Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Позитронная эмиссионная томография для измерения содержания миелина в модели крысы лизолецитина рассеянного склероза

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/62094
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1
1Laboratory of Nuclear Medicine (LIM-43), Departamento de Radiologia e Oncologia, Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, 2Nuclear Medicine Division, Hospital Sirio-Libanes

ERRATUM NOTICE

Summary

Этот протокол имеет целью мониторинг изменений in vivo myelin (демиелинизация и ремиелинизация) с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) в животной модели рассеянного склероза.

Abstract

Рассеянный склероз (MS) является нейровоспалительным заболеванием с расширением аксональной и нейрональной дегенерации и демиелинизации в центральной нервной системе, что приводит к двигательным дисфункциям, психическим нарушениям и когнитивным нарушениям во время прогрессирования MS. Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) — это метод визуализации, способный количественно давать количественную оценку клеточным и молекулярным изменениям in vivo.

Радиотрактеры с сродством к нетронутой миелин может быть использован для in vivo изображения миелина изменения содержания с течением времени. Можно обнаружить либо увеличение или уменьшение содержания миелина, что означает, что этот метод визуализации может обнаружить демиелинизации и ремиелинизации процессов центральной нервной системы. В этом протоколе мы демонстрируем, как использовать ПЭТ-изображения для обнаружения изменений миелина в модели крысы лизолецитина, которая является моделью поражения очаговой демиелинизации (индуцированной стереотаксической инъекцией) (т.е. модель болезни рассеянного склероза). 11 Лет C-PIB ПЭТ-изображение было выполнено на базовом уровне, и через 1 неделю и 4 недели после стереотаксиса инъекции лизолецитина 1% в правом стриатуме (4 МКЛ) и корпусе каллосума (3 МКЛ) крысиного мозга, что позволяет количественно определить очаговую демиелинизацию (место инъекции после 1 недели) и процесс ремиелинизации (место инъекции в течение 4 недель).

Миелин ПЭТ-изображения является интересным инструментом для мониторинга in vivo изменения содержания миелина, которые могут быть полезны для мониторинга демиелинизирующих прогрессии заболевания и терапевтической реакции.

Introduction

Рассеянный склероз (MS) является нейровоспалительным заболеванием, которое влияет на центральную нервную систему, характеризуется воспалением, демиелинизацией и аксональнойпотерей 1. Прогноз этого заболевания является переменной даже с достижениями в лечении, и это одна из наиболее распространенных причин неврологического дефицита у молодых людей1. Диагноз MS основан на критериях клинического проявления и визуализации характерных поражений магнитно-резонансной томографией(МРТ) 2,3.

Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) может быть полезным инструментом для виво мониторинга прогрессирования РС и терапевтических эффектов. Питтсбург соединения B radiotracer (PIB) помечены углерода-11 (11C-PIB) широко используется для количественной оценки β-амилоидных бляшек; однако, в последнее десятилетие, было изучено для количественной оценки содержания миелина и показать динамическую демиелинизациюи ремиелинизацию 4,5,6.

Различные амилоидные ПЭТ трассировщики (11C-PIB, 18F-florbetaben,18F-florbetapir, 18F-flutemetamol) могут быть использованы для количественной оценки миелина и предоставить важную информацию о прогрессировании заболевания и терапевтической реакции, что позволяет идентифицировать демиелинизациии ремиелинизации процессов, без вмешательства нейровоспаления, которые могут произойти с обычными магнитно-резонансных изображений(МРТ) 7. Амилоид ПЭТ визуализации показали снижение поглощения трассировщика у активных пациентов MS по сравнению с неигровых пациентов, которые могут быть объяснены ранним повреждением белого вещества у активныхпациентов 8. Нижний амилоидный трассировщик поглощения также был связан с когнитивным снижением в последующем исследовании, показывая этот метод, чтобы быть ценным инструментом для изучения патофизиологии болезни и клиническихисходов 9.

Модель крысы лизолецитина (LPC) является химической индуцированной моделью рассеянного склероза, где инъекционный токсин, LPC, вызывает высокую реакцию макрофагов, что приводит к увеличению воспаления и, следовательно, демиелинизации10,11. Демиелинизация быстро меняется примерно через 4 недели, что делает эту модель хорошей моделью для оценки процессов демиелинизации и ремиелинизации у грызунов. Эта модель уже была оценена с помощью ПЭТ-изображения, с хорошими результатами и корреляцией с посмертным эссе12.

Здесь мы представляем протокол для миелин ПЭТ-изображения с 11C-PIB в модели крысы лизолецитина, показывая этот метод изображения, чтобы быть полезным инструментом для измерения in vivo содержания миелина.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами Национального совета по контролю за экспериментами на животных (CONCEA, Бразилия) и были одобрены Комитетом по этике по исследованиям животных Медицинской школы Университета Сан-Паулу (CEUA-FMUSP, Бразилия - протокол номер: 25/15).

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, мы показываем, как вызвать лизолецитин крысы модель рассеянного склероза и как приобрести и проанализировать миелин ПЭТ изображения.

1. Препарат раствора лизолецитина

  1. Взвешивание лизолецитина (L-α-Lysophosphatidylcholine из яичного желтка) в аналитическом масштабе с использованием конической пластиковой трубки (1,5 мл).
  2. Добавить стерильный солевой раствор в трубку, чтобы сделать 1% раствор (например: вес 1 мг лизолецитина и растворить его с 100 л солевого раствора) и растворить лизолецитин, встряхивая трубку (встряхивая из стороны в сторону и не поворачивая сверху вниз).
  3. Подготовьте раствор прямо перед запуском индукции модели животного (не запаситесь окончательным готовым раствором).

2. Модель крысы лизолецитина - Стереотаксисная хирургия

  1. Используйте самцов крыс Wistar весом от 220 до 270 г. Используйте перчатки и маску во время всех процедур.
  2. Индуцировать анестезию с 5% изофлюраном, смешанным в 100% O2 (1 л/мин) с помощью индукционной коробки. Проверьте, является ли животное анестезировано при наблюдении за отсутствием движения (следует наблюдать только дыхание).
  3. Поместите животное в стереотаксисный аппарат на грелку. Зафиксив нос и уши животного на оборудовании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о том, как выполнить стереотаксис хирургии можно найти в JoVE науки образования базы данных. Неврология. Стереотаксис грызунов. JoVE, Кембридж, Массачусетс, 2021.
    1. Мониторинг анестезии в течение всей процедуры (включая операцию и приобретение изображений). Чтобы скорректировать концентрацию изофлюрана, наблюдайте за скоростью дыхания животных. Быстрая скорость дыхания требует более высокой концентрации, а медленная частота дыхания требует более низкой анестезии.
  4. Вводят обезболивающее (кетопрофен - 5 мг/кг) подкожно (разбавляют препарат до 1 мл солевым раствором, это поможет увлажнить животное).
  5. Положите крем для глаз в глаза животного, чтобы защитить от обезвоживания.
  6. Используйте 0,5% хлоргексидина раствор для очистки области разреза.
  7. Ввпрыснуть 100 МКЛ лидокаина гидрохлорида 2% подкожно в области разреза.
  8. Бритье области черепа.
  9. Используйте стерильные инструменты для этой процедуры.
  10. Используя скальпель, сделайте разрез около 2 см кожи над черепом.
  11. Разоблачить череп с бульдогом зажимы.
  12. Используйте тампон для очистки области черепа с 1% пероксидазы водорода.
  13. Найдите и отметте брегму (стереотаксис атлас мозга крысы может помочь тождестветь Bregma).
  14. Распоистите шприц Гамильтона (шприцы неврозов) на брегме.
  15. Используя брегму и стереотаксисный атлас в качестве эталона, располагайте шприц Гамильтона по следующим координатам: Antero-posterior: -0,30 мм, боковой- боковой: -3,0 мм, и брюшной, пока он не коснется кости черепа, и отметьте череп и обратите внимание на координаты ориентации на бумаге.
  16. Просверлите череп на маркированную координату. Позаботьтесь с dura mater (повреждение dura mater может вызвать много кровотечений).
  17. Заполните шприц Гамильтона 7 МЛ раствора лизолецитина (1% в солевом растворе). В шприц можно поместить больший объем, но вводить только 7 МКЛ (вывести пузырьки из шприца для правильного измерения объема).
  18. Распоитите шприц Гамильтона в предыдущих координатах, чтобы начать инъекцию препарата (всего 7 мкл в 3 различных желудочковых стереотаксических координат). Учитывая ранее отмеченные координаты, опустите шприц Гамильтона до брюшной координаты -5,0 мм.
  19. Очень медленно вводят 2 МКЛ раствора лизолецитина (1 йл/10 мин). Подождите 3 мин.
  20. Возьмите иглу до следующей вентраальной стереотаксисной координаты (-4,2 мм) и медленно ввишите 2 мл раствора лизолецитина (1 йл/ 10 мин). Подождите 3 мин.
  21. Ввишите третью вентрал-координату -3,0 мм (3 мкл раствора лизолецитина - 1 мл/10 мин).
  22. Подождите 5 минут, а затем удалить шприц Гамильтона из мозга.
  23. Шов кожи.
  24. Удалите животное из стереотаксического аппарата и дайте животному пробудиться.
  25. Вернуть животное в домашнюю клетку, держать животное в покое и под наблюдением, чтобы проверить признаки дискомфорта.
  26. Вводят подкожный анальгет (кетопрофен - 5 мг/кг), разбавленный солевым раствором, при 24 ч и 48 ч после операции.

3. Приобретение ПЭТ

  1. Возьмите от 7 до 20 MBq 11C-PIB радиоактивности в шприце (1 мл является максимальным объемом, допустимым для внутривенных инъекций у крыс).
  2. Анестезировать животное с 5% изофлюран смешивается в 100% O2 (1 л / мин) с помощью индукционной коробки.
  3. Инъекция 11C-PIB (радиоактивность, определенная в пункте 4.1 выше) в вену полового члена, или хвостовую вену крысы (оба административных участка в порядке, решение является личным выбором. Мы только советуем не использовать ретро-орбитальную инъекцию, так как расположение слишком близко к области интереса (мозг) и может ухудшить качество изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение приобретения базовой точки времени выполняется до стереотаксисных инъекций, а остальные 2 точки времени на 1 неделю и 4 недели после операции.
  4. Удалите животное из наркоза, чтобы животное пробудилось (оставьте животное на теплой площадке, пока оно полностью не проснется).
  5. Верните животное в домашнюю клетку.
  6. Подождите 30 минут для следующего шага.
  7. Обезболивать крыс с 5% изофлюран смешивается в 100% O2 (1 л / мин) с помощью индукционной коробки.
  8. Открытое программное обеспечение ПЭТ сканера.
  9. Выберите Сканирование и Pet Готов.
  10. Полный главный исследователь детали, исследование ID, серия ID, животных ID, вес животных (г), и дополнительные заметки. Выберите следующий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте точку (.) для десятичного числа в весе животного.
  11. Редактировать roi области для сканирования (обычно между 3 и 8). Это область, которая будет включена в изображение (области между числами 3 и 8 крышки кровати появится в окончательном изображении).
  12. Распоить анестезированую крысу на стандартной крысиной ложе ПЭТ-сканера и включить анестезию (3% изофлюран в 100% O2 является хорошим началом, а затем скорость анестезии должна быть скорректирована по мере необходимости). Чтобы настроить анестезию, проверьте данные мониторинга программного обеспечения сканера, чтобы убедиться, что животное дышит в постоянном и медленном ритме.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Включите вакуумный насос в сочетании с активированным углеродным фильтром для сбора избытка газа изофлюран (если насос доступен).
  13. Нанесите крем для глаз, чтобы защитить глаза животного.
  14. Нажмите кровать животного внутри ПЭТ сканера.
  15. Полная информация о деятельности, время калибровки активности, Изотоп (C-11) и продолжительность сканирования (20 минут). Выберите начало сканирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сообщение Pet Moving Bed появится, и животное кровать будет двигаться в оборудование и остановиться на ранее выбранной позиции рентабельности инвестиций. Время приобретения начнется отсчет и количество подсчетов в секунду появится (CPS).
  16. В программном обеспечении сканера перейдите на вкладку Monitor слева от экрана, проверьте порог изменения дыхательных параметров (BPM).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окно всплывает, в комплекте с параметром порога (500). Выберите OK.
  17. Перейдите на 0% POWER, чтобы изменить параметры температуры, чтобы нагреть животное во время сканирования. Окно всплывает; завершить параметр (80 - 100). Выберите OK.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте от 80 до 100% мощности в зависимости от условий комнатной температуры (чем больше мощности, тем теплее она будет получать).
  18. Перейдите на вкладку SCAN.
  19. Перейдите к инструменту конфигурации (значок передач) и завершите время впрыска, оставшуюся активность, оставшееся время калибровки активности. Выберите Сохранить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всплывающее окно "Вы уверены, что хотите изменить метаданные протокола?" Да, ДА
  20. Перейдите обратно на вкладку Monitor (проверьте дыхательные параметры животного, а при необходимости увеличьте или уменьшите концентрацию изофлюрана - обычно достаточно 3% в 100% O2).
  21. Когда приобретение ПЭТ будет закончено, сообщение Pet Ready появится на вкладке Scan, проверьте Arrow Out Icon (слева от инструмента конфигурации), чтобы выйти из кровати животного.
  22. Снимите животное с наркоза и дайте пробудиться на теплой площадке.
  23. Для восстановления изображения перейдитена вкладку «Реконструкция».
  24. Проверьте плюс значок в левом нижнем углу экрана и выберите файл исследования, который будет реконструирован. Выберите следующий.
  25. Перейдите к инструменту разрешения энергии. Окно всплывает. Настройте энергетический пик (keV) на параметр оборудования (на основе ежемесячного контроля качества). Выберите Закрыть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Энергетический пик может меняться каждый месяц при выполнении ежемесячной калибровки оборудования.
  26. Держите все остальные параметры по умолчанию (размер изометрического воксела: 400 мм; количество итераций: 30; Разрешение энергии: 30%; Сохранить только последнюю итерацию; uncheck Храните двоичные данные) .
  27. Проверить Добавить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всплывающее окно "Реконструкция была добавлена в очередь и начнется, как только другие закончили". Выберите OK. Файл появится в списке реконструкций на вкладке «Реконструкция», и статус будет отображаться как ожидание или % (прогресс) или законченный.

4. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните анализ изображений с помощью специального программного обеспечения для анализа изображений. В текущем протоколе демонстрация использует определенную программу, но если она недоступна, могут быть использованы другие варианты.

  1. Открыть PMOD и предохранитель его.
  2. Перейдите на вкладку Соответствие в верхней части экрана.
  3. Откройте меню Load Input в правой середине экрана и выберите файлы Autodetect, выберите ФАЙЛ PET (DICOM, Interfile или NifTI), добавьте к выбранному, нажмите кнопку Operations, переориентуйте на стандартную ориентацию, нажмите Load и Close.
  4. Проверить, правильно ли животное видов в нижней части экрана (RAT).
  5. Проверьте поле урожая в правом нижнем углу экрана.
  6. Отрегулируйте размер желтой коробки на ПЭТ-изображении, чтобы взять весь мозг.
  7. Нажмите кнопку Rigid справа от экрана. При подтверждении окна нажмите Да.
  8. Нажмите на инструмент мозга в правой середине экрана, чтобы открыть справочный атлас. Выберите Px Крыса (W.Schiffer) - T2.
  9. Выберите результаты матча из первой правой вкладки (Выберите вкладку этапа обработки).
  10. Нажмите на ре нарезку данных (4-явкладкав правом верхнем меню).
  11. Выравнивание ПЭТ-изображения с эталоном шаблона с помощью инструмента вращения (белый значок в центре ИЗОБРАЖЕНИЯ ПЭТ). Проверьте выравнивание для 3 анатомических плоскостей.
  12. Сохраните файл совместной регистрации (правое боковое меню экрана).
  13. Выберите формат вывода (DICOMor NifTI), каталог и приставку к файлу. Нажмите Сохранить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если совместно зарегистрированный выход сохраняется как NifTi, информация об изображении заголовка будет потеряна.
  14. Нажмите меню VOIs в нижней части экрана.
  15. Перейдите на шаблон «Gt; Atlas» в нижней части экрана (ниже окна VOIs).
  16. Выберите Px Rat (W.Schiffer) из выпадают из меню.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вам нужно проанализировать только конкретные VOIs вы можете выбрать только области мозга, представляющие интерес. Если вы хотите, чтобы все области мозга атласа мозга, никаких действий не требуется.
  17. Нажмите Outline в нижней части экрана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: VOIs областей мозга появится в окне VOIs.
  18. Вручную нарисуйте VOI в месте поражения и контралатеральной области полушария мозга(11C-PIB низкой области поглощения и контралатерального полушария мозга, соответственно).
  19. Нажмите в области ПЭТ-изображения с 11C-PIB низким поглощением.
  20. Выберите Новый VOI и OK.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Появится электронная таблица
  21. Перейдите к значку SPHERE в средней части экрана (слева от окна VOIs)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Появится электронная таблица.
  22. Выберите имя VOI: поражение и выберите Применить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сфера появится на со-зарегистрированном изображении.
  23. Выровнять сферу в области поражения и настроить VOI для всех анатомических плоскостей.
  24. Нажмите Закрыть (в нижней части таблицы).
  25. Выберите поражение VOI (из списка VOIs).
  26. Перейдите на значок зеркальных операций VOI (в правом верхнем справа от окна VOIs) и выберите клон и зеркало влево/вправо.
  27. Перейдите для расчета выбранной статистики VOI в верхней части окна списка VOIs. Перейдите к выберите статистику для расчета значка для выбора выходных данных (в правую сторону значка статистики VOI). Обычно для миелина проверка содержания Статистика для группы VOIs, Средний, SD, Мин, Макс).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Появится электронная таблица. Установка данных по умолчанию kBq/cc. В левой верхней части таблицы (СТАТИСТИКА VOI) вы можете проверить единицу данных как внедорожник (Стандартизированное значение поглощения). Если вы завершили администрирование радиотрасера и данные о приобретении изображений правильно в программном обеспечении сканера, как описано ранее, данные внедорожника будут рассчитываться автоматически программным обеспечением PMOD, если нет, вы можете редактировать детали.
  28. Перейдите на copy с помощью формата номеров системного лока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте, выбраны ли все статистические данные для копирования в качестве вывода (Проверить значок в правой верхней части экрана). Данные, которые будут скопированы, зависят от выбранной Группы данных.
  29. Вставьте выходные данные в блокнот или электронную таблицу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о настройках программного обеспечения для точечных и запятых символов между числами. Это может отличаться между конфигурациями языков.
  30. Сохраните файл с именем исследования и деталями.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 показаны иллюстративные 11C-PIB ПЭТ-изображения с изменениями миелина с течением времени. В базовом сканировании нет различий в содержании миелина (т.е. демиелинизации нет). На 1-недельном изображении можно увидеть очаговое демиелинетное поражение (в правом полушарии), о чем свидетельствует белая стрелка. Изображения представлены в 3 анатомических плоскостях (корональных, осяных и сагиттал) и можно определить демиелинированные повреждения во всех из них. 1-недельное изображение является иллюстрацией хорошо делимитированного поражения в месте инъекции, представляющего правильную индукцию модели и обнаружение изображений. В 4 недели изображения, не поражение не видно больше, что свидетельствует о том, что ремиелинизация произошла и содержание миелина возвращается к нормальной жизни (или близко к нему).

На репрезентативных графиках показана количественная оценка изображений 4 животных в 3 различных точках времени. Первый график показывает результаты от количественной оценки поражения (ручное VOI) к контралатеральной стороне соотношение демонстрирует более фокусные изменения миелина, где инъекция лизолецитина была выполнена. Второй график показывает ту же количественную оценку, но в стриатуме (вводимое стриатум контралатеральное соотношение) и в этом случае разница не является статистически значимой, что может быть объяснено небольшим размером выборки и тем, что VOI больше и концентрация радиоактивности измеряется не только там, где был введен лизолецитин.

Различия между группами были проанализированы тестом Крускаль Уоллис, а затем тест Данна для нескольких сравнений и результаты представлены как среднее значение ± SD. При поражении VOI (H No 7.063; P-0.017), на 1-недельом изображении коэффициент поглощения трассировщика (0,90±0,07) был на 16% ниже базового (1,07±0,06), со статистической значимостью (стр. 0,024). Существенных отличий в 4-недельом изображении (1.01±0.06) обнаружено не было.

В стриатуме статистических различий обнаружено не было (H 1,412; П-0,5393). Коэффициенты поглощения изображений составили 1,07±0,07 для базового уровня, 1,02±0,07 за 1 неделю и 1,01±0,08 за 4 недели.

На третьем графике (нижняя линия, левый график) представлена количественная оценка контралатеральной стриатума (не вводили сторону). На этом графике можно заметить, что не было никакой разницы (P-9397) между точками времени, а это означает, что изменение в инъекционной стороне связано с изменениями миелина, а не из-за изменения поглощения трассировщика с течением времени.

Окончательный график, в правом нижнем углу, показывает количественную оценку инъекционного участка (поражение VOI) у животных, где модель не была хорошо индуцирована (вероятно, из-за быстрой инъекции лизолецитина, неправильной стереотаксисной манипуляции и/или неправильной подготовки раствора). В этом случае, более низкое поглощение не рассматривается в 1 неделю времени точки, то есть не демиелинизации процесс не произошло, и низкое поглощение на 4 недели может быть связано с более поздним процессом демиелинизации или повреждения тканей, обе ситуации связаны с плохой модели животных индукции. Этот график был добавлен в протокол, чтобы проинпротекторировать появление результатов, когда индукция животных не выполняется хорошо, и подчеркнуть важность каждого шага протокола, от начала до конца. Нет никаких различий в поглощении трассировщика (H 2.745, P 0.267) с коэффициентами поглощения 1.06±0.05, 1.02±0.14 и 0.96±0.10 для базовых, 1 недели и 4 недели ПЭТ-изображений.

Рисунок 2 добавляет больше информации к результатам, где рисунок 2A детали, где руководство VOI был нарисован, на основе ссылки шаблона МРТ и рисунок 2B показывает лукол быстро синее окрашивание (для получения подробной информации о лукол быстро синий протокол окрашивания, см. Де Паула Фариаи др. 13) от инъекционной стороны и не вводили стороны на 7 дней после стереотаксиса инъекции.

Figure 1
Рисунок 1: Иллюстративные 11C-PIB ПЭТ изображения, показывающие изображения исходной линии, 1 неделя, и 4 недели после стереотаксической инъекции. Графики в нижней части рисунка представляют собой количественную оценку поглощения трассировщика (n'4) в разных точках времени. Первые два графика представляют собой коэффициент поглощения в инъекционной стороне контралатеральной стороны в поражении и в стриатуме в хорошо индуцированной модели (т.е. крысы, представляющие поражение после инъекции лизолецитина). Третий график (внизу слева) показывает количественную оценку непрыснутого стриатума (отрицательный контроль), а окончательный график (внизу справа) представляет собой поглощение 11C-PIB в месте инъекции животных, которые не представляют демиелинатическое поражение (плохо индуцированная модель). Результаты представлены как средние±SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Детали расположения поражения. A) Иллюстративные VOIs впрыснутой стороны (dashed линии) и non-injected стороны (белая линия) нарисованная вручную основанная на шаблоне MRI (регионе callosum корпуса и striatum) на 1 неделе столб стереотаксической впрыски. B) Луксор быстрое синее окрашивание, показывающее демиелинизацию в инъекционной полушарии по сравнению с неинжекторной стороной (вверху: 40x увеличение, дно: 100x увеличение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Самым большим преимуществом использования модели лизолецитина для изучения рассеянного склероза является быстрая шкала времени демиелинизации (около 1 недели) и ремиелинизации (около 4 недель)происходит 14. Эта модель также может быть индуцированау мышей 15, однако, индукция у крыс является более выгодным для in vivo ПЭТ изображений из-за большего размера мозга крысы по сравнению с мышами.

Первый шаг индукционной модели заключается в том, чтобы быть крайне осторожным. Эта модель была проверена на миелин ПЭТ-изображения де ПаулаФариа и др. 10 в 2014 году, и было показано, что скорость инъекции лизолецитина внутри мозга имеет решающее значение для хорошо индуцированной модели. Инъекции должны быть выполнены очень медленно, 1 йл каждые 10 минут, как способ избежать повреждения тканей. Раствор лизолецитина также должен быть подготовлен в тот же день, что и стереотаксическая инъекция, предпочтительно непосредственно перед началом хирургической процедуры. Если модель будет впервые использована в исследовательской группе, мы рекомендуем проверить модель перед выполнением любой количественной оценки миелина с помощью ПЭТ-изображения. Проверка должна включать в себя посмертный анализ тканей путем миелинового окрашивания, например: Luxol быстрой синей гистологии, как показано на рисунке 2, и миелин основной белок (MPB) иммуногистохимии, в различных точках времени, предназначенных для использования в анализе in vivo. В разделе результатов мы показали количественную оценку поглощения радиотрактора, где индукция поражения не была успешной, и, следовательно, различия не были обнаружены 11C-PIB ПЭТ-изображения.

Поражение, которое должно быть количественно по этому методу, должно быть больше, чем разрешение ПЭТ-сканера (около 1 мм в доклиническом оборудовании и около 5 мм в клиническом оборудовании).

