Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Tomografia de emissão de pósitrons para medição in vivo de conteúdo de mielina no modelo de rato de lysolecithin de esclerose múltipla

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/62094
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1
1Laboratory of Nuclear Medicine (LIM-43), Departamento de Radiologia e Oncologia, Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, 2Nuclear Medicine Division, Hospital Sirio-Libanes

ERRATUM NOTICE

Summary

Este protocolo tem o objetivo de monitorar as alterações in vivo da mielina (desmielinização e remielinização) por meio da tomografia de emissão de pósitrons (PET) em um modelo animal de esclerose múltipla.

Abstract

A esclerose múltipla (EM) é uma doença neuroinflamatória com expansão da degeneração axonal e neuronal e desmielinização no sistema nervoso central, levando a disfunções motoras, incapacidade psíquica e comprometimento cognitivo durante a progressão da EM. A tomografia de emissão de pósitrons (PET) é uma técnica de imagem capaz de quantificar alterações celulares e moleculares in vivo.

Os radiotracers com afinidade com a mielina intacta podem ser usados para imagens in vivo de alterações de conteúdo de mielina ao longo do tempo. É possível detectar um aumento ou diminuição do teor de mielina, o que significa que esta técnica de imagem pode detectar processos de desmielinização e remyelinação do sistema nervoso central. Neste protocolo demonstramos como usar a imagem PET para detectar alterações de mielina no modelo de rato de lisesolecithin, que é um modelo de lesão de desmielinização focal (induzida por injeção estereotática) (ou seja, um modelo de doença da esclerose múltipla). 11 A imagem PET C-PIB foi realizada na linha de base, e 1 semana e 4 semanas após injeção estereotaxica de lisolecithin 1% no estriado direito (4 μL) e corpus calosum (3 μL) do cérebro de rato, permitindo quantificação de desmielinização focal (local de injeção após 1 semana) e o processo de remielinização (local de injeção em 4 semanas).

A imagem myelin PET é uma ferramenta interessante para monitorar mudanças in vivo no conteúdo de mielina que poderiam ser úteis para monitorar a progressão da doença desmielinina e a resposta terapêutica.

Introduction

A esclerose múltipla (EM) é uma doença neuroinflamatória que afeta o sistema nervoso central, caracterizada por inflamação, desmielinização e perda axonal1. O prognóstico dessa doença é variável mesmo com avanços no tratamento, sendo uma das causas mais comuns de déficits neurológicos em jovens1. O diagnóstico de ESM baseia-se nos critérios de manifestação clínica e visualização de lesões características por ressonância magnética (RM)2,3.

A tomografia por emissão de pósitrons (PET) pode ser uma ferramenta útil para o monitoramento in vivo da progressão da ESM e dos efeitos terapêuticos. O radiotracer B composto de Pittsburgh (PIB) rotulado com carbono-11 (11C-PIB) é amplamente utilizado para quantificar placas β-amilóides; no entanto, na última década, tem sido estudado para quantificar o conteúdo da mielina e mostrar desmielinização dinâmica e remyelination4,5,6.

Diferentes rastreadores PET amiloides (11C-PIB, 18F-florbetaben,18F-florbetapir, 18F-flutemetamol) podem ser usados para quantificar a mielina e fornecer informações importantes sobre a progressão da doença e resposta terapêutica, permitindo a identificação de processos de desmielinização e remyelinação, sem a interferência da neuroinflamation, que pode ocorrer com imagens convencionais de ressonância magnética (MRI)7. A imagem pet amiloide mostrou diminuição da absorção de rastreadores em pacientes ativos de ES em comparação com pacientes não ativos, o que poderia ser explicado por danos precoces à matéria branca nos pacientes ativos8. A menor absorção de rastreador amiloide também esteve associada ao declínio cognitivo em um estudo de acompanhamento, mostrando que essa técnica é uma ferramenta valiosa para o estudo da fisiopatologia da doença e dos desfechos clínicos9.

O modelo de rato de lisesolecithin (LPC) é um modelo induzido químico de esclerose múltipla, onde a toxina injetada, LPC, induz uma alta resposta de macrófagos que resulta em aumento da inflamação e, consequentemente, desmielinização10,11. A dessalinização é rapidamente invertida, em aproximadamente 4 semanas, o que torna este um bom modelo para avaliar processos de desmielinização e remyelinação em roedores. Este modelo já foi avaliado utilizando imagem PET, com bons resultados e correlação com ensaios post-mortem12.

Aqui apresentamos o protocolo para imagem PET de mielina com 11C-PIB no modelo de rato de lisesolecithin, mostrando que essa técnica de imagem é uma ferramenta útil para a medição in vivo do conteúdo de mielina.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Nacional de Controle da Experimentação Animal (CONCEA, Brasil) e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (CEUA-FMUSP) - número do protocolo: 25/15).

NOTA: Neste protocolo, mostramos como induzir um modelo de rato de esclerose múltipla e como adquirir e analisar as imagens PET de mielina.

1. Preparação da solução de lysolecithin

  1. Pesar lysolecithin (L-α-Lysophosphatidylcholine de gema de ovo) em uma escala analítica usando um tubo plástico conic (1,5 mL).
  2. Adicione soro fisiológico estéril ao tubo para fazer 1% de solução (por exemplo: pesar 1 mg de lisecitina e dissolvê-lo com 100 μL de soro fisiológico) e dissolver a lisecirina sacudindo o tubo (balançando de um lado para o outro e não girando de cima para baixo).
  3. Prepare a solução pouco antes de iniciar a indução do modelo animal (não estocar a solução pronta final).

2. Modelo de rato de lysolecithin - Cirurgia estereotaxica

  1. Use ratos Wistar machos pesando entre 220 e 270 g. Use luvas e máscara durante todos os procedimentos.
  2. Induzir anestesia com 5% de isoflurane misturado em 100% O2 (1 L/min) usando uma caixa de indução. Verifique se o animal está anestesiado observando a ausência de movimento (somente a respiração deve ser observada).
  3. Coloque o animal em aparelho estereotaxo em uma almofada de aquecimento. Conserte o nariz e as orelhas do animal no equipamento.
    NOTA: Detalhes de como realizar cirurgia estereotaxa podem ser encontrados no Banco de Dados de Educação Científica da JoVE. Neurociência. Cirurgia Estererófica de Roedores. JoVE, Cambridge, MA, 2021.
    1. Monitore a anestesia durante todo o procedimento (incluindo cirurgia e aquisição de imagens). Para ajustar a concentração de isoflurane, observe a taxa de respiração animal. Uma taxa de respiração rápida requer maior concentração e uma taxa de respiração lenta requer menor concentração anestésico.
  4. Injete o analgésico (cetoprofeno - 5 mg/kg) subcutâneamente (diluir a medicação para 1 mL em soro fisiológico, isso ajudará a hidratar o animal).
  5. Coloque creme nos olhos do animal para proteger contra a desidratação.
  6. Use uma solução de clorexidina de 0,5% para limpar a área de incisão.
  7. Injete 100 μL de cloridrato de lidocaína 2% subcutâneamente na região da incisão.
  8. Raspe a área do crânio.
  9. Use instrumentos estéreis para este procedimento.
  10. Usando um bisturi, faça uma incisão de cerca de 2 cm na pele sobre o crânio.
  11. Exponha o crânio com grampos bulldog.
  12. Use um cotonete para limpar a área do crânio com 1% de peroxidase de hidrogênio.
  13. Localizar e marcar o bregma (um atlas cerebral de rato estereotaxic pode ajudar a identificar o Bregma).
  14. Posicione a seringa Hamilton (seringas neuros μL) no bregma.
  15. Usando o bregma e um atlas estereotaxic como referência, posicione a seringa Hamilton nas seguintes coordenadas: Antero-posterior: -0,30 mm, latero-lateral: -3,0 mm e ventral até tocar o osso do crânio, e marque o crânio e observe a orientação das coordenadas no papel.
  16. Perfurar o crânio na coordenada marcada. Tome cuidado com dura mater (danificar dura mater pode causar um monte de sangramento).
  17. Encha a seringa Hamilton com 7 μL de solução de lisecitina (1% em soro fisiológico). Um volume maior pode ser colocado na seringa, mas apenas 7 μL será injetado (tire as bolhas da seringa para medir o volume corretamente).
  18. Posicione a seringa Hamilton nas coordenadas anteriores para iniciar a injeção de drogas (total de 7 μL em 3 coordenadas estereotáticas ventrais diferentes). Considerando as coordenadas previamente anotadas, baixe a seringa Hamilton para coordenar ventral -5,0 mm.
  19. Injete lentamente 2 μL de solução de lisesolecithin (1 μL/10 min). Espere 3 min.
  20. Leve a agulha até a próxima coordenada estereotaxica ventral (-4,2 mm) e injete lentamente 2μL de solução de liossolecithin (1 μL/ 10 min). Espere 3 min.
  21. Injete a terceira coordenada ventral -3.0 mm (3 μL de solução de lisecitina - 1 μL/ 10 min).
  22. Espere 5 min e depois remova a seringa Hamilton do cérebro.
  23. Sutura a pele.
  24. Remova o animal do aparelho estereotático e permita que o animal acorde.
  25. Devolva o animal para a gaiola de casa, mantenha o animal sozinho e sob supervisão para verificar se há sinais de desconforto.
  26. Injete analgésico subcutâneo (cetoprofeno - 5 mg/kg) diluído em soro fisiológico, a 24h e 48 h após a cirurgia.

3. Aquisição de PET

  1. Tome de 7 a 20 MBq de radioatividadeC-PIB em uma seringa (1 mL é o volume máximo permitido para injeção intravenosa em ratos).
  2. Anestesiar o animal com 5% de isoflurane misturado em 100% O2 (1 L/min) usando a caixa de indução.
  3. Injete 11C-PIB (radioatividade definida no item 4.1 acima) na veia peniana, ou veia traseira do rato (ambos os locais de administração são bons, a decisão é uma escolha pessoal. Nós apenas aconselhamos a não usar uma injeção retro-orbital, uma vez que o local é muito próximo da região de interesse (o cérebro) e pode prejudicar a qualidade da imagem.
    NOTA: A aquisição de imagem do ponto de tempo da linha de base é realizada antes da injeção estereotipada e os outros 2 pontos de tempo em 1 semana e 4 semanas após a cirurgia.
  4. Retire o animal da anestesia para permitir que o animal acorde (deixe o animal em uma almofada quente até que ele esteja completamente acordado).
  5. Devolva o animal para a jaula.
  6. Espere 30 min para o próximo passo.
  7. Anestesiar os ratos com 5% de isoflurane misturado em 100% O2 (1 L/min) usando uma caixa de indução.
  8. Abra o software de scanner PET.
  9. Selecione Digitalização > Pronto para animais de estimação.
  10. Detalhes completos do pesquisador principal, ID do Estudo, ID da Série, Y Animal, Peso Animal (g) e Notas adicionais. Selecione Next.
    NOTA: Use ponto (.) para número decimal no peso animal.
  11. Editar área de ROI para digitalização (geralmente entre 3 e 8). Esta é a área que será incluída na imagem (áreas entre os números 3 e 8 da tampa da cama aparecerão na imagem final).
  12. Posicione o rato anestesiado em um leito de rato padrão do scanner PET e ligue a anestesia (3% de isoflurane em 100% O2 é um bom começo, e então a taxa de anestesia deve ser ajustada conforme necessário). Para ajustar a anestesia, verifique os dados de monitoramento do software do scanner para verificar se o animal está respirando em um ritmo constante e lento.
    NOTA: Ligue a bomba de vácuo acoplada ao filtro de carbono ativado para coletar o excesso de gás isoflurane (se a bomba estiver disponível).
  13. Aplique creme para os olhos para proteger os olhos do animal.
  14. Empurre a cama animal dentro do scanner PET.
  15. Detalhes completos da atividade, tempo de calibração da atividade, isótopo (C-11) e duração da varredura (20 minutos). Selecione Iniciar varredura.
    NOTA: Uma mensagem de cama de movimento para animais aparecerá, e o leito animal se moverá para o equipamento e interromperá na posição de ROI previamente selecionada. O tempo de aquisição começará a contar e o número de contagens por segundo aparecerá (CPS).
  16. No software do scanner, navegue até a guia Monitor à esquerda da tela, verifique a alteração do limiar de alteração para os parâmetros respiratórios (BPM).
    NOTA: Uma janela aparecerá, completa com parâmetro de limiar (500). Selecione OK.
  17. Navegue até 0% DE POTÊNCIA para alterar os parâmetros de temperatura para aquecer o animal durante a varredura. Uma janela vai aparecer; completar o parâmetro (80 - 100). Selecione OK.
    NOTA: Escolha entre 80 e 100% de energia com base nas condições de temperatura ambiente (quanto mais energia, mais quente ele vai ficar).
  18. Navegue de volta para a guia SCAN.
  19. Navegue até a ferramenta de configuração (ícone de engrenagem) e complete o tempo de injeção, atividade restante, tempo de calibração de atividade restante. Selecione Salvar.
    NOTA: Uma janela aparecerá "Tem certeza de que deseja modificar os metadados do protocolo?" > SIM
  20. Navegue de volta para a guia Monitor (verifique os parâmetros respiratórios do animal e, se necessário, aumente ou diminua a concentração de isoflurane - geralmente 3% em 100% O2 é suficiente).
  21. Quando a aquisição pet estiver concluída, a mensagem Pet Ready aparecerá na guia Scan, confira o Ícone de Seta (à esquerda da ferramenta de configuração) para mover a cama animal.
  22. Retire o animal da anestesia e deixe despertar em uma almofada quente.
  23. Para reconstruir aimagem, navegue até a guia Reconstruir.
  24. Verifique mais ícone no canto inferior esquerdo da tela e selecione o arquivo de estudo que será reconstruído. Selecione Next.
  25. Navegue até a ferramenta de Resolução de Energia. Uma janela vai aparecer. Configure o pico de energia (keV) no parâmetro do equipamento (com base no controle mensal de qualidade). Selecione Fechar.
    NOTA: O pico de energia pode mudar a cada mês ao realizar a calibração mensal do equipamento.
  26. Mantenha todos os outros parâmetros como padrão (tamanho voxel isométrico: 400 mm; número de iterações: 30; Resolução de energia: 30%; Salvar apenas a última iteração; desmarcar Manter dados binários) .
  27. Verificar Adicionar.
    NOTA: Uma janela aparecerá "A reconstrução foi adicionada à fila e começará assim que as outras terminarem". Selecione OK. Um arquivo aparecerá na lista de reconstrução na guia Reconstruir e o status aparecerá como espera ou % (progresso) ou terminado.

4. Análise de imagem

NOTA: Realize a análise de imagens usando um software dedicado de análise de imagens. No protocolo atual, a demonstração usa um programa de software específico, mas se não estiver disponível, outras opções podem ser usadas.

  1. Abra PMOD > Fusa-o.
  2. Navegue até a guia Matching na parte superior da tela.
  3. Abra o menu De entrada de carga no meio direito da tela e selecione arquivos Autodetect, selecione arquivo PET (DICOM, Interfile ou NifTI), adicione aos selecionados, clique com Operações, Reoriente para Orientação Padrão, clique em Carregar e Fechar.
  4. Verifique se a espécie animal está correta na parte inferior da tela(RAT).
  5. Verifique a caixa Crop no canto inferior direito da tela.
  6. Ajuste o tamanho da caixa amarela na imagem PET para levar todo o cérebro.
  7. Clique no botão Rígido à direita da tela. Na janela de confirmação clique em Sim.
  8. Clique na ferramenta cerebral no meio direito da tela para abrir o Atlas de Referência. Selecione Px Rat (W.Schiffer) - T2.
  9. Selecione Resultados de correspondência na guia superior direita (Selecione a guia estágio de processamento).
  10. Clique em Reslicing de dados (4ª guia no menu superior direito).
  11. Alinhe a imagem PET com o modelo de referência usando a ferramenta rotativa (ícone branco no centro da imagem PET). Verifique o alinhamento de 3 aviões anatômicos.
  12. Salve o arquivo de co-registro (menu lateral direito da tela).
  13. Selecione o formato de saída (DICOMor NifTI), diretório e prefixo de arquivo. Clique em Salvar.
    NOTA: Se a saída co-registrada for salva como NifTi, as informações da imagem do cabeçalho serão perdidas.
  14. Clique no menu VOIs na parte inferior da tela.
  15. Navegue até o Modelo > Atlas na parte inferior da tela (abaixo da janela VOIs).
  16. Selecione Px Rat (W.Schiffer) no menu suspenso.
    NOTA: Se você precisar analisar apenas VOIs específicos, você pode selecionar apenas as áreas de interesse do cérebro. Se você quer todas as áreas cerebrais do atlas cerebral, nenhuma ação é necessária.
  17. Clique em Contorno na parte inferior da tela.
    NOTA: VoIs de áreas cerebrais aparecerão na janela VOIs.
  18. Desenhe manualmente o VOI no local da lesão e na área do hemisfério cerebral contralateral (11C-PIB área de baixa absorção e hemisfério cerebral contralateral, respectivamente).
  19. Clique na área de imagem PET com 11C-PIB de baixa absorção.
  20. Selecione Novo VOI > OK.
    NOTA: Uma planilha aparecerá
  21. Navegue até o ícone SPHERE na parte central da tela (à esquerda da janela VOIs)
    NOTA: Uma planilha aparecerá.
  22. Escolha o nome VOI: lesão e selecione Aplicar.
    NOTA: Uma esfera aparecerá na imagem co-registrada.
  23. Alinhe a esfera na área da lesão e ajuste o VOI para todos os planos anatômicos.
  24. Clique em Fechar (na parte inferior da planilha).
  25. Selecione o VOI da lesão (da lista VOIs).
  26. Navegue até o ícone de operações de espelhamento voi (no canto superior direito da janela VOIs) e selecione Clone e espelho à esquerda/direita.
  27. Navegue para calcular estatísticas voi selecionadas no topo da janela de lista VOIs. Navegue até Selecionar estatísticas para ser calculado ícone para escolher os dados de saída (para o lado direito do ícone de estatísticas VOI). Normalmente para verificação de conteúdo de mielina Estatísticas para grupo de VOIs, Média, SD, Min, Max).
    NOTA: Uma planilha aparecerá. A unidade de dados de configuração padrão é kBq/cc. Na parte superior esquerda da planilha (VOI Statistics) você pode verificar a Unidade de Dados como SUV (Valor de Absorção Padronizada). Se você completou os detalhes de administração de radiotracer e aquisição de imagens corretamente no software do scanner, como descrito anteriormente, os dados do SUV serão calculados automaticamente pelo software PMOD, se não, você poderá editar os detalhes.
  28. Navegar para copiar usando o formato de número de localização do sistema.
    NOTA: Verifique se todas as estatísticas estão selecionadas para copiar como saída (Verifique o ícone na parte superior direita da tela). Os dados que serão copiados dependem da Unidade de Dados selecionada.
  29. Cole os dados de saída em um bloco de notas ou planilha.
    NOTA: Tome cuidado com as configurações de software para símbolos de ponto e círia entre os números. Isso pode ser diferente entre as configurações do idioma.
  30. Salve o arquivo com o nome do estudo e os detalhes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A Figura 1 mostra imagens ilustrativas de 11C-PIB PET com alterações de mielina ao longo do tempo. Na varredura da linha de base, não podem ser observadas diferenças no conteúdo da mielina (ou seja, não há desmielinização). Na imagem de ponto de tempo de 1 semana, é possível ver a lesão focal desmielinada (no hemisfério direito) como indicado pela seta branca. As imagens são apresentadas nos 3 planos anatômicos (coronal, axial e sagital) e é possível identificar a lesão desmielinizada em todos eles. A imagem de 1 semana é a ilustração de uma lesão bem delimitada no local da injeção, representando a indução correta do modelo e a detecção de imagem. Na imagem de 4 semanas, nenhuma lesão é mais visível, indicando que a remielinação ocorreu e o conteúdo da mielina voltou ao normal (ou perto dela).

