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Neuroscience

Imaging tomografico ad emissione di positroni per la misurazione in vivo del contenuto di mielina nel modello di ratto di lisolecitina della sclerosi multipla

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/62094
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1
1Laboratory of Nuclear Medicine (LIM-43), Departamento de Radiologia e Oncologia, Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, 2Nuclear Medicine Division, Hospital Sirio-Libanes

ERRATUM NOTICE

Summary

Questo protocollo ha lo scopo di monitorare i cambiamenti in vivo della mielina (demielinazione e remielinazione) mediante l'imaging della tomografia ad emissione di positroni (PET) in un modello animale di sclerosi multipla.

Abstract

La sclerosi multipla (SM) è una malattia neuroinfiammatoria con degenerazione assonale e neuronale in espansione e demielinizzazione nel sistema nervoso centrale, che porta a disfunzioni motorie, disabilità psichica e deficit cognitivo durante la progressione della SM. La tomografia ad emissione di positroni (PET) è una tecnica di imaging in grado di quantificare alterazioni cellulari e molecolari in vivo.

I radiotraccianti con affinità con la mielina intatta possono essere utilizzati per l'imaging in vivo dei cambiamenti del contenuto di mielina nel tempo. È possibile rilevare un aumento o una diminuzione del contenuto di mielina, il che significa che questa tecnica di imaging può rilevare i processi di demielinizzazione e remielinizzazione del sistema nervoso centrale. In questo protocollo dimostriamo come utilizzare l'imaging PET per rilevare i cambiamenti di mielina nel modello del ratto di lisolecitina, che è un modello di lesione della demielinazione focale (indotta dall'iniezione stereotassica) (cioè un modello di malattia da sclerosi multipla). 11 la commissione per la L'imaging PET C-PIB è stato eseguito al basale e 1 settimana e 4 settimane dopo l'iniezione stereotassica di litoletta 1% nello striato destro (4 μL) e nel corpo calloso (3 μL) del cervello del topo, consentendo la quantificazione della demielinizzazione focale (sito di iniezione dopo 1 settimana) e del processo di remielinizzazione (sito di iniezione a 4 settimane).

L'imaging PET mielina è uno strumento interessante per monitorare i cambiamenti in vivo nel contenuto di mielina che potrebbero essere utili per monitorare la progressione della malattia demielinante e la risposta terapeutica.

Introduction

La sclerosi multipla (SM) è una malattia neuroinfiammatoria che colpisce il sistema nervoso centrale, caratterizzata da infiammazione, demielinazione e perdita assonale1. La prognosi di questa malattia è variabile anche con progressi nel trattamento, ed è una delle cause più comuni di deficit neurologici nei giovani1. La diagnosi di SM si basa sui criteri di manifestazione clinica e visualizzazione delle lesioni caratteristiche mediante risonanza magnetica (MRI)2,3.

La tomografia ad emissione di positroni (PET) può essere uno strumento utile per il monitoraggio in vivo della progressione della SM e degli effetti terapeutici. Il radiotracciatore B composto di Pittsburgh (PIB) etichettato con carbonio-11(11C-PIB) è ampiamente usato per quantificare le placche β-amiloide; tuttavia, nell'ultimo decennio, è stato studiato per quantificare il contenuto di mielina e mostrare la demielinazione dinamica e la remielinazione4,5,6.

Diversi traccianti PET amiloide (11C-PIB, 18F-florbetaben,18F-florbetapir, 18F-flautometamol) possono essere utilizzati per quantificare la mielina e fornire importanti informazioni sulla progressione della malattia e sulla risposta terapeutica, consentendo l'identificazione dei processi di demielinizzazione e remielinizzazione, senza l'interferenza della neuroinfiammazione, che può verificarsi con le immagini di risonanza magnetica convenzionali ( MRI)7. L'imaging pet amiloide ha mostrato una diminuzione dell'assorbimento del tracciante nei pazienti affetti da SM attivi rispetto ai pazienti non attivi che potrebbe essere spiegata dai primi danni alla materia bianca nei pazientiattivi 8. L'assorbimento del tracciante amiloide inferiore è stato anche associato al declino cognitivo in uno studio di follow-up, mostrando che questa tecnica è uno strumento prezioso per studiare la fisiopatologia della malattia e gli esiti clinici9.

Il modello di ratto di litolettacitina (LPC) è un modello chimico indotto di sclerosi multipla, in cui la tossina iniettata, LPC, induce un'alta risposta di macrofagi che si traduce in un aumento dell'infiammazione e, di conseguenza, della demielinazione10,11. La demielinizzazione viene rapidamente invertita, in circa 4 settimane, il che lo rende un buon modello per valutare i processi di demielinizzazione e remielinizzazione nei roditori. Questo modello è già stato valutato utilizzando l'imaging PET, con buoni risultati e correlazione con saggi post mortem12.

Qui presentiamo il protocollo per l'imaging PET mielina con 11C-PIB nel modello del ratto di lisolecitina, mostrando questa tecnica di imaging come uno strumento utile per la misurazione in vivo del contenuto di mielina.

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Protocol

Tutte le procedure sono state condotte in conformità con le linee guida del Consiglio Nazionale per il controllo della Sperimentazione Animale (CONCEA, Brasile) e sono state approvate dal Comitato Etico per la Ricerca Animale della Facoltà di Medicina dell'Università di San Paolo (CEUA-FMUSP, Brasile - numero di protocollo: 25/15).

NOTA: In questo protocollo, mostriamo come indurre un modello di ratto di lisolecitina della sclerosi multipla e come acquisire e analizzare le immagini pet mielina.

1. Preparazione della soluzione di lisolecitina

  1. Pesare la lilsolecitina (L-α-lisofosfatilcolina dal tuorlo d'uovo) su una scala analitica utilizzando un tubo di plastica conico (1,5 ml).
  2. Aggiungere la salina sterile al tubo per fare soluzione all'1% (ad esempio: pesare 1 mg di litoletta e scioglierla con 100 μL di soluzione salina) e sciogliere la litoletta scuotendo il tubo (scuotendo da un lato all'altro e non girando dall'alto verso il basso).
  3. Preparare la soluzione poco prima di iniziare l'induzione del modello animale (non stoccare la soluzione pronta finale).

2. Modello di ratto di lisolecitina - Chirurgia stereotassica

  1. Utilizzare ratti Wistar maschi del peso compreso tra 220 e 270 g. Utilizzare guanti e maschera durante tutte le procedure.
  2. Indurre l'anestesia con il 5% di isoflurane miscelato in 100% O2 (1 L/min) utilizzando una scatola di induzione. Controllare se l'animale viene anestetizzato osservando l'assenza di movimento (si deve solo respirare).
  3. Posizionare l'animale in un apparecchio stereotassico su una pastiglia riscaldante. Fissare il naso e le orecchie dell'animale all'attrezzatura.
    NOTA: I dettagli su come eseguire la chirurgia stereotassica sono disponibili nel JoVE Science Education Database. Neuroscienze. Chirurgia stereotassica dei roditori. JoVE, Cambridge, MA, 2021.
    1. Monitorare l'anestesia per l'intera procedura (inclusa la chirurgia e l'acquisizione di immagini). Per regolare la concentrazione di isoflurane, osservare la frequenza respiratoria dell'animale. Una frequenza respiratoria rapida richiede una maggiore concentrazione e una bassa frequenza respiratoria richiede una minore concentrazione anestetica.
  4. Iniettare l'analgesico (chetoprofene - 5 mg / kg) per via sottocutanea (diluire il farmaco a 1 mL in salina, questo aiuterà a idratare l'animale).
  5. Metti la crema per gli occhi negli occhi dell'animale per proteggerti dalla disidratazione.
  6. Utilizzare una soluzione di clorexidina allo 0,5% per pulire l'area di incisione.
  7. Iniettare 100 μL di cloridrato di lidocaina il 2% per via sottocutanea nella regione di incisione.
  8. Radere l'area del cranio.
  9. Utilizzare strumenti sterili per questa procedura.
  10. Usando un bisturi, fare un'incisione di circa 2 cm nella pelle sopra il cranio.
  11. Esponi il cranio con morsetti Bulldog.
  12. Utilizzare un tampone per pulire l'area del cranio con l'1% di perossidasi di idrogeno.
  13. Individuare e contrassegnare il bregma (un atlante cerebrale stereotassico del ratto può aiutare a identità il Bregma).
  14. Posizionare la siringa Hamilton (siringhe μL neuros) al bregma.
  15. Usando il bregma e un atlante stereotassico come riferimento, posizionare la siringa Hamilton alle seguenti coordinate: Antero-posteriore: -0,30 mm, latero-laterale: -3,0 mm e ventrale fino a quando non tocca l'osso crano, e segnare il cranio e notare l'orientamento delle coordinate sulla carta.
  16. Perforare il cranio alla coordinata contrassegnata. Fare attenzione con dura mater (danneggiare dura mater può causare un sacco di sanguinamento).
  17. Riempire la siringa Hamilton con 7 μL di soluzione di litolettatina (1% in salina). Un volume maggiore può essere posizionato nella siringa, ma verranno iniettati solo 7 μL (espulsi le bolle dalla siringa per misurare correttamente il volume).
  18. Posizionare la siringa Hamilton alle coordinate precedenti per iniziare l'iniezione di farmaco (totale di 7 μL in 3 diverse coordinate stereotattiche ventrali). Considerando le coordinate precedentemente note, abbassare la siringa Hamilton alla coordinata ventrale -5,0 mm.
  19. Iniettare molto lentamente 2 μL di soluzione di lisolecitina (1 μL/10 min). Aspetta 3 minuti.
  20. Portare l'ago fino alla coordinata stereotassica ventrale successiva (-4,2 mm) e iniettare lentamente 2μL di soluzione di litolettatina (1 μL / 10 min). Aspetta 3 minuti.
  21. Iniettare la terza coordinata ventrale -3,0 mm (3 μL di soluzione di litolettatina - 1 μL/ 10 min).
  22. Attendere 5 minuti e quindi rimuovere la siringa Hamilton dal cervello.
  23. Sutura la pelle.
  24. Rimuovere l'animale dall'apparato stereotattico e lasciare che l'animale si svegli.
  25. Riportare l'animale nella gabbia di casa, tenere l'animale da solo e sotto supervisione per verificare la presenza di segni di disagio.
  26. Iniettare analgesico sottocutaneo (chetoprofene - 5 mg/kg) diluito in salina, a 24 ore e 48 ore dopo l'intervento chirurgico.

3. Acquisizione pet

  1. Assumere da 7 a 20 MBq di radioattività 11C-PIB in una siringa (1 ml è il volume massimo consentito per l'iniezione endovenosa nei ratti).
  2. Anestetizzare l'animale con il 5% di isoflurane mescolato al 100% O2 (1 L/min) utilizzando la scatola di induzione.
  3. Iniettare 11C-PIB (radioattività definita al precedente punto 4.1) nella vena del pene o nella vena di coda del ratto (entrambi i siti di somministrazione vanno bene, la decisione è una scelta personale. Consigliamo solo di non utilizzare un'iniezione retro-orbitale poiché la posizione è troppo vicina alla regione di interesse (il cervello) e può compromettere la qualità dell'immagine.
    NOTA: L'acquisizione dell'immagine del punto di tempo di base viene eseguita prima dell'iniezione stereotassica e degli altri 2 punti di tempo a 1 settimana e 4 settimane dopo l'intervento chirurgico.
  4. Rimuovere l'animale dall'anestesia per consentire all'animale di svegliarsi (lasciare l'animale su un pad caldo fino a quando non è completamente sveglio).
  5. Riportare l'animale nella gabbia di casa.
  6. Attendere 30 minuti per il passaggio successivo.
  7. Anestetizzare i ratti con il 5% di isoflurane miscelato al 100% O2 (1 L/min) utilizzando una scatola di induzione.
  8. Aprire il software dello scanner PET.
  9. Selezionare Scansione > Pronto per animali domestici.
  10. Dettagli completi del ricercatore principale, ID studio, ID serie, ID animale, peso animale (g) e note aggiuntive. Selezionare Avanti.
    NOTA: utilizzare il punto (.) per il numero decimale nel peso animale.
  11. Modificare l'area ROI per la scansione (in genere tra 3 e 8). Questa è l'area che verrà inclusa nell'immagine (le aree tra i numeri 3 e 8 della copertina del letto appariranno nell'immagine finale).
  12. Posizionare il ratto anestetizzato su un letto standard per topi dello scanner PET e accendere l'anestesia (il 3% di isoflurane nel 100% O2 è un buon inizio, quindi il tasso di anestesia deve essere regolato se necessario). Per regolare l'anestesia, controllare i dati di monitoraggio del software dello scanner per verificare che l'animale respiri a un ritmo costante e lento.
    NOTA: Accendere la pompa per vuoto accoppiata al filtro a carbone attivo per raccogliere l'eccesso di gas isoflurane (se la pompa è disponibile).
  13. Applicare la crema per gli occhi per proteggere gli occhi dell'animale.
  14. Spingere il letto degli animali all'interno dello scanner IN PET.
  15. Dettagli completi dell'attività, tempo di calibrazione dell'attività, isotopo (C-11) e durata della scansione (20 minuti). Selezionare Avvia analisi.
    NOTA: apparirà un messaggio del letto mobile per animali domestici e il letto dell'animale si sposterà nell'apparecchiatura e si fermerà nella posizione del ROI precedentemente selezionata. Il tempo di acquisizione inizierà a contare e apparirà il numero di conteggi per secondo (CPS).
  16. Nel software dello scanner passare alla scheda Monitor a sinistra dello schermo, selezionare Cambia soglia alla modifica dei parametri respiratori (BPM).
    NOTA: verrà visualizzata una finestra, completa di parametro threshold (500). Selezionare OK.
  17. Passare allo 0% DI POTENZA per modificare i parametri di temperatura per riscaldare l'animale durante la scansione. Verrà visualizzata una finestra; completare il parametro (80 - 100). Selezionare OK.
    NOTA: scegli tra l'80 e il 100% di potenza in base alle condizioni di temperatura ambiente (più potenza, più caldo ostarà).
  18. Tornare alla scheda SCAN.
  19. Passare allo strumento di configurazione (icona a forma di ingranaggio) e completare il tempo di iniezione, l'attività rimanente, il tempo di calibrazione dell'attività rimanente. Selezionare Salva.
    NOTA: verrà visualizzata una finestra "Modificare i metadati del protocollo?" > SI
  20. Tornare alla scheda Monitor (controllare i parametri respiratori dell'animale e, se necessario, aumentare o diminuire la concentrazione di isoflurane - di solito è sufficiente il 3% in 100% O2).
  21. Al termine dell'acquisizione del PET, il messaggio Pet Ready apparirà nella scheda Scansione, controlla Arrow Out Icon (a sinistra dello strumento di configurazione) per spostare il letto degli animali.
  22. Rimuovere l'animale dall'anestesia e lasciare risvegliare su un pad caldo.
  23. Per ricostruire l'immagine, passare alla scheda Ricostruisci.
  24. Controlla l'icona più in basso a sinistra dello schermo e seleziona il file di studio che verrà ricostruito. Selezionare Avanti.
  25. Passare allo strumento Risoluzione energia. Apparirà una finestra. Configurare il picco di energia (keV) sul parametro dell'apparecchiatura (in base al controllo di qualità mensile). Selezionare Chiudi.
    NOTA: il picco di energia può cambiare ogni mese quando si esegue la calibrazione mensile delle apparecchiature.
  26. Mantenere tutti gli altri parametri come predefinito (dimensione voxel isometrica: 400 mm; numero di iterazioni: 30; Risoluzione energetica: 30%; Salvare solo l'ultima iterazione; deselezionare Mantieni dati binari) .
  27. Selezionare Aggiungi.
    NOTA: verrà visualizzata una finestra "La ricostruzione è stata aggiunta alla coda e inizierà una volta che gli altri avranno finito". Selezionare OK. Un file verrà visualizzato nell'elenco ricostruzione nella scheda Ricostruisci e lo stato apparirà come in attesa o % (stato) o finito.

4. Analisi delle immagini

NOTA: eseguire l'analisi delle immagini utilizzando un software di analisi delle immagini dedicato. Nel protocollo corrente la dimostrazione utilizza un programma software specifico, ma se non è disponibile, è possibile utilizzare altre opzioni.

  1. Apri PMOD > Fusibile.
  2. Passare alla scheda Corrispondenza nella parte superiore dello schermo.
  3. Aprite il menu Carica input (Load Input) al centro destro dello schermo e selezionate File di rilevamento automatico, selezionate File PET (DICOM, Interfile o NifTI), aggiungete a selezionato, fate clic su Operazioni (Operations), Riorienta orientamento standard (Reorient to Standard Orientation), fate clic su Carica (Load) e Chiudi (Close).
  4. Verificare se la specie animale è corretta nella parte inferiore dello schermo (RAT).
  5. Selezionare La casella Ritaglia in basso a destra dello schermo.
  6. Regolare le dimensioni della scatola gialla nell'immagine PET per prendere l'intero cervello.
  7. Fare clic sul pulsante Rigido a destra dello schermo. Nella finestra di conferma fare clic su Sì.
  8. Clicca sullo strumento cervello al centro destro dello schermo per aprire Atlante di riferimento. Selezionare Ratto Px (W.Schiffer) - T2.
  9. Selezionare Corrispondenza risultati dalla scheda in alto a destra (selezionare la scheda fase di elaborazione).
  10. Fare clic su Trasferimento dati (4aschedanel menu in alto a destra).
  11. Allineare l'immagine PET al modello di riferimento utilizzando lo strumento di rotazione (icona bianca al centro dell'immagine PET). Controllare l'allineamento per 3 piani anatomici.
  12. Salvare il file di co-registrazione (menu sul lato destro dello schermo).
  13. Selezionate formato di output (DICOMor NifTI), prefisso di directory e file. Fare clic su Salva.
    NOTA: se l'output co-registrato viene salvato come NifTi, le informazioni sull'immagine dell'intestazione verranno perse.
  14. Fare clic sul menu VOI nella parte inferiore dello schermo.
  15. Passare a Modello > Atlante nella parte inferiore dello schermo (sotto la finestra VOI).
  16. Selezionate Ratto Px (W.Schiffer) dal menu a discesa.
    NOTA: Se è necessario analizzare solo i 2C specifici, è possibile selezionare solo le aree cerebrali di interesse. Se vuoi tutte le aree cerebrali dell'atlante cerebrale, non è necessaria alcuna azione.
  17. Fare clic su Contorno nella parte inferiore dello schermo.
    NOTA: I VOI delle aree cerebrali appariranno nella finestra dei VOI.
  18. Disegnare manualmente il VOI nel sito della lesione e nell'area dell'emisfero cerebrale conlaterale(11C-PIB area di basso assorbimento e emisfero cerebrale contralaterale, rispettivamente).
  19. Clicca nell'area dell'immagine PET con 11C-PIB a basso assorbimento.
  20. Selezionare Nuovo VOI > OK.
    NOTA: verrà visualizzato un foglio di calcolo
  21. Passare all'icona SPHERE nella parte centrale dello schermo (a sinistra della finestra DEI)
    NOTA: verrà visualizzato un foglio di calcolo.
  22. Scegliete il nome VOI: lesione e selezionate Applica.
    NOTA: una sfera apparirà nell'immagine co-registrata.
  23. Allineare la sfera nell'area della lesione e regolare il VOI per tutti i piani anatomici.
  24. Fare clic su Chiudi (nella parte inferiore del foglio di calcolo).
  25. Selezionare la lesione VOI (dall'elenco DEI).
  26. Passare all'icona delle operazioni di mirroring VOI (in alto a destra nella finestra VOI) e selezionare Clona e specchia sinistra/destra.
  27. Passare a Calcola statistiche VOI selezionate nella parte superiore della finestra dell'elenco VOI. Passare all'icona Seleziona statistiche da calcolare per scegliere i dati di output (sul lato destro dell'icona delle statistiche DEL VOI). Di solito per il controllo del contenuto di mielina Statistiche per il gruppo di UB, Media, SD, Min, Max).
    NOTA: verrà visualizzato un foglio di calcolo. L'impostazione predefinita Data Unit è kBq/cc. Nella parte superiore sinistra del foglio di calcolo (STATISTICHE VOI) è possibile controllare l'unità dati come SUV (Standardized Uptake Value). Se hai completato correttamente i dettagli di amministrazione e acquisizione delle immagini del radiotracciatore nel software dello scanner, come descritto in precedenza, i dati del SUV verranno calcolati automaticamente dal software PMOD, in caso meno, è possibile modificare i dettagli.
  28. Passare a Copia utilizzando il formato del numero delle impostazioni locali del sistema.
    NOTA: verificare se tutte le statistiche sono selezionate per la copia come output (icona Controlla nella parte superiore destra dello schermo). I dati che verranno copiati dipendono dall'unità dati selezionata.
  29. Incollare i dati di output in un Blocco note o in un foglio di calcolo.
    NOTA: fai attenzione alle impostazioni software per i simboli di punti e virgole tra i numeri. Questo può essere diverso tra le configurazioni del linguaggio.
  30. Salvare il file con il nome e i dettagli dello studio.

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Representative Results

La figura 1 mostra 11 immaginiPET C-PIB illustrative con modifiche mieline nel tempo. Nella scansione di base, non è possibile vedere alcuna differenza nel contenuto di mielina (cioè non è presente alcuna demielinazione). Nell'immagine del punto di tempo di 1 settimana, è possibile vedere la lesione demielinizzata focale (nell'emisfero destro) come indicato dalla freccia bianca. Le immagini sono presentate nei 3 piani anatomici (coronale, assiale e sagittale) ed è possibile identificare la lesione demielinata in tutti loro. L'immagine di 1 settimana è l'illustrazione di una lesione ben delimitata nel sito di iniezione, che rappresenta la corretta induzione del modello e il rilevamento delle immagini. Nell'immagine di 4 settimane, nessuna lesione è più visibile, indicando che si è verificata la remielinazione e che il contenuto di mielina è tornato alla normalità (o vicino ad esso).

I grafici rappresentativi mostrano la quantificazione delle immagini di 4 animali nei 3 diversi punti di tempo. Il primo grafico mostra i risultati della quantificazione del rapporto tra lesion (VOI manuale) e lato contralto che dimostrano più cambiamenti di mielina focale, dove è stata eseguita l'iniezione di litolettatina. Il secondo grafico mostra la stessa quantificazione, ma nello striato (striato iniettato al rapporto contralaterale) e in questo caso la differenza non è statisticamente significativa, il che può essere spiegato dalla piccola dimensione del campione e perché il VOI è più grande e la concentrazione di radioattività viene misurata non solo dove è stata iniettata la litolettatina.

Le differenze tra i gruppi sono state analizzate dal test di Kruskal Wallis, seguito dal test di Dunn per confronti multipli e i risultati sono presentati come ± SD. Nella lesione VOI (H = 7,063; P=0,017), nell'immagine di 1 settimana, il rapporto di assorbimento dei tracciari (0,90±0,07) era inferiore del 16% rispetto al basale (1,07±0,06), con significatività statistica (p=0,024). Non sono state riscontrate differenze significative nell'immagine di 4 settimane (1,01±0,06).