После того, как модель хорошо индуцирована, процедура визуализации должна быть хорошо спланирована, из-за радиотракера, помеченного углеродом-11, который имеет короткий период полусейла 20 минут. Сотрудники доклинной лаборатории визуализации должны подготовить весь необходимый материал, заполнить анестезию, проверить, все ли работает должным образом, и распечатать формы, которые должны быть завершены в ходе эксперимента. ПЭТ-сканер также должен быть проверен до начала эксперимента, когда все меры контроля качества, необходимые в оборудовании (в зависимости от каждой страны) должны быть выполнены для проверки сканера хорошо функционирует. После получения трассировщика для инъекций, измерение активности также должно быть измерено в калибровке дозы, чтобы гарантировать правильную дозу введения, и информация (активность в шприце, до и после инъекции) написана на форме, а также соответствующее время, когда было выполнено измерение. Установить, какие часы будут использоваться, так как в нужное время находится время на рабочей станции ПЭТ-сканера, время, которое будет учитываться при коррекции распада изображений, поэтому любые часы, используемые в ходе эксперимента, должны быть синхронизированы со временем работы сканера.

Во время получения изображений животных, температура и дыхание животных должны контролироваться и анестезия регулируется, по мере необходимости. Температура зависит от местоположения и должна быть скорректирована для благополучия животных. После того, как изображение будет закончено, важно держать животное на теплой площадке, чтобы восстановиться перед тем, как вернуться в клетку.

Обработка изображений имеет решающее значение для получения надежных результатов экспериментов с использованием ПЭТ-изображений. Идеально то, что анализатор не знает о группах животных и / или лечения, и что он / она уже имеет опыт работы в ПЭТ-изображения с ПЭТ трассировщик используется таким образом, чтобы гарантировать идеальную регистрацию между ПЭТ-изображения и МРТ шаблон. Мы использовали программное обеспечение PMOD в этом протоколе, но если это программное обеспечение не доступно, альтернативное программное обеспечение количественной оценки изображений может быть использовано, хотя внимание должно быть уделено достижению хорошего определения области мозга и количественной оценки. Для определения места поражения, дополнительные меры должны быть приняты для обеспечения того, чтобы вводили сайт находится внутри обращается поражения VOI (знание анатомии мозга крысы необходимо).

Важно сказать, что миелин ПЭТ-изображения могут быть выполнены и в других моделях MS животных, показывая непредсказуемые поражения, как уже показано нашей группой в экспериментальной аутоиммунной энцефаломиелит (EAE) мармосетмодели 5. Как уже говорилось, важным параметром для рассмотрения в количественной оценке поражения является разрешение ПЭТ-сканера, которое является ограничением для выявления слишком малых поражений. ПЭТ-изображения является плохим разрешением техники визуализации по сравнению с другими методами, такими как МРТ, однако это весьма специфический способ и, из-за этого, количественная оценка ПЭТ изображения использует анатомический шаблон, такие как МРТ, для оказания помощи в составлении области интереса, как показано в вышеупомянутом протоколе.

Хотя ручной рисунок VOIs зависит от оператора, это лучший вариант для модели животных LPC, так как поражение может быть переменным между животными. Чтобы уменьшить предвзятость в процессе количественной оценки, важно выполнить зеркальное VOI, как это объясняется в протоколе, который будет в том же регионе и того же размера, что и впрыскиваемая сторона. Важно также иметь в виду стереотаксисные координаты при рисовании VOI в шаблоне МРТ, чтобы гарантировать, что правильная область мозга считается. Использование миелина окрашивания в качестве руководства для выявления demyelinated области также может помочь в рисунке, как объяснил в де Паула Фариа12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ни один.

