apical. Les réponses à l’induction de lésions par les cytokines pro-inflammatoires peuvent être mesurées avec ces lectures, ainsi que les effets potentiels des composés qui restaurent la barrière.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail est soutenu par le Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland (LSH-TKI) allocation de partenariats public-privé (PPP) du secteur néerlandais LSH avec le numéro de projet LSHM16021 Organoïdes comme nouvel outil de modélisation toxicologique à Hubrecht Organoid Technology (HUB) et HUB financement interne au département de modélisation des maladies et de toxicologie. Nous remercions les laboratoires de Sabine Middendorp (Division de gastroentérologie pédiatrique, Wilhelmina Children’s Hospital, UMC, Utrecht) et Hugo R. de Jonge et Marcel J.C. Bijvelds (Département de gastroentérologie et d’hépatologie, Erasmus MC, Rotterdam) d’avoir fourni un soutien technique initial pour la mise en place de monocouches sur inserts membranaires.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% ethanol Fisher Emergo 10644795
1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips Greiner bio-one 732-1432 / 732-1434 / 732-2383
15 mL conical tubes Greiner bio-one 188271
24-well cell culture plates Greiner bio-one 662160
24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) Corning 351156
24-well HTS Transwell plates (Table 1) Corning 3378
24-well plate with Transwell inserts Corning 3470
40 µm cell strainer PluriSelect 43-50040-01
50 mL conical tubes Greiner bio-one 227261
6-well cell culture plates Greiner bio-one 657160
96-well black plate transparent bottom Greiner bio-one 655090
96-well fast thermal cycling plates Life Technologies Europe BV 4346907
96-well HTS Fluoroblok Transwell plate Corning 351162
96-well HTS Transwell plates (Table 1) Corning 7369
96-well transparent culture plate Greiner bio-one 655180
A83-01 Bio-Techne Ltd 2939
Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies Europe BV A11105-01 Cell dissociation reagent 2
Advanced DMEM/F-12 Life Technologies Europe BV 12634028
B27 supplement Life Technologies Europe BV 17504001
Cell culture microscope (light / optical microscope) Leica
CellTiter-Glo Promega G9683
Centrifuge Eppendorf
CO2 incubator PHCBI
DAPT Sigma-Aldrich D5942
DEPC treated H2O Life Technologies Europe BV 750024
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ Life Technologies Europe BV 14040091
DPBS, powder, no calcium, no magnesium Life Technologies Europe BV 21600069
EnzChek Lysozyme Assay Kit Life Technologies Europe BV E22013
EVOM2 meter with STX electrode WTI
Gastrin Bio-Techne Ltd 3006
Glass pipettes Volac
GlutaMAX Life Technologies Europe BV 35050038
hEGF Peprotech AF-100-15
HEPES Life Technologies Europe BV 15630056
Human Noggin Peprotech 120-10C
Human Rspo3 Bio-Techne Ltd 3500-RS/CF
IWP-2 Miltenyi Biotec 130-105-335
Ki67 primary antibody Sanbio BSH-7302-100
Ki67 secondary antibody Agilent K400111-2
Kova International Glasstic Slide with Counting grids Fisher Emergo 10298483
Laminar flow hood Thermo scientific
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma-Aldrich L0259
Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) Corning 356231 extracellular matrix (ECM)
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL Life Technologies Europe BV 4358293
MicroAmp Optical 8-Cap Strips Life Technologies Europe BV 4323032
Microcentrifuge tubes Eppendorf 0030 120 086
Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) Gilson
Microtome Leica
MUC2 primary antibody Santa Cruz Biotechnology sc-15334
MUC2 secondary antibody VWR VWRKS/DPVR-HRP
Multichannel pipette (200 µL) Gilson
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165
NGS Wnt U-Protein Express N001-0.5mg
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Oligonucleotide ALPI1/Forward Custom-made GGAGTTATCCTGCTCCCCAC
Oligonucleotide ALPI1/Reverse Custom-made CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG
Oligonucleotide LGR5/Forward Custom-made ACACGTACCCACAGAAGCTC
Oligonucleotide LGR5/Reverse Custom-made GGAATGCAGGCCACTGAAAC
Oligonucleotide MUC2/Forward Custom-made AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG
Oligonucleotide MUC2/Reverse Custom-made TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT
Oligonucleotide TBP/Forward Custom-made ACGCCGAATATAATCCCAAGCG
Oligonucleotide TBP/Reverse Custom-made AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG
Optical adhesive covers Life Technologies Europe BV 4311971
PD0325901 Stemcell Technologies 72184
Penicillin/streptomycin Life Technologies Europe BV 15140122
Plate shaker Panasonic
PowerUp SYBR Green Master Mix Fisher Emergo A25776
Primocin InvivoGen ANT-PM-2 antimicrobial formulation for primary cells
Qubit RNA HS Assay Kit Life Technologies Europe BV Q32852
Reagent reservoir for multichannel pipet Sigma-Aldrich CLS4870
REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe WTI
Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit Thermo scientific 87023
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106
SB202190 Sigma-Aldrich S7076
Serological pipettes Greiner bio-one 606180 / 607180 / 760180
Serological pipettor (Pipet-Aid) Drummond
Single edge razor blade GEM Scientific
Superscript 1st strand system for RT-PCR Life Technologies Europe BV 11904018
Tecan Spark 10M plate reader Tecan
Trypan Blue Solution, 0.4% Life Technologies Europe BV 15250-061
TrypLE Express Enzyme (1x) Life Technologies Europe BV 12605-010 Cell dissociation reagent 1
Water bath Grant
Y27632 (ROCK inhibitor) AbMole M1817

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References

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Biologie numéro 173 monocouche épithéliale organoïdes intestinaux humains insert membranaire fonction barrière perméabilité transport
Monocouche épithéliale dérivée d’organoïdes : un modèle in vitro cliniquement pertinent pour la fonction de barrière intestinale
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van Dooremalen, W. T. M., Derksen,… More

van Dooremalen, W. T. M., Derksen, M., Roos, J. L., Higuera Barón, C., Verissimo, C. S., Vries, R. G. J., Boj, S. F., Pourfarzad, F. Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function. J. Vis. Exp. (173), e62074, doi:10.3791/62074 (2021).

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