Nello striato non sono state riscontrate differenze statistiche (H =1,412; P=0,5393). I rapporti di assorbimento per le immagini sono stati 1,07±0,07 per la linea di base, 1,02±0,07 per 1 settimana e 1,01±0,08 per 4 settimane.

Il terzo grafico (linea di fondo, grafico sinistro) presenta la quantificazione dello striato contralaterale (lato non iniettato). In questo grafico è possibile osservare che non c'era differenza (P=9397) tra i punti di tempo, il che significa che la variazione nel lato iniettato è dovuta a cambiamenti di mielina e non a variazioni di assorbimento del tracciante nel tempo.

Il grafico finale, in basso a destra, mostra la quantificazione del sito iniettato (lesione VOI) in animali in cui il modello non era ben indotto (probabilmente a causa di iniezione rapida di licitina, manipolazione stereotassica errata e / o preparazione errata della soluzione). In questo caso, l'assorbimento inferiore non è visto nel periodo di 1 settimana, il che significa che non si è verificato alcun processo di deielinizzazione e il basso assorbimento a 4 settimane può essere correlato a un successivo processo di deielinizzazione o danni ai tessuti, entrambe le situazioni sono correlate a una cattiva induzione del modello animale. Questo grafico è stato aggiunto al protocollo per esemplificare l'aspetto dei risultati quando l'induzione animale non è ben eseguita e per sottolineare l'importanza di ogni fase del protocollo, dall'inizio alla fine. Non ci sono differenze nell'assorbimento del tracciante (H = 2,745, P = 0,267) con rapporti di assorbimento di 1,06±0,05, 1,02±0,14 e 0,96±0,10 per le immagini PET di base, 1 settimana e 4 settimane.

La figura 2 aggiunge ulteriori informazioni ai risultati, dove la figura 2A descrive in dettaglio dove è stato disegnato il VOI manuale, sulla base del riferimento al modello MRI e la figura 2B mostra la colorazione blu veloce luxol (per i dettagli sul protocollo di colorazione blu veloce luxol, vedi De Paula Faria et al.13) dal lato iniettato e non iniettato a 7 giorni dopo iniezione stereotassica.

Figure 1
Figura 1: Illustrazione di 11immagini PET C-PIB che mostrano immagini di basale, 1 settimana e 4 settimane dopo l'iniezione stereotassica. I grafici in fondo alla figura rappresentano la quantificazione dell'assorbimento del tracciante (n=4) in diversi punti di tempo. I primi due grafici rappresentano il rapporto di assorbimento nel lato iniettato al lato contralaterale nella lesione e nello striato in un modello ben indotto (cioè ratti che presentano lesione dopo iniezione di litoletta). Il terzo grafico (in basso a sinistra) mostra la quantificazione dello striato non iniettato (controllo negativo), e il grafico finale (in basso a destra) rappresenta l'assorbimento di 11C-PIB nel sito di iniezione di animali che non presentavano lesione demielinata (modello gravemente indotto). I risultati vengono presentati come ±SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Dettagli sulla posizione della lesione. A) RITI illustrativi di lato iniettato (linea tratteggiata) e lato non iniettato (linea bianca) disegnati manualmente in base al modello MRI (regione del corpo calloso e striato) a 1 settimana dopo iniezione stereotassica. B) Colorazione blu veloce Luxol che mostra la demielinazione nell'emisfero iniettato rispetto al lato non iniettato (in alto: ingrandimento 40x, in basso: ingrandimento 100x). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il più grande vantaggio dell'uso del modello di lisolecitina per studiare la sclerosi multipla è la tempistica veloce per la demielinazione (circa 1 settimana) e la remielinazione (circa 4 settimane) che siverifica 14. Questo modello può anche essere indotto neitopi 15, tuttavia, l'induzione nei ratti è più vantaggiosa per l'imaging PET in vivo a causa delle maggiori dimensioni del cervello del topo rispetto ai topi.

Il primo passo del modello di induzione è quello di essere estremamente cauti. Questo modello è stato convalidato per l'imaging pet mielina da de Paula Faria etal. L'iniezione deve essere eseguita molto lentamente, 1 μL ogni 10 minuti, come modo per evitare danni ai tessuti. La soluzione di lisolecitina deve anche essere preparata lo stesso giorno dell'iniezione stereotassiva, preferibilmente poco prima di iniziare la procedura chirurgica. Se il modello verrà utilizzato per la prima volta in un gruppo di ricerca, si consiglia di convalidare il modello prima di eseguire qualsiasi quantificazione della mielina mediante imaging PET. La convalida deve includere l'analisi dei tessuti post mortem mediante colorazione mielina, ad esempio: istologia blu veloce Luxol, come mostrato nella figura 2, e immunoistochimica delle proteine di base mielina (MPB), nei diversi punti di tempo destinati ad essere utilizzati nell'analisi in vivo. Nella sezione risultati abbiamo mostrato una quantificazione dell'assorbimento del radiotracciatore in cui l'induzione della lesione non è stata ben riuscita e, pertanto, le differenze non sono state rilevate da 11imaging PET C-PIB.