Acknowledgments

β (Molecubes NV, Бельгия) было поддержано Научно-исследовательским фондом Сан-Паулу, FAPESP - Бразилия (#2018/15167-1). LES имеет докторскую стипендию студента от FAPESP - Бразилия (#2019/15654-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analytical Balance Marte AUWZZOD max: 220 g- min: 1 mg
Anestesia vaporizer Nanitech 15800
Beta-cube Molecubes
Bulldog clamp Stoelting 5212043P
clorexidine Rioquimica 0.5%/100 mL
Cotton swabs johnson e johnson
Dose calibrator Capintech
Drill Kinzo powertools 352901 Model Q0M-DC3C
Eppendorf tube Eppendorf 30125150 1.5 mL
Eye lubricant ADVFARMA 30049099  vaseline 15 g (pharmaceutical purity)
Fine forceps Stoelting 52102-38P
Gloves Descarpack 212101  6.5 size
Heating pad Softhear
Injection Syringe Hamilton 80314 10µ, 32ga, model 701
Insuline syringe BD 328328 1 mL insulin syringes with needle
Isoflurane Cristália 410525 100 mL , concentration 1 mL/1 mL
Ketoprofen or other analgesic Sanofi 100 mg/2 mL
lidocaine Hipolabor 1.1343.0102.001-5 2%/20mL
L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk Sigma-aldrich L-4129 25 mg - ≥99%, Type I, powder
Needle holder Stoelting 5212290P
Oxygen White Martins 7782-44-7 Compressed gas
PMOD software PMOD technologies Version 4.1 module fuse it
Rat anesthesia mask KOPF Model 906
Saline Farmace 0543325/ 14-8 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Scapel blades Stoelting 52173-10
Scapel handles Stoelting 52171P
Scissor Stoelting 52136-50P
Semi-analytical Balance Quimis BK-3000 max:3,100 g; min:0.2 g
shaver Mega profissional AT200 model
Stereotactic Apparatus KOPF Nodel 900
Universal holder with needle support KOPF Model 1772-F1 Hamilton support for 5 and 10 µL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oh, J., Vidal-Jordana, A., Montalban, X. Multiple sclerosis: clinical aspects. Current Opinion in Neurology. 31 (6), 752-759 (2018).
  2. Sand, I. K. Classification, diagnosis, and differential diagnosis of multiple sclerosis. Current Opinion in Neurology. 28 (3), 193-205 (2015).
  3. Thompson, A. J., et al. Diagnosis of multiple sclerosis: 2017 revisions of the McDonald criteria. Lancet Neurology. 17 (2), 162-173 (2018).
  4. Veronese, M., et al. Quantification of C-11 PIB PET for imaging myelin in the human brain: a test-retest reproducibility study in high-resolution research tomography. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 35 (11), 1771-1782 (2015).
  5. Carvalho, R. H. F., et al. C-11 PIB PET imaging can detect white and grey matter demyelination in a non-human primate model of progressive multiple sclerosis. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 35, 108-115 (2019).
  6. Stankoff, B., et al. Imaging central nervous system myelin by positron emission tomography in multiple sclerosis using [methyl-(1)(1)C]-2-(4'-methylaminophenyl)- 6-hydroxybenzothiazole. Annals of Neurology. 69 (4), 673-680 (2011).
  7. Faria, D. D. Myelin positron emission tomography (PET) imaging in multiple sclerosis. Neural Regeneration Research. 15 (10), 1842-1843 (2020).
  8. Pietroboni, A. M., et al. Amyloid PET as a marker of normal-appearing white matter early damage in multiple sclerosis: correlation with CSF -amyloid levels and brain volumes. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 46 (2), 280-287 (2019).
  9. Pytel, V., et al. Amyloid PET findings in multiple sclerosis are associated with cognitive decline at 18 months. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 39, (2020).
  10. Faria, D. dP., et al. PET imaging of glucose metabolism, neuroinflammation and demyelination in the lysolecithin rat model for multiple sclerosis. Multiple Sclerosis Journal. 20 (11), 1443-1452 (2014).
  11. Rinaldi, M., et al. Galectin-1 circumvents lysolecithin-induced demyelination through the modulation of microglial polarization/phagocytosis and oligodendroglial differentiation. Neurobiology of Disease. 96, 127-143 (2016).
  12. Faria, D. dP., et al. PET imaging of focal demyelination and remyelination in a rat model of multiple sclerosis comparison of [C-11]MeDAS, [C-11]CIC and [C-11]PIB. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 41 (5), 995-1003 (2014).
  13. Faria, D. dP., et al. PET imaging of focal demyelination and remyelination in a rat model of multiple sclerosis: comparison of [11C]MeDAS, [11C]CIC and [11C]PIB. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 41 (5), 995-1003 (2014).
  14. vander Star, B. J., et al. In Vitro and In Vivo Models of Multiple Sclerosis. CNS & Neurological Disorders-Drug Targets. 11 (5), 570-588 (2012).
  15. Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216 (2015).

Tags

Неврология Выпуск 168 11C-PIB ПЭТ-изображения миелин рассеянный склероз молекулярная визуализация модель крысы лизолецитина анализ VOI

Erratum

Formal Correction: Erratum: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. The citation was updated.

The citation was updated from:

de Paula Faria, D., Cristiano Real, C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).

to:

de Paula Faria, D., Real, C.C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).

Позитронная эмиссионная томография <em>для измерения содержания</em> миелина в модели крысы лизолецитина рассеянного склероза
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Paula Faria, D., Real, C. C.,… More

de Paula Faria, D., Real, C. C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter