Summary
Burada, bağırsak bariyer fonksiyonunu, geçirgenliğini ve taşınmasını incelemek için insan organoid türevi bağırsak epitel monokatmanlarının hazırlanmasını açıklıyoruz. Organoidler dış uyaranlara karşı orijinal epitel dokusu yanıtını temsil ettiğinden, bu modeller hücre hatlarının genişletilebilirliğinin avantajlarını ve birincil dokunun alaka düzeyini ve karmaşıklığını birleştirir.
Abstract
Geçmişte, intestinal epitel model sistemleri transforme hücre hatları ve primer doku ile sınırlıydı. Bu model sistemler, birincisi orijinal doku fizyolojisini sadık bir şekilde temsil etmediğinden ve ikincisinin mevcudiyeti sınırlı olduğundan, doğal sınırlamalara sahiptir. Bu nedenle, uygulamaları temel ve ilaç geliştirme araştırmalarını engellemektedir. Yetişkin kök hücre bazlı organoidler (bundan böyle organoidler olarak anılacaktır), türetildikleri normal veya hastalıklı epitel dokusunun minyatürleridir. Farklı gastrointestinal (GI) sistem bölgelerinden çok verimli bir şekilde kurulabilirler, uzun süreli genişletilebilirliğe sahiptirler ve in vitro tedavilere doku ve hastaya özgü yanıtları simüle ederler. Burada, intestinal organoid kaynaklı epitel monokatmanlarının oluşumu, epitel bariyer bütünlüğünü, geçirgenliği ve transportunu, antimikrobiyal protein sekresyonunu ve histolojiyi ölçme yöntemleri ile birlikte gösterilmiştir. Ayrıca, bağırsak organoidinden türetilmiş tek katmanlar, çoğalan kök ve transit yükseltici hücrelerin yanı sıra anahtar farklılaşmış epitel hücreleri ile zenginleştirilebilir. Bu nedenle, bileşiklerin hedef hücreler üzerindeki etkilerini ve etki biçimlerini incelemek için uyarlanabilecek bir model sistemi temsil ederler. Organoid kültürler teknik olarak hücre hatlarından daha zorlu olsalar da, bir kez kurulduktan sonra, in vivo epitel karmaşıklığını ve hastalar arası heterojenliği gerçekten temsil ettikleri için ilaç geliştirmenin sonraki aşamalarındaki başarısızlıkları azaltabilirler.
Introduction
Bağırsak epiteli, bağırsakların luminal içeriği ile altta yatan doku arasında fiziksel bir bariyer görevi görür. Bu bariyer, bitişik hücreler arasında güçlü hücreler arası bağlantılar kuran sıkı kavşaklarla bağlanan esas olarak emici enterositlerin tek bir epitel tabakasını içerir. Bu hücreler, bağırsağın apikal (lümen) ve bazolateral taraflarını ayıran polarize bir epitel astarı oluştururken, aynı zamanda sindirilmiş besinlerin ve metabolitlerin parasellüler taşınmasını düzenler. Enterositlere ek olarak, kadeh, paneth ve enteroendokrin hücreler gibi diğer önemli epitel hücreleri de sırasıyla mukus, antimikrobiyal peptitler ve hormonlar üreterek bağırsak homeostazına katkıda bulunur. Bağırsak epiteli, lösin bakımından zengin tekrar içeren G-proteini eşleşmiş reseptör 5-pozitif (LGR5 +) kök hücrelerinin, yukarı doğru göç eden ve diğer hücre tiplerine farklılaşan geçiş-yükseltici (TA) hücreler üreten bağırsak kriptlerinin dibinde bölünmesiyle sürekli olarak yenilenir1. İntestinal epitel homeostazının gıda alerjenlerine, tıbbi bileşiklere ve mikrobiyal patojenlere maruz kalma gibi genetik ve çevresel faktörlerle bozulması, bağırsak bariyer fonksiyonunun bozulmasına yol açar. Bu koşullar, inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD), çölyak hastalığı ve ilaca bağlı GI toksisitesi 2 dahil olmak üzere çeşitli bağırsak hastalıklarına nedenolur.
Bağırsak epiteli ile ilgili çalışmalar, membran ekleri, çip üzerindeki organlar, Ussing odaları ve bağırsak halkaları gibi çeşitli in vitro platform sistemleri kullanılarak gerçekleştirilir. Bu platformlar, membranın hem apikal hem de bazolateral taraflarına erişimi olan, dönüştürülmüş hücre hatlarını veya birincil dokuyu model olarak kullanan polarize epitel monokatmanları oluşturmak için uygundur. Kolorektal (adeno) karsinom hücre hatları Caco-2, T84 ve HT-29 gibi dönüştürülmüş hücre hatları, polarize bağırsak enterositlerine veya mukus üreten hücrelere bir dereceye kadar farklılaşabilse de, birkaç hücre tipi eksik olduğundan ve çeşitli reseptörler ve taşıyıcılar anormal bir şekilde ifade edildiğinden in vivo epiteli temsil etmezler3 . Ek olarak, hücre hatları tek bir donörden türetildiğinden, hastalar arası heterojenliği temsil etmezler ve karmaşıklığın ve fizyolojik ilginin azalmasından muzdariptirler. Ussing odalarında ve bağırsak halkaları olarak kullanılan birincil dokular in vivo durumu daha iyi temsil etse de, sınırlı kullanılabilirlikleri, kısa süreli canlılıkları ve genişletilebilirlik eksikliği, onları yüksek verimli (HT) çalışmalar için bir ortam olarak uygun hale getirmemektedir.
Organoidler bağırsak, böbrek, karaciğer, pankreas ve akciğer gibi farklı organlardan kurulan in vitro epitel kültürleridir. Uzun vadeli, stabil genişleyen ve genetik ve fenotipik stabiliteye sahip oldukları kanıtlanmıştır ve bu nedenle orijinal organın epitelinin temsili biyolojik minyatürleridir ve dış uyaranlara sadık tepkiler verirler 4,5,6,7,8,9. Organoidler, heterojen hastaya özgü yanıtları temsil eden normal, hastalıklı, iltihaplı veya kanserli dokudan rezeke edilmiş veya biyopsi yapılmış 10,11,12,13,14,15,16 etkili bir şekilde kurulur. Bu yazıda organoid kültürlerden türetilen intestinal epitel monokatmanlarının nasıl oluşturulacağı gösterilmektedir. Tek katmanlı maddeler ince bağırsakların yanı sıra kolonik ve rektal organoid kültürlerden de başarıyla kurulmuştur. Bu model, epitel hücrelerinin ilaçlara taşınmasını ve geçirgenliğini ve epitel üzerindeki toksikolojik etkilerini incelemek için bir fırsat yaratır. Dahası, model, bağışıklık hücreleri ve bakterilerle birlikte kültürün bağırsak epiteli ile etkileşimlerini incelemesine izin verir17,18,19. Ayrıca, bu model tedavilere verilen yanıtları hastaya özgü bir şekilde incelemek ve epitel bariyer odaklı terapötiklerin bir sonraki dalgasını aramak için tarama çabalarını başlatmak için kullanılabilir. Böyle bir yaklaşım kliniğe genişletilebilir ve kişiselleştirilmiş tedavilere giden yolu açabilir.
Bu protokoldeki epitel monokatmanları insan normal bağırsak organoidlerinden hazırlanmış olsa da, protokol diğer organoid modeller için uygulanabilir ve optimize edilebilir. Epitelyal organoid monokatmanlar, kök hücre proliferasyonunu desteklemek ve bağırsak kript hücresel kompozisyonunu temsil etmek için Wnt içeren intestinal organoid genişleme ortamında kültürlenir. Bağırsak organoidleri, Wnt, Notch ve epidermal büyüme faktörü (EGF) yollarını modüle ederek enterositler, Paneth, kadeh ve enteroendokrin hücreler gibi farklı bağırsak epitel kaderlerine sahip olacak şekilde zenginleştirilebilir. Burada, genleşme ortamında tek katmanların kurulmasından sonra, daha önce tarif edildiği gibi daha farklılaşmış bağırsak epitel hücrelerine doğru yönlendirilirler20,21,22,23,24,25. Tarama amacıyla, ilgilenilen bileşiğin etki şekline, hedef hücrelerine ve deneysel koşullara bağlı olarak, tek katmanlar, bileşiğin etkilerini ilgili fonksiyonel okumalarla ölçmek için tercih edilen hücresel bileşime doğru yönlendirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kültür için reaktiflerin hazırlanması
NOT: Bir biyogüvenlik kabini içindeki tüm adımları uygulayın ve hücre kültürleriyle çalışmak için standart yönergeleri izleyin. Ultraviyole ışık, biyogüvenlik kabinini çalıştırmadan önce 10 dakika boyunca kullanılır. Kullanım öncesi ve sonrasında, biyogüvenlik kabininin yüzeyi% 70 etanol içine batırılmış bir kağıt mendil ile temizlenir. Üç boyutlu hücre dışı matris (ECM) damlalarının oluşumunu kolaylaştırmak için, inkübatörde 37 ° C'de önceden ısıtılmış 96, 24 ve 6 delikli plakaların hazır bir stoğunu saklayın.
- Bazal ortam hazırlığı
- 5 mL 200 mM glutamin, 5 mL 1 M 4-(2-hidrokyethil)-1piperazineethanesülfonik asit (HEPES) ve 5 mL penisilin/streptomisin (kalem/strep) çözeltisi (10.000 U/mL veya 10.000 μg/mL) ekleyerek Ham'ın Besin Karışımı F-12 (Ad-DF) orta şişeli 500 mL Advanced Dulbecco'nun Modifiye Kartal Medium'unda bazal ortam (BM) hazırlayın. Bu, buzdolabında 4 ° C'de en az 4 hafta saklanabilir.
- Wnt kaynakları
- Wnt3a şartlandırılmış ortamı (Wnt3aCM) daha önce açıklanan yöntem26'ya göre hazırlayın.
NOT: Son zamanlarda, insan bağırsak organoidlerinin genişlemesini de destekleyen yeni nesil bir vekil Wnt (NGS-Wnt) üretildi27.
- Wnt3a şartlandırılmış ortamı (Wnt3aCM) daha önce açıklanan yöntem26'ya göre hazırlayın.
- Bağırsak organoid baz orta preparatı
NOT: Tüm büyüme faktörlerini ve reaktifleri üreticinin tavsiyelerine göre kullanın. Küçük alikotlar kullanın ve donma-çözülme döngülerinden kaçının; fonksiyonel büyüme faktörleri başarılı organoid kültür için gereklidir.- BM'yi 1 μM A83-01, 2.5 mM N-asetilsistein, 2x B27 takviyesi, 100 ng / mL insan epidermal büyüme faktörü (hEGF), 10 nM gastrin, 200 ng / mL hNoggin ve 100 μg / mL birincil hücreler için bir antimikrobiyal formülasyon ile destekleyerek konsantre 2x bağırsak organoid baz ortamı (2x IBM) hazırlayın (bkz.
- 2x IBM'i havalandırın ve -20 °C'de 4 aya kadar dondurun. Gerektiğinde, bir aliquot'u gece boyunca 4 ° C'de veya oda sıcaklığında (RT) birkaç saat boyunca eritin.
- Bağırsak organoid genleşme ortamı (IEM) hazırlamak için, 2x IBM'i %50 Wnt3aCM veya %50 BM ve 0,5 nM NGS-Wnt, 250 ng/mL insan Rspondin-3 (hRspo3), 10 mM nikotinamid ve 10 μM SB202190 ile tamamlayın.
- Bağırsak organoid farklılaşma ortamı hazırlığı
- 2x IBM'i %50 BM, 250 ng/mL hRspo3 ve 1.5 μM Wnt yol inhibitörü (IWP-2) ile destekleyerek enterosit farklılaşma ortamı (eDM) hazırlayın. eDM'yi 4 °C'de 10 güne kadar saklayın.
- 2x IBM'i %40 BM ve %10 Wnt3aCM veya %50 BM ve 0,1 nM NGS-Wnt, 250 ng/mL hRspo3, 10 μM DAPT ve 100 nM PD0325901 ile destekleyerek kombinasyon farklılaştırma ortamı (cDM) hazırlayın. cDM'yi 4 °C'de 10 güne kadar saklayın.
- Hücre dışı matriksin (ECM) manipülasyonu
NOT: Hücre dışı matrisi (ECM) üreticinin tavsiyesine göre hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakın).- ECM'yi bir gecede buz üzerinde çözün; ECM'yi, her ikisi de -20 °C'de önceden soğutulmuş 5 mL'lik bir pipet kullanarak şişeden 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Alikotları -20 ° C'de sadece bir kez yeniden dondurun. Çözüldükten sonra, ECM'yi buzdolabında 4 ° C'de 7 güne kadar saklayın. Kullanmadan önce buz üzerinde en az 30 dakika inkübe edin.
NOT: ECM'yi düzgün bir şekilde karıştırın ve kriptleri veya organoidleri gömmeden önce soğuk olduğundan emin olun.
- ECM'yi bir gecede buz üzerinde çözün; ECM'yi, her ikisi de -20 °C'de önceden soğutulmuş 5 mL'lik bir pipet kullanarak şişeden 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Alikotları -20 ° C'de sadece bir kez yeniden dondurun. Çözüldükten sonra, ECM'yi buzdolabında 4 ° C'de 7 güne kadar saklayın. Kullanmadan önce buz üzerinde en az 30 dakika inkübe edin.
2. Organoid kültürler
- Dondurulmuş organoidlerden kültürlerin oluşturulması
NOT: BM'nin RT'ye ulaşmasına izin verin ve dondurulmuş organoidler içeren bir kriyovyalin çözülme prosedürüne başlamadan önce 37 ° C'ye ısıtılmış 12 mL'lik bir aliquot'u hazır tutun.- Organoid kriyovial, sadece bir parça buz kalana kadar 37 ° C'lik bir su banyosunda çalkalayarak hızla çözün. Hemen kriyovale damla damla 500 μL ılık BM ekleyin ve dondurucu ortamı seyreltmek ve içeriği dikkatlice karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Bir P1000 pipet kullanarak, organoidleri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve tüpün tabanını hafifçe karıştırırken damla yönünde 1 mL daha sıcak BM ekleyin. Dondurucu ortamı seyreltmek ve içeriği dikkatlice karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Organoidleri içeren 15 mL'lik konik tüpe damla damla 12 mL'ye kadar sıcak BM ekleyin ve organoidleri nazikçe askıya almak için 10 mL'lik steril pipetle yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Organoid süspansiyonu 85 × g ve 8 °C'de 5 dakika santrifüj yapın. Peleti rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice atın ve organoidleri, 10 μM Y27632 veya diğer rho ile ilişkili sarmal bobin oluşturan protein serin / treonin kinaz inhibitörü (ROCK inhibitörü) ile desteklenmiş IEM'nin% 30 v / v'sinde yeniden askıya alın. Tüpü buzun üzerine yerleştirin.
- Organoidleri içeren 15 mL konik tüpe %70 v/v ECM ekleyin. 15 mL konik tüpü buz üzerinde tutan organoid süspansiyonu karıştırın ve yoğunluğu kontrol etmek için süspansiyonun 5 μL'sini tohumlayın (Şekil 1A). Yoğunluk uygunsa kaplamaya devam edin; yoğunluk çok yüksekse, sırasıyla% 30-70 v / v oranında daha fazla IEM / ECM çözeltisi ekleyin.
- Önceden ısıtılmış 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğunda, 10 μL'lik 5 ayrı damla pipetleme yaparak organoid süspansiyonun 50 μL'sini tohumlayın (Şekil 1B). Plakayı baş aşağı çevirin ve 5 dakika boyunca biyogüvenlik kabininde bırakın. Plakayı hala baş aşağı 37 ° C inkübatöre aktarın ve 30 dakika daha bekletin.
- Her bir kuyucuğa 10 μM ROCK inhibitörü ile 500 μL IEM ekleyin ve plakayı inkübatöre aktarın. Büyümeyi izlemek için düzenli olarak bir damla görüntü oluşturun ve eski ortamı aspire ederek ve 500 μL taze IEM ekleyerek IEM'yi her 2-3 günde bir yenileyin.
- Organoidleri, çözülmeden düzgün bir şekilde iyileştikten ve işlenecek doğru boyuta ulaştıktan sonra (Şekil 1C), bölüm 2.2'de açıklandığı gibi geçirin.
- Bağırsak organoidlerinin pasajı
NOT: ECM'yi buz üzerinde en az 30 dakika soğutun ve kullanmadan önce IEM'yi RT'de en az 1 saat tutun.- 1250 μL düşük tutma filtre ucu kullanarak organoid kubbeleri parçalamak için ortamı bir kültür kuyusundan kullanın ve kuyu içeriğini etiketli 15 mL konik bir tüpe aktarın. Kuyuyu 1 mL BM ile yıkayın ve aynı 15 mL konik tüpe aktarın.
- 2.2.1 ve 2.2.2 adımlarını diğer tüm kuyucuklarla tekrarlayın (maksimum yarım plaka veya 600 μL ECM damlası yıkanabilir ve bir 15 mL konik tüpe eklenebilir).
- Tüpü 12 mL'ye kadar doldurmak için BM ekleyin ve 10 mL'lik pipet kullanarak 10 kat yukarı ve aşağı pipet çekin. 85 °C'de 5 dakika boyunca 85 × g'da santrifüj.
- BM'yi çıkarmadan önce, tüm organoidlerin 15 mL konik tüpün dibinde pelet edilip edilmediğini görmek için mikroskop altında kontrol edin (Şekil 1D). Organoid peletin üzerine binen ECM yoksa veya ECM tabakası temizse veya peletlenmiş organoidlere kıyasla sadece enkaz, tek hücre veya çok az organoid içeriyorsa, süpernatantı aspire edin ve bir P200 pipeti kullanarak organoid peletin üzerine çok dikkatli bir şekilde yerleştiren ECM'yi pipetleyin.
NOT: Organoidler ECM'de sıkışabilir ve düşük santrifüj kuvveti nedeniyle kompakt bir pelet olarak tortu yapmazlar. ECM organoidler içeriyorsa, tüpü 8 ° C'de 5 dakika boyunca 450 × g'da tekrar santrifüj edin ve süpernatantı 2.2.4'te açıklandığı gibi dikkatlice çıkarın. Birden fazla 15 mL konik tüp varsa, adım 2.2.4'ten sonra havuza alınabilirler. - Her pelete 1 mL BM ekleyin (organoid kültür ve yoğunluğa bağlı olarak 50-200 μL hacimde) ve dikkatlice geri koyun. Organoidleri kesmek için en az 5 kat yukarı ve aşağı pipetleyin, köpük oluşumunu önleyin. Organoidlerin bozulup bozulmadığını görmek için mikroskop altında kontrol edin (Şekil 2A). Organoidler bozulursa, adım 2.2.7'ye geçin; organoidler bozulmamışsa, 5x daha pipetleyin. Bu kez, organoidleri bozmak için daha fazla mekanik kuvvet uygulamak için plastik tüpün duvarına pipet ucuyla dokunun.
NOT: Kistik (Şekil 1C) ve tomurcuklanan (Şekil 1E) organoidlerin mekanik olarak kesilmesi, organoidlerin bozulması için gereken hacme bağlı olarak, düşük retansiyonlu 1250 μL filtre ucu (Şekil 1F) üzerine takılı 200 μL veya 10 μL plastik pipet ucu ile mümkündür. Daralmış bir cam pipetin kullanılması (Şekil 1F), organoidleri içeren 200 μL'den fazla ECM işlendiğinde önerilir (6 delikli bir plakanın bir kuyucuğu veya 24 delikli bir plakanın 4 deliği). - Organoidlerin bozulup bozulmadığını görmek için mikroskop altında tekrar kontrol edin. Kesintiye uğrarsanız, bir sonraki adıma geçin; değilse, organoidleri 20x'e kadar pipetleyin, organoidleri mikroskop altında düzenli olarak kontrol edin. Organoidler hala bozulmamışsa, süspansiyona% 25 v / v hücre ayrışma reaktifi 1 ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, 2 dakika boyunca 37 ° C'de su banyosunda inkübe edin ve organoidleri 20x'e kadar pipetleyin, organoidleri mikroskop altında düzenli olarak kontrol ederek tek hücrelere sindirilmediklerinden emin olun.
- 15 mL'lik konik tüpe 12 mL'ye kadar BM ekleyin ve organoid peleti yukarı ve aşağı pipetleyerek yıkayın. 85 °C'de 5 dakika boyunca 85 × g'da santrifüj. Süper natantı atın ve organoid peletine IEM ve ECM ekleyerek son konsantrasyonu% 70 v / v ECM'ye ayarlayın.
- Organoid peleti, geçiş için toplanan IEM / ECM hacminin iki katı ile yeniden askıya almaya başlayın ve yoğunluğu kontrol etmek için süspansiyonun 5 μL'sini tohumlayın. Yoğunluk uygunsa kaplamaya devam edin (Şekil 2B); yoğunluk çok yüksekse daha fazla IEM/ECM çözümü ekleyin. Önceden ısıtılmış 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna süspansiyonun 200 μL'sini ekleyin ve 10 μL hacimli ayrı damlalar yapın.
- Plakayı baş aşağı çevirin ve 5 dakika boyunca biyogüvenlik kabininde bırakın. Plakayı hala baş aşağı 37 ° C inkübatöre aktarın ve 30 dakika daha bırakın. Her bir kuyucuğa 10 μM ROCK inhibitörü ile 2 mL IEM ekleyin ve plakayı inkübatöre aktarın.
- Büyümeyi izlemek için düzenli olarak bir damla görüntü oluşturun ve eski ortamı aspire ederek ve 2 mL taze IEM ekleyerek IEM'yi her 2-3 günde bir yenileyin.
- Epitelyal tek katmanlı preparat için bağırsak organoidlerinin pasajı
- Tek katmanlı hazırlık için hasattan 3 gün önce pasaj organoidleri, bir istisna dışında bölüm 2.2'de açıklanan aynı pasaj protokolünü izleyerek. Adım 2.2.7'de, organoidleri, tek katmanlı hazırlık için hasat edildiklerinde daha yüksek bir yoğunluğa ve genleşme potansiyeline sahip olmak için IEM / ECM'nin başlangıç hacminin 1-1.5 katında yeniden askıya alın (Şekil 3A).
3. Epitelyal tek katmanlı preparat
- Çeşitli mevcut plaka tiplerine sahip hem 24 delikli hem de 96 delikli membran uçlarında kültür epitel monokatmanları (Tablo 1). Her iki boyut için de yüksek verimli sistem (HTS) membran kesici uçları kullanın, çünkü bunlar membran uçları ve bir alıcı plakası içeren entegre bir tepsi içerir. 24 delikli format için, ayrı çıkarılabilir membran uçlarına sahip plakaların kullanılması da mümkündür.
NOT: Farklı membran tipleri (polietilen tereftalat (PET) veya polikarbonat) ve gözenek boyutları (0.4-8.0 μm) mevcuttur ve deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak kullanılabilir. Tek katmanlar yalnızca PET membranlı kesici uçlar kullanıldığında parlak alanla görüntülenebilir. Işık geçirmez membranlar, apikalden bazolateral bölmeye floresan ışık sızıntısını bloke eder ve floresan olarak etiketlenmiş substratların dinamik taşınması veya geçirgenliği incelendiğinde düşünülebilir. Mevcut protokol 24 delikli membran uçları kullanır; 96 delikli membran kesici uçlar için uyarlamalar bölüm 5'te açıklanmıştır. Organoidlerin yoğunluğuna, morfolojisine ve boyutuna bağlı olarak (Şekil 3A), 6 delikli bir plakanın 6 kuyucuğu (bölüm 2.3'te tohumlandığı gibi), tam 24 delikli membran ekleri plakasının tohumlanması için yeterlidir. - Membran kesici uçların ECM ile kaplanması
NOT: Yeterli hücreye sahip olma konusunda şüpheleriniz varsa, hücreleri saydıktan sonra ekleri kaplayın. Bu, gereksiz kaplamayı ve pahalı membran kesici uçların kaybını önlemek içindir.- Membran eklerini biyogüvenlik kabinindeki destek plakasına yerleştirin. ECM 40x'i buz gibi soğuk Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) Ca 2+ ve Mg2+ ile seyreltin ve seyreltilmiş ECM'nin 150 μL'sini her bir kesici ucun apikal bölmesine pipetleyin. Plakayı en az 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Tohumlama için hücrelerin hazırlanması
- Su banyosunda hücre ayrışma reaktifi 2'nin ön sıcak alikotları (37 ° C). 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğu için 2 mL reaktif hazırlayın.
- Organoidleri içeren kültür plakasını (bölüm 2.3'te hazırlanan) inkübatörden biyogüvenlik kabinine aktarın. Organoidleri 2.2.1.-2.2.4 adımlarında açıklandığı gibi işleyin. Birden fazla tüpü tek bir tüpte toplamayın.
- DPBS ile 12 mL'ye kadar (Ca 2+ve Mg 2+ olmadan) 6 delikli bir plakanın maksimum 3 deliğinden organoidler içeren tüpü doldurun ve 10 mL'lik bir pipet kullanarak 10 kat yukarı ve aşağı pipet çekin. 8 °C'de 5 dakika boyunca 85 × g'da santrifüj yapın ve organoid peleti rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin.
- Başlangıç malzemesi olarak kullanılan 6 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 2 mL önceden ısıtılmış hücre ayrışma reaktifi 2 ekleyin ve yeniden askıya alın. Organoidlerin tüpün dibine batmasını önlemek için tüpleri 37 ° C'deki su banyosunda 5 dakika boyunca çapraz veya yatay olarak inkübe edin.
- Pipet, hücre ayrışma reaktifinin toplam hacmine bağlı olarak 5 mL steril plastik pipet veya P1000 pipet kullanarak 10 kat yukarı ve aşağı Pipet. Tek hücrelerin ve 2-4 hücreden oluşan bazı hücre kümelerinin bir karışımının oluşup oluşmadığını görmek için mikroskop altında organoid süspansiyonu kontrol edin (Şekil 3B). Gerekirse, karışım Şekil 3B'ye benzeyene kadar 3.3.4-3.3.5 adımlarını tekrarlayarak (hücre ayrışma reaktifinin hacmini arttırmayın) sindirime devam edin.
NOT: Organoidleri tamamen tek hücrelere sindirmekten kaçının. Bazı küçük hücre gruplarına (yani 2-4 hücreli gruplara) sahip olmak gerekir. - Hücre süspansiyonuna 10 μM ROCK inhibitörü de dahil olmak üzere 12 mL'ye kadar BM ekleyerek hücre ayrışmasını durdurun. 8 °C'de 5 dakika boyunca 450 × g'da santrifüj yapın ve hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin. Aynı organoid kültürü birkaç 15 mL konik tüpte kullanırken, hücre peletlerini bir araya getirin ve 12 mL BM'de yeniden askıya alın.
- Hücre süspansiyonunu BM ile önceden ıslatılmış 40 μm'lik bir süzgeçten süzün ve akışı 50 mL'lik konik bir tüpe toplayın. Süzgeci 10 mL BM ile yıkayın ve akışı aynı 50 mL konik tüpe toplayın.
- Gergin hücre süspansiyonunu iki yeni 15 mL konik tüpe aktarın. 8 °C'de 5 dakika boyunca 450 × g'da santrifüj yapın ve hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin. Başlangıç malzemesi olarak kullanılan tam kültür plakası başına 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 4 mL IEM'deki hücreleri yeniden askıya alın.
- Saymak için az miktarda hücre süspansiyonunu 1: 1 oranında tripan mavisi ile karıştırın. Mavi değil canlı hücreleri sayın (Şekil 3C) ve toplam canlı hücre sayısını hesaplayın. Küçük kümelerde, her bir hücreyi sayın.
- 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş IEM'nin mL'si başına 3 × 106 canlı hücre içeren bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
- Polyester membran uçlarındaki tohumlama hücreleri
- Plakayı yatay tutarken ECM kaplı kesici uçlardan DPBS'yi dikkatlice aspire edin (adım 3.2.1). Pipet 800 μL IEM, her bazolateral bölmeye ROCK inhibitörü ile desteklenir. Pipet 150 μL, apikal bölmedeki ECM kaplı membran üzerine damla doğru 3.3.10 adımında hazırlanan hücre süspansiyonunun. Plaka başına, yalnızca BM ile en az bir "boş" kuyu olduğundan emin olun.
- Hücreler membran üzerine çökeldikten sonra, bölüm 4.1'de açıklandığı gibi transepitelyal elektrik direncini (TEER) ölçün ve membran eklerini mikroskop kullanarak görüntüleyin. Plakayı inkübatöre 37 ° C'de ve% 5 CO2'ye yerleştirin. TEER'i her gün ölçün ve tek katmanlı oluşumu izlemek için düzenli olarak görüntüler elde edin (Şekil 4A-D).
- Ferahlatıcı tek katmanlı
NOT: Hücrelerin üzerinde pozitif bir hidrostatik basınç sağlamak ve hücrelerin zardan itilmesini önlemek için aşağıdaki sıraya bağlı kalarak ortamı her 2-3 günde bir yenileyin. Ortamı yenilerken, ortamın aspirasyonu üzerine görülebilen tek katmanın pipet ucundan zarar görmediğinden emin olun.- Ortamı, membran eklerini içeren plakanın bazolateral bölmelerinden çıkarın. Daha sonra, ortamı membran eklerinin apikal bölmelerinden dikkatlice aspire edin.
- Her apikal bölmeye damla damla 150 μL taze IEM ekleyin ve ardından her bazolateral bölmeye 800 μL taze IEM ekleyin.
- İstenilen bağırsak epitel hücre tipleri için tek tabakanın zenginleştirilmesi
- Tek katmanın, yaklaşık 100 Ω·cm²'lik bir TEER değerine karşılık gelen IEM'de akıcılaşmasına izin verin (adım 4.1.1.4'te hesaplandığı gibi). Tek katmanların tamamen oluşup oluşmadığını (Şekil 4D) ve deliklerin bulunmadığını ( Şekil 4B, C'de görüldüğü gibi) belirlemek için mikroskop altında kontrol edin.
- IEM'yi membran kesici uçlarının bazolateral ve apikal bölmelerinden dikkatlice çıkarın ve bölüm 1.4'te hazırlandığı gibi eDM veya cDM ile değiştirin. Organoid hücrelerin istenen spesifik hücre tipi ile zenginleştirilmesini sağlamak için monokatmanı spesifik farklılaşma ortamında 3-4 gün daha kültürleyin. Bölüm 3.4'te açıklandığı gibi ortamı her 2-3 günde bir yenileyin.
- TEER'i günlük olarak ölçün ve istenirse düzenli olarak görüntü elde edin (Şekil 5A-C).
NOT: Tamamen organize edilmiş zenginleştirilmiş tek katmanlı bir tek katmanı gösteren TEER değeri, organoid kültüre göre değişir; tipik olarak TEER değerleri 600'e yükselir ve diferansiyasyon ortamında 3 gün sonra 1000 Ω ·cm2'ye (adım 4.1.1.4'te hesaplandığı gibi) kadar artabilir ve 3-5 gün boyunca stabildir.
4. Epitelyal tek katmanlı tahlil okumaları
- Transepitelyal elektrik direncinin (TEER) ölçülmesi
NOT: TEER ölçümleri, epitel monokatmanları28,29 gibi fizyolojik bariyerlerin biyolojik modellerinde sıkı bağlantı dinamiklerini ve bariyer fonksiyon bütünlüğünü analiz etmek için bir yöntem olarak yaygın olarak kabul edilmektedir. Dar kavşaklarda artan hücresel etkileşim nedeniyle farklılaşmadan sonra TEER'deki artış, manuel bir TEER ölçüm cihazı veya otomatik bir TEER ölçüm robotu kullanılarak ölçülebilir.- Manuel TEER ölçüm cihazı kullanılarak TEER ölçümü
- Elektrotu% 70 etanol ile temizleyin ve biyogüvenlik kabininin içinde hava ile kurumasını bekleyin. Elektrodu BM içeren bir tüpe yerleştirin. elektrodu manuel TEER ölçüm cihazına bağlayın. Ohm (Ω) cinsinden ölçmek için İşlev düğmesini çevirin. Güç düğmesini açın.
- Kısa elektrodu kesici ucun apikal bölmesine yerleştirin, uzun elektrot ise bazolateral bölmeye yerleştirilir (Şekil 6A). Tek katmana dokunmaktan kaçının.
- Boş kuyucuktaki direnci ölçün (Rboşluğu) ve ardından kalan numuneleri (Rnumunesi) aynı şekilde ölçün. Elektrodu farklı koşullara sahip numuneler arasında BM ile yıkayın. Elektrodu önce yarı suyla, sonra% 70 etanol ile temizleyin ve havayla kurumasını bekleyin.
- TEER (Ω·cm2) hesaplayın: [Rnumunesi (Ω) - Rboş (Ω)] × membran alanı (cm2) (Tablo 1 ve Şekil 6B).
- Otomatik bir TEER ölçüm robotu kullanılarak TEER ölçümü (Malzeme Tablosu)
- Membran uçları içeren 96 delikli ve 24 delikli HTS plakaları için HTS sistemlerini kullanırken otomatik TEER ölçümleri gerçekleştirin. Her iki tip için TEER ölçümü için farklı elektrotlar kullanın (24- ve 96- HTS membran uçları). TEER'i otomatik bir TEER ölçüm robotu kullanarak ölçmek için üreticinin talimatlarını izleyin.
- Manuel TEER ölçüm cihazı kullanılarak TEER ölçümü
- Epitel bariyer bütünlüğünün ve geçirgenliğinin ölçülmesi
NOT: Bu protokol, tek katmanlı bütünlüğün bir göstergesi olarak apikalden bazolateral bölmeye Lucifer Sarı geçirgenliğini tanıtır. Bu bölümde, tek katmanlı geçirgenliği ve dolayısıyla bariyer bütünlüğünü değerlendirmek için 1 saatlik bir inkübasyon adımından sonra bazolateral bölmede floresan ölçümü açıklanmaktadır. Bu ölçüm bir son nokta testidir ve özellikle bileşiklerin bariyer bütünlüğü üzerindeki etkilerini test ederken kullanışlıdır.- Lucifer Yellow'u buz üzerinde çözün ve BM'nin RT'ye dengelenmesine izin verin. Bir adet 24 delikli membran eki plakası için, BM'de 60 μM Lucifer Sarısı'ndan 5 mL çalışma çözeltisi hazırlayın.
NOT: Lucifer Yellow ışığa duyarlıdır. Seyreltmeleri karanlık 1,5 mL steril tüplerde hazırlayın ve biyogüvenlik kabini ışığı kapalıyken tüm adımları gerçekleştirin. - Ortamı, adım 3.5.1'de açıklandığı gibi, membran eklerinin bazolateral ve apikal bölmelerinden dikkatlice çıkarın. İstenirse, hasarlı bir bariyerden Lucifer Yellow sızıntısı için pozitif bir kontrol olarak bir pipet ucu kullanarak işlenmemiş bir tek katmanı çizin.
- Her apikal bölmeye 60 μM Lucifer Sarısı ile 150 μL BM ekleyin ve her bazolateral bölmeye Lucifer Sarısı olmadan 800 μL BM ekleyin. Plakayı 60 dakika boyunca 37 °C, 50 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirin.
- Bu arada, 4.2.1 adımında hazırlanan çalışma çözeltisinden başlayarak BM'de Lucifer Sarısı'nın standart bir eğrisini hazırlayın. 3 nM'lik bir konsantrasyona ulaşılana kadar her adımda 1:3 oranında seyreltin. Negatif bir denetim ekleyin (yalnızca BM).
- Her standardın 100 μL'sini üçlü olarak 96 delikli şeffaf bir plakaya aktarın. 60 dakikalık inkübasyondan sonra, membran eklerini çıkarın ve her bir bazolateral kuyudan (adım 4.2.3) 100 μL'yi 96 delikli şeffaf plakaya üçlü olarak aktarın. 430 nm uyarma dalga boyunda ve 530 nm emisyon dalga boyunda bir plaka okuyucu kullanarak plakanın floresansını ölçün.
- Negatif kontrol değerini düzelttikten sonra (yalnızca BM), bazolateral bölmedeki Lucifer Sarı konsantrasyonunu hesaplamak için standart eğri değerlerini kullanın (son alıcı konsantrasyonu (μM)).
- Görünür geçirgenlik katsayısını (Puygulaması) aşağıdaki formüle göre hesaplayın (Şekil 6C):
- Membran kesici uçlar içeren 24 delikli bir plaka için aşağıdaki formülü kullanın:
- Lucifer Yellow'u buz üzerinde çözün ve BM'nin RT'ye dengelenmesine izin verin. Bir adet 24 delikli membran eki plakası için, BM'de 60 μM Lucifer Sarısı'ndan 5 mL çalışma çözeltisi hazırlayın.
- Tek katmanların sabitlenmesi ve astroloji için parafin bloklarının hazırlanması
NOT: Epitel monokatmanları, hücresel bileşimlerinin, polaritelerinin ve bileşke proteinleri, proliferasyon veya farklılaşma belirteçleri gibi ilgilenilen farklı proteinlerin ekspresyonunun değerlendirilmesi için histolojik boyama için kullanılabilir. Bu bölümde histolojik boyama için parafin blok hazırlığı anlatılmaktadır.- Ortamı, membran eklerinin bazolateral ve apikal bölmelerinden, adım 3.5.1'de açıklandığı gibi dikkatlice çıkarın.
- Tek katmanları, her apikal bölmeye 150 μL DPBS (Ca 2+ ve Mg2+ olmadan) ve her bazolateral bölmeye 800 μL ekleyerek yıkayın. DPBS'yi önce bazolateral bölmeden ve daha sonra apikal bölmeden dikkatlice aspire edin.
NOT: Bazolateral bölme bu adımdan itibaren boş kalacaktır. - Bir duman davlumbazında, her apikal bölmeye 150 μL% 4 paraformaldehit ekleyin ve RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
NOT: Bu adımdan itibaren, paraformaldehit toksik olduğundan, bu bölümdeki tüm eylemleri bir duman başlığı içinde gerçekleştirin. - Fiksatifi membran eklerinin apikal bölmelerinden dikkatlice aspire edin ve sıvı halojen atık olarak atın.
NOT: Bu adımdan itibaren tüm sıvı atıkları sıvı halojen atık olarak bertaraf ediniz. - Her apikal bölmeye 200 μL DPBS (Ca2+ ve Mg2+ olmadan) ekleyerek monokatmanları yıkayın ve DPBS'yi tekrar dikkatlice aspire edin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
- Her apikal bölmeye 200 μL% 25 etil alkol (EtOH) ekleyin ve RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin. 15 dakika sonra, membran eklerinin apikal bölmelerinden %25 EtOH'yi dikkatlice aspire edin. % 50 EtOH çözeltisi ve daha sonra% 70 EtOH çözeltisi ile tekrarlayın.
- Her apikal bölmeye 200 μL% 70 EtOH ekleyin ve plakayı parafilm ile sarın. Daha fazla kullanana kadar 4 ° C'de saklayın.
- %70 EtOH'yi dikkatlice aspire edin ve tek katmanlı membranları kesici uçlardan dikkatlice kesmek için bir neşter kullanın. Bazolateral taraftan, kesici ucun kenarı etrafında kesin.
- Standart prosedürü izleyerek parafin blokları hazırlayın.
- Parafin hala sıcak olduğunda, tek katmanı parafinden cımbızla alın ve önceden soğutulmuş bir yüzeye yerleştirin.
- Tek katmana zarar vermemeye dikkat edin. Tek kenarlı bir bıçak kullanarak tek katmanı ikiye bölün.
- Kasetin altındaki parafin katılaşmaya başladığında, iki tek katmanlı parçayı parafinin içine, düz tarafı aşağı ve dikey yönde olacak şekilde yan yana yerleştirmek için ısıtmalı cımbız kullanın.
- Parafin bloklar hazır olduğunda, blokları bir mikrotom kullanarak kesin ve standart prosedürü izleyerek 4 μm kalınlığında kesitlerden slaytlar yapın. Tek katmanların coupe'de dikey olarak sona erdiğinden emin olun.
- Histolojik lekeleri daha önce tarif edildiği gibi gerçekleştirin 7,9. Genel morfolojiyi, proliferatif hücreleri, mukus üretimini ve kadeh hücrelerini göstermek için sırasıyla hematoksilin ve eozin (H & E), Ki67, müsin-2 (MUC2) ve Alcian Blue kullanın (Şekil 6E).
NOT: Paneth hücreleri için lizozim gibi ek farklılaşma belirteçleri de kullanılabilir. Bu belirteç Şekil 6E'de sunulmamıştır, çünkü Paneth hücreleri kolon epiteli yerine ince bağırsak epitelinde bulunur.
- Orta süpernatantta salgılanan protein ölçümü
- İleal monokatmanların apikal süpernatantındaki lizozim seviyelerini Malzeme Tablosunda listelenen kiti kullanarak ölçün (bkz. Şekil 6D). İstenirse, farklı sitokinlerin ve diğer ilgili proteinlerin seviyelerini ölçün.
- Gen ekspresyon analizi
- Kantitatif ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) kullanarak farklılaşma ortamının epitel hücre belirteci genlerinin ekspresyonu üzerindeki etkilerini ölçmek.
- Tek katmanları 350 μL RNA lizis tamponunda lize edin ve ardından üreticinin talimatlarına göre RNA izolasyonu yapın. Daha önce 7,9'da açıklandığı gibi, Malzeme Tablosunda listelenen cDNA sentez kitlerini, ana karışımı ve oligonükleotidleri kullanarak cDNA sentezi ve qPCR'leri gerçekleştirin.
- Kantitatif ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) kullanarak farklılaşma ortamının epitel hücre belirteci genlerinin ekspresyonu üzerindeki etkilerini ölçmek.
5. Membran ekleri içeren 96 delikli plakalara yükseltme
NOT: Membran ekleri içeren HTS 96 delikli plakaları kullanarak daha yüksek verimli ilaç taramaları veya çoklu ortam koşulları için epitel monokatmanları hazırlayın.
- 96 delikli formatta monokatmanlar hazırlarken uyarlamalar
- Membran ekleri içeren 24 delikli plakalar için bu protokolde açıklanan tüm adımları izleyin, hacimleri ve hücre numaralarını Tablo 1'de açıklananlarla değiştirin. Membran uçlu 96 delikli plakalar üzerinde tek katmanlı malzemeler hazırlamak için, aşağıdaki farklılıklarla bölüm 3'te açıklandığı gibi devam edin.
- Membran uçları ile tam bir 96 delikli plakayı tohumlamak için Şekil 3A'da temsil edilen organoid yoğunluğa sahip 6 kuyucuklu bir kültür plakasının yaklaşık 9 kuyucuğuna ihtiyaç vardır. Adım 3.2.1'de, membranları DPBS'de 67 μL 40x seyreltilmiş ECM ile ön kat edin (Ca 2+ ve Mg2+ ile).
- Bölüm 3.5'te, hem apikal hem de bazolateral bölmelerin orta derecede ferahlamasına izin vermek için önce membran eklerinin entegre plakasını başka bir 96 delikli plakaya aktarın.
- Membran ekleri içeren 24 delikli plakalar için bu protokolde açıklanan tüm adımları izleyin, hacimleri ve hücre numaralarını Tablo 1'de açıklananlarla değiştirin. Membran uçlu 96 delikli plakalar üzerinde tek katmanlı malzemeler hazırlamak için, aşağıdaki farklılıklarla bölüm 3'te açıklandığı gibi devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1A, bağırsak organoidlerinin bir kriyovyalden çözüldükten sonra temsili bir parlak alan görüntüsünü göstermektedir. Optimal iyileşmeyi sağlamak için organoidleri yüksek yoğunlukta çözmek önemlidir. Organoidler, yaklaşık 10 μL'lik ECM kubbelerinde 24 veya 6 delikli plakalar halinde kaplanır (Şekil 1B). Çoğu normal bağırsak organoidinin kistik morfolojisi vardır. Çözülme işleminden kurtulduktan sonra, organoidler daha büyük bir boyuta büyür ve organoid kültüre bağlı olarak 3-7 gün sonra geçmeye hazırdır (Şekil 1C). Organoidleri topladıktan ve ECM'yi yıkadıktan sonra (Şekil 1D), organoidler mekanik kesme ile küçük bir boyuta kadar bozulabilir. Organoidlerin morfolojisine bağlı olarak (kistik Şekil 1C, tomurcuklanan Şekil 1E), organoidler plastik veya cam pipetler kullanılarak bozulabilir (Şekil 1F). Organoidler, mikroskop altında düzenli olarak izlenmesi gereken bir süspansiyonda (Şekil 2A) bozulur. Onları çok küçük yapmaktan kaçınmak önemlidir, çünkü organoid büyümesini sağlamak için hücre gruplarının bir arada kalması gerekir. Şekil 2B, ECM'deki organoidlerin pasajdan hemen sonra düştüğünü göstermektedir. Genel olarak, kistik organoidler nispeten yüksek yoğunlukta kaplanırken, tomurcuklanan organoidler düşük yoğunlukta kaplanır; Bununla birlikte, bu farklı organoid kültürler arasında farklılık gösterebilir.
Tek katmanların hazırlanması için organoidleri geçirirken, onları yüksek yoğunlukta plakaladığınızdan emin olun ve üç gün boyunca büyümelerine izin verin, böylece optimum genleşme koşullarında olurlar. Organoidler, boyut ve yoğunluk bakımından Şekil 3A ile karşılaştırılabilir olduklarında tek katmanlı hazırlık için toplanabilir; burada her biri 200 μL organoid kubbe içeren 6 kuyucuklu bir plakanın 6 kuyucuğu, tipik olarak tam bir 24 delikli membran ekleri plakasının tohumlanması için yeterlidir. Hücre ayrışma reaktifi ile tek hücreli bir süspansiyonun hazırlanmasından sonra, tek hücreler ve küçük hücre kümeleri görünür olmalıdır (Şekil 3B) ve canlı hücreler sayılabilir (Şekil 3C). Oklar, sayma dışında bırakılması gereken tripan mavisi ile lekelenmiş ölü hücreleri gösterir. Tek hücreler ve küçük kümeler daha sonra Şekil 4A'da görüldüğü gibi membran eklerine tohumlanır. Tek katmanlı oluşum 1-3 gün sonra görülebilir (Şekil 4B,C) ve tek katmanlı yapı organoid kültüre bağlı olarak genellikle 3-6 gün sonra birleşir (Şekil 4D). Tek katmanlar, birleşene kadar genleşme ortamında kalırlar, daha sonra diğerlerinin yanı sıra farklı zenginleştirme ortamları kullanılarak enterositler veya kadeh hücreleri ile zenginleştirilebilirler. Şekil 5A, genişleme ortamında (IEM) 8 gün boyunca kültürlenmiş bir tek katmanı göstermektedir. Enterositlerle (eDM) zenginleştirildiğinde, Şekil 5B'de olduğu gibi bir yapı görülürken, kombinasyon ortamına (cDM) maruz kalan tek katmanlar daha pürüzsüz bir yapı göstermektedir (Şekil 5C).
Tek katmanlı oluşum kantitatif olarak TEER ölçümü ile takip edilebilir (Şekil 6A). Tamamen akıcı bir tek katman, ~100 Ω · cm 2'lik bir TEER değerine sahiptir ve bu da herhangi bir farklılaşma ortamına maruz kaldığında ~ 1000 Ω · cm2'ye yükselir (Şekil 6B). Tüm ortam koşullarındaki tek katmanlar, Lucifer Sarısı'na (0,45 kDa) düşük görünür geçirgenlik (Puygulaması) gösterir. IEM'de kültürlenen ileal monokatmanlar tarafından lizozim sekresyonu, IEM'de kültürlenen tek katmanlı tabakalardan daha yüksekti ve eDM veya cDM'de 4 gün daha (+ sonraki eDM veya cDM olarak gösterilir) (Şekil 6D). IEM, IEM + sonraki eDM veya IEM + sonraki cDM'de kültürlenen tek katmanlar, H & E boyaması ile gözlemlenebileceği gibi farklı morfoloji göstermektedir (Şekil 6E). IEM ve cDM ortamlarındaki kolon organoid kaynaklı epitel monokatmanları pürüzsüz bir apikal yüzeye sahipken, enterosit diferansiye monokatmanlar, Wnt. Ki67-pozitif proliferatif hücrelerin yokluğunda invaginasyonlu apikal morfoloji sunar, sadece genişleme koşullarında tespit edilebilir. Alcian Blue ve MUC2 boyası mukus, goblet hücreleri tarafından üretilir ve sırasıyla Wnt, Notch ve EGF sinyallemesi inhibe edildiğinde eDM'de ve daha belirgin olarak cDM'de farklılaşan tek katmanlarda görselleştirilir (Şekil 6E). Farklılaşma üzerine, proliferatif hücreler azalırken, goblet hücresi ve enterosit belirteci gen ekspresyonu, sırasıyla qRT-PCR ile LGR5, MUC2 ve ALPI gen ekspresyonu nicelleştirmesi ile gösterildiği gibi, IEM koşulları altında gözlenenlere kıyasla artar (Şekil 6F).
Şekil 1: Dondurulmuş organoidlerden bir bağırsak organoid kültürünün oluşturulması. (A) Çözüldükten sonra bağırsak organoid kültürünün temsili parlak alan görüntüsü. (B) 24 kuyucuklu bir kültür plakasının her bir kuyucuğuna ekilen ECM kubbeleri (50 μL). (C) Pasaja hazır normal bir bağırsak organoid kültürünün temsili görüntüsü. (D) Işık mikroskobu altında organoidler içeren 15 mL'lik bir tüpte ECM'nin varlığının nasıl kontrol edileceğine dair temsili görüntü. (E) Pasaja hazır, tomurcuklanan bir bağırsak organoid kültürünün temsili görüntüsü. (F) Organoidlerin mekanik olarak kesilmesi için düşük retansiyonlu 1250 μL filtre ucu (solda) ve daraltılmış cam pipet (sağda) üzerine takılı 10 μL plastik pipet ucu. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltma: ECM = hücre dışı matris. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tek katmanların bakımı veya hazırlanması için bağırsak organoidlerinin işlenmesi . (A) Mekanik bozulmadan sonra bağırsak organoidlerinin temsili görüntüsü. (B) Pasajdan sonra tohumlanan bir bağırsak organoid kültürünün temsili görüntüsü. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Tek katmanlı hazırlık için bağırsak organoidlerinden tek hücrelerin hazırlanması. (A) Tek katmanlı hazırlık için hasat edilmeye hazır bağırsak organoidleri. (B) Tek hücre hazırlığından sonra tek hücreler ve küçük hücre kümeleri. (C) Bir ızgara odasında sayım sırasında görünür tek hücreler ve küçük kümeler. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Membranlar üzerinde tek hücrelerin tohumlanmasından sonra tek katmanlı oluşum. (A) Membranlar üzerinde tohumlamadan hemen sonra tek hücreler. Ortalama olarak, (B) tek katman tohumlamadan 1-3 gün sonra yaklaşık% 50 akıcıdır, (C) 3-5. günde ~% 90 oranında akıcıdır ve (D) tüm tek katman 4-7. gün civarında oluşmuştur. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Tek katmandaki belirli hücre tiplerinin zenginleştirilmesi . (A) IEM'de 8 gün sonra tek katman. (B) IEM'de 4 gün ve eDM'de 4 gün sonra enterositlerle zenginleştirilmiş tek katmanlı. (C) IEM'de 4 gün ve cDM'de 4 gün sonra kadeh hücreleri ve diğer hücre tipleri ile zenginleştirilmiş tek katmanlı. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: IEM = bağırsak organoid genişleme ortamı; eDM = enterosit farklılaşma ortamı; cDM = kombinasyon farklılaştırma ortamı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Epitelyal organoid monokatmanları kullanan çeşitli olası okumalar . (A) TEER'i ölçmek için membran ekindeki elektrot. (B) TEER değerleri, tek katman birleşime ulaştığında ~ 100 Ω ·cm2 değeri ile zaman içinde artar. Tek katmanları enterositlerle veya farklı epitel hücrelerinin bir kombinasyonuyla zenginleştirdikten sonra, TEER 1000 Ω ·cm2 veya daha yükseğe çıkar. (C) Tüm ortam koşullarında (IEM + 4 gün IEM/eDM/cDM) tek katmanlar Lucifer Yellow'a karşı geçirimsizdir. (D) Lizozimin ekspresyonu, genleşme ortamında yetiştirildiğinde ileum monokatmanlarında, her iki tipte de farklılaşma ortamından (IEM + 4 gün IEM / eDM / cDM) daha yüksektir. (E) Kolon monokatmanları, H&E, Ki67, Alcian Blue ve MUC2 lekeleri tarafından görselleştirildiği gibi farklı ortam koşullarına (IEM + 4 gün IEM / eDM / cDM) maruz kaldıklarında farklı morfolojiler gösterir. Beklendiği gibi, genleşme ortamında kültürlenmiş tek katmanlar, Ki67 boyaması ile gösterildiği gibi çok çoğalır. eDM ile farklılaşan tek katmanlılar, proliferatif hücreler olmadan sütunlu bir epitel gösterir. cDM'ye maruz kalan tek katmanlı katmanlar da proliferatif değildir ve daha fazla kadeh hücresi geliştirir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (F) qRT-PCR ile kolon monokatmanlarında kök hücre (LGR5), kadeh hücresi (MUC2) ve enterosit (ALPI) belirteci gen ekspresyonu. Kısaltmalar: TEER = transepitelyal elektrik direnci; IEM = bağırsak organoid genişleme ortamı; eDM = enterosit farklılaşma ortamı; cDM = kombinasyon farklılaşma ortamı; Puygulaması = görünür geçirgenlik katsayısı; LGR5 = lösin bakımından zengin tekrar-içeren G-proteini eşleşmiş reseptör 5; H&E = hematoksilin ve eozin; AB = Alcian Mavisi; MUC2 = müsin-2; ALPI = bağırsak alkali fosfataz; qRT-PCR = kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Membran kesici uçlar | ||
| 24 kuyucuklu plakalar | 96 delikli plakalar | |
| Membran yüzeyi (cm2) | 0.33 | 0.143 |
| Apikal hacim (μL) | 150 | 100 |
| Bazolateral hacim (μL) | 800 | 300 |
| # Kuyu başına tohumlanacak hücreler | 450,000 | 200,000 |
| Membran uçlu HTS plakaları | EVCİL HAYVAN | EVCİL HAYVAN |
| Ayrı uçlu plakalar | EVCİL HAYVAN | NA |
| Membran uçlu ışık geçirmez plakalar | ||
| Elektrotlar iki format için farklıdır | Malzeme Tablosuna bakın | |
Tablo 1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, bağırsak organoidlerinin genel manipülasyonunu ve bakımını ve ayrıca bu organoidlerden türetilen epitel monokatmanlarının hazırlanmasını ve olası uygulamalarını açıklar. Bugüne kadar, monokatmanlar, normal, daha önce ve aktif olarak iltihaplı bağırsak dokusundan türetilen duodenum, ileum ve kolon organoidlerinin farklı bölgelerinden başarıyla hazırlanmıştır (yayınlanmamış veriler). Hasta kaynaklı organoid monokatmanların uygulanması, bariyer fonksiyonunun hastalığa ve hastaya özgü bir şekilde incelenmesini ve çeşitli ilaç tedavilerine hastaya özgü yanıtların incelenmesini kolaylaştırır. Hücre çizgileri, bağırsak enterositleri ve kadeh benzeri hücreler içeren farklılaşmış ve polarize tek katmanlar oluşturabilse de, birçok farklı enzim ve taşıyıcı bu hücre hatlarında anormal bir şekilde eksprese edilir ve bu da karmaşıklığın ve fizyolojik ilginin azalmasına neden olur 3,30. Organoid kültür teknik olarak hücre kültüründen daha zorlu ve zahmetlidir; Bununla birlikte, organoidler in vivo durumu daha iyi temsil ederken, hücre hatları karmaşık kurulumlarda doku yanıtlarını temsil etmekte defalarca başarısız olmuştur.
Birincil doku bazlı modeller in vivo situation'u temsil edebilse de, test hayvanlarının kullanılmasını veya sınırlı kullanılabilirlik ve etik kısıtlamalarla ilişkili insan materyaline erişimi gerektirir. Ek olarak, birincil dokunun genişletilebilirliği yoktur veya sınırlıdır ve genişletilmiş deneysel zaman dilimlerinde stabil değildir. Organoid teknoloji, genetik ve fizyolojik olarak stabil uzun vadeli genişleyen kültürler oluşturmak için sınırlı miktarda primer doku gerektirirken, epitel dokusu karmaşıklığını ve hasta heterojenliğini temsil etmektedir. Caco-2 gibi farklı hücre hatları genellikle epitel tek katmanlarını hazırlamak için kullanılır. Kako-2 hücrelerinin, herhangi bir deney için kullanılabilecek polarize bir epitel tek katmanı oluşturması 21 gün sürer30. Organoid türevi epitel monokatmanları, mevcut protokolde açıklandığı gibi organoid tek hücrelerden hazırlanır ve 3-6 gün sonra, enterositler veya kadeh hücreleri ile zenginleştirmek için daha da farklılaştırılabilen polarize bir epitel oluşturur.
Tek katmanlar, çip üzerindeki organlarda görüldüğü gibi mikroakışkan bir akıştan veya mekanik gerilmeden yoksun statik bir modeldir. Bununla birlikte, (otolog) bağışıklık hücrelerinin yanı sıra bakteri veya parazitlerle birlikte kültürlenme fırsatı sunarlar17,18,19,31. Organoidler, genleşme aşamasındayken tek katmanlı hazırlık için uygundur; bağırsak organoidleri için, bu genellikle pasajdan 3 gün sonradır. Organoidlerin tek hücrelere ayrışması, sindirim enzimlerine uzun süre maruz kalmamak için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Tek hücreli bir süspansiyonun hazırlanmasından sonra kök hücrelerin sağkalımını arttırmak için, Rho ile ilişkili protein kinaz inhibitörü (ROCK inhibitörü), Y27632, anoikis kaynaklı hücre ölümünü önlemek için hücrelere eklenir32. Ayrıca, organoid özelliklerini ve polarizasyonlarını korumalarını sağlamak için ECM ile önceden kaplanmış bir membran üzerindeki tek katmanların kültürlenmesi kritik öneme sahiptir. Dış uyaranlara karşı GI yolu epitel hücresi yanıtlarını ölçen fonksiyonel tarama testleri için, organoid kültürlerin, geliştirilecek tahlil türüne ve nihai okumalara bağlı olarak gerekli hücresel karmaşıklığı temsil etmesi önemlidir.
İntestinal organoidler, in vivo olarak kök, TA, enterosit, Paneth, kadeh ve enteroendokrin hücreler 4,5 gibi farklı epitel hücre tiplerini temsil eder ve bu protokolde açıklandığı gibi hazırlanmış tanımlanmış bir organoid ortam kullanılarak hazırlanır ve sürdürülür. Enterosit farklılaşması, Wnt yolunu ikili olarak inhibe eden kültür koşulları kullanılarak organoidlerin dört gün daha kültürlenmesiyle, Wnt moleküllerinin / aktivatörlerinin çıkarılmasıyla ve Kirpi inhibitörü IWP-2'nin (enterosit kolon farklılaşma ortamı, eDM) eklenmesiyle teşvik edilebilir. Mukus üreten kadeh hücreleri bariyer fonksiyonlu homeostazı için de gerekli olduğundan, ikinci bir kültür koşulu, IEM'de kullanılan% 50 (0.5 nM NGS-Wnt) yerine, Wnt3aCM'yi% 10'a (veya NGS-Wnt için 0.1 nM) düşürerek Wnt sinyallemesinin kısmen aktif tutulduğu kök, enterosit ve goblet hücreleri içeren daha heterojen bir hücre popülasyonu üretmeyi amaçlamaktadır. Enterosit farklılaşması için zenginleştiren eDM'nin aksine, bu ikinci koşul birkaç hücre tipinin varlığını destekler ve bu nedenle kombinasyon farklılaşma ortamı (cDM) olarak adlandırılır.
Organoid türevi monokatmanların uygulamaları, epitel bariyer bütünlüğünün izlenmesinin yanı sıra sıkı bağlantı ve taşıyıcı ekspresyonunun incelenmesini içerir. Bariyer bütünlüğü, geçirgenlik ve taşıma, bu protokolde tanıtılan okumalar kullanılarak analiz edilebilir. TEER sıkı kavşaklar yoluyla iyonik iletkenliği ölçerken, geçirgenlik testi su akışını ve dolayısıyla sıkı kavşaklar boyunca parasellüler geçirgenliği ölçer28,29. Tek katmanların epitel bariyer bütünlüğü, geçirgenliği ve taşıma işlevselliği, membran eklerinin apikal ve bazolateral bölmeleri boyunca farklı floresan veya radyoaktif substratların trafiğini ölçerek değerlendirilebilir. TEER ölçümleri, bariyer bütünlüğünün nicelleştirilmesine izin verir, polarize enterositlere ve kadeh hücrelerine doğru farklılaşırken değerlerde bir artış gösterir ve tek katmanlara zarar verdikten sonra bir azalma gösterir.
Lucifer Sarı geçirgenlik testi, ilk bariyer bütünlüğü değerlendirmesi ve tek katmanlı yaralanmalara neden olduktan sonra azaltılmış bütünlüğün doğrulanması için kullanılabilir. Bu protokol, Lucifer Sarı geçirgenliğini, tek katmanlı bütünlüğün bir göstergesi olarak apikalden bazolateral bölmeye getirir. Benzer şekilde, 4 veya 40 kDa dekstran gibi diğer floresan etiketli reaktifler, bariyer hasarına neden olan ajanların sonucu olarak artan parasellüler geçirgenliği değerlendirmek için kullanılabilir. Rhodamine 123 gibi floresan etiketli substratlar, P-glikoprotein-1 gibi farklı taşıyıcıların aktivitesini ölçmek için kullanılabilir. Bu protokolde açıklanan floresan testi, apikal bölmeye salgılanan lizozim gibi protein seviyelerinin ölçülmesine izin verir. Pro-inflamatuar sitokinler tarafından yaralanma indüksiyonuna verilen yanıtlar, bu okumaların yanı sıra bariyer geri kazandırıcı bileşiklerin potansiyel etkileri ile ölçülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Hollanda LSH sektörünün Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health ~ Holland (LSH-TKI) kamu-özel sektör ortaklıkları (PPP) ödeneği tarafından desteklenmektedir LSHM16021 Proje numarası ile Hubrecht Organoid Teknolojisine (HUB) toksikoloji modellemesi için yeni bir araç olarak Organoidler ve Hastalık Modelleme ve Toksikoloji departmanına HUB iç finansmanı. Sabine Middendorp (Pediatrik Gastroenteroloji Bölümü, Wilhelmina Çocuk Hastanesi, UMC, Utrecht) ve Hugo R. de Jonge ve Marcel J.C. Bijvelds (Gastroenteroloji ve Hepatoloji Bölümü, Erasmus MC, Rotterdam) laboratuvarlarına, membran eklerinde tek katmanlı tabakalar kurmak için ilk teknik desteği sağladıkları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
| 1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
| 15 mL conical tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 24-well cell culture plates | Greiner bio-one | 662160 | |
| 24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) | Corning | 351156 | |
| 24-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 3378 | |
| 24-well plate with Transwell inserts | Corning | 3470 | |
| 40 µm cell strainer | PluriSelect | 43-50040-01 | |
| 50 mL conical tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner bio-one | 657160 | |
| 96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
| 96-well fast thermal cycling plates | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
| 96-well HTS Fluoroblok Transwell plate | Corning | 351162 | |
| 96-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 7369 | |
| 96-well transparent culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
| A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
| Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | Cell dissociation reagent 2 |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
| B27 supplement | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
| Cell culture microscope (light / optical microscope) | Leica | ||
| CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| CO2 incubator | PHCBI | ||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| DEPC treated H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
| DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
| EVOM2 meter with STX electrode | WTI | ||
| Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
| Glass pipettes | Volac | ||
| GlutaMAX | Life Technologies Europe BV | 35050038 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
| Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
| IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| Ki67 primary antibody | Sanbio | BSH-7302-100 | |
| Ki67 secondary antibody | Agilent | K400111-2 | |
| Kova International Glasstic Slide with Counting grids | Fisher Emergo | 10298483 | |
| Laminar flow hood | Thermo scientific | ||
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | extracellular matrix (ECM) |
| MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
| MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | |
| Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) | Gilson | ||
| Microtome | Leica | ||
| MUC2 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
| MUC2 secondary antibody | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
| Multichannel pipette (200 µL) | Gilson | ||
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Oligonucleotide ALPI1/Forward | Custom-made | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
| Oligonucleotide ALPI1/Reverse | Custom-made | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
| Oligonucleotide LGR5/Forward | Custom-made | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
| Oligonucleotide LGR5/Reverse | Custom-made | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
| Oligonucleotide MUC2/Forward | Custom-made | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
| Oligonucleotide MUC2/Reverse | Custom-made | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
| Oligonucleotide TBP/Forward | Custom-made | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
| Oligonucleotide TBP/Reverse | Custom-made | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | |
| Optical adhesive covers | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
| PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies Europe BV | 15140122 | |
| Plate shaker | Panasonic | ||
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
| Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | antimicrobial formulation for primary cells |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
| Reagent reservoir for multichannel pipet | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
| REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe | WTI | ||
| Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| Serological pipettes | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
| Serological pipettor (Pipet-Aid) | Drummond | ||
| Single edge razor blade | GEM Scientific | ||
| Superscript 1st strand system for RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
| Tecan Spark 10M plate reader | Tecan | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Cell dissociation reagent 1 |
| Water bath | Grant | ||
| Y27632 (ROCK inhibitor) | AbMole | M1817 |
References
- Haegebarth, A., Clevers, H. Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin. The American Journal of Pathology. 174 (3), 715-721 (2009).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Martínez-Maqueda, D., Miralles, B., Recio, I., et al. HT29 Cell Line. The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 113-124 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5(+) liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 11 (2), 179-194 (2013).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 1-20 (2019).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- d'Aldebert, E., et al. Characterization of human colon organoids from inflammatory bowel disease patients. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 363 (2020).
- Dotti, I., et al. Alterations in the epithelial stem cell compartment could contribute to permanent changes in the mucosa of patients with ulcerative colitis. Gut. 66 (12), 2069-2079 (2017).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270 (2017).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- van Es, J. H., et al. Wnt signalling induces maturation of Paneth cells in intestinal crypts. Nature Cell Biology. 7 (4), 381-386 (2005).
- van Es, J. H., et al. Dll1 marks early secretory progenitors in gut crypts that can revert to stem cells upon tissue damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- de Lau, W. B. M., Snel, B., Clevers, H. C.
- Basak, O., Beumer, J., Wiebrands, K., Seno, H., van Oudenaarden, A., Clevers, H. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).
- Beumer, J., et al. Enteroendocrine cells switch hormone expression along the crypt-to-villus BMP signalling gradient. Nature Cell Biology. 20 (8), 909-916 (2018).
- Yin, X., Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H., Langer, R., Karp, J. M. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
- Miao, Y., et al. Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo. Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Blume, L. -F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Die Pharmazie. 65 (1), 19-24 (2010).
- Lea, T. Caco-2 cell line. The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 103-111 (2015).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