La lesione da quantificare con questa tecnica deve essere maggiore della risoluzione dello scanner IN PET (circa 1 mm in apparecchiature precliniche e circa 5 mm nelle apparecchiature cliniche).

Una volta che il modello è ben indotto, la procedura di imaging deve essere ben pianificata, a causa del radiotracciante etichettato con carbonio-11, che ha una breve emipa emiura di 20 minuti. Il personale del laboratorio di imaging preclinico deve preparare tutto il materiale necessario, riempire il sistema di anestesia, verificare se tutto funziona correttamente e stampare i moduli da compilare durante l'esperimento. Lo scanner in PET deve anche essere verificato prima dell'esperimento, quando tutti i controlli di qualità necessari nell'apparecchiatura (a seconda del paese) devono essere eseguiti per verificare che lo scanner sia ben funzionante. Dopo aver ricevuto il tracciante per iniezione, la misurazione dell'attività deve anche essere misurata in un calibratore di dose calibrato per garantire la dose iniettata corretta e le informazioni (attività nella siringa, prima e dopo l'iniezione) scritte sulla forma, nonché il rispettivo momento in cui la misurazione è stata eseguita. Stabilire quale orologio verrà utilizzato, poiché il momento giusto è il momento sulla postazione di lavoro dello scanner PET, il tempo che verrà considerato nella correzione del decadimento delle immagini, pertanto, tutti gli orologi utilizzati durante l'esperimento devono essere sincronizzati con il tempo della workstation dello scanner.

Durante l'acquisizione dell'immagine animale, la temperatura e la respirazione animale devono essere monitorate e l'anestesia regolata, se necessario. La temperatura dipende dalla posizione e deve essere regolata per il benessere dell'animale. Al termine dell'acquisizione dell'immagine, è importante mantenere l'animale su un pad caldo per riprendersi prima di essere restituito alla gabbia.

L'elaborazione delle immagini è fondamentale per ottenere risultati affidabili dagli esperimenti che utilizzano l'imaging PET. L'ideale è che l'analizzatore non sia a conoscenza dei gruppi animali e/o del trattamento e che abbia già esperienza nelle immagini in PET con il tracciante pet utilizzato in modo tale da garantire una perfetta registrazione tra l'imaging PET e il modello MRI. Abbiamo usato il software PMOD in questo protocollo, ma se questo software non è disponibile, è possibile utilizzare software alternativo di quantificazione delle immagini, anche se bisogna prestare attenzione al raggiungimento di una buona definizione e quantificazione della regione cerebrale. Per la definizione della posizione della lesione, è necessario prestare particolare attenzione per garantire che il sito iniettato si trova all'interno della lesione te (è necessaria una conoscenza dell'anatomia cerebrale del ratto).

È importante dire che l'imaging PET mielina può essere eseguito anche in altri modelli di animali ms, mostrando lesioni imprevedibili, come già mostrato dal nostro gruppo nella marmoset sperimentale Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) modello5. Come già detto, il parametro importante da considerare nella quantificazione della lesione è la risoluzione dello scanner PET, che è la limitazione per il rilevamento di lesioni troppo piccole. L'imaging PET è una tecnica di imaging a bassa risoluzione rispetto ad altre tecniche come la risonanza magnetica, tuttavia è una modalità altamente specifica e, per questo motivo, la quantificazione delle immagini PET utilizza un modello anatomico, come la risonanza magnetica, per aiutare a disegnare la regione di interesse, come mostrato nel protocollo precedente.

Sebbene il disegno manuale dei TA dipenda dall'operatore, è l'opzione migliore per il modello animale LPC, poiché la lesione può essere variabile tra gli animali. Per diminuire la distorsione nel processo di quantificazione, è importante eseguire un VOI specchio, come spiegato nel protocollo, che si trova nella stessa regione e delle stesse dimensioni del lato iniettato. È anche importante avere in mente le coordinate stereotassiche quando si disegna il VOI nel modello MRI per garantire che sia considerata la giusta regione cerebrale. L'uso della colorazione della mielina come guida per identificare l'area demielinata può anche aiutare nel disegno, come spiegato in de Paula Faria12.

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Disclosures

Nessuno.

Acknowledgments

β-cubetto (Molecubes NV, Belgio) è stata supportata dalla Fondazione di ricerca di San Paolo, FAPESP - Brasile (#2018/15167-1). LES ha una borsa di studio per dottorandi della FAPESP - Brasile (#2019/15654-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analytical Balance Marte AUWZZOD max: 220 g- min: 1 mg
Anestesia vaporizer Nanitech 15800
Beta-cube Molecubes
Bulldog clamp Stoelting 5212043P
clorexidine Rioquimica 0.5%/100 mL
Cotton swabs johnson e johnson
Dose calibrator Capintech
Drill Kinzo powertools 352901 Model Q0M-DC3C
Eppendorf tube Eppendorf 30125150 1.5 mL
Eye lubricant ADVFARMA 30049099  vaseline 15 g (pharmaceutical purity)
Fine forceps Stoelting 52102-38P
Gloves Descarpack 212101  6.5 size
Heating pad Softhear
Injection Syringe Hamilton 80314 10µ, 32ga, model 701
Insuline syringe BD 328328 1 mL insulin syringes with needle
Isoflurane Cristália 410525 100 mL , concentration 1 mL/1 mL
Ketoprofen or other analgesic Sanofi 100 mg/2 mL
lidocaine Hipolabor 1.1343.0102.001-5 2%/20mL
L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk Sigma-aldrich L-4129 25 mg - ≥99%, Type I, powder
Needle holder Stoelting 5212290P
Oxygen White Martins 7782-44-7 Compressed gas
PMOD software PMOD technologies Version 4.1 module fuse it
Rat anesthesia mask KOPF Model 906
Saline Farmace 0543325/ 14-8 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Scapel blades Stoelting 52173-10
Scapel handles Stoelting 52171P
Scissor Stoelting 52136-50P
Semi-analytical Balance Quimis BK-3000 max:3,100 g; min:0.2 g
shaver Mega profissional AT200 model
Stereotactic Apparatus KOPF Nodel 900
Universal holder with needle support KOPF Model 1772-F1 Hamilton support for 5 and 10 µL

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References

  1. Oh, J., Vidal-Jordana, A., Montalban, X. Multiple sclerosis: clinical aspects. Current Opinion in Neurology. 31 (6), 752-759 (2018).
  2. Sand, I. K. Classification, diagnosis, and differential diagnosis of multiple sclerosis. Current Opinion in Neurology. 28 (3), 193-205 (2015).
  3. Thompson, A. J., et al. Diagnosis of multiple sclerosis: 2017 revisions of the McDonald criteria. Lancet Neurology. 17 (2), 162-173 (2018).
  4. Veronese, M., et al. Quantification of C-11 PIB PET for imaging myelin in the human brain: a test-retest reproducibility study in high-resolution research tomography. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 35 (11), 1771-1782 (2015).
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  6. Stankoff, B., et al. Imaging central nervous system myelin by positron emission tomography in multiple sclerosis using [methyl-(1)(1)C]-2-(4'-methylaminophenyl)- 6-hydroxybenzothiazole. Annals of Neurology. 69 (4), 673-680 (2011).
  7. Faria, D. D. Myelin positron emission tomography (PET) imaging in multiple sclerosis. Neural Regeneration Research. 15 (10), 1842-1843 (2020).
  8. Pietroboni, A. M., et al. Amyloid PET as a marker of normal-appearing white matter early damage in multiple sclerosis: correlation with CSF -amyloid levels and brain volumes. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 46 (2), 280-287 (2019).
  9. Pytel, V., et al. Amyloid PET findings in multiple sclerosis are associated with cognitive decline at 18 months. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 39, (2020).
  10. Faria, D. dP., et al. PET imaging of glucose metabolism, neuroinflammation and demyelination in the lysolecithin rat model for multiple sclerosis. Multiple Sclerosis Journal. 20 (11), 1443-1452 (2014).
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  12. Faria, D. dP., et al. PET imaging of focal demyelination and remyelination in a rat model of multiple sclerosis comparison of [C-11]MeDAS, [C-11]CIC and [C-11]PIB. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 41 (5), 995-1003 (2014).
  13. Faria, D. dP., et al. PET imaging of focal demyelination and remyelination in a rat model of multiple sclerosis: comparison of [11C]MeDAS, [11C]CIC and [11C]PIB. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 41 (5), 995-1003 (2014).
  14. vander Star, B. J., et al. In Vitro and In Vivo Models of Multiple Sclerosis. CNS & Neurological Disorders-Drug Targets. 11 (5), 570-588 (2012).
  15. Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216 (2015).

Tags

Neuroscienze Numero 168 11C-PIB Imaging PET mielina sclerosi multipla imaging molecolare modello di ratto di litoletta analisi VOI

Erratum

Formal Correction: Erratum: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2023. Citeable Link.

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de Paula Faria, D., Cristiano Real, C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).

to:

de Paula Faria, D., Real, C.C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).

Imaging tomografico ad emissione di <em>positroni per la</em> misurazione in vivo del contenuto di mielina nel modello di ratto di lisolecitina della sclerosi multipla
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