Summary
Her beskriver vi utarbeidelsen av humane organoid-avledede intestinale epitelmonolayers for å studere tarmbarrierefunksjon, permeabilitet og transport. Ettersom organoider representerer original epitelvevsrespons på ytre stimuli, kombinerer disse modellene fordelene ved utvidelse av cellelinjer og relevansen og kompleksiteten til primærvevet.
Abstract
Tidligere var intestinale epitelmodellsystemer begrenset til transformerte cellelinjer og primærvev. Disse modellsystemene har iboende begrensninger da førstnevnte ikke trofast representerer original vevsfysiologi, og tilgjengeligheten av sistnevnte er begrenset. Derfor hemmer søknaden deres grunnleggende forskning og forskning på narkotikautvikling. Voksne stamcellebaserte organoider (heretter kalt organoider) er miniatyrer av normalt eller sykt epitelvev som de er avledet fra. De kan etableres svært effektivt fra forskjellige gastrointestinale (GI) traktatregioner, har langsiktig utvidbarhet og simulerer vevs- og pasientspesifikke responser på behandlinger in vitro. Her har etableringen av intestinal organoid-avledede epitelale monolayers blitt demonstrert sammen med metoder for å måle epitelial barriereintegritet, permeabilitet og transport, antimikrobiell proteinsekresjon, samt histologi. Videre kan intestinale organoid-avledede monolayers berikes med prolifererende stamme- og transittforsterkende celler samt med viktige differensierte epitelceller. Derfor representerer de et modellsystem som kan skreddersys for å studere effekten av forbindelser på målceller og deres virkningsmåte. Selv om organoidkulturer er teknisk mer krevende enn cellelinjer, kan de når de først er etablert, redusere feil i de senere stadiene av narkotikautvikling, da de virkelig representerer in vivo epitelkompleksitet og interpatient heterogenitet.
Introduction
Tarmepitelet virker som en fysisk barriere mellom tarmens lysende innhold og det underliggende vevet. Denne barrieren består av et enkelt epitellag av hovedsakelig absorptive enterocytter som er forbundet med tette veikryss, som etablerer sterke intercellulære forbindelser mellom tilstøtende celler. Disse cellene danner en polarisert epitelforing som skiller de apikale (lumen) og basolaterale sidene av tarmen, samtidig som paracellulær transport av fordøyde næringsstoffer og metabolitter reguleres samtidig. I tillegg til enterocytter bidrar andre viktige epitelceller som beger, Paneth og enterokendokrine celler også til intestinal homeostase ved å produsere henholdsvis slim, antimikrobielle peptider og hormoner. Tarmepitelet etterfylles kontinuerlig ved å dele leucinrike repeterende G-protein-koblede reseptor 5-positive (LGR5+) stamceller i bunnen av tarmkrypter som produserer transittforsterkende (TA) celler som migrerer oppover og skiller seg ut i andre celletyper1. Forstyrrelse av intestinal epitelial homeostase ved genetiske og miljømessige faktorer, for eksempel eksponering for matallergener, medisinske forbindelser og mikrobielle patogener, fører til forstyrrelse av tarmbarrierefunksjonen. Disse tilstandene forårsaker flere tarmsykdommer, inkludert inflammatorisk tarmsykdom (IBD), cøliaki og legemiddelindusert GI-toksisitet2.
Studier på tarmepitelet utføres ved hjelp av flere in vitro-plattformsystemer som membraninnlegg, organer-på-en-chip-systemer, Ussing-kamre og tarmringer. Disse plattformene er egnet for å etablere polariserte epitel monolayers med tilgang til både apikale og basolaterale sider av membranen, ved hjelp av transformerte cellelinjer eller primærvev som modeller. Selv om transformerte cellelinjer, som de kolorektale (adeno)karsinomcellelinjene Caco-2, T84 og HT-29, er i stand til å skille seg ut i polariserte tarm enterocytter eller slimproduserende celler til en viss grad, er de ikke representative for in vivo epitelet ettersom flere celletyper mangler, og ulike reseptorer og transportører er avvikende uttrykt3 . I tillegg, ettersom cellelinjer er avledet fra en enkelt donor, representerer de ikke interpatient heterogenitet og lider av redusert kompleksitet og fysiologisk relevans. Selv om primærvev som brukes i ussingkamre og som tarmringer er mer representative for in vivo-situasjonen, gjør deres begrensede tilgjengelighet, kortsiktig levedyktighet og mangel på utvidelsesevne dem uegnet som et medium for HT-studier (high-throughput).
Organoider er in vitro epitelkulturer etablert fra forskjellige organer som tarm, nyre, lever, bukspyttkjertel og lunge. De har vist seg å ha langsiktig, stabil utvidbarhet samt genetisk og fenotypisk stabilitet og er derfor representative biologiske miniatyrer av epitelet i det opprinnelige organet med trofaste svar på ytre stimuli 4,5,6,7,8,9. Organoider er effektivt etablert fra enten resected eller biopsied normal, syk, betent eller kreftvev, som representerer heterogene pasientspesifikke responser 10,11,12,13,14,15,16. Dette papiret demonstrerer hvordan man etablerer intestinale epitelmonolayer avledet fra organoidkulturer. Monolayers har blitt vellykket etablert fra små tarm samt koloniske og rektal organoid kulturer. Denne modellen skaper en mulighet til å studere transport og permeabilitet av epitelceller til narkotika samt deres toksikologiske effekter på epitelet. Videre tillater modellen samkultur med immunceller og bakterier å studere deres interaksjoner med tarmepitelet 17,18,19. Videre kan denne modellen brukes til å studere svar på terapier på en pasientspesifikk måte og initiere screeninginnsats for å se etter neste bølge av epitelbaserte barrierefokuserte terapeutiske behandlinger. En slik tilnærming kan utvides til klinikken og bane vei for personlige behandlinger.
Selv om epitel monolayers i denne protokollen er fremstilt fra humane normale intestinale organoider, kan protokollen brukes og optimaliseres for andre organoidmodeller. Epitelial organoid monolayers dyrkes i intestinal organoid ekspansjonsmedium som inneholder Wnt for å støtte stamcelleproliferasjon og representere intestinal kryptcellulær sammensetning. Intestinale organoider kan berikes for å ha forskjellige intestinale epiteliske skjebner, for eksempel enterocytter, Paneth, beger og enteroendokrine celler, ved å modulere Wnt, Notch og epidermal vekstfaktor (EGF) veier. Her, etter etableringen av monolayers i ekspansjonsmedium, drives de mot mer differensierte tarmepiteleceller, som beskrevet tidligere 20,21,22,23,24,25. For screeningformål, avhengig av virkningsmåten til forbindelsen av interesse, målcellene og de eksperimentelle forholdene, kan monolayers drives mot den valgte cellesammensetningen for å måle effekten av forbindelsen med relevante funksjonelle avlesninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbereder reagenser for kultur
MERK: Utfør alle trinnene i et biosikkerhetsskap og følg standardretningslinjer for arbeid med cellekulturer. Ultrafiolett lys brukes i 10 minutter før du starter biosikkerhetsskapet. Før og etter bruk rengjøres overflaten av biosikkerhetsskapet med et vevspapir gjennomvåt i 70% etanol. For å lette dannelsen av tredimensjonale dråper ekstracellulær matrise (ECM), hold et forhåndsvarslet lager på 96-, 24- og 6-brønnsplater klare i inkubatoren ved 37 °C.
- Basal medium forberedelse
- Forbered basal medium (BM) i en 500 ml avansert dulbeccos modifiserte ørn medium med Skins næringsblanding F-12 (Ad-DF) middels flaske ved å legge til 5 ml 200 mM glutamin, 5 ml 1 M 4-(2-hydroksyetl)-1piperazinetanesulfonsyre (HEPES) og 5 ml penicillin/streptomycin (penn/strep) oppløsninger (10 000 U/ml eller 10 000 μg/ml). Dette kan oppbevares i kjøleskapet ved 4 °C i minst 4 uker.
- Wnt kilder
- Forbered Wnt3a-betinget medium (Wnt3aCM) i henhold til den tidligere beskrevne metoden26.
MERK: Nylig har en neste generasjons surrogat Wnt (NGS-Wnt), som også støtter utvidelse av humane tarmorganoider, blitt generert27.
- Forbered Wnt3a-betinget medium (Wnt3aCM) i henhold til den tidligere beskrevne metoden26.
- Intestinal organoid base medium forberedelse
MERK: Bruk alle vekstfaktorer og reagenser i henhold til produsentens anbefalinger. Bruk små aliquots og unngå fryse-tine sykluser; funksjonelle vekstfaktorer er avgjørende for vellykket organoidkultur.- Forbered konsentrert 2x intestinal organoid basemedium (2x IBM) ved å supplere BM med 1 μM A83-01, 2,5 mM N-acetylcysteine, 2x B27 supplement, 100 ng/ml human epidermal vekstfaktor (hEGF), 10 nM gastrin, 200 ng/ml hNoggin og 100 μg/ml av en antimikrobiell formulering for primærceller (se materialtabellen).
- Aliquot 2x IBM og fryse ved -20 °C i opptil 4 måneder. Ved behov, tine en aliquot over natten ved 4 °C eller i flere timer ved romtemperatur (RT).
- For å forberede intestinal organoid ekspansjonsmedium (IEM), supplere 2x IBM med enten 50% Wnt3aCM eller 50% BM og 0,5 nM NGS-Wnt, 250 ng / ml menneskelig Rspondin-3 (hRspo3), 10 mM nikotinamid og 10 μM SB202190.
- Intestinal organoid differensiering medium forberedelse
- Forbered enterocyttdifferensieringsmedium (eDM) ved å supplere 2x IBM med 50% BM, 250 ng/ml hRspo3 og 1,5 μM Wnt-banehemmer (IWP-2). Oppbevar eDM ved 4 °C i opptil 10 dager.
- Forbered kombinasjonsdifferensieringsmedium (cDM) ved å supplere 2x IBM med enten 40% BM og 10% Wnt3aCM eller 50% BM og 0.1 nM NGS-Wnt, 250 ng / ml hRspo3, 10 μM DAPT og 100 nM PD0325901. Oppbevar cDM ved 4 °C i opptil 10 dager.
- Manipulering av ekstracellulær matrise (ECM)
MERK: Klargjør den ekstracellulære matrisen (ECM) (se materialtabellen) i henhold til produsentens anbefaling.- Tine ECM over natten på is; overføre ECM fra flasken til et konisk rør på 15 ml ved hjelp av en 5 ml pipette, begge forkjølt ved -20 °C. Refreeze aliquots bare en gang ved -20 °C. Når den er tint, oppbevar ECM i kjøleskap ved 4 °C i opptil 7 dager. Inkuber i minst 30 min på is før bruk.
MERK: Bland ECM riktig og sørg for at den er kald før du bygger inn krypter eller organoider.
- Tine ECM over natten på is; overføre ECM fra flasken til et konisk rør på 15 ml ved hjelp av en 5 ml pipette, begge forkjølt ved -20 °C. Refreeze aliquots bare en gang ved -20 °C. Når den er tint, oppbevar ECM i kjøleskap ved 4 °C i opptil 7 dager. Inkuber i minst 30 min på is før bruk.
2. Organoide kulturer
- Etablering av kulturer fra frosne organoider
MERK: La BM nå RT, og hold en 12 ml aliquot, oppvarmet til 37 °C, klar før du starter prosedyren for å tine en kryo toårig som inneholder frosne organoider.- Tine organoid kryofanten raskt ved å agitere i et 37 °C vannbad til bare en isbit gjenstår. Tilsett umiddelbart 500 μL varm BM dråpevis til kryo toårig, og pipet opp og ned et par ganger for å fortynne frysemediet og bland innholdet forsiktig.
- Bruk en P1000 pipette, overfør organoidene til et 15 ml konisk rør, og tilsett ytterligere 1 ml varm BM-dropwise mens du forsiktig blander bunnen av røret. Rør opp og ned et par ganger for å fortynne frysemediet og blande innholdet forsiktig.
- Tilsett opptil 12 ml varm BM-dråpevis til det koniske røret på 15 ml som inneholder organoidene, og rør opp og ned med en 10 ml steril pipette for forsiktig å resuspendere organoidene.
- Sentrifuger organoidfjæringen i 5 min ved 85 × g og 8 °C. Kast supernatanten forsiktig uten å forstyrre pelletsen, og resuspender organoidene i 30% v / v av IEM supplert med 10 μM Y27632 eller annen rho-assosiert spoledannende protein serin / threonine kinase inhibitor (ROCK-hemmer). Plasser røret på isen.
- Tilsett 70% v/v ECM i det koniske røret på 15 ml som inneholder organoidene. Bland den organoide suspensjonen og hold det koniske røret på 15 ml på is, og frø 5 μL av suspensjonen for å kontrollere tettheten (figur 1A). Fortsett å plating hvis tettheten er passende; Hvis tettheten er for høy, legger du til mer IEM/ ECM-løsning i samme forhold på henholdsvis 30-70% v / v.
- I hver brønn av en forhåndsvarslet 24-brønnsplate frø 50 μL av organoid suspensjon ved pipettering 5 separate dråper på 10 μL (figur 1B). Snu platen opp ned, og la den stå i biosikkerhetsskapet i 5 min. Overfør platen fortsatt opp ned til 37 °C inkubatoren, og la den stå i ytterligere 30 minutter.
- Tilsett 500 μL IEM med 10 μM ROCK-hemmer til hver brønn, og overfør platen til inkubatoren. Bilde en dråpe regelmessig for å overvåke veksten, og oppdatere IEM hver 2-3 dager ved å aspirere det gamle mediet og legge til 500 μL fersk IEM.
- Passasje organoidene når de har kommet seg riktig fra opptining og har nådd riktig størrelse som skal behandles (figur 1C), som beskrevet i pkt. 2.2.
- Passaging av intestinale organoider
MERK: Kjøl ECM på is i minst 30 minutter, og hold IEM ved RT i minst 1 time før bruk.- Bruk mediet fra en kulturbrønn for å bryte opp organoidkuplene ved hjelp av en 1250 μL filterspiss med lav oppbevaring, og overfør brønninnholdet til et merket 15 ml konisk rør. Vask brønnen med 1 ml BM, og overfør den til samme koniske rør på 15 ml.
- Gjenta trinn 2.2.1 og 2.2.2 med alle andre brønner (maksimalt en halv plate eller 600 μL ECM-dråper kan vaskes og legges til ett 15 ml konisk rør).
- Tilsett BM for å fylle røret opp til 12 ml, og pipet opp og ned 10x ved hjelp av en 10 ml pipette. Sentrifuge ved 85 × g i 5 min ved 8 °C.
- Før du fjerner BM-en, må du kontrollere under mikroskopet for å se om alle organoider er pelletert på bunnen av det koniske røret på 15 ml (figur 1D). Hvis det ikke er noen ECM som ligger over den organoide pelletsen eller ECM-laget enten er rent eller inneholder bare rusk, enkeltceller eller svært få organoider sammenlignet med pelleterte organoider, aspirerer du supernatanten og rører ut ECM som legger organoidpellet veldig nøye ved hjelp av en P200 pipette.
MERK: Organoider kan bli fanget i ECM og ikke sediment som en kompakt pellets på grunn av lav sentrifugeringskraft. Hvis ECM inneholder organoider, sentrifugerer du røret igjen ved 450 × g i 5 min ved 8 °C, og fjerner forsiktig supernatanten som beskrevet i 2.2.4. Hvis det er flere koniske rør på 15 ml, kan de samles etter trinn 2.2.4. - Tilsett 1 ml BM i hver pellets (volum 50-200 μL, avhengig av organoidkultur og tetthet), og resuspend forsiktig. Rør organoidene opp og ned minst 5x for å skjære dem, unngå skumdannelse. Kontroller under mikroskopet for å se om organoidene er forstyrret (figur 2A). Hvis organoidene blir forstyrret, fortsett til trinn 2.2.7; hvis organoidene ikke forstyrres, pipet dem en annen 5x. Denne gangen berører du veggen av plastrøret med pipettespissen for å utøve mer mekanisk kraft for å forstyrre organoidene.
MERK: Mekanisk skjæring av cystiske (figur 1C) og spirende (figur 1E) organoider er mulig med enten en 200 μL eller 10 μL plastpipettespiss montert på en 1250 μL filterspiss med lav oppbevaring (figur 1F), avhengig av volumet som kreves for å forstyrre organoidene. Bruk av en innsnevret glasspipette (figur 1F) anbefales når mer enn 200 μL ECM som inneholder organoidene behandles (en brønn med en 6-brønns plate eller 4 brønner av en 24-brønns plate). - Sjekk under mikroskopet igjen for å se om organoidene er forstyrret. Hvis du blir forstyrret, fortsetter du med neste trinn. Hvis ikke, rør organoidene opp til 20x, kontroller organoidene under mikroskopet regelmessig. Hvis organoidene fortsatt ikke blir forstyrret, tilsett 25% v / v celle dissosiasjonsreagens 1 (se materialtabellen) til suspensjonen, inkuber i vannbadet ved 37 °C i 2 min, og rør organoidene opp til 20x, kontroller organoidene under mikroskopet regelmessig for å sikre at de ikke fordøyes til enkeltceller.
- Tilsett opptil 12 ml BM til det koniske røret på 15 ml, og vask den organoide pelletsen ved å pipettere opp og ned. Sentrifuge ved 85 × g i 5 min ved 8 °C. Kast supernatanten, og juster den endelige konsentrasjonen til 70% v / v ECM ved å legge IEM og ECM til organoidpellet.
- Begynn å resuspendere den organoide pelletsen med dobbelt volumet av IEM / ECM samlet for passaging, og frø 5 μL av suspensjonen for å sjekke tettheten. Fortsett plating hvis tettheten er passende (figur 2B); tilsett mer IEM/ECM-løsning hvis tettheten er for høy. Tilsett 200 μL av suspensjonen til hver brønn av en forhåndsvarslet 6-brønns plate, noe som gjør separate dråper på 10 μL volum.
- Snu platen opp ned, og la den stå i biosikkerhetsskapet i 5 min. Overfør platen fortsatt opp ned til 37 °C inkubatoren, og la den stå i ytterligere 30 minutter. Tilsett 2 ml IEM med 10 μM ROCK-hemmer til hver brønn, og overfør platen til inkubatoren.
- Bilde en dråpe regelmessig for å overvåke veksten, og oppdatere IEM hver 2-3 dager ved å aspirere det gamle mediet og legge til 2 ml fersk IEM.
- Passaging av intestinale organoider for epitelmonolayerpreparat
- Passasjeorganoider 3 dager før høsting for monolayerpreparat ved å følge den samme passagingprotokollen som er beskrevet i avsnitt 2.2 med ett unntak. I trinn 2.2.7 bruker organoidene på nytt i 1-1,5 ganger startvolumet til IEM/ECM for å ha et høyere tetthets- og ekspansjonspotensial når de høstes for monolagrepreparat (figur 3A).
3. Epitelial monolayer forberedelse
- Kultur epitel monolayers på både 24-brønns og 96-brønns membraninnlegg med en rekke tilgjengelige platetyper (tabell 1). Bruk HTS-membraninnsatser (high-throughput system) for begge størrelser, da disse inneholder en integrert skuff med membraninnleggene og en mottakerplate. For 24-brønnsformatet er bruk av plater med separate avtagbare membraninnlegg også mulig.
MERK: Ulike membrantyper (polyetylentereftalat (PET) eller polykarbonat) og porestørrelser (0,4-8,0 μm) er tilgjengelige og kan brukes avhengig av eksperimentelle behov. Monolayers kan bare avbildes av brightfield når innsatser med PET-membraner brukes. Lystette membraner blokkerer fluorescerende lyslekkasje fra det apikale til basolaterale rommet og kan vurderes når dynamisk transport eller permeabilitet av fluorescerende merkede substrater studeres. Den nåværende protokollen bruker 24-brønns membraninnlegg; tilpasninger for 96-brønns membraninnlegg er beskrevet i avsnitt 5. Avhengig av tetthet, morfologi og størrelse på organoidene (figur 3A) , er 6 brønner av en 6-brønns plate (som frø i pkt. 2.3) nok til å så en full 24-brønns plate med membraninnlegg. - Beleggmembraninnsatser med ECM
MERK: Hvis det er tvil om å ha nok celler, belegge innsatsene etter å ha talt cellene. Dette for å forhindre unødvendig belegg og tap av de dyre membraninnleggene.- Plasser membraninnleggene i støtteplaten i biosikkerhetsskapet. Fortynn ECM 40x i iskald Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) med Ca2+ og Mg2+, og rør 150 μL av den fortynnede ECM i det apikale rommet i hver innsats. Inkuber platen ved 37 °C i minst 1 time.
- Forberedelse av celler for såing
- Prewarm aliquots av cellen dissosiasjon reagens 2 i vannbadet (37 °C). Forbered 2 ml reagens for hver brønn på en 6-brønns plate.
- Overfør kulturplaten som inneholder organoidene (fremstilt i avsnitt 2.3) fra inkubatoren til biosikkerhetsskapet. Behandle organoidene, som beskrevet i trinn 2.2.1.-2.2.4. Ikke samle flere rør i ett rør.
- Fyll røret, som inneholder organoider fra maksimalt 3 brønner av en 6-brønns plate, opptil 12 ml med DPBS (uten Ca2+ og Mg2+), og pipet opp og ned 10x ved hjelp av en 10 ml pipette. Sentrifuge ved 85 × g i 5 min ved 8 °C, og aspirer supernatanten uten å forstyrre den organoide pelletsen.
- Tilsett 2 ml av det forhåndsvarmede celledissosiasjonsreagenset 2 per brønn av en 6-brønnsplate som brukes som startmateriale og resuspend. Inkuber rørene diagonalt eller horisontalt i 5 minutter i vannbadet ved 37 °C, for å forhindre at organoidene synker til bunnen av røret.
- Pipet opp og ned 10x ved hjelp av en 5 ml steril plastpipette eller en P1000 pipette, avhengig av det totale volumet av celledissosiasjonsreagensen. Kontroller organoidfjæringen under mikroskopet for å se om en blanding av enkeltceller og noen celleklumper som består av 2-4 celler har dannet seg (figur 3B). Fortsett om nødvendig fordøyelsen ved å gjenta trinn 3.3.4-3.3.5 (ikke øk volumet av celledissosiasjonsreagens) til blandingen ser ut som figur 3B.
MERK: Unngå å fordøye organoidene helt til enkeltceller. Det er nødvendig å ha noen små grupper av celler (dvs. grupper på 2-4 celler). - Stopp celledissosiasjon ved å legge til opptil 12 ml BM inkludert 10 μM ROCK-hemmer til celleopphenget. Sentrifuge ved 450 × g i 5 min ved 8 °C, og aspirer supernatanten uten å forstyrre cellepelleten. Når du håndterer den samme organoidkulturen i flere koniske rør på 15 ml, må du samle cellepellets og resuspendere dem i 12 ml BM.
- Filtrer celleopphenget gjennom en 40 μm sil forhåndsgiftet med BM, og høst gjennomstrømningen i et 50 ml konisk rør. Vask silen med 10 ml BM, og høst gjennomstrømningen i samme koniske rør på 50 ml.
- Overfør den anstrengte cellefjæringen til to nye koniske rør på 15 ml. Sentrifuge ved 450 × g i 5 min ved 8 °C, og aspirer supernatanten uten å forstyrre cellepelleten. Resuspend cellene i 4 ml IEM supplert med 10 μM ROCK-hemmer per full kulturplate som brukes som startmateriale.
- Bland en liten mengde cellesuspensjon i forholdet 1:1 med trypanblå for telling. Tell de aktive, ikke blå cellene (figur 3C), og beregn totalt antall aktive celler. I små klumper teller du hver enkelt celle.
- Forbered en celleoppheng som inneholder 3 × 106 levende celler per ml IEM supplert med 10 μM ROCK-hemmer.
- Såddceller på polyestermembraninnlegg
- Aspirer DPBS forsiktig fra de ECM-belagte innsatsene (trinn 3.2.1), samtidig som platen holdes horisontalt. Pipet 800 μL IEM supplert med ROCK-hemmer i hvert basolaterale rom. Pipet 150 μL av cellefjæringen fremstilt i trinn 3.3.10 på den ECM-belagte membranen i det apikale rommet dropwise. Per plate, sørg for å ha minst en "blank" brønn bare med BM.
- Når cellene har sedimentert seg på membranen, måler du transepithelial elektrisk motstand (TEER), som beskrevet i pkt. 4.1, og avbilder membranen settes inn ved hjelp av et mikroskop. Plasser platen i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2. Mål TEER hver dag, og hent bilder regelmessig for å overvåke monolagsdannelse (figur 4A-D).
- Forfriskende monolag
MERK: Oppdater mediet hver 2-3 dager, og følg følgende rekkefølge for å opprettholde et positivt hydrostatisk trykk over cellene og forhindre at celler skyves av membranen. Mens du oppdaterer mediet, må du sørge for at monolayeren, som er synlig ved hjelp av mediets aspirasjon, ikke er skadet av pipettespissen.- Fjern mediet fra basolaterale rom på platen som inneholder membraninnsatsene. Deretter aspirerer du forsiktig mediet fra de apikale rommene på membraninnleggene.
- Tilsett 150 μL fersk IEM-dråpevis til hvert apikale rom, og tilsett deretter 800 μL fersk IEM i hvert basolaterale rom.
- Berikelse av monolayer for ønskede intestinale epitelceller
- La monolayeren bli sammenfallende i IEM, tilsvarende en TEER-verdi på rundt 100 Ω·cm² (som beregnet i trinn 4.1.1.4). Kontroller under mikroskopet for å finne ut om monolagerne er fullstendig dannet (figur 4D) og for fravær av hull (som vist i figur 4B,C).
- Fjern IEM forsiktig fra de basolaterale og apikale rommene på membraninnleggene, og erstatt det med enten eDM eller cDM som klargjort i avsnitt 1.4. Kultur monolayer i ytterligere 3-4 dager i det spesifikke differensieringsmediet for å få organoidcellene beriket med ønsket spesifikk celletype. Oppdater mediet hver 2-3 dager, som beskrevet i avsnitt 3.4.
- Mål TEER daglig, og hent bilder regelmessig hvis ønskelig (figur 5A-C).
MERK: TEER-verdien som indikerer et fullstendig organisert beriket monolag varierer per organoidkultur; TEER-verdier øker vanligvis til 600 og kan øke opptil 1000 Ω·cm2 (som beregnet i trinn 4.1.1.4) etter 3 dager i differensieringsmedier og er stabile i 3-5 dager.
4. Epitelial monolayer analyse avlesninger
- Måling av transepithelial elektrisk motstand (TEER)
MERK: TEER-målinger er allment akseptert som en metode for å analysere tett koblingsdynamikk og barrierefunksjonsintegritet i biologiske modeller av fysiologiske barrierer, for eksempel epitel monolayers28,29. Økning i TEER etter differensiering på grunn av økt mobilinteraksjon ved tette veikryss kan måles ved hjelp av en manuell TEER-måler eller en automatisert TEER-målerobot.- Måling av TEER ved hjelp av en manuell TEER-måler
- Rengjør elektroden med 70% etanol, og la den lufttørke inne i biosikkerhetsskapet. Plasser elektroden i et rør som inneholder BM. Koble elektroden til den manuelle TEER-måleren. Vri funksjonsbryteren for å måle i Ohms (Ω). Slå på strømbryteren .
- Plasser den korte elektroden i det apikale rommet på innsatsen, mens den lange elektroden er plassert i basolateralrommet (figur 6A). Unngå å berøre monolayeren.
- Mål motstanden i den tomme brønnen (Rblank), og mål deretter de resterende prøvene (R-prøven) på samme måte. Vask elektroden med BM mellom prøver med forskjellige forhold. Rengjør elektroden først med demi vann og deretter med 70% etanol og la den lufttørke.
- Beregn TEER (Ω·cm2): [R-prøve (Ω) - Rblank (Ω)] × membranområde (cm2) (tabell 1 og figur 6B).
- Måling av TEER ved hjelp av en automatisert TEER-målerobot (Materialtabell)
- Utfør automatiserte TEER-målinger ved bruk av HTS-systemer for 96-brønns og 24-brønns HTS-plater som inneholder membraninnlegg. Bruk forskjellige elektroder for TEER-måling for begge typer (24- og 96-HTS membraninnlegg). Hvis du vil måle TEER ved hjelp av en automatisert TEER-målerobot, følger du produsentens instruksjoner.
- Måling av TEER ved hjelp av en manuell TEER-måler
- Måling av epitelial barriereintegritet og permeabilitet
MERK: Denne protokollen introduserer Lucifer Yellow permeabilitet fra det apikale til basolaterale rommet som en indikasjon på monolayerintegritet. Denne delen beskriver fluorescensmåling i basolateralrommet etter et 1 h inkubasjonstrinn for å evaluere monolayer permeabilitet og dermed barriereintegritet. Denne målingen er en sluttpunktanalyse og er spesielt nyttig når du tester forbindelser for deres effekt på barriereintegriteten.- Tin Lucifer Yellow på is, og la BM likevekte til RT. For en 24-brønns plate med membraninnlegg, lag 5 ml arbeidsløsning på 60 μM Lucifer Yellow i BM.
MERK: Lucifer Yellow er lysfølsom. Forbered fortynning i mørke 1,5 ml sterile rør og utfør alle trinn med biosikkerhetskabinettlyset slått av. - Fjern forsiktig mediet fra de basolaterale og apikale rommene på membraninnleggene, som beskrevet i trinn 3.5.1. Skrap eventuelt en ubehandlet monolayer ved hjelp av en pipettespiss som en positiv kontroll for Lucifer Yellow-lekkasje gjennom en skadet barriere.
- Tilsett 150 μL BM med 60 μM Lucifer Yellow i hvert apikale rom, og tilsett 800 μL BM uten Lucifer Yellow i hvert basolaterale rom. Plasser platen på en shaker ved 37 °C, 50 o/min i 60 minutter.
- I mellomtiden utarbeider du en standardkurve for Lucifer Yellow i BM fra og med arbeidsløsningen som er utarbeidet i trinn 4.2.1. Fortynn 1:3 i hvert trinn til en konsentrasjon på 3 nM er nådd. Ta med en negativ kontroll (bare BM).
- Overfør 100 μL av hver standard i triplikat til en 96-brønns gjennomsiktig plate. Etter 60 min inkubasjon, fjern membraninnsatsene og overfør 100 μL fra hver basolaterale brønn (trinn 4.2.3) i triplikat til den 96-brønns gjennomsiktige platen. Mål fluorescensen på platen ved hjelp av en plateleser ved en eksitasjonsbølgelengde på 430 nm og en utslippsbølgelengde på 530 nm.
- Når du har korrigert for den negative kontrollverdien (kun BM), bruker du standard kurveverdier til å beregne Lucifer Yellow-konsentrasjonen i basolateralrommet (total mottakerkonsentrasjon (μM)).
- Beregn den tilsynelatende permeabilitetskoeffisienten (P-appen) i henhold til følgende formel (figur 6C):
- For en 24-brønns plate som inneholder membraninnlegg, bruk følgende formel:
- Tin Lucifer Yellow på is, og la BM likevekte til RT. For en 24-brønns plate med membraninnlegg, lag 5 ml arbeidsløsning på 60 μM Lucifer Yellow i BM.
- Feste monolayers og forberede parafinblokker for histologi
MERK: Epiteliale monolayers kan brukes til histopologisk farging for evaluering av deres cellulære sammensetning, polaritet og uttrykk for forskjellige proteiner av interesse som koblingsproteiner, spredning eller differensieringsmarkører. Denne delen beskriver parafinblokkforberedelse for histopologisk farging.- Fjern forsiktig mediet fra de basolaterale og apikale rommene på membraninnleggene, som beskrevet i trinn 3.5.1.
- Vask monolagene ved å tilsette 150 μL DPBS (uten Ca2+ og Mg2+) til hvert apikale rom og 800 μL til hvert basolaterale rom. Aspirer DPBS forsiktig igjen, først fra basolateralrommet og deretter fra det apikale rommet.
MERK: Det basolaterale rommet forblir tomt fra dette trinnet. - I en avtrekkshette tilsettes 150 μL 4% paraformaldehyd til hvert apikale rom, og inkuberes i 30 min ved RT.
MERK: Fra dette trinnet og fremover, utfør alle handlinger i denne delen inne i en avtrekkshette, da paraformaldehyd er giftig. - Aspirer forsiktig fikseringsmiddelet fra de apikale rommene på membraninnleggene, og kast det som flytende halogenavfall.
MERK: Kast alt flytende avfall som flytende halogenavfall fra dette trinnet og utover. - Vask monolagene ved å legge til 200 μL DPBS (uten Ca2+ og Mg2+) til hvert apikale rom, og aspirer DPBS forsiktig igjen. Gjenta dette trinnet én gang til.
- Tilsett 200 μL 25% etylalkohol (EtOH) i hvert apikale rom, og inkuber i 15 min ved RT. Etter 15 min aspirerer du forsiktig 25% EtOH fra de apikale rommene på membraninnleggene. Gjenta med 50% EtOH-løsning og deretter med 70% EtOH-løsning.
- Tilsett 200 μL 70% EtOH i hvert apikale rom, og pakk platen med parafilm. Oppbevar den ved 4 °C til videre bruk.
- Aspirer forsiktig 70% EtOH, og bruk en skalpell for å forsiktig kutte monolayermembranene fra innsatsene. Klipp fra basolateral side, rundt kanten av innsatsen.
- Forbered parafinblokker etter standardprosedyren.
- Når parafinen fortsatt er varm, ta monolayeren fra parafinen med pinsett, og legg den på en forhåndskjølt overflate.
- Vær forsiktig så du ikke skader monolayeren. Klipp monolayeren i to med et enkelt kantblad.
- Når parafinen i bunnen av kassetten begynner å størkne, bruk oppvarmede pinsett for å plassere de to monolayerdelene i parafinen, ved siden av hverandre med den rette siden ned og i vertikal retning for å sikre at monolayeren blir vertikal i kupéen.
- Når parafinblokker er klare, kutt blokkene ved hjelp av en mikrotom, og gjør lysbilder på 4 μm tykke seksjoner etter standard prosedyre. Pass på at monolayers ender opp vertikalt i kupéen.
- Utfør histologiske flekker som beskrevet tidligere 7,9. Bruk hematoksylin og eosin (H&E), Ki67, mucin-2 (MUC2) og Alcian Blue for å vise henholdsvis generell morfologi, proliferative celler, slimproduksjon og begerceller (figur 6E).
MERK: Ytterligere differensieringsmarkører, for eksempel lysozyme for Paneth-celler, kan også brukes. Denne markøren er ikke presentert i figur 6E som Paneth celler er til stede i liten intestinal epitel i stedet for kolon epitel.
- Utskilt proteinmåling i middels supernatant
- Mål lysozymenivåer i den apikale supernatanten til ilealmonolayers (se figur 6D) ved hjelp av settet som er oppført i materialtabellen. Om ønskelig, mål nivåer av forskjellige cytokiner og andre proteiner av interesse.
- Analyse av genuttrykk
- Kvantifisere effekten av differensieringsmediet på uttrykket av epitelcellemarkørgener ved hjelp av kvantitativ omvendt transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR).
- Lyse monolayers i 350 μL av RNA lysis buffer etterfulgt av RNA isolasjon i henhold til produsentens instruksjoner. Utfør cDNA-syntese og qPCRs, som beskrevet tidligere 7,9, ved hjelp av cDNA-syntesesettene, mastermiksen og oligonukleotidene som er oppført i materialtabellen.
- Kvantifisere effekten av differensieringsmediet på uttrykket av epitelcellemarkørgener ved hjelp av kvantitativ omvendt transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR).
5. Oppskalering til 96-brønnsplater som inneholder membraninnlegg
MERK: Forbered epitel monolayers for høyere gjennomstrømning narkotika screenings eller flere middels forhold ved hjelp av HTS 96-brønns plater som inneholder membran innsatser.
- Tilpasninger ved tilberedning av monolayers i 96-brønnsformat
- Følg alle trinnene som er beskrevet i denne protokollen for 24-brønnsplater som inneholder membraninnlegg, endring av volumer og cellenumre til de som er beskrevet i tabell 1. For tilberedning av monolagre på 96-brønnsplater med membraninnlegg, gå frem som beskrevet i avsnitt 3 med følgende forskjeller.
- Omtrent 9 brønner av en 6-brønns kulturplate med organoid tetthet representert i figur 3A er nødvendig for å frø en full 96-brønns plate med membraninnlegg. I trinn 3.2.1, precoat membranene med 67 μL av 40x fortynnet ECM i DPBS (med Ca2 + og Mg2 +).
- I pkt. 3.5 må du først overføre den integrerte membranplaten til en annen 96-brønnsplate for å tillate middels forfriskning av både apikale og basolaterale rom.
- Følg alle trinnene som er beskrevet i denne protokollen for 24-brønnsplater som inneholder membraninnlegg, endring av volumer og cellenumre til de som er beskrevet i tabell 1. For tilberedning av monolagre på 96-brønnsplater med membraninnlegg, gå frem som beskrevet i avsnitt 3 med følgende forskjeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser et representativt brightfield-bilde av intestinale organoider etter å ha tint dem fra en kryofil. Det er viktig å tine organoider med høy tetthet for å sikre optimal utvinning. Organoider er belagt i 24- eller 6-brønnsplater i ECM-kupler på ca. 10 μL (figur 1B). De fleste normale intestinale organoider har en cystisk morfologi. Etter å ha kommet seg fra opptiningsprosessen, vokser organoidene til en større størrelse og er klare til å bli passasjet etter 3-7 dager, avhengig av organoidkulturen (figur 1C). Etter høsting av organoidene og vasking av ECM (figur 1D), kan organoider forstyrres til en liten størrelse ved mekanisk skjæring. Avhengig av organoidenes morfologi (cystisk figur 1C, spirende figur 1E), kan organoider forstyrres ved hjelp av plast- eller glasspipetter (figur 1F). Organoider avbrytes i en suspensjon (figur 2A), som regelmessig overvåkes under mikroskopet. Det er viktig å unngå å gjøre dem for små, da grupper av celler må holde seg sammen for å sikre organoid vekst. Figur 2B viser organoidene i ECM-dråper like etter passivring. Generelt er cystiske organoider belagt med en relativt høy tetthet mens spirende organoider er belagt i lav tetthet; Dette kan imidlertid variere mellom forskjellige organoidkulturer.
Når du passerer organoider for fremstilling av monolayers, sørg for å plate dem med høy tetthet, og la dem vokse i tre dager, slik at de er i optimale ekspansjonsforhold. Organoider kan høstes for monolayerpreparat når de er sammenlignbare med figur 3A i størrelse og tetthet, hvor 6 brønner av en 6-brønns plate, som hver inneholder 200 μL organoidkupler, vanligvis er nok til å så en full 24-brønns plate med membraninnlegg. Etter utarbeidelsen av en encellet suspensjon med celledissosiasjonsreagenset, skal enkeltceller og små klumper av celler være synlige (figur 3B), og levende celler kan telles (figur 3C). Pilene indikerer døde celler farget med trypan blå, som bør utelukkes fra telling. Enkeltcellene og små klumper blir deretter sådd i membraninnleggene som vist i figur 4A. Monolayerformasjonen er synlig etter 1-3 dager (figur 4B, C), og monolayers vil generelt være sammenfallende etter 3-6 dager, avhengig av organoidkulturen (figur 4D). Monolayers forblir i ekspansjonsmedium til de er sammenfallende, hvorpå de kan berikes med blant annet enterocytter eller begerceller ved hjelp av forskjellige berikelsesmedier. Figur 5A viser et monolag som ble dyrket i 8 dager i ekspansjonsmedium (IEM). Når den er beriket med enterocytter (eDM), ses en struktur, som i figur 5B, mens monolayers utsatt for kombinasjonsmedium (cDM) viser en jevnere struktur (figur 5C).
Monolayerformasjonen kan kvantitativt etterfølges av måling av TEER (figur 6A). En helt sammenfallende monolag har en TEER-verdi på ~100 Ω·cm2, som øker til ~1000 Ω·cm2 når den utsettes for et av differensieringsmediene (figur 6B). Monolayers under alle middels forhold viser en lav tilsynelatende permeabilitet (Papp) til Lucifer Yellow (0,45 kDa). Lysozyme-sekresjonen av ilealmonolayers dyrket i IEM var høyere enn for monolayers dyrket i IEM til sammenløp og i ytterligere 4 dager i eDM eller cDM (betegnet som + påfølgende eDM eller cDM) (figur 6D). Monolayers dyrket i IEM, IEM + påfølgende eDM eller IEM + påfølgende cDM viser forskjellig morfologi, som det kan observeres med H &E farging (figur 6E). Mens kolon organoid-avledede epiteliale monolayers i IEM og cDM media har en jevn apikal overflate, enterocyte-differensierte monolayers presentere en invaginert apikal morfologi i fravær av Wnt. Ki67-positive proliferative celler kan bare oppdages i ekspansjonsforhold. Alcian Blue og MUC2 flekkslim produsert av begerceller, som visualiseres i monolayers differensiert i eDM og mer fremtredende i cDM når Wnt, Notch og EGF-signalering hemmes, henholdsvis (figur 6E). Ved differensiering reduseres proliferative celler mens begercelle- og enterocytmarkørgenuttrykk øker i forhold til det som observeres under IEM-forhold, som vist av lgr5, MUC2 og ALPI genuttrykks kvantifisering av henholdsvis qRT-PCR (figur 6F).
Figur 1: Etablering av en intestinal organoidkultur fra frosne organoider. (A) Representativt brightfield-bilde av en intestinal organoidkultur etter opptining. (B) ECM kupler (50 μL) frø i hver brønn av en 24-brønns kulturplate. (C) Representativt bilde av en normal intestinal organoid kultur klar for passivring. (D) Representativt bilde om hvordan du kontrollerer tilstedeværelsen av ECM i et 15 ml rør som inneholder organoider under et lysmikroskop. (E) Representativt bilde av en spirende intestinal organoid kultur klar for passivring. (F) En 10 μL plastpipettespiss montert på en 1250 μL filterspiss med lav oppbevaring (venstre) og en innsnevret glasspipette (høyre) for mekanisk skjæring av organoider. Skalastenger = 100 μm. Forkortelse: ECM = ekstracellulær matrise. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Behandling av intestinale organoider for vedlikehold eller fremstilling av monolayers. (A) Representativt bilde av tarmorganoider etter mekanisk forstyrrelse. (B) Representativt bilde av en intestinal organoid kultur frøet etter passivring. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Forbereder enkeltceller fra tarmorganoider for monolayerpreparat. (A) Intestinale organoider klare til å høste for monolayerpreparat. (B) Enkeltceller og små klumper av celler etter klargjøring av enkeltceller. (C) Synlige enkeltceller og små klumper under telling i et rutenettkammer. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Monolayerformasjon etter sådd av enkeltceller på membraner. (A) Enkeltceller like etter sådd på membraner. I gjennomsnitt er (B) monolayeren rundt 50% sammenfallende 1-3 dager etter sådd, (C) ~ 90% konfluent på dag 3-5, og (D) den komplette monolayer har dannet seg rundt dag 4-7. Skalastenger = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Berikelse av bestemte celletyper i monolayeren. (A) Monolayer etter 8 dager i IEM. (B) Monolayer beriket med enterocytter etter 4 dager i IEM og ytterligere 4 dager i eDM. (C) Monolayer beriket med begerceller og andre celletyper etter 4 dager i IEM og ytterligere 4 dager i cDM. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: IEM = intestinal organoid ekspansjonsmedium; eDM = enterocytt differensieringsmedium; cDM = kombinasjonsdifferensieringsmedium. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: En rekke mulige avlesninger ved hjelp av epitelorganoide monolayers. (A) Elektrode i membraninnsatsen for å måle TEER. (B) TEER-verdier øker i tid med en verdi på ~100 Ω·cm2 når monolayeren når sammenløpet. Etter å ha beriket monolayers med enterocytter eller en kombinasjon av forskjellige epitelceller, øker TEER til 1000 Ω·cm2 eller høyere. (C) Monolayers under alle middels forhold (IEM + 4 dager IEM / eDM / cDM) er ugjennomtrengelige for Lucifer Yellow. (D) Uttrykk for lysozym er høyere hos ileummonolayers når det vokser i ekspansjonsmedium enn i begge typer differensieringsmedium (IEM + 4 dager IEM / eDM / cDM). (E) Kolonmonolayers viser forskjellige morfologier når de utsettes for forskjellige middels forhold (IEM + 4 dager IEM / eDM / cDM) som visualisert av H &E, Ki67, Alcian Blue og MUC2 flekker. Som forventet er monolayers dyrket i ekspansjonsmedium svært proliferative, som vist av Ki67 farging. Monolayers differensiert med eDM viser et kolonne epitel uten proliferative celler. Monolayers utsatt for cDM er heller ikke proliferative og utvikler flere begerceller. Skalastang = 100 μm. (F) Stamcelle (LGR5), begercelle (MUC2) og enterocytt (ALPI) markørgenuttrykk i kolonmonolayere av qRT-PCR. Forkortelser: TEER = transepithelial elektrisk motstand; IEM = intestinal organoid ekspansjonsmedium; eDM = enterocytt differensieringsmedium; cDM = kombinasjonsdifferensieringsmedium; Papp = tilsynelatende permeabilitetskoeffisient; LGR5 = leucinrik repeterende G-protein-koblet reseptor 5; H&E = hematoksylin og eosin; AB = Alcian Blå; MUC2 = mucin-2; ALPI = intestinal alkalisk fosfatase; qRT-PCR = kvantitativ polymerasekjedereaksjon med omvendt transkripsjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Membraninnlegg | ||
| 24-brønns plater | 96-brønns plater | |
| Membranoverflate (cm2) | 0.33 | 0.143 |
| Apikalt volum (μL) | 150 | 100 |
| Basolateralt volum (μL) | 800 | 300 |
| Celler til frø per brønn | 450,000 | 200,000 |
| HTS-plater med membraninnlegg | KJÆLEDYR | KJÆLEDYR |
| Plater med separate innsatser | KJÆLEDYR | NA |
| Lett stramme plater med membraninnlegg | ||
| Elektroder er forskjellige for de to formatene | Se materialfortegnelsen | |
Tabell 1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver generell manipulering og vedlikehold av intestinale organoider samt fremstilling og mulige anvendelser av epitelmonolayer avledet fra disse organoidene. Til dags dato har monolayers blitt vellykket forberedt fra tolvfingertarmen, ileum og forskjellige regioner av kolonorganoider avledet fra normal så vel som tidligere og aktivt betent tarmvev (upubliserte data). Anvendelsen av pasientavledede organoidmonolayers letter studiet av barrierefunksjon på en sykdoms- og pasientspesifikk måte, samt studiet av pasientspesifikke responser på en rekke narkotikabehandlinger. Selv om cellelinjer kan danne differensierte og polariserte monolayers som inneholder intestinale enterocytter og begerlignende celler, uttrykkes mange forskjellige enzymer og transportører avvikende i disse cellelinjene, noe som resulterer i redusert kompleksitet og fysiologisk relevans 3,30. Organoid kultur er teknisk mer krevende og arbeidskrevende enn cellekultur; Organoider er imidlertid mer representative for in vivo-situasjonen, mens cellelinjer gjentatte ganger ikke har klart å representere vevsresponser i komplekse oppsett.
Selv om primære vevsbasertemodeller kan være representative for in vivos ituasjon, krever de bruk av testdyr eller tilgang til menneskelig materiale, som er forbundet med begrenset tilgjengelighet og etiske begrensninger. I tillegg har primærvev ingen eller begrenset utvidbarhet og er ikke stabilt i utvidede eksperimentelle tidsrammer. Organoid teknologi krever begrenset mengde primærvev for å etablere genetisk og fysiologisk stabile langsiktige ekspanderende kulturer, samtidig som det representerer epitelvevskompleksitet og pasient heterogenitet. Ulike cellelinjer, for eksempel Caco-2, brukes ofte til å forberede epitelale monolayers. Caco-2 celler tar 21 dager å etablere en polarisert epitel monolayer som kan brukes til ethvert eksperiment30. Organoid-avledede epitelmonolayer fremstilles fra organoide enkeltceller som beskrevet i den nåværende protokollen, og etter 3-6 dager danner et polarisert epitel som kan differensieres ytterligere for å berike dem med enterocytter eller begerceller.
Monolayers er en statisk modell som mangler en mikrofluidisk strømning eller mekanikerstrekk som det ses i organer-på-en-chip. De tilbyr imidlertid muligheten for å samarbeide med (autologe) immunceller, samt bakterier eller parasitter 17,18,19,31. Organoider er egnet for monolayerpreparat når de er i ekspansjonsfasen; for intestinale organoider er dette vanligvis 3 dager etter passivring. Dissosiasjon av organoider til enkeltceller bør utføres raskt for å unngå langvarig eksponering for fordøyelsesenzymer. For å øke overlevelsen av stamceller etter tilberedning av en encellet suspensjon, tilsettes Rho-assosiert proteinkinasehemmer (ROCK-hemmer), Y27632, til cellene for å forhindre anoikisindusert celledød32. Videre er det avgjørende for kulturen monolayers på en membran forhåndsbelagt med ECM for å sikre at de opprettholder sine organoide egenskaper og polarisering. For funksjonelle screeninganalyser som kvantifiserer GI-traktatens epitelcelleresponser på ytre stimuli, er det viktig at organoidkulturer representerer den nødvendige cellulære kompleksiteten avhengig av hvilken type analyse som skal utvikles og eventuelt avlesninger.
Intestinale organoider representerer forskjellige epitelceller som finnes in vivo, for eksempel stamme, TA, enterocytt, Paneth, beger og enterokendokrine celler 4,5, og fremstilles og vedlikeholdes ved hjelp av et definert organoid medium utarbeidet som beskrevet i denne protokollen. Enterocyttdifferensiering kan fremmes ved å dyrke organoider i ytterligere fire dager ved hjelp av kulturforhold som behørig hemmer Wnt-banen, ved fjerning av Wnt-molekyler / aktivatorer, og tilsetningen av pinnsvinhemmeren, IWP-2 (enterocytt kolondifferensieringsmedium, eDM). Siden slimproduserende begerceller også er avgjørende for barrierefunksjonen homeostase, en annen kulturtilstand tar sikte på å produsere en mer heterogen cellepopulasjon som inneholder stamme-, enterocyt- og begerceller, der Notch- og EGF-veier hemmes mens Wnt-signalering holdes delvis aktiv ved å redusere Wnt3aCM til 10% (eller 0,1 nM for NGS-Wnt) i stedet for 50% (0,5 nM NGS-Wnt) som brukes i IEM. I motsetning til eDM, som beriker for enterocyttdifferensiering, støtter denne andre tilstanden tilstedeværelsen av flere celletyper og kalles derfor kombinasjonsdifferensieringsmedium (cDM).
Anvendelser av organoid-avledede monolayers inkluderer overvåking av epitelial barriereintegritet samt undersøkelse av tett kryss og transportøruttrykk. Barriereintegritet, permeabilitet og transport kan analyseres ved hjelp av avlesningene som er introdusert i denne protokollen. Mens TEER måler ionisk ledning gjennom tette veikryss, måler permeabilitetsanalysen vannstrømmen og dermed paracellulær permeabilitet gjennom de tette kryssene28,29. Epitelial barriereintegritet, permeabilitet og transportfunksjonalitet for monolayers kan evalueres ved å måle trafikken til forskjellige fluorescerende eller radioaktive substrater over apikale og basolaterale rom i membraninnleggene. TEER-målinger gjør det mulig å kvantifisere barriereintegriteten, som viser en økning i verdier når de differensierer mot polariserte enterocytter og begerceller, og en reduksjon etter å ha påført skade på monolayers.
Lucifer Yellow permeabilitetsanalyse kan brukes til innledende barriereintegritetsvurdering samt bekreftelse av redusert integritet etter å ha påført skade på monolayers. Denne protokollen introduserer Lucifer Yellow permeabilitet fra det apikale til basolaterale rommet som en indikasjon på monolayerintegritet. På samme måte kan andre fluorescerende merkede reagenser, for eksempel 4 eller 40 kDa dextran, brukes til å evaluere økt paracellulær permeabilitet som følge av barriereskadeinduserende midler. Fluorescerende merkede substrater, som Rhodamine 123, kan brukes til å måle aktiviteten til forskjellige transportører, for eksempel P-glykoprotein-1. Fluorescensanalysen beskrevet i denne protokollen tillater måling av nivåene av proteiner, som lysozym, som utskilles i det apikale rommet. Responser på skadeinduksjon ved proinflammatoriske cytokiner kan måles med disse avlesningene, samt de potensielle effektene av barriere-gjenopprettende forbindelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av Topsector Life Sciences &Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland (LSH-TKI) offentlig-private partnerskap (PPP) kvote av den nederlandske LSH-sektoren med prosjektnummer LSHM16021 Organoider som nytt verktøy for toksikologimodellering til Hubrecht Organoid Technology (HUB) og HUB intern finansiering til sykdomsmodellering og toksikologiavdeling. Vi takker laboratoriene til Sabine Middendorp (Divisjon for pediatrisk gastroenterologi, Wilhelmina Children's Hospital, UMC, Utrecht) og Hugo R. de Jonge og Marcel J.C. Bijvelds (Department of Gastroenterology and Hepatology, Erasmus MC, Rotterdam) for å gi innledende teknisk støtte til å sette opp monolayers på membraninnlegg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
| 1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
| 15 mL conical tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 24-well cell culture plates | Greiner bio-one | 662160 | |
| 24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) | Corning | 351156 | |
| 24-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 3378 | |
| 24-well plate with Transwell inserts | Corning | 3470 | |
| 40 µm cell strainer | PluriSelect | 43-50040-01 | |
| 50 mL conical tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner bio-one | 657160 | |
| 96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
| 96-well fast thermal cycling plates | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
| 96-well HTS Fluoroblok Transwell plate | Corning | 351162 | |
| 96-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 7369 | |
| 96-well transparent culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
| A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
| Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | Cell dissociation reagent 2 |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
| B27 supplement | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
| Cell culture microscope (light / optical microscope) | Leica | ||
| CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| CO2 incubator | PHCBI | ||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| DEPC treated H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
| DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
| EVOM2 meter with STX electrode | WTI | ||
| Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
| Glass pipettes | Volac | ||
| GlutaMAX | Life Technologies Europe BV | 35050038 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
| Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
| IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| Ki67 primary antibody | Sanbio | BSH-7302-100 | |
| Ki67 secondary antibody | Agilent | K400111-2 | |
| Kova International Glasstic Slide with Counting grids | Fisher Emergo | 10298483 | |
| Laminar flow hood | Thermo scientific | ||
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | extracellular matrix (ECM) |
| MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
| MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | |
| Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) | Gilson | ||
| Microtome | Leica | ||
| MUC2 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
| MUC2 secondary antibody | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
| Multichannel pipette (200 µL) | Gilson | ||
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Oligonucleotide ALPI1/Forward | Custom-made | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
| Oligonucleotide ALPI1/Reverse | Custom-made | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
| Oligonucleotide LGR5/Forward | Custom-made | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
| Oligonucleotide LGR5/Reverse | Custom-made | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
| Oligonucleotide MUC2/Forward | Custom-made | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
| Oligonucleotide MUC2/Reverse | Custom-made | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
| Oligonucleotide TBP/Forward | Custom-made | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
| Oligonucleotide TBP/Reverse | Custom-made | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | |
| Optical adhesive covers | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
| PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies Europe BV | 15140122 | |
| Plate shaker | Panasonic | ||
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
| Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | antimicrobial formulation for primary cells |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
| Reagent reservoir for multichannel pipet | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
| REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe | WTI | ||
| Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| Serological pipettes | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
| Serological pipettor (Pipet-Aid) | Drummond | ||
| Single edge razor blade | GEM Scientific | ||
| Superscript 1st strand system for RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
| Tecan Spark 10M plate reader | Tecan | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Cell dissociation reagent 1 |
| Water bath | Grant | ||
| Y27632 (ROCK inhibitor) | AbMole | M1817 |
References
- Haegebarth, A., Clevers, H. Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin. The American Journal of Pathology. 174 (3), 715-721 (2009).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Martínez-Maqueda, D., Miralles, B., Recio, I., et al. HT29 Cell Line. The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 113-124 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5(+) liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 11 (2), 179-194 (2013).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 1-20 (2019).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- d'Aldebert, E., et al. Characterization of human colon organoids from inflammatory bowel disease patients. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 363 (2020).
- Dotti, I., et al. Alterations in the epithelial stem cell compartment could contribute to permanent changes in the mucosa of patients with ulcerative colitis. Gut. 66 (12), 2069-2079 (2017).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270 (2017).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- van Es, J. H., et al. Wnt signalling induces maturation of Paneth cells in intestinal crypts. Nature Cell Biology. 7 (4), 381-386 (2005).
- van Es, J. H., et al. Dll1 marks early secretory progenitors in gut crypts that can revert to stem cells upon tissue damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- de Lau, W. B. M., Snel, B., Clevers, H. C.
- Basak, O., Beumer, J., Wiebrands, K., Seno, H., van Oudenaarden, A., Clevers, H. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).
- Beumer, J., et al. Enteroendocrine cells switch hormone expression along the crypt-to-villus BMP signalling gradient. Nature Cell Biology. 20 (8), 909-916 (2018).
- Yin, X., Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H., Langer, R., Karp, J. M. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
- Miao, Y., et al. Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo. Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Blume, L. -F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Die Pharmazie. 65 (1), 19-24 (2010).
- Lea, T. Caco-2 cell line. The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 103-111 (2015).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
