Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Måling af Myelin Indhold i Lysolecithin Rat Model af multipel sklerose

Summary

Denne protokol har til formål at overvåge in vivo myelin ændringer (demyelination og remyelination) ved positron emission tomografi (PET) billeddannelse i et dyr model af multipel sklerose.

Abstract

Multipel sklerose (MS) er en neuroinflammatorisk sygdom med ekspanderende axonal og neuronal degeneration og demyelination i centralnervesystemet, hvilket fører til motoriske dysfunktioner, psykisk handicap og kognitiv svækkelse under MS-progression. Positron emission tomografi (PET) er en billeddannelse teknik i stand til at kvantificere in vivo cellulære og molekylære ændringer.

Radiotracers med affinitet til intakt myelin kan bruges til in vivo billeddannelse af myelin indhold ændringer over tid. Det er muligt at opdage enten en stigning eller fald i myelin indhold, hvad betyder denne billeddannelse teknik kan opdage afmyelination og remyelination processer i centralnervesystemet. I denne protokol demonstrerer vi, hvordan man bruger PET-billeddannelse til at opdage myelinændringer i lysolecithin rottemodellen, som er en model af fokal demyelinationslæsion (induceret af stereotaktisk injektion) (dvs. en model af multipel sklerosesygdom). ^{11 af de 11.} C-PIB PET-billeddannelse blev udført ved baseline, og 1 uge og 4 uger efter stereotaxisk injektion af lysolecithin 1% i højre striatum (4 μL) og corpus callosum (3 μL) af rottehjernen, hvilket gjorde det muligt at kvantificere brændviddemyelination (injektionssted efter 1 uge) og remyelineringsprocessen (injektionssted efter 4 uger).

Myelin PET-billeddannelse er et interessant værktøj til overvågning in vivo ændringer i myelin indhold, som kunne være nyttige til overvågning af afmyelinating sygdomsprogression og terapeutisk respons.

Introduction

Multipel sklerose (MS) er en neuroinflammatorisk sygdom, der påvirker centralnervesystemet, karakteriseret ved betændelse, demyelination og axonalt tab¹. Prognosen for denne sygdom er variabel selv med fremskridt i behandlingen, og det er en af de mest almindelige årsager til neurologiske underskud hos unge¹. Diagnosen MS er baseret på kriterierne for klinisk manifestation og visualisering af karakteristiske læsioner ved magnetisk resonansbilleddannelse (MRI)^2,3.

Positronemissionstomografi (PET) kan være et nyttigt redskab til in vivo-overvågning af MS-progression og terapeutiske virkninger. Pittsburgh sammensatte B radiotracer (PIB) mærket med kulstof-11 (¹¹C-PIB) er meget udbredt til at kvantificere β-amyloid plaques; I det sidste årti er det dog blevet undersøgt for at kvantificere myelinindhold og vise dynamisk afmyelinering og remyelination^4,5,6.

Forskellige amyloid PET-sporstoffer (¹¹C-PIB, ¹⁸F-florbetaben,¹⁸F-florbetapir, ¹⁸F-flutemetamol) kan bruges til at kvantificere myelin og give vigtige oplysninger om sygdomsprogression og terapeutisk respons, hvilket gør det muligt at identificere afmyelinerings- og remyelineringsprocesser uden interferens af neuroinflammation, som kan forekomme med konventionelle magnetiske resonansbilleder (MRI)⁷. Amyloid PET-billeddannelse viste nedsat sporstofoptagelse hos aktive MS-patienter sammenlignet med ikke-aktive patienter, hvilket kunne forklares ved tidlig skade på hvidt stof hos de aktive patienter⁸. Lavere amyloid sporstofoptagelse var også forbundet med kognitiv tilbagegang i en opfølgende undersøgelse, der viser, at denne teknik er et værdifuldt værktøj til at studere sygdommens patofysiologi og kliniske resultater⁹.

Lysolecithin (LPC) rottemodellen er en kemisk induceret model af multipel sklerose, hvor det injicerede toksin, LPC, fremkalder en høj respons af makrofager, der resulterer i øget inflammation og dermed demyelinering^10,11. Afmyelineringen vendes hurtigt om om ca. 4 uger, hvilket gør dette til en god model til evaluering af demyelinerings- og remyelineringsprocesser hos gnavere. Denne model er allerede blevet evalueret ved hjælp af PET-billeddannelse, med gode resultater og korrelation med post mortem essays¹².

Her præsenterer vi protokollen for myelin PET-billeddannelse med ¹¹C-PIB i lysolecithin rottemodellen, der viser, at denne billeddannelsesteknik er et nyttigt værktøj til in vivo-måling af myelinindhold.

Protocol

Alle procedurer blev gennemført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Det Nationale Råd for Kontrol med Dyreforsøg (CONCEA, Brasilien) og blev godkendt af Den Etiske Komité for Dyreforskning ved Medicinsk Skole ved Universitetet i Sao Paulo (CEUA-FMUSP, Brasilien - protokolnummer: 25/15).

BEMÆRK: I denne protokol viser vi, hvordan man fremkalder en lysolecithin rottemodel af multipel sklerose, og hvordan man erhverver og analyserer myelin PET-billederne.

1. Klargøring af lysolecithinopløsning

1. Lysolecithin (L-α-Lysophosphatidylcholine fra æggeblomme) afvejes på en analytisk skala ved hjælp af et konisk plastrør (1,5 mL).
2. Der tilsættes steril saltvand til røret for at fremstille 1% opløsning (f.eks.: veje 1 mg lysolecithin og opløse det med 100 μL saltvand) og opløse lysolecithin ved at ryste røret (ryste fra side til side og ikke dreje fra top til bund).
3. Forbered opløsningen lige før du starter dyremodellen induktion (lager ikke den endelige klar løsning).

2. Lysolecithin rotte model - Stereotaxic kirurgi

1. Brug mandlige Wistar rotter, der vejer mellem 220 - 270 g. Brug handsker og maske under alle procedurer.
2. Fremkalde anæstesi med 5% isofluran blandet i 100% O₂ (1 L/min) ved hjælp af en induktion boks. Kontroller, om dyret bedøves ved at observere fravær af bevægelse (kun vejrtrækning skal observeres).
3. Placer dyret i stereotaxic apparatur på en varmepude. Fastgør dyrets næse og ører til udstyret.
   BEMÆRK: Nærmere oplysninger om, hvordan man udfører stereotaxic kirurgi kan findes i JoVE Science Education Database. Neurovidenskab. Gnaver stereotaxisk kirurgi. JoVE, Cambridge, CAN, 2021.
   1. Overvåg anæstesi for hele proceduren (herunder kirurgi og billederhvervelse). For at justere isoflurankoncentrationen skal du observere dyrets vejrtrækningshastighed. En hurtig vejrtrækning kræver højere koncentration og en langsom vejrtrækning kræver lavere bedøvelseskoncentration.
4. Injicere smertestillende (ketoprofen - 5 mg / kg) subkutant (fortynd medicinen til 1 mL i saltvand, dette vil bidrage til at hydrere dyret).
5. Sæt øjencreme i dyrets øjne for at beskytte mod dehydrering.
6. Brug en 0,5% chlorhexidinopløsning til at rengøre indsnitsområdet.
7. 100 μL lidocainhydrochlorid injiceres 2% subkutant i indsnitsområdet.
8. Barber kraniet.
9. Brug sterile instrumenter til denne procedure.
10. Brug en skalpel, lav et snit på ca. 2 cm i huden over kraniet.
11. Udsæt kraniet med Bulldog klemmer.
12. Brug en vatpind til at rense kraniet område med 1% brintoverilte.
13. Find og marker bregmaen (et stereotaxisk rottehjerneatlas kan hjælpe med at identificere Bregma).
14. Placer Hamilton-sprøjten (μL neurosprøjter) ved bregmaen.
15. Brug bregma og et stereotaxisk atlas som reference, placer Hamilton-sprøjten ved følgende koordinater: Antero-posterior: -0,30 mm, latero-lateral: -3,0 mm, og ventral, indtil den rører kranieknoglen, og marker kraniet og noter koordinatretningen på papir.
16. Bor kraniet ved den markerede koordinat. Pas på dig selv med dura mater (skadelig dura mater kan forårsage en masse blødning).
17. Hamilton-sprøjten fyldes med 7 μL lysolecithinopløsning (1% i saltvand). Et større volumen kan placeres i sprøjten, men kun 7 μL injiceres (tag boblerne ud af sprøjten for at måle lydstyrken korrekt).
18. Placer Hamilton-sprøjten ved de tidligere koordinater for at starte injektionen af lægemidlet (i alt 7 μL i 3 forskellige ventrale stereotaktiske koordinater). I betragtning af de tidligere noterede koordinater sænkes Hamilton-sprøjten til ventralkoordinaten -5,0 mm.
19. Der injiceres meget langsomt 2 μL lysolecithinopløsning (1 μL/10 min. Vent 3 minutter.
20. Tag nålen op til den næste ventrale stereotaxiske koordinat (-4,2 mm), og injicer langsomt 2μL lysolecithinopløsning (1 μL/ 10 min). Vent 3 minutter.
21. Den tredje ventralkoordinat indsprøjtes -3,0 mm (3 μL lysolecithinopløsning - 1 μL/ 10 min).
22. Vent 5 min og derefter fjerne Hamilton sprøjten fra hjernen.
23. Sutur huden.
24. Fjern dyret fra det stereotaktiske apparat og lad dyret vågne.
25. Returner dyret til hjemmeburet, hold dyret alene og under tilsyn for at kontrollere for tegn på ubehag.
26. Injicere subkutan smertestillende (ketoprofen - 5 mg/kg) fortyndet i saltvand ved 24 timer og 48 timer efter operationen.

3. Erhvervelse af PET

1. Tag 7 til 20 MBq af ¹¹C-PIB radioaktivitet i en sprøjte (1 mL er det maksimale volumen, der er tilladt for intravenøs injektion hos rotter).
2. Bedøve dyret med 5% isoflurane blandet i 100% O₂ (1 L/ min) ved hjælp af induktionsboksen.
3. ^{Indsprøjtning 11}C-PIB (radioaktivitet defineret i punkt 4.1 ovenfor) i rottens penisåre eller haleåre (begge administrationssteder er fine, beslutningen er et personligt valg. Vi råder kun til ikke at bruge en retro-orbital injektion, da placeringen er for tæt på interesseregionen (hjernen) og kan forringe billedkvaliteten.
   BEMÆRK: Billederhvervelse af baseline-tidspunkt udføres før stereotaxisk injektion og de øvrige 2 tidspunkter ved 1 uge og 4 uger efter operationen.
4. Fjern dyret fra anæstesi for at lade dyret vågne (lad dyret stå på en varm pude, indtil det er helt vågent).
5. Returner dyret til hjemmeburet.
6. Vent 30 minutter på det næste trin.
7. Bedøve rotterne med 5% isofluran blandet i 100% O₂ (1 L/min) ved hjælp af en induktionsboks.
8. Åbn PET-scannersoftware.
9. Vælg Scan > Pet Ready.
10. Komplet principal investigator detaljer, Undersøgelse ID, Serie ID, Animal ID, Animal vægt (g), og yderligere noter. Vælg Næste.
    BEMÆRK: Brug prik (.) for decimaltal i dyrets vægt.
11. Rediger ROI-området til scanning (normalt mellem 3 og 8). Dette er det område, der vil blive inkluderet i billedet (områder mellem tallene 3 og 8 i sengetæppet vises i det endelige billede).
12. Placer bedøvet rotte på en standard rotte seng af PET-scanneren og tænde anæstesi på (3% isoflurane i 100% O₂ er en god start, og derefter anæstesi sats bør justeres efter behov). For at justere anæstesien skal du kontrollere scannersoftwarens overvågningsdata for at kontrollere, at dyret trækker vejret i en konstant og langsom rytme.
    BEMÆRK: Tænd vakuumpumpen koblet til det aktiverede kulfilter for at opsamle isoflurangasoverskridelser (hvis pumpen er tilgængelig).
13. Påfør øjencreme for at beskytte dyrets øjne.
14. Skub dyresengen ind i PET-scanneren.
15. Fuldstændige aktivitetsoplysninger, aktivitetskalibreringstid, isotop (C-11) og scanningsvarighed (20 minutter). Vælg Start scanning.
    BEMÆRK: Der vises en pet moving bed-besked, og dyresengen flyttes ind i udstyret og stopper ved den tidligere valgte ROI-position. Anskaffelsestidspunktet begynder at tælle ned, og antallet af optællinger pr. sekund vises (CPS).
16. I scannersoftwaren skal du gå til fanen Skærm til venstre på skærmen og kontrollere Skift tærskel til ændring af respiratoriske parametre (BPM).
    BEMÆRK: Der vises et vindue, komplet med tærskelparameter (500). Vælg OK.
17. Naviger til 0% STRØM for at ændre temperaturparametre for at opvarme dyret under scanningen. Der vises et vindue. parameteren (80 - 100). Vælg OK.
    BEMÆRK: Vælg mellem 80 og 100% strøm baseret på stuetemperaturforhold (jo mere strøm, jo varmere bliver det).
18. Gå tilbage til fanen SCAN.
19. Gå til konfigurationsværktøjet (tandhjulsikonet) og fuldfør injektionstid, resterende aktivitet, resterende aktivitetskalibreringstid. Vælg Gem.
    BEMÆRK: Et vindue vises "Er du sikker på, at du vil ændre protokolmetadataene?" > JA
20. Naviger tilbage til fanen Skærm (kontroller dyrets åndedrætsparametre, og om nødvendigt øge eller mindske isoflurankoncentrationen - normalt er 3% i 100% O₂ nok).
21. Når PET-anskaffelsen er færdig, vises pet ready-meddelelsen under fanen Scanning, og tjek Pileud-ikonet (til venstre for konfigurationsværktøjet) for at flytte dyresengen ud.
22. Fjern dyret fra anæstesi og lad det vågne på en varm pad.
23. Hvis du vil rekonstruere billedet, skal du gå til fanen Rekonstruer .
24. Kontroller plusikonet nederst til venstre på skærmen, og vælg den undersøgelsesfil, der skal rekonstrueres. Vælg Næste.
25. Gå til værktøjet Energiopløsning. Der dukker et vindue op. Konfigurer energitoppen (keV) til udstyrsparameteren (baseret på månedlig kvalitetskontrol). Vælg Luk.
    BEMÆRK: Energitoppen kan ændre sig hver måned, når der udføres månedlig kalibrering af udstyr.
26. Alle andre parametre skal bevares som standard (isometrisk voxelstørrelse: 400 mm; antal gentagelser: 30; Energi beslutning: 30%; Gem kun sidste gentagelse. fjern markeringen i Bevar binære data) .
27. Kontroller Tilføj.
    BEMÆRK: Et vindue dukker op "Rekonstruktionen blev tilføjet til køen og starter, når de andre er færdige". Vælg OK. En fil vises på genopbygningslisten under fanen Rekonstruer, og status vises som ventetid eller % (fremdrift) eller færdig.

4. Billedanalyse

BEMÆRK: Udfør billedanalyse ved hjælp af dedikeret billedanalysesoftware. I den aktuelle protokol bruger demonstrationen et bestemt softwareprogram, men hvis det ikke er tilgængeligt, kan der bruges andre indstillinger.

1. Åbn PMOD > Sammensmelt det.
2. Gå til fanen Matchende øverst på skærmen.
3. Åbn menuen Indlæs input i højre midt på skærmen, vælg Autodetect-filer, vælg PET-fil (DICOM, Interfile eller NifTI), føj til markeret, klik med Handlinger, Ret til standardretning, klik på Indlæs og luk.
4. Kontroller, om dyrearten er korrekt nederst på skærmen (RAT).
5. Marker beskæringsboksen nederst til højre på skærmen.
6. Juster den gule boksstørrelse i PET-billedet for at tage hele hjernen.
7. Klik på knappen Stiv til højre på skærmen. Klik på Javed bekræftelsesvinduet.
8. Klik på hjerneværktøjet i højre midt på skærmen for at åbne Reference Atlas. Vælg Px Rat (W.Schiffer) - T2.
9. Vælg Match resultater øverst til højre (fanen Vælg behandlingsstadie).
10. Klik på Datarelikering ^(4.fane øverst til højre).
11. Juster PET-billedet med referenceskabelonen ved hjælp af rotationsværktøjet (hvidt ikon i midten af PET-billedet). Kontroller justeringen for 3 anatomiske planer.
12. Gem co-registreringsfilen (højre menu på skærmen).
13. Vælg outputformat (DICOMor NifTI), mappe- og filpræfiks. Klik på Gem.
    BEMÆRK: Hvis co-registreret output gemmes som NifTi header billedoplysninger vil gå tabt.
14. Klik på VOI-menuen nederst på skærmen.
15. Gå til Skabelon > Atlas nederst på skærmen (under VOI-vinduet).
16. Vælg Px Rat (W.Schiffer) i rullemenuen.
    BEMÆRK: Hvis du kun har brug for at analysere specifikke VOI'er, kan du kun vælge de hjerneområder, der er af interesse. Hvis du vil have alle hjerneområder i hjerneatlasset, er der ikke behov for handling.
17. Klik på Disposition nederst på skærmen.
    BEMÆRK: VOI'er i hjerneområder vises i VOI-vinduet.
18. Træk manuelt VOI på læsionsstedet og det kontralaterale hjernehalvdelsområde (henholdsvis¹¹C-PIB-område med lav optagelse og kontralateral hjernehalvdel).
19. Klik i området af PET-billede med ¹¹C-PIB lav optagelse.
20. Vælg Ny VOI > OK.
    BEMÆRK: Der vises et regneark
21. Gå til ikonet SPHERE i den midterste del af skærmen (til venstre for VOI-vinduet)
    BEMÆRK: Der vises et regneark.
22. Vælg VOI-navnet: læsion, og vælg Anvend.
    BEMÆRK: Der vises en kugle i det medregistrerede billede.
23. Juster kuglen i læsionsområdet, og juster VOI'en for alle anatomiske planer.
24. Klik på Luk (nederst i regnearket).
25. Vælg læsions-VOI'en (på VOI-listen).
26. Gå til ikonet VOI-spejlingshandlinger (øverst til højre i VOI-vinduet), og vælg Klon og spejl til venstre/højre.
27. Naviger for at beregne den valgte VOI-statistik øverst i vinduet VOI-liste. Gå til Ikonet Vælg statistik, der skal beregnes, for at vælge outputdataene (til højre side af VOI-statistikikonet). Normalt for myelin indhold check Statistik for gruppe af VOI'er, Gennemsnit, SD, Min, Max).
    BEMÆRK: Der vises et regneark. Standardindstillingen Dataenhed er kBq/cc. Øverst i regnearket (VOI Statistics) kan du kontrollere dataenheden som SUV (Standardiseret optagelsesværdi). Hvis du har gennemført radiotracer administration og billederhvervelse detaljer korrekt i scanneren software, som beskrevet tidligere, vil SUV data beregnes automatisk af PMOD software, hvis ikke, kan du redigere detaljerne.
28. Gå til Kopier ved hjælp af systemets landestandardnummerformat.
    BEMÆRK: Kontroller, om alle statistikker er valgt til at blive kopieret som output (ikonet Kontroller øverst på skærmen). De data, der kopieres, afhænger af den valgte dataenhed.
29. Indsæt outputdataene i en notesblok eller et regneark.
    BEMÆRK: Vær forsigtig med softwareindstillinger for prik- og kommasymboler mellem tal. Dette kan være forskelligt mellem sprogkonfigurationer.
30. Gem filen med studienavn og detaljer.

Representative Results

Figur 1 viser illustrative ¹¹C-PIB PET-billeder med myelin ændringer over tid. I baseline scanning, kan ingen forskelle ses i myelin indhold (dvs. ingen demyelination er til stede). I 1-ugers tidspunktsbilledet er det muligt at se den fokale demyelinerede læsion (på højre halvkugle) som angivet af den hvide pil. Billeder præsenteres i de 3 anatomiske planer (koronar, aksial og sagittal), og det er muligt at identificere den demyelinerede læsion i dem alle. 1-ugers billedet er illustrationen af en godt afgrænset læsion på injektionsstedet, der repræsenterer den korrekte modelinduktion og billeddetektering. I de 4 uger billedet, ingen læsion er synlig længere, hvilket tyder på, at remyelination har fundet sted, og myelin indhold er tilbage til normal (eller tæt på det).

De repræsentative grafer viser kvantificeringen af billederne af 4 dyr i de 3 forskellige tidspunkter. Den første graf viser resultaterne fra kvantificeringen af læsionen (manuel VOI) til kontralateralt sideforhold, der viser mere fokale myelinændringer, hvor lysolecithininindsprøjtningen blev udført. Den anden graf viser den samme kvantificering, men i striatum (injiceret striatum til kontralateralt forhold), og i dette tilfælde er forskellen ikke statistisk signifikant, hvilket kan forklares ved den lille prøvestørrelse, og fordi VOI er større, og radioaktivitetskoncentrationen måles ikke kun, hvor lysolecithin blev injiceret.

Forskelle mellem grupper blev analyseret af Kruskal Wallis-testen, efterfulgt af Dunns test for flere sammenligninger, og resultaterne præsenteres som middel ± SD. I læsionen VOI (H = 7,063; P=0,017) var sporingsoptagelsesforholdet (0,90±0,07) i 1-ugers billedet 16% lavere end basislinjen (1,07±0,06) med statistisk signifikans (p=0,024). Der blev ikke fundet væsentlige forskelle i det 4-ugers billede (1,01±0,06).

I striatum blev der ikke fundet nogen statistiske forskelle (H = 1,412; P=0,5393). Optagelsesforholdet for billederne var 1,07±0,07 for baseline, 1,02±0,07 i 1 uge og 1,01±0,08 i 4 uger.

Den tredje graf (bundlinje, venstre graf) viser kvantificeringen af den kontralaterale striatum (ikke-injiceret side). I denne graf er det muligt at observere, at der ikke var nogen forskel (P = 9397) blandt tidspunkter, hvilket betyder, at variationen i den injicerede side skyldes myelinændringer og ikke på grund af sporstofoptagelsesvariation over tid.

Den endelige graf nederst til højre viser kvantificeringen af det injicerede sted (læsion VOI) hos dyr, hvor modellen ikke var godt induceret (sandsynligvis på grund af hurtig lysolecithinindsprøjtning, forkert stereotaxisk manipulation og / eller forkert opløsningspræparat). I dette tilfælde ses den lavere optagelse ikke i 1 ugers tidspunktet, hvilket betyder, at der ikke er forekommet nogen demyelineringsproces, og den lave optagelse efter 4 uger kan være relateret til en senere demyelinationsproces eller vævsskade, begge situationer er relateret til dårlig induktion af dyremodel. Denne graf blev tilføