Summary
Здесь мы описываем подготовку органоидных монослоев кишечного эпителия человека для изучения кишечной барьерной функции, проницаемости и транспорта. Поскольку органоиды представляют собой оригинальный ответ эпителиальной ткани на внешние раздражители, эти модели сочетают в себе преимущества расширяемости клеточных линий и актуальность и сложность первичной ткани.
Abstract
В прошлом модельные системы эпителия кишечника были ограничены трансформированными клеточными линиями и первичной тканью. Эти модельные системы имеют присущие им ограничения, поскольку первые не точно представляют первоначальную физиологию тканей, а доступность последних ограничена. Следовательно, их применение препятствует фундаментальным исследованиям и исследованиям в области разработки лекарств. Органоиды на основе взрослых стволовых клеток (отныне называемые органоидами) представляют собой миниатюры нормальной или больной эпителиальной ткани, из которой они получены. Они могут быть установлены очень эффективно из различных областей желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), имеют долгосрочную расширяемость и имитируют специфические для тканей и пациента реакции на лечение in vitro. Здесь было продемонстрировано создание эпителиальных монослоев кишечного органоидного происхождения наряду с методами измерения целостности эпителиального барьера, проницаемости и транспорта, секреции антимикробного белка, а также гистологии. Кроме того, монослои кишечного органоидного происхождения могут быть обогащены пролиферирующими стволовыми и транзит-амплифицирующими клетками, а также ключевыми дифференцированными эпителиальными клетками. Поэтому они представляют собой модельную систему, которая может быть адаптирована для изучения воздействия соединений на клетки-мишени и способ их действия. Хотя органоидные культуры технически более требовательны, чем клеточные линии, после их создания они могут уменьшить сбои на более поздних стадиях разработки лекарств, поскольку они действительно представляют сложность эпителия in vivo и межпациентную гетерогенность.
Introduction
Эпителий кишечника действует как физический барьер между просветным содержимым кишечника и подлежащей тканью. Этот барьер содержит единый эпителиальный слой преимущественно абсорбирующих энтероцитов, которые соединены плотными соединениями, которые устанавливают прочные межклеточные связи между соседними клетками. Эти клетки образуют поляризованную эпителиальную оболочку, которая разделяет апикальную (просветную) и базолатеральную стороны кишечника, одновременно регулируя параклеточный транспорт переваренных питательных веществ и метаболитов. В дополнение к энтероцитам, другие важные эпителиальные клетки, такие как бокал, панет и энтероэндокринные клетки, также способствуют кишечному гомеостазу, производя слизь, антимикробные пептиды и гормоны соответственно. Кишечный эпителий постоянно пополняется путем деления богатых лейцином повторно содержащих G-белок 5-положительных рецепторных (LGR5+) стволовых клеток в нижней части кишечных крипт, продуцирующих транзитно-амплифицирующие (ТА) клетки, которые мигрируют вверх и дифференцируются в другие типы клеток1. Нарушение гомеостаза кишечного эпителия генетическими и экологическими факторами, такими как воздействие пищевых аллергенов, лекарственных соединений и микробных патогенов, приводит к нарушению барьерной функции кишечника. Эти состояния вызывают несколько кишечных заболеваний, включая воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), целиакию и лекарственную токсичность ЖКТ2.
Исследования кишечного эпителия проводятся с использованием нескольких платформенных систем in vitro, таких как мембранные вставки, системы органов на чипе, камеры Ussing и кишечные кольца. Эти платформы подходят для создания поляризованных эпителиальных монослоев с доступом как к апикальной, так и к базолатеральной сторонам мембраны, используя в качестве моделей трансформированные клеточные линии или первичную ткань. Хотя трансформированные клеточные линии, такие как клеточные линии колоректальной (адено)карциномы Caco-2, T84 и HT-29, способны в некоторой степени дифференцироваться в поляризованные энтероциты кишечника или клетки, продуцирующие слизь, они не являются репрезентативными для эпителия in vivo, поскольку отсутствуют несколько типов клеток, а различные рецепторы и транспортеры аберрантно экспрессируются3 . Кроме того, поскольку клеточные линии получены от одного донора, они не представляют межпациентной гетерогенности и страдают от снижения сложности и физиологической значимости. Хотя первичные ткани, используемые в камерах Ussing и в качестве кишечных колец, более репрезентативны для ситуации in vivo, их ограниченная доступность, краткосрочная жизнеспособность и отсутствие расширяемости делают их непригодными в качестве среды для исследований с высокой пропускной способностью (HT).
Органоиды представляют собой эпителиальные культуры in vitro, созданные из разных органов, таких как кишечник, почки, печень, поджелудочная железа и легкие. Доказано, что они обладают долгосрочной, стабильной расширяемостью, а также генетической и фенотипической стабильностью и поэтому являются репрезентативными биологическими миниатюрами эпителия исходного органа с верными реакциями на внешние раздражители 4,5,6,7,8,9. Органоиды эффективно устанавливаются из резецированной или биопсированной нормальной, больной, воспаленной или раковой ткани, представляя собой гетерогенные специфические для пациента ответы 10,11,12,13,14,15,16. В данной работе показано, как установить монослои эпителия кишечника, полученные из органоидных культур. Монослои были успешно установлены из тонкокишечных, а также кишечных и ректальных органоидных культур. Данная модель создает возможность для изучения транспорта и проницаемости эпителиальных клеток к лекарственным средствам, а также их токсикологического воздействия на эпителий. Более того, модель позволяет совместно культивировать с иммунными клетками и бактериями изучать их взаимодействие с эпителием кишечника 17,18,19. Кроме того, эта модель может быть использована для изучения реакций на терапию в зависимости от пациента и инициирования скрининговых усилий для поиска следующей волны эпителиальных барьерно-ориентированных терапевтических средств. Такой подход может быть распространен на клинику и проложить путь к персонализированному лечению.
Хотя эпителиальные монослои в этом протоколе получены из нормальных органоидов кишечника человека, протокол может быть применен и оптимизирован для других органоидных моделей. Эпителиальные органоидные монослои культивируют в кишечной органоидной экспансионистской среде, содержащей Wnt для поддержки пролиферации стволовых клеток и представляющей клеточный состав кишечного крипта. Кишечные органоиды могут быть обогащены, чтобы иметь различные кишечные эпителиальные судьбы, такие как энтероциты, панет, кубок и энтероэндокринные клетки, путем модуляции путей Wnt, Notch и эпидермального фактора роста (EGF). Здесь, после установления монослоев в расширительной среде, они движутся в сторону более дифференцированных эпителиальных клеток кишечника, как описано ранее 20,21,22,23,24,25. Для целей скрининга, в зависимости от способа действия интересующего соединения, его клеток-мишеней и экспериментальных условий, монослои могут быть направлены к клеточному составу выбора для измерения эффектов соединения с соответствующими функциональными показаниями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка реагентов к культуре
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги внутри шкафа биобезопасности и следуйте стандартным рекомендациям по работе с клеточными культурами. Ультрафиолетовый свет используется в течение 10 минут перед запуском шкафа биобезопасности. До и после использования поверхность шкафа биобезопасности очищается папиросной бумагой, пропитанной 70% этанолом. Чтобы облегчить образование трехмерных капель внеклеточного матрикса (ECM), держите предварительно расплавленный запас 96-, 24- и 6-луночных пластин наготове в инкубаторе при 37 °C.
- Подготовка базальной среды
- Приготовьте базальную среду (BM) в 500 мл модифицированной орлиной среды Advanced Dulbecco со средней бутылкой Ham's Nutrient Mix F-12 (Ad-DF), добавив 5 мл 200 мМ глутамина, 5 мл 1 М 4-(2-гидроксиэтил)-1пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES) и 5 мл растворов пенициллина/стрептомицина (ручка/стрептококк) (10 000 Ед/мл или 10 000 мкг/мл). Его можно хранить в холодильнике при температуре 4 °C не менее 4 недель.
- Источники Wnt
- Готовят Wnt3a-кондиционированную среду (Wnt3aCM) согласно ранее описанномуспособу 26.
ПРИМЕЧАНИЕ: Недавно был сгенерирован суррогатный Wnt следующего поколения (NGS-Wnt), который также поддерживает расширение органоидов кишечника человека,27.
- Готовят Wnt3a-кондиционированную среду (Wnt3aCM) согласно ранее описанномуспособу 26.
- Препарат кишечной органоидной основы среды
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте все факторы роста и реагенты в соответствии с рекомендациями производителя. Используйте небольшие аликвоты и избегайте циклов замораживания-оттаивания; функциональные факторы роста необходимы для успешной органоидной культуры.- Готовят концентрированную 2x кишечную органоидную базовую среду (2x IBM), добавляя BM с 1 мкМ A83-01, 2,5 мМ N-ацетилцистеина, 2x добавкой B27, 100 нг/мл эпидермального фактора роста человека (hEGF), 10 нМ гастрина, 200 нг/мл hNoggin и 100 мкг/мл антимикробного препарата для первичных клеток (см. Таблицу материалов).
- Aliquot 2x IBM и заморозить при -20 °C на срок до 4 месяцев. При необходимости разморозьте аликвоту на ночь при 4 °C или в течение нескольких часов при комнатной температуре (RT).
- Чтобы приготовить кишечную органоидную расширительную среду (IEM), добавьте 2x IBM либо 50% Wnt3aCM, либо 50% BM и 0,5 nM NGS-Wnt, 250 нг/мл человеческого Rspondin-3 (hRspo3), 10 мМ никотинамида и 10 мкМ SB202190.
- Подготовка среды дифференцировки органоидов кишечника
- Получают энтероцитарную дифференцирующую среду (eDM), добавляя 2x IBM с 50% BM, 250 нг/мл hRspo3 и 1,5 мкМ ингибитора пути Wnt (IWP-2). Хранить eDM при температуре 4 °C до 10 дней.
- Приготовьте комбинированную дифференцировочную среду (cDM), добавив 2x IBM либо 40% BM и 10% Wnt3aCM, либо 50% BM и 0,1 нМ NGS-Wnt, 250 нг/мл hRspo3, 10 мкМ DAPT и 100 нМ PD0325901. Хранить cDM при 4 °C в течение 10 дней.
- Манипуляции с внеклеточным матриксом (ECM)
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте внеклеточный матрикс (ECM) (см. Таблицу материалов) в соответствии с рекомендацией производителя.- Оттаивание ECM на ночь на льду; переложите ECM из бутылки в коническую трубку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 5 мл, обе предварительно охлажденные при -20 °C. Повторно замораживать аликвоты только один раз при -20 °C. После размораживания храните ECM в холодильнике при температуре 4 °C в течение 7 дней. Инкубировать не менее 30 мин на льду перед употреблением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Правильно смешайте ECM и убедитесь, что он холодный, прежде чем встраивать крипты или органоиды.
- Оттаивание ECM на ночь на льду; переложите ECM из бутылки в коническую трубку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 5 мл, обе предварительно охлажденные при -20 °C. Повторно замораживать аликвоты только один раз при -20 °C. После размораживания храните ECM в холодильнике при температуре 4 °C в течение 7 дней. Инкубировать не менее 30 мин на льду перед употреблением.
2. Органоидные культуры
- Создание культур из замороженных органоидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Пусть БМ достигнет RT, и держите 12 мл аликвоты, нагретой до 37 °C, готовой к началу процедуры размораживания одного криовиала, содержащего замороженные органоиды.- Быстро разморозьте органоидный криовиал, перемешивая на водяной бане с температурой 37 °C, пока не останется только кусочек льда. Немедленно добавьте 500 мкл теплого BM по каплям в криовиал и несколько раз пипетируйте вверх и вниз, чтобы разбавить морозильную среду и тщательно перемешать содержимое.
- Используя пипетку P1000, перенесите органоиды в коническую трубку объемом 15 мл и добавьте еще 1 мл теплого BM по каплям, осторожно перемешивая дно трубки. Пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы разбавить морозильную среду и тщательно перемешать содержимое.
- Добавьте до 12 мл теплого БМ по каплям в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую органоиды, и пипетируйте вверх и вниз стерильной пипеткой объемом 10 мл, чтобы мягко повторно суспендировать органоиды.
- Центрифугируют органоидную суспензию в течение 5 мин при 85 × г и 8 °C. Осторожно откажитесь от надосадочного вещества, не нарушая гранулу, и повторно суспендируйте органоиды в 30% v/v IEM, дополненного 10 мкМ Y27632 или другим rho-ассоциированным спирально-образующим ингибитором серин/треонинкиназы (ингибитор ROCK). Поместите трубку на лед.
- Добавьте 70% v/v ECM в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую органоиды. Смешайте органоидную суспензию, держа коническую трубку объемом 15 мл на льду, и посейте 5 мкл суспензии, чтобы проверить плотность (рисунок 1А). Продолжайте нанесение покрытий, если плотность соответствующая; если плотность слишком высока, добавьте больше раствора IEM/ECM в том же соотношении 30-70% v/v, соответственно.
- В каждую лунку предварительно выровненной 24-луночной пластины засевают 50 мкл органоидной суспензии путем пипетирования 5 отдельных капель по 10 мкл (рисунок 1В). Переверните тарелку вверх дном и оставьте в шкафу биобезопасности на 5 минут. Переложите пластину вверх ногами в инкубатор с температурой 37 °C и оставьте еще на 30 минут.
- Добавьте 500 мкл IEM с ингибитором ROCK 10 мкМ в каждую лунку и перенесите пластину в инкубатор. Регулярно снимайте одну каплю, чтобы контролировать рост, и обновляйте IEM каждые 2-3 дня, аспирируя старую среду и добавляя 500 мкл свежего IEM.
- Прохождение органоидов после того, как они должным образом восстановились после оттаивания и достигли нужного размера для обработки (рисунок 1С), как описано в разделе 2.2.
- Пассаж кишечных органоидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Охладите ECM на льду не менее 30 минут и держите IEM на RT не менее 1 ч перед использованием.- Используйте среду из одной культуральной скважины для разрушения органоидных куполов с помощью фильтрующего наконечника с низким удержанием 1250 мкл и перенесите содержимое скважины в меченую коническую трубку объемом 15 мл. Промойте лунку 1 мл БМ и переложите ее в ту же коническую трубку объемом 15 мл.
- Повторите шаги 2.2.1 и 2.2.2 со всеми остальными скважинами (максимум половину пластины или 600 мкл капель ECM можно промыть и добавить в одну коническую трубку объемом 15 мл).
- Добавьте BM, чтобы заполнить трубку до 12 мл, и пипетку вверх и вниз 10 раз с помощью пипетки 10 мл. Центрифуга при 85 × г в течение 5 мин при 8 °C.
- Перед удалением БМ проверьте под микроскопом, чтобы увидеть, все ли органоиды гранулированы на дне конической трубки объемом 15 мл (рисунок 1D). Если ECM не накладывается на органоидную гранулу или слой ECM либо чистый, либо содержит только мусор, одиночные клетки или очень мало органоидов по сравнению с гранулированными органоидами, аспирировать супернатант и пипетировать ECM, накладывая органоидную гранулу очень осторожно, используя пипетку P200.
ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды могут попасть в ловушку в ECM и не оседать в виде компактной гранулы из-за низкой силы центрифугирования. Если ECM содержит органоиды, центрифугируют трубку снова при 450 × г в течение 5 мин при 8 °C и осторожно удаляют супернатант, как описано в 2.2.4. При наличии нескольких конических трубок объемом 15 мл их можно объединить после шага 2.2.4. - Добавьте 1 мл БМ к каждой грануле (объемом 50-200 мкл, в зависимости от культуры органоидов и плотности) и осторожно повторно суспендируйте. Пипетируйте органоиды вверх и вниз по крайней мере в 5 раз, чтобы срезать их, избегая образования пены. Проверьте под микроскопом, чтобы увидеть, не нарушены ли органоиды (рисунок 2A). Если органоиды нарушены, перейдите к шагу 2.2.7; если органоиды не нарушены, пипетируйте их еще в 5 раз. На этот раз коснитесь стенки пластиковой трубки наконечником пипетки, чтобы приложить больше механической силы, чтобы нарушить работу органоидов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Механическая сдвиг кистозных (рисунок 1С) и почковых (рисунок 1Е) органоидов возможна с помощью пластикового наконечника пипетки объемом 200 мкл или 10 мкл, установленного на фильтрующем наконечнике с низким удержанием 1250 мкл (рисунок 1F), в зависимости от объема, необходимого для разрушения органоидов. Использование суженной стеклянной пипетки (рисунок 1F) рекомендуется при переработке более 200 мкл ECM, содержащего органоиды (одна скважина из 6-луночной пластины или 4 скважины из 24-луночной пластины). - Проверьте под микроскопом еще раз, чтобы увидеть, не нарушены ли органоиды. Если это нарушено, перейдите к следующему шагу; если нет, пипетируйте органоиды до 20x, регулярно проверяя органоиды под микроскопом. Если органоиды все еще не нарушены, добавьте 25% v/v реагент диссоциации клеток 1 (см. Таблицу материалов) к суспензии, инкубируйте на водяной бане при 37 °C в течение 2 мин и пипетируйте органоиды до 20x, регулярно проверяя органоиды под микроскопом, чтобы убедиться, что они не перевариваются в отдельные клетки.
- Добавьте до 12 мл БМ в коническую трубку объемом 15 мл и промыте органоидную гранулу путем пипетки вверх и вниз. Центрифуга при 85 × г в течение 5 мин при 8 °C. Откажитесь от супернатанта и отрегулируйте конечную концентрацию до 70% v/v ECM, добавив IEM и ECM к органоидной грануле.
- Начните повторное использование органоидной гранулы с удвоенным объемом IEM/ ECM, собранным для пассирования, и посейте 5 мкл суспензии, чтобы проверить плотность. Продолжайте покрытие, если плотность соответствующая (рисунок 2B); добавить больше раствора IEM/ECM, если плотность слишком высока. Добавьте 200 мкл суспензии в каждую лунку предварительно выровненной 6-луночной пластины, сделав отдельные капли объемом 10 мкл.
- Переверните тарелку вверх дном и оставьте в шкафу биобезопасности на 5 минут. Переложите пластину вверх ногами в инкубатор с температурой 37 °C, оставив ее еще на 30 минут. Добавьте 2 мл IEM с ингибитором ROCK 10 мкМ в каждую лунку и перенесите пластину в инкубатор.
- Регулярно снимайте одну каплю, чтобы контролировать рост, и обновляйте IEM каждые 2-3 дня, аспирируя старую среду и добавляя 2 мл свежего IEM.
- Пассаж кишечных органоидов для получения эпителиального монослоя
- Проход органоидов за 3 дня до забора для однослойной подготовки путем соблюдения того же протокола прохождения, описанного в разделе 2.2, за одним исключением. На этапе 2.2.7 повторно суспендируют органоиды в 1-1,5 раза больше начального объема IEM/ECM, чтобы они имели более высокую плотность и потенциал расширения при их сборе для однослойного приготовления (рисунок 3A).
3. Эпителиальный монослойный препарат
- Культивирование эпителиальных монослоев как на 24-луночных, так и на 96-луночных мембранных вставках с различными доступными типами пластин (табл. 1). Используйте мембранные вставки с высокопроизводительной системой (HTS) для обоих размеров, поскольку они содержат встроенный лоток с мембранными вставками и приемную пластину. Для 24-луночного формата также возможно использование пластин с отдельными съемными мембранными вставками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Доступны различные типы мембран (полиэтилентерефталат (ПЭТ) или поликарбонат) и размеры пор (0,4-8,0 мкм), которые могут использоваться в зависимости от экспериментальных потребностей. Монослои могут быть изображены brightfield только при использовании вставок с ПЭТ-мембранами. Светонепроницаемые мембраны блокируют утечку флуоресцентного света из апикального в базолатеральный отсек и могут быть рассмотрены при изучении динамического переноса или проницаемости флуоресцентно меченых подложек. Текущий протокол использует 24-луночные мембранные вставки; адаптации для мембранных вставок из 96 скважин описаны в разделе 5. В зависимости от плотности, морфологии и размера органоидов (рисунок 3А) для посева полной 24-луночной пластины мембранных вставок достаточно 6-луночной пластины (как посеяно в разделе 2.3). - Покрытие мембранных вставок ECM
ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть сомнения в наличии достаточного количества клеток, покройте вставки после подсчета клеток. Это делается для предотвращения ненужного покрытия и потери дорогостоящих мембранных вставок.- Поместите мембранные вставки в опорную пластину в шкафу биобезопасности. Разбавьте ECM 40x в ледяном фосфатно-буферном физиологическом растворе Dulbecco (DPBS) с Ca2+ и Mg2+ и пипетируйте 150 мкл разбавленного ECM в апикальный отсек каждой вставки. Инкубировать пластину при 37 °C в течение не менее 1 ч.
- Подготовка клеток к посеву
- Предваренные аликвоты клеточного диссоциации реагента 2 на водяной бане (37 °C). Подготовьте 2 мл реагента для каждой лунки 6-луночной пластины.
- Перенесите культуральную пластину, содержащую органоиды (подготовленную в разделе 2.3), из инкубатора в шкаф биобезопасности. Обработать органоиды, как описано на этапах 2.2.1.-2.2.4. Не объединяйте несколько трубок в одну.
- Заполните трубку, содержащую органоиды, максимум из 3 лунок 6-луночной пластины, до 12 мл DPBS (без Ca2+ и Mg2+), и пипетку вверх и вниз 10x с помощью пипетки 10 мл. Центрифугу при 85 × г в течение 5 мин при 8 °С и аспирируют супернатант, не нарушая органоидную гранулу.
- Добавьте 2 мл предварительного реагента диссоциации клеток 2 на лунку 6-луночной пластины, используемой в качестве исходного материала, и повторно суспендируйте. Инкубируют трубки по диагонали или горизонтально в течение 5 мин на водяной бане при 37 °C, чтобы предотвратить погружение органоидов на дно трубки.
- Пипетка вверх и вниз 10x с использованием 5 мл стерильной пластиковой пипетки или пипетки P1000, в зависимости от общего объема реагента диссоциации клеток. Проверьте органоидную суспензию под микроскопом, чтобы увидеть, образовалась ли смесь одиночных клеток и некоторых клеточных сгустков, состоящих из 2-4 клеток (рисунок 3B). При необходимости продолжайте пищеварение, повторяя шаги 3.3.4-3.3.5 (не увеличивайте объем реагента диссоциации клеток) до тех пор, пока смесь не будет выглядеть аналогично рисунку 3B.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте переваривания органоидов полностью в отдельные клетки. Необходимо иметь несколько небольших групп клеток (т.е. группы по 2-4 клетки). - Остановить диссоциацию клеток путем добавления до 12 мл БМ, включая ингибитор ROCK 10 мкМ , в клеточную суспензию. Центрифугу при 450 × г в течение 5 мин при 8 °C и аспирируют супернатант, не нарушая клеточную гранулу. При обработке одной и той же органоидной культуры в нескольких конических трубках по 15 мл объединяют гранулы клеток и повторно суспендируют их в 12 мл БМ.
- Отфильтруйте клеточную суспензию через ситечко 40 мкм, предварительно смазанное BM, и соберите проточную трубу в коническую трубку объемом 50 мл. Промыть сетчатый фильтр 10 мл БМ и собрать проточную трубу в ту же коническую трубку объемом 50 мл.
- Перенесите суспензию процеженной клетки в две новые конические трубки объемом 15 мл. Центрифуга при 450 × г в течение 5 мин при 8 °C и аспирация супернатанта, не нарушая клеточную гранулу. Повторное суспендирование клеток в 4 мл IEM, дополненных ингибитором ROCK 10 мкМ на полную культуральную пластину, используемую в качестве исходного материала.
- Смешайте небольшое количество клеточной суспензии в соотношении 1:1 с трипан-синим для подсчета. Подсчитайте живые, а не синие ячейки (рисунок 3C) и рассчитайте общее количество живых клеток. В небольших скоплениях подсчитайте каждую отдельную клетку.
- Готовят клеточную суспензию, содержащую 3 × 106 живых клеток на мл IEM, дополненную ингибитором ROCK 10 мкМ.
- Посевные ячейки на полиэфирных мембранных вставках
- Тщательно аспирируйте DPBS из вкладышей с покрытием ECM (этап 3.2.1), сохраняя пластину горизонтально. Пипет 800 мкл IEM, дополненный ингибитором ROCK, в каждый базолатеральный компартмент. Пипетка 150 мкл клеточной суспензии, приготовленной на стадии 3.3.10, на мембрану с покрытием ECM в апикальном отсеке по каплям. На каждую пластину обязательно приходится хотя бы один «пустой» колодец только с БМ.
- После того, как клетки оседают на мембране, измерьте трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER), как описано в разделе 4.1, и визуализируйте мембранные вставки с помощью микроскопа. Поместите пластину в инкубатор при 37 °C и 5% CO2. Измеряйте TEER каждый день и регулярно получайте изображения для мониторинга образования монослоя (рисунок 4A-D).
- Освежающие монослои
ПРИМЕЧАНИЕ: Обновляйте среду каждые 2-3 дня, придерживаясь следующего порядка, чтобы поддерживать положительное гидростатическое давление над клетками и предотвращать выталкивание клеток из мембраны. Освежая среду, убедитесь, что монослой, который виден при аспирации среды, не поврежден кончиком пипетки.- Удалите среду из базолатеральных отсеков пластины, содержащей мембранные вставки. Затем осторожно аспирировать среду из апикальных отсеков мембранных вставок.
- Добавьте 150 мкл свежего IEM по каплям в каждый апикальный отсек, а затем добавьте 800 мкл свежего IEM в каждый базолатеральный отсек.
- Обогащение монослоя для желаемых типов эпителиальных клеток кишечника
- Позвольте монослою влиться в IEM, что соответствует значению TEER около 100 Ω·см² (как рассчитано на этапе 4.1.1.4). Проверьте под микроскопом, чтобы определить, полностью ли образовались монослои (рисунок 4D) и на отсутствие отверстий (как показано на рисунке 4B, C).
- Осторожно удалите IEM из базолатерального и апикального отсеков мембранных вставок и замените их либо eDM, либо cDM, как подготовлено в разделе 1.4. Культивируйте монослой еще 3-4 дня в специфической среде дифференцировки, чтобы органоидные клетки обогащались желаемым конкретным типом клеток. Обновляйте среду каждые 2-3 дня, как описано в разделе 3.4.
- Ежедневно измеряйте TEER и при желании регулярно получайте изображения (рисунок 5A-C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Значение TEER, указывающее на полностью организованный обогащенный монослой, варьируется в зависимости от культуры органоидов; Обычно значения TEER увеличиваются до 600 и могут увеличиваться до 1000 Ω·см2 (как рассчитано на шаге 4.1.1.4) через 3 дня в дифференцировочных средах и стабильны в течение 3-5 дней.
4. Показания эпителиального монослоя
- Измерение трансэпителиального электрического сопротивления (TEER)
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения TEER широко приняты в качестве метода анализа динамики плотных соединений и целостности барьерной функции в биологических моделях физиологических барьеров, таких как эпителиальные монослои28,29. Увеличение TEER после дифференциации из-за повышенного клеточного взаимодействия в плотных соединениях может быть измерено с помощью ручного измерителя TEER или автоматизированного измерительного робота TEER.- Измерение TEER с помощью ручного измерителя TEER
- Очистите электрод 70% этанолом и дайте ему высохнуть на воздухе внутри шкафа биобезопасности. Поместите электрод в трубку, содержащую BM. Подключите электрод к ручному измерителю TEER. Поверните переключатель Function для измерения в Омах (Ω). Включите выключатель питания .
- Поместите короткий электрод в апикальный отсек вставки, а длинный электрод расположен в базолатеральном отсеке (рисунок 6А). Избегайте прикосновения к монослою.
- Измерьте сопротивление в пустой скважине (Rblank), а затем измерьте оставшиеся образцы (R sample) таким же образом. Промывайте электрод с БМ между образцами с различными условиями. Очистите электрод сначала полуводой, а затем 70% этанолом и дайте ему высохнуть на воздухе.
- Расчет TEER (Ω·см2): [образец R (Ω) -R бланк (Ω)] × площадь мембраны (см2) (таблица 1 и рисунок 6B).
- Измерение TEER с помощью автоматизированного измерительного робота TEER (Таблица материалов)
- Выполнение автоматизированных измерений TEER при использовании систем HTS для плит HTS с 96 и 24 скважинами, содержащими мембранные вставки. Используйте различные электроды для измерения TEER для обоих типов (мембранные вставки 24- и 96-HTS). Чтобы измерить TEER с помощью автоматизированного измерительного робота TEER, следуйте инструкциям производителя.
- Измерение TEER с помощью ручного измерителя TEER
- Измерение целостности и проницаемости эпителиального барьера
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол вводит люциферово-желтую проницаемость от апикального к базолатеральному компартменту в качестве показателя целостности монослоя. В этом разделе описывается измерение флуоресценции в базолатеральном компартменте после стадии инкубации 1 ч для оценки монослойной проницаемости и, следовательно, барьерной целостности. Это измерение является анализом конечной точки и особенно полезно при тестировании соединений на предмет их влияния на целостность барьера.- Разморозьте Люцифера Желтого на льду, и пусть БМ уравновесится до RT. Для одной 24-луночной пластины мембранных вставок готовят 5 мл рабочего раствора 60 мкМ Люцифера Желтого в БМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Люцифер Желтый светочувствительный. Подготовьте разведения в темных стерильных пробирках объемом 1,5 мл и выполните все этапы с выключенным светом шкафа биобезопасности. - Осторожно удалите среду из базолатерального и апикального отсеков мембранных вставок, как описано на этапе 3.5.1. При желании поцарапайте один необработанный монослой, используя наконечник пипетки в качестве положительного контроля утечки Люцифера Желтого через поврежденный барьер.
- Добавьте 150 мкл БМ с 60 мкМ Люцифера Желтого в каждый апикальный отсек и добавьте 800 мкл БМ без Люцифера Желтого в каждый базолатеральный отсек. Поместите пластину на шейкер при температуре 37 °C, 50 об/мин в течение 60 мин.
- Тем временем подготовьте стандартную кривую люциферного желтого цвета в БМ, начиная с рабочего раствора, приготовленного на этапе 4.2.1. Разбавляйте 1:3 на каждой стадии до тех пор, пока не будет достигнута концентрация 3 нМ. Включите отрицательный контроль (только БМ).
- Переложите 100 мкл каждого стандарта в трех экземплярах на 96-луночную прозрачную пластину. После 60 мин инкубации извлекают мембранные вставки и переносят 100 мкл из каждого базолатерального колодца (этап 4.2.3) в три раза в 96-луночную прозрачную пластину. Измерьте флуоресценцию пластины с помощью считывателя пластин при длине волны возбуждения 430 нм и длине волны излучения 530 нм.
- После корректировки отрицательного контрольного значения (только BM) используйте стандартные значения кривой для расчета концентрации Люцифера Желтого в базолатеральном отсеке (концентрация конечного приемника (мкМ)).
- Рассчитайте коэффициент кажущейся проницаемости (приложение P) по следующей формуле (рисунок 6C):
- Для 24-луночной пластины, содержащей мембранные вставки, используйте следующую формулу:
- Разморозьте Люцифера Желтого на льду, и пусть БМ уравновесится до RT. Для одной 24-луночной пластины мембранных вставок готовят 5 мл рабочего раствора 60 мкМ Люцифера Желтого в БМ.
- Фиксация монослоев и подготовка парафиновых блоков к гистологии
ПРИМЕЧАНИЕ: Эпителиальные монослои могут быть использованы для гистологического окрашивания для оценки их клеточного состава, полярности и экспрессии различных белков, представляющих интерес, таких как соединительные белки, маркеры пролиферации или дифференцировки. В этом разделе описывается подготовка парафинового блока к гистологическому окрашиванию.- Осторожно удалите среду из базолатерального и апикального отсеков мембранных вставок, как описано в шагах 3.5.1.
- Промывайте монослои, добавляя 150 мкл DPBS (без Ca2+ и Mg2+) в каждый апикальный отсек и 800 мкл в каждый базолатеральный отсек. Осторожно аспирируйте DPBS снова, сначала из базолатерального отсека, а затем из апикального отсека.
ПРИМЕЧАНИЕ: Базолатеральный отсек будет оставаться пустым с этого шага. - В вытяжной капюшон добавляют 150 мкл 4% параформальдегида в каждый апикальный отсек и инкубируют в течение 30 мин при РТ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого шага, выполните все действия в этом разделе внутри вытяжного шкафа, так как параформальдегид токсичен. - Осторожно аспирируйте фиксатор из апикальных отсеков мембранных вставок и утилизируйте его как жидкие галогенные отходы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого шага, утилизируйте все жидкие отходы как жидкие галогенные отходы. - Вымойте монослои, добавив 200 мкл DPBS (без Ca2+ и Mg2+) в каждый апикальный отсек, и снова осторожно аспирируйте DPBS. Повторите этот шаг еще раз.
- Добавьте 200 мкл 25% этилового спирта (EtOH) в каждый апикальный отсек и инкубируйте в течение 15 мин при RT. Через 15 мин осторожно аспирировать 25% EtOH из апикальных отсеков мембранных вставок. Повторить с 50% раствором EtOH и впоследствии с 70% раствором EtOH.
- Добавьте 200 мкл 70% EtOH в каждый апикальный отсек и оберните пластину парапленкой. Храните при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
- Осторожно аспирируйте 70% EtOH и используйте скальпель, чтобы аккуратно вырезать однослойные мембраны из вставок. Вырезать с базолатеральной стороны, по краю вставки.
- Подготовьте парафиновые блоки, следуя стандартной процедуре.
- Когда парафин еще теплый, возьмите монослой из парафина пинцетом и поместите его на предварительно охлажденную поверхность.
- Будьте осторожны, чтобы не повредить монослой. Разрежьте монослой пополам с помощью лезвия с одним краем.
- Когда парафин в нижней части кассеты начнет затвердевать, используйте нагретый пинцет, чтобы поместить две монослойные части в парафин, рядом друг с другом прямой стороной вниз и в вертикальном направлении, чтобы гарантировать, что монослой будет вертикальным в купе.
- Когда парафиновые блоки будут готовы, вырежьте блоки с помощью микротома и сделайте слайды из секций толщиной 4 мкм в соответствии со стандартной процедурой. Убедитесь, что монослои оказываются вертикальными в купе.
- Выполняют гистологические окрашивания, как описано ранее 7,9. Используйте гематоксилин и эозин (H & E), Ki67, муцин-2 (MUC2) и Alcian Blue, чтобы показать общую морфологию, пролиферативные клетки, производство слизи и бокаловидные клетки соответственно (рисунок 6E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Также могут использоваться дополнительные маркеры дифференцировки, такие как лизоцим для клеток Paneth. Этот маркер не представлен на рисунке 6E , поскольку клетки Панета присутствуют в эпителии тонкого кишечника, а не в эпителии толстой кишки.
- Измерение секретируемого белка в среде супернатанта
- Измерьте уровни лизоцима в апикальном супернатанте подвздошных монослоев (см. Рисунок 6D) с помощью набора, указанного в Таблице материалов. При желании измерьте уровни различных цитокинов и других интересующих белков.
- Анализ экспрессии генов
- Количественная оценка влияния дифференцировочных сред на экспрессию генов эпителиальных клеточных маркеров с помощью количественной обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (qRT-PCR).
- Лизируйте монослои в 350 мкл буфера лизиса РНК с последующей изоляцией РНК в соответствии с инструкциями производителя. Выполняют синтез кДНК и qPCR, как описано ранее 7,9, используя наборы синтеза кДНК, мастер-микс и олигонуклеотиды, перечисленные в Таблице материалов.
- Количественная оценка влияния дифференцировочных сред на экспрессию генов эпителиальных клеточных маркеров с помощью количественной обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (qRT-PCR).
5. Масштабирование до 96-луночных пластин, содержащих мембранные вставки
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте эпителиальные монослои для скрининга лекарств с более высокой пропускной способностью или множественных средовых условий с использованием пластин HTS 96-луночных отверстий, содержащих мембранные вставки.
- Адаптации при подготовке монослоев в 96-луночном формате
- Выполните все шаги, описанные в этом протоколе для 24-луночных пластин, содержащих мембранные вставки, изменив объемы и номера ячеек на те, которые описаны в таблице 1. Для приготовления монослоев на 96-луночных пластинах с мембранными вставками действуйте так, как описано в разделе 3 со следующими отличиями.
- Приблизительно 9 лунок 6-луночной культуральной пластины с плотностью органоидов, представленной на рисунке 3А , необходимы для засева полной 96-луночной пластины мембранными вставками. На этапе 3.2.1 предварительно покрывали мембраны 67 мкл 40x разбавленного ECM в DPBS (с Ca2+ и Mg2+).
- В разделе 3.5 сначала перенесите интегральную пластину мембранных вставок на другую 96-луночную пластину, чтобы обеспечить среднее освежение как апикального, так и базолатерального отсеков.
- Выполните все шаги, описанные в этом протоколе для 24-луночных пластин, содержащих мембранные вставки, изменив объемы и номера ячеек на те, которые описаны в таблице 1. Для приготовления монослоев на 96-луночных пластинах с мембранными вставками действуйте так, как описано в разделе 3 со следующими отличиями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1А показано репрезентативное яркое изображение органоидов кишечника после их размораживания от криовиала. Важно размораживать органоиды при высокой плотности, чтобы обеспечить оптимальное восстановление. Органоиды покрыты 24- или 6-луночными пластинами в куполах ECM приблизительно 10 мкл (рисунок 1B). Большинство нормальных кишечных органоидов имеют кистозную морфологию. После восстановления после процесса оттаивания органоиды вырастают до большего размера и готовы к прохождению через 3-7 дней в зависимости от культуры органоидов (рисунок 1С). После извлечения органоидов и смывания ECM (рисунок 1D) органоиды могут быть разрушены до небольшого размера механическим сдвигом. В зависимости от морфологии органоидов ( кистозный рисунок 1С, почковый рисунок 1Е), органоиды могут быть разрушены с помощью пластиковых или стеклянных пипеток (рисунок 1F). Органоиды разрушаются в суспензии (рисунок 2А), которую следует регулярно контролировать под микроскопом. Важно не делать их слишком маленькими, так как группы клеток должны оставаться вместе, чтобы обеспечить рост органоидов. На рисунке 2B показаны органоиды в ECM падает сразу после пассирования. В целом, кистозные органоиды покрыты относительно высокой плотностью, в то время как почковые органоиды покрыты низкой плотностью; однако это может отличаться между различными органоидными культурами.
При прохождении органоидов для приготовления монослоев обязательно наклейте их на высокую плотность, и дайте им расти в течение трех дней, чтобы они находились в оптимальных условиях расширения. Органоиды могут быть извлечены для однослойной подготовки, когда они сопоставимы с Фиг.3А по размеру и плотности, где 6 лунок 6-луночной пластины, каждая из которых содержит 200 мкл органоидных куполов, обычно достаточно для посева полной 24-луночной пластины мембранных вставок. После приготовления одноклеточной суспензии с реагентом диссоциации клеток должны быть видны одиночные клетки и небольшие скопления клеток (рисунок 3В), а также можно подсчитать живые клетки (рисунок 3С). Стрелками обозначены мертвые клетки, окрашенные трипан-синим цветом, которые следует исключить из подсчета. Одиночные клетки и небольшие сгустки затем засеваются в мембранные вставки, как показано на рисунке 4А. Образование монослоя видно через 1-3 дня (рисунок 4B,C), а монослои, как правило, будут сливаться через 3-6 дней в зависимости от органоидной культуры (рисунок 4D). Монослои остаются в расширительной среде до тех пор, пока они не сольются, после чего они могут быть обогащены, среди прочего, энтероцитами или бокаловидными клетками с использованием различных сред обогащения. На рисунке 5А показан монослой, который культивировали в течение 8 дней в среде расширения (IEM). При обогащении энтероцитами (eDM) видна структура, как на рисунке 5B, в то время как монослои, подвергшиеся воздействию комбинированной среды (cDM), показывают более гладкую структуру (рисунок 5C).
За формированием монослоя можно количественно следить путем измерения TEER (рисунок 6A). Полностью сливающийся монослой имеет значение TEER ~100 Ω·см2, которое увеличивается до ~1000 Ω·см2 при воздействии любой дифференцирующей среды (рисунок 6B). Монослои во всех средних условиях показывают низкую кажущуюся проницаемость (приложение P) до Люцифера Желтого (0,45 кДа). Секреция лизоцима подвздошными монослоями, культивируемыми в IEM, была выше, чем у монослоев, культивируемых в IEM до слияния и в течение еще 4 дней в eDM или cDM (обозначается как + последующий eDM или cDM) (рисунок 6D). Монослои, культивируемые в IEM, IEM + последующие eDM или IEM + последующие cDM, показывают различную морфологию, что можно наблюдать при окрашивании H&E (рисунок 6E). В то время как эпителиальные монослои, полученные из органоидов толстой кишки в средах IEM и cDM, имеют гладкую апикальную поверхность, энтероцитарно-дифференцированные монослои представляют собой инвагинированную апикальную морфологию в отсутствие Wnt. Ki67-положительные пролиферативные клетки могут быть обнаружены только в условиях расширения. Алциановая синяя и MUC2 окрашивающая слизь, продуцируемая бокаловидными клетками, которая визуализируется в монослоях, дифференцированных в eDM и более заметно в cDM, когда сигнализация Wnt, Notch и EGF ингибируется соответственно (рисунок 6E). После дифференцировки пролиферативные клетки уменьшаются, в то время как экспрессия генов маркеров бокалок и энтероцитарных маркеров увеличивается по сравнению с тем, что наблюдается в условиях IEM, как показано количественной оценкой экспрессии генов LGR5, MUC2 и ALPI с помощью qRT-PCR, соответственно (рисунок 6F).
Рисунок 1: Создание культуры органоидов кишечника из замороженных органоидов. (А) Репрезентативное изображение культуры органоидов кишечника после оттаивания. (B) Купола ECM (50 мкл), засеянные в каждой скважине 24-луночной культуральной плиты. (C) Репрезентативное изображение нормальной кишечной органоидной культуры, готовой к прохождению. (D) Репрезентативное изображение того, как проверить наличие ECM в 15-мл трубке, содержащей органоиды, под световым микроскопом. (E) Репрезентативное изображение почки кишечной органоидной культуры, готовой к пассированию. (F) Пластиковый наконечник пипетки объемом 10 мкл, установленный на наконечнике фильтра с низким уровнем удержания 1250 мкл (слева) и суженной стеклянной пипетке (справа) для механической резки органоидов. Шкала стержней = 100 мкм. Аббревиатура: ECM = внеклеточный матрикс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Обработка кишечных органоидов для поддержания или получения монослоев. (А) Репрезентативное изображение органоидов кишечника после механического нарушения. (B) Репрезентативное изображение кишечной органоидной культуры, посеянной после пассирования. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Подготовка одиночных клеток из кишечных органоидов для однослойного приготовления. (А) Органоиды кишечника, готовые к сбору для однослойного приготовления. (B) Одиночные клетки и небольшие скопления клеток после одноклеточной подготовки. (C) Видимые одиночные ячейки и небольшие скопления во время подсчета в сетчатой камере. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Образование монослоя после посева одиночных клеток на мембраны. (А) Одиночные клетки сразу после посева на мембраны. В среднем, (B) монослой составляет около 50% слива через 1-3 дня после посева, (C) ~ 90% сливается на 3-5 день, и (D) полный монослой сформировался примерно на 4-7 день. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Обогащение определенных типов клеток в монослое. (А) Монослой через 8 дней в ИЭМ. (B) Монослой, обогащенный энтероцитами через 4 дня в IEM и еще 4 дня в eDM. (C) Монослой, обогащенный бокаловидными клетками и другими типами клеток через 4 дня в IEM и еще 4 дня в cDM. Шкала стержней = 100 мкм. Сокращения: IEM = среда расширения органоидов кишечника; eDM = среда дифференцировки энтероцитов; cDM = комбинированная дифференцирующая среда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Различные возможные показания с использованием эпителиальных органоидных монослоев. (А) Электрод в мембранной вставке для измерения TEER. (B) Значения TEER увеличиваются во времени со значением ~100 Ω·см2 , когда монослой достигает слияния. После обогащения монослоев энтероцитами или комбинацией различных эпителиальных клеток TEER увеличивается до 1000 Ω·см2 и выше. (C) Монослои во всех средних условиях (IEM + 4 дня IEM/eDM/cDM) непроницаемы для Люцифера Желтого. (D) Экспрессия лизоцима выше в монослоях подвздошной кишки при выращивании в расширительной среде, чем в любом типе дифференцирующей среды (IEM + 4 дня IEM/eDM/cDM). (E) Монослои толстой кишки показывают различную морфологию при воздействии различных условий среды (IEM + 4 дня IEM / eDM / cDM), как визуализируется пятнами H & E, Ki67, Alcian Blue и MUC2. Как и ожидалось, монослои, культивируемые в среде расширения, очень пролиферативны, как показано окрашиванием Ki67. Монослои, дифференцированные с помощью eDM, показывают столбчатый эпителий без пролиферативных клеток. Монослои, подвергшиеся воздействию хДМ, также не являются пролиферативными и развивают больше бокаловидных клеток. Шкала bar = 100 мкм. (F) стволовых клеток (LGR5), кубковых клеток (MUC2) и экспрессии маркеров энтероцитов (ALPI) в монослоях толстой кишки с помощью qRT-PCR. Сокращения: TEER = трансэпителиальное электрическое сопротивление; IEM = среда расширения органоидов кишечника; eDM = среда дифференцировки энтероцитов; cDM = комбинированная дифференцирующая среда; Papp = кажущийся коэффициент проницаемости; LGR5 = богатый лейцином повторно содержащий G-белок рецептор 5; H&E = гематоксилин и эозин; AB = Алциан синий; MUC2 = муцин-2; ALPI = кишечная щелочная фосфатаза; qRT-PCR = количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Мембранные вставки | ||
| Плиты с 24 скважинами | Плиты на 96 скважин | |
| Поверхность мембраны (см2) | 0.33 | 0.143 |
| Апикальный объем (мкл) | 150 | 100 |
| Базолатеральный объем (мкл) | 800 | 300 |
| # Клетки для посева в лунку | 450,000 | 200,000 |
| Пластины HTS с мембранными вставками | ДОМАШНЕЕ ЖИВОТНОЕ | ДОМАШНЕЕ ЖИВОТНОЕ |
| Пластины с отдельными вставками | ДОМАШНЕЕ ЖИВОТНОЕ | Н.А. |
| Светонепроницаемые пластины с мембранными вставками | ||
| Электроды различны для двух форматов | Обратитесь к таблице материалов | |
Таблица 1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает общие манипуляции и поддержание кишечных органоидов, а также приготовление и возможное применение эпителиальных монослоев, полученных из этих органоидов. На сегодняшний день монослои успешно получены из двенадцатиперстной кишки, подвздошной кишки и различных областей органоидов толстой кишки, полученных из нормальной, а также ранее и активно воспаленной кишечной ткани (неопубликованные данные). Применение органоидных монослоев, полученных от пациента, облегчает изучение барьерной функции в зависимости от заболевания и пациента, а также изучение специфических реакций пациента на различные лекарственные препараты. Хотя клеточные линии могут образовывать дифференцированные и поляризованные монослои, содержащие кишечные энтероциты и бокалоподобные клетки, многие различные ферменты и транспортеры аберрантно экспрессируются в этих клеточных линиях, что приводит к снижению сложности и физиологической значимости 3,30. Органоидная культура технически более требовательна и трудоемка, чем клеточная культура; однако органоиды более репрезентативны для ситуации in vivo, тогда как клеточные линии неоднократно не представляли тканевые реакции в сложных установках.
Хотя модели, основанные на первичных тканях, могут быть репрезентативными для in vivo,они требуют использования подопытных животных или доступа к человеческому материалу, что связано с ограниченной доступностью и этическими ограничениями. Кроме того, первичная ткань не имеет или ограничена расширяемостью и не стабильна в течение длительных экспериментальных временных рамок. Органоидная технология требует ограниченного количества первичной ткани для создания генетически и физиологически стабильных долгосрочных расширяющихся культур, в то же время представляя сложность эпителиальной ткани и гетерогенность пациента. Различные клеточные линии, такие как Caco-2, часто используются для приготовления эпителиальных монослоев. Клеткам Како-2 требуется 21 день, чтобы установить поляризованный эпителиальный монослой, который можно использовать для любого эксперимента30. Органоидные эпителиальные монослои получают из органоидных одиночных клеток, как описано в настоящем протоколе, и через 3-6 дней образуют поляризованный эпителий, который можно дополнительно дифференцировать, чтобы обогатить их энтероцитами или бокаловидными клетками.
Монослои представляют собой статическую модель, в которой отсутствует микрофлюидный поток или механическое растяжение, как это видно на примере органов на чипе. Тем не менее, они предлагают возможность совместного культивирования с (аутологичными) иммунными клетками, а также бактериями или паразитами 17,18,19,31. Органоиды подходят для однослойного приготовления, когда они находятся в фазе расширения; для органоидов кишечника это обычно через 3 дня после пассирования. Диссоциация органоидов на отдельные клетки должна выполняться быстро, чтобы избежать длительного воздействия пищеварительных ферментов. Для повышения выживаемости стволовых клеток после приготовления одноклеточной суспензии к клеткам добавляют Rho-ассоциированный ингибитор протеинкиназы (ингибитор ROCK), Y27632, чтобы предотвратить гибель клеток, вызванную аноикисом32. Кроме того, крайне важно культивировать монослои на мембране, предварительно покрытой ECM, чтобы гарантировать, что они сохраняют свои органоидные характеристики и поляризацию. Для функциональных скрининговых анализов, которые количественно определяют реакцию эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта на внешние раздражители, важно, чтобы органоидные культуры представляли требуемую клеточную сложность в зависимости от типа анализа, который должен быть разработан, и возможных показаний.
Кишечные органоиды представляют собой различные типы эпителиальных клеток, присутствующих in vivo, такие как стволовые, ТА, энтероцитарные, панетовые, бокалистые и энтероэндокринные клетки 4,5, и получают и поддерживают с использованием определенной органоидной среды, приготовленной, как описано в настоящем протоколе. Дифференцировке энтероцитов может способствовать культивирование органоидов в течение дополнительных четырех дней с использованием условий культивирования, которые дуально ингибируют путь Wnt, путем удаления молекул / активаторов Wnt и добавления ингибитора Дикобраза, IWP-2 (среда дифференцировки толстой кишки энтероцитов, eDM). Поскольку бокал-клетки, продуцирующие слизь, также необходимы для гомеостаза барьерной функции, второе условие культуры направлено на получение более гетерогенной популяции клеток, содержащей стволовые, энтероцитарные и бокаловидные клетки, в которых пути Notch и EGF ингибируются, в то время как передача Wnt сохраняется частично активной путем снижения Wnt3aCM до 10% (или 0,1 нМ для NGS-Wnt) вместо 50% (0,5 нМ NGS-Wnt), используемого в IEM. В отличие от eDM, который обогащает дифференцировку энтероцитов, это второе условие поддерживает наличие нескольких типов клеток и поэтому называется комбинированной дифференцировочной средой (cDM).
Применение монослоев органоидного происхождения включает мониторинг целостности эпителиального барьера, а также изучение плотного соединения и экспрессии транспортера. Целостность барьера, проницаемость и транспорт могут быть проанализированы с использованием показаний, введенных в этом протоколе. В то время как TEER измеряет ионную проводимость через плотные соединения, анализ проницаемости измеряет поток воды и, следовательно, параклеточную проницаемость через плотные соединения28,29. Целостность эпителиального барьера, проницаемость и транспортную функциональность монослоев могут быть оценены путем измерения движения различных флуоресцентных или радиоактивных субстратов через апикальные и базолатеральные отсеки мембранных вставок. Измерения TEER позволяют количественно оценить целостность барьера, показывая увеличение значений при дифференцировке в сторону поляризованных энтероцитов и бокаловидных клеток и снижение после индуцирования повреждения монослоев.
Анализ проницаемости Люцифера Желтого может быть использован для первоначальной оценки целостности барьера, а также для подтверждения сниженной целостности после повреждения монослоев. Этот протокол вводит люциферовую проницаемость от апикального к базолатеральному компартменту как признак целостности монослоя. Аналогичным образом, другие флуоресцентно меченые реагенты, такие как декстран 4 или 40 кДа, могут быть использованы для оценки повышенной параклеточной проницаемости в результате агентов, вызывающих повреждение барьера. Флуоресцентно меченые субстраты, такие как родамин 123, могут быть использованы для измерения активности различных транспортеров, таких как P-гликопротеин-1. Флуоресцентный анализ, описанный в этом протоколе, позволяет измерять уровни белков, таких как лизоцим, которые секретируются в апикальный компартмент. Реакции на индукцию повреждения провоспалительными цитокинами могут быть измерены с помощью этих показаний, а также потенциальные эффекты восстанавливающих барьер соединений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health ~ Holland (LSH-TKI) государственно-частное партнерство (PPP) голландского сектора LSH с номером проекта LSHM16021 Органоиды в качестве нового инструмента для токсикологического моделирования для Hubrecht Organoid Technology (HUB) и внутреннего финансирования HUB для отдела моделирования и токсикологии заболеваний. Мы благодарим лаборатории Сабины Миддендорп (отделение детской гастроэнтерологии, детская больница Вильгельмина, UMC, Утрехт) и Хуго Р. де Йонге и Марселя Й.К. Бийвельдса (отделение гастроэнтерологии и гепатологии, Erasmus MC, Роттердам) за оказание первоначальной технической поддержки в установке монослоев на мембранных вставках.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
| 1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
| 15 mL conical tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 24-well cell culture plates | Greiner bio-one | 662160 | |
| 24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) | Corning | 351156 | |
| 24-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 3378 | |
| 24-well plate with Transwell inserts | Corning | 3470 | |
| 40 µm cell strainer | PluriSelect | 43-50040-01 | |
| 50 mL conical tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner bio-one | 657160 | |
| 96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
| 96-well fast thermal cycling plates | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
| 96-well HTS Fluoroblok Transwell plate | Corning | 351162 | |
| 96-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 7369 | |
| 96-well transparent culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
| A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
| Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | Cell dissociation reagent 2 |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
| B27 supplement | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
| Cell culture microscope (light / optical microscope) | Leica | ||
| CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| CO2 incubator | PHCBI | ||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| DEPC treated H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
| DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
| EVOM2 meter with STX electrode | WTI | ||
| Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
| Glass pipettes | Volac | ||
| GlutaMAX | Life Technologies Europe BV | 35050038 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
| Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
| IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| Ki67 primary antibody | Sanbio | BSH-7302-100 | |
| Ki67 secondary antibody | Agilent | K400111-2 | |
| Kova International Glasstic Slide with Counting grids | Fisher Emergo | 10298483 | |
| Laminar flow hood | Thermo scientific | ||
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | extracellular matrix (ECM) |
| MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
| MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | |
| Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) | Gilson | ||
| Microtome | Leica | ||
| MUC2 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
| MUC2 secondary antibody | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
| Multichannel pipette (200 µL) | Gilson | ||
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Oligonucleotide ALPI1/Forward | Custom-made | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
| Oligonucleotide ALPI1/Reverse | Custom-made | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
| Oligonucleotide LGR5/Forward | Custom-made | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
| Oligonucleotide LGR5/Reverse | Custom-made | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
| Oligonucleotide MUC2/Forward | Custom-made | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
| Oligonucleotide MUC2/Reverse | Custom-made | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
| Oligonucleotide TBP/Forward | Custom-made | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
| Oligonucleotide TBP/Reverse | Custom-made | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | |
| Optical adhesive covers | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
| PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies Europe BV | 15140122 | |
| Plate shaker | Panasonic | ||
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
| Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | antimicrobial formulation for primary cells |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
| Reagent reservoir for multichannel pipet | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
| REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe | WTI | ||
| Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| Serological pipettes | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
| Serological pipettor (Pipet-Aid) | Drummond | ||
| Single edge razor blade | GEM Scientific | ||
| Superscript 1st strand system for RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
| Tecan Spark 10M plate reader | Tecan | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Cell dissociation reagent 1 |
| Water bath | Grant | ||
| Y27632 (ROCK inhibitor) | AbMole | M1817 |
References
- Haegebarth, A., Clevers, H. Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin. The American Journal of Pathology. 174 (3), 715-721 (2009).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Martínez-Maqueda, D., Miralles, B., Recio, I., et al. HT29 Cell Line. The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 113-124 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5(+) liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 11 (2), 179-194 (2013).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 1-20 (2019).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- d'Aldebert, E., et al. Characterization of human colon organoids from inflammatory bowel disease patients. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 363 (2020).
- Dotti, I., et al. Alterations in the epithelial stem cell compartment could contribute to permanent changes in the mucosa of patients with ulcerative colitis. Gut. 66 (12), 2069-2079 (2017).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270 (2017).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- van Es, J. H., et al. Wnt signalling induces maturation of Paneth cells in intestinal crypts. Nature Cell Biology. 7 (4), 381-386 (2005).
- van Es, J. H., et al. Dll1 marks early secretory progenitors in gut crypts that can revert to stem cells upon tissue damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- de Lau, W. B. M., Snel, B., Clevers, H. C.
- Basak, O., Beumer, J., Wiebrands, K., Seno, H., van Oudenaarden, A., Clevers, H. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).
- Beumer, J., et al. Enteroendocrine cells switch hormone expression along the crypt-to-villus BMP signalling gradient. Nature Cell Biology. 20 (8), 909-916 (2018).
- Yin, X., Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H., Langer, R., Karp, J. M. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
- Miao, Y., et al. Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo. Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Blume, L. -F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Die Pharmazie. 65 (1), 19-24 (2010).
- Lea, T. Caco-2 cell line. The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 103-111 (2015).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