Os gráficos representativos mostram a quantificação das imagens de 4 animais nos 3 pontos de tempo diferentes. O primeiro gráfico mostra os resultados da quantificação da lesão (VOI manual) à razão lateral contralateral demonstrando mais alterações de mielina focal, onde a injeção de lysolecithin foi realizada. O segundo gráfico mostra a mesma quantificação, mas no estriato (estriado injetado à razão contralateral) e neste caso a diferença não é estatisticamente significante, o que pode ser explicado pelo pequeno tamanho da amostra e porque o VOI é maior e a concentração de radioatividade é medida não apenas onde a lisesolecithin foi injetada.

As diferenças entre os grupos foram analisadas pelo teste de Kruskal Wallis, seguido pelo teste de Dunn para múltiplas comparações e os resultados são apresentados como média ± SD. Na lesão VOI (H = 7,063; P=0,017), na imagem de 1 semana, a razão de absorção do rastreador (0,90±0,07) foi 16% menor que a linha de base (1,07±0,06), com significância estatística (p=0,024). Não foram encontradas diferenças significativas na imagem de 4 semanas (1,01±0,06).

No estriado, não foram encontradas diferenças estatísticas (H =1.412; P=0,5393). Os índices de absorção das imagens foram de 1,07±0,07 para a linha de base, 1,02±0,07 em 1 semana e 1,01±0,08 por 4 semanas.

O terceiro gráfico (linha inferior, gráfico esquerdo) apresenta a quantificação do estriado contralateral (lado não injetado). Neste gráfico é possível observar que não houve diferença (P=9397) entre os pontos de tempo, o que significa que a variação no lado injetado é devido a alterações de mielina e não devido à variação de absorção do rastreador ao longo do tempo.

O gráfico final, no canto inferior direito, mostra a quantificação do local injetado (VOI da lesão) em animais onde o modelo não foi bem induzido (provavelmente devido à injeção rápida de lysolecithin, manipulação estereotaxic errada e/ou preparação incorreta da solução). Neste caso, a menor absorção não é vista no ponto de tempo de 1 semana, o que significa que nenhum processo de desmielinização ocorreu, e a baixa absorção em 4 semanas pode estar relacionada a um processo de desmielinização posterior ou danos teciduais, ambas as situações estão relacionadas à má indução do modelo animal. Este gráfico foi adicionado ao protocolo para exemplificar o aparecimento dos resultados quando a indução animal não é bem realizada e enfatizar a importância de cada etapa do protocolo, do início ao fim. Não há diferenças na captação do rastreador (H = 2,745, P = 0,267) com taxas de absorção de 1,06±0,05, 1,02±0,14 e 0,96±0,10 para imagens PET de linha de base, 1 semana e 4 semanas pet.

A Figura 2 adiciona mais informações aos resultados, onde a Figura 2A detalha onde o VOI manual foi desenhado, com base na referência do modelo de ressonância magnética e figura 2B mostra a coloração azul rápida luxol (para detalhes sobre o protocolo de coloração azul rápido luxol, ver De Paula Faria et al.13) do lado injetado e lado não injetado em 7 dias pós injeção estereotaxic.

Figure 1
Figura 1: Imagens ilustrativas 11C-PIB PET mostrando imagens de linha de base, 1 semana e 4 semanas após injeção estereotática. Os gráficos na parte inferior da figura representam a quantificação da absorção do rastreador (n=4) em diferentes pontos de tempo. Os dois primeiros gráficos representam a razão de absorção no lado injetado para o lado contralateral na lesão e no estriado em um modelo bem induzido (ou seja, ratos apresentando lesão após injeção de liosolecithin). O terceiro gráfico (inferior esquerdo) mostra a quantificação do estriado não injetado (controle negativo), e o gráfico final (inferior direito) representa a absorção de 11C-PIB no local de injeção de animais que não apresentaram lesão desmielinizada (modelo gravemente induzido). Os resultados são apresentados como média±SD. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Detalhes da localização da lesão. A) VOIs ilustrativos de lado injetado (linha tracejada) e lado não injetado (linha branca) desenhados manualmente com base no modelo de ressonância magnética (região de corpus calosum e estriado) em 1 semana após injeção estereotática. B) Coloração azul rápida luxol mostrando desmielinização no hemisfério injetado em comparação com o lado não injetado (Topo: ampliação de 40x, inferior: 100x de ampliação). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

A maior vantagem de usar o modelo de lisecitina para estudar a esclerose múltipla é o cronograma rápido para a desmielinização (cerca de 1 semana) e a remielinação (cerca de 4 semanas) para ocorrer14. Este modelo também pode ser induzido em camundongos15, no entanto, a indução em ratos é mais vantajosa para imagens in vivo PET devido ao tamanho maior do cérebro de rato em comparação com ratos.

O primeiro passo do modelo de indução é ser extremamente cauteloso. Este modelo foi validado para a imagem pet de mielina por de Paula Faria et al.10 em 2014 e foi demonstrado que a velocidade da injeção de lisolecithin dentro do cérebro é crucial para um modelo bem induzido. A injeção deve ser realizada muito lentamente, 1 μL a cada 10 minutos, como forma de evitar danos teciduais. A solução de lisesolecithin também deve ser preparada no mesmo dia da injeção estereotática, de preferência pouco antes de iniciar o procedimento cirúrgico. Se o modelo for usado pela primeira vez em um grupo de pesquisa, recomendamos que o modelo seja validado antes de realizar qualquer quantificação de mielina por imagem PET. A validação precisa incluir a análise de tecido pós-morte por manchas de mielina, por exemplo: histologia azul rápido de Luxol, como mostra a Figura 2, e a imunohistoquímica da proteína básica de mielina (MPB), nos diferentes pontos de tempo destinados a serem utilizados na análise in vivo. Na seção de resultados, mostramos uma quantificação da captação de radiotracer onde a indução da lesão não foi bem sucedida e, portanto, as diferenças não foram detectadas por 11imagens PET C-PIB.

A lesão a ser quantificada por essa técnica deve ser maior do que a resolução do scanner PET (cerca de 1 mm em equipamentos pré-clínicos e cerca de 5 mm em equipamentos clínicos).

Uma vez que o modelo é bem induzido, o procedimento de imagem deve ser bem planejado, devido ao radiotracer rotulado com carbono-11, que tem uma curta meia-vida de 20 minutos. O pessoal do laboratório de imagens pré-clínicos precisa preparar todo o material necessário, preencher o sistema de anestesia, verificar se tudo está funcionando corretamente e imprimir os formulários a serem preenchidos durante o experimento. O scanner PET também deve ser verificado antes do experimento, quando todos os controles de qualidade necessários no equipamento (dependente de cada país) devem ser realizados para verificar se o scanner está funcionando bem. Após receber o rastreador para injeção, a medição da atividade também deve ser medida em um calibrador de dose calibrada para garantir a dose injetada correta, e as informações (atividade na seringa, antes e depois da injeção) escritas no formulário, bem como o respectivo tempo em que a medição foi realizada. Estabeleça qual relógio será usado, pois o momento certo é o tempo na estação de trabalho do scanner PET, o tempo que será considerado na correção de decadência das imagens, portanto, quaisquer relógios usados durante o experimento devem ser sincronizados com o tempo de estação de trabalho do scanner.

Durante a aquisição de imagens animais, a temperatura e a respiração animal devem ser monitoradas e a anestesia ajustada, conforme necessário. A temperatura é dependente de localização e deve ser ajustada para o bem-estar animal. Após o término da aquisição da imagem, é importante manter o animal em uma almofada quente para se recuperar antes de ser devolvido à gaiola.

O processamento de imagens é crucial para obter resultados confiáveis dos experimentos usando imagens PET. O ideal é que o analisador não esteja ciente dos grupos e/ou tratamentos animais e que já tenha experiência em imagens PET com o rastreador PET utilizado de forma a garantir o registro perfeito entre o modelo de imagem PET e ressonância magnética. Utilizamos o software PMOD neste protocolo, mas se este software não estiver disponível, um software alternativo de quantificação de imagem pode ser usado, embora seja preciso atenção para alcançar uma boa definição e quantificação da região cerebral. Para a definição do local da lesão, deve-se tomar cuidado extra para garantir que o local injetado esteja dentro da lesão desenhada VOI (um conhecimento da anatomia cerebral de rato é necessário).

É importante dizer que a imagem PET de mielina também pode ser realizada em outros modelos animais de MS, apresentando lesões imprevisíveis, como já mostrado pelo nosso grupo no modelo de sagui5(EAE) experimental de Encefalomielite Autoimune (EAE). Como já dito, o parâmetro importante a considerar na quantificação da lesão é a resolução do scanner PET, que é a limitação para a detecção de lesões muito pequenas. A imagem PET é uma técnica de imagem de baixa resolução quando comparada a outras técnicas como a Ressonância Magnética, porém é uma modalidade altamente específica e, por isso, a quantificação das imagens PET utiliza um modelo anatômico, como a ressonância magnética, para ajudar a desenhar a região de interesse, como mostrado no protocolo acima.

Embora o desenho manual de VOIs seja dependente do operador, é a melhor opção para o modelo animal LPC, já que a lesão pode ser variável entre os animais. Para diminuir o viés no processo de quantificação, é importante realizar um VOI espelho, como explicado no protocolo, que será na mesma região e do mesmo tamanho do lado injetado. Também é importante ter em mente as coordenadas estereotribíficas ao desenhar o VOI no modelo de ressonância magnética para garantir que a região cerebral correta seja considerada. O uso da coloração de mielina como guia para identificar a área desmielinizada também pode ajudar no desenho, como explica De Paula Faria12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nenhum.

Acknowledgments

β-cubos (Molecubes NV, Bélgica) contou com o apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo, a FAPESP - Brasil (#2018/15167-1). O LES possui bolsa de doutorado da FAPESP - Brasil (#2019/15654-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analytical Balance Marte AUWZZOD max: 220 g- min: 1 mg
Anestesia vaporizer Nanitech 15800
Beta-cube Molecubes
Bulldog clamp Stoelting 5212043P
clorexidine Rioquimica 0.5%/100 mL
Cotton swabs johnson e johnson
Dose calibrator Capintech
Drill Kinzo powertools 352901 Model Q0M-DC3C
Eppendorf tube Eppendorf 30125150 1.5 mL
Eye lubricant ADVFARMA 30049099  vaseline 15 g (pharmaceutical purity)
Fine forceps Stoelting 52102-38P
Gloves Descarpack 212101  6.5 size
Heating pad Softhear
Injection Syringe Hamilton 80314 10µ, 32ga, model 701
Insuline syringe BD 328328 1 mL insulin syringes with needle
Isoflurane Cristália 410525 100 mL , concentration 1 mL/1 mL
Ketoprofen or other analgesic Sanofi 100 mg/2 mL
lidocaine Hipolabor 1.1343.0102.001-5 2%/20mL
L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk Sigma-aldrich L-4129 25 mg - ≥99%, Type I, powder
Needle holder Stoelting 5212290P
Oxygen White Martins 7782-44-7 Compressed gas
PMOD software PMOD technologies Version 4.1 module fuse it
Rat anesthesia mask KOPF Model 906
Saline Farmace 0543325/ 14-8 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Scapel blades Stoelting 52173-10
Scapel handles Stoelting 52171P
Scissor Stoelting 52136-50P
Semi-analytical Balance Quimis BK-3000 max:3,100 g; min:0.2 g
shaver Mega profissional AT200 model
Stereotactic Apparatus KOPF Nodel 900
Universal holder with needle support KOPF Model 1772-F1 Hamilton support for 5 and 10 µL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oh, J., Vidal-Jordana, A., Montalban, X. Multiple sclerosis: clinical aspects. Current Opinion in Neurology. 31 (6), 752-759 (2018).
  2. Sand, I. K. Classification, diagnosis, and differential diagnosis of multiple sclerosis. Current Opinion in Neurology. 28 (3), 193-205 (2015).
  3. Thompson, A. J., et al. Diagnosis of multiple sclerosis: 2017 revisions of the McDonald criteria. Lancet Neurology. 17 (2), 162-173 (2018).
  4. Veronese, M., et al. Quantification of C-11 PIB PET for imaging myelin in the human brain: a test-retest reproducibility study in high-resolution research tomography. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 35 (11), 1771-1782 (2015).
  5. Carvalho, R. H. F., et al. C-11 PIB PET imaging can detect white and grey matter demyelination in a non-human primate model of progressive multiple sclerosis. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 35, 108-115 (2019).
  6. Stankoff, B., et al. Imaging central nervous system myelin by positron emission tomography in multiple sclerosis using [methyl-(1)(1)C]-2-(4'-methylaminophenyl)- 6-hydroxybenzothiazole. Annals of Neurology. 69 (4), 673-680 (2011).
  7. Faria, D. D. Myelin positron emission tomography (PET) imaging in multiple sclerosis. Neural Regeneration Research. 15 (10), 1842-1843 (2020).
  8. Pietroboni, A. M., et al. Amyloid PET as a marker of normal-appearing white matter early damage in multiple sclerosis: correlation with CSF -amyloid levels and brain volumes. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 46 (2), 280-287 (2019).
  9. Pytel, V., et al. Amyloid PET findings in multiple sclerosis are associated with cognitive decline at 18 months. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 39, (2020).
  10. Faria, D. dP., et al. PET imaging of glucose metabolism, neuroinflammation and demyelination in the lysolecithin rat model for multiple sclerosis. Multiple Sclerosis Journal. 20 (11), 1443-1452 (2014).
  11. Rinaldi, M., et al. Galectin-1 circumvents lysolecithin-induced demyelination through the modulation of microglial polarization/phagocytosis and oligodendroglial differentiation. Neurobiology of Disease. 96, 127-143 (2016).
  12. Faria, D. dP., et al. PET imaging of focal demyelination and remyelination in a rat model of multiple sclerosis comparison of [C-11]MeDAS, [C-11]CIC and [C-11]PIB. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 41 (5), 995-1003 (2014).
  13. Faria, D. dP., et al. PET imaging of focal demyelination and remyelination in a rat model of multiple sclerosis: comparison of [11C]MeDAS, [11C]CIC and [11C]PIB. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 41 (5), 995-1003 (2014).
  14. vander Star, B. J., et al. In Vitro and In Vivo Models of Multiple Sclerosis. CNS & Neurological Disorders-Drug Targets. 11 (5), 570-588 (2012).
  15. Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216 (2015).

Tags

Neurociência Edição 168 11C-PIB imagem PET mielina esclerose múltipla imagem molecular modelo de rato de lysolecithin análise VOI

Erratum

Formal Correction: Erratum: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. The citation was updated.

The citation was updated from:

de Paula Faria, D., Cristiano Real, C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).

to:

de Paula Faria, D., Real, C.C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).

Tomografia de emissão de pósitrons para <em>medição in vivo</em> de conteúdo de mielina no modelo de rato de lysolecithin de esclerose múltipla
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Paula Faria, D., Real, C. C.,… More

de Paula Faria, D., Real, C. C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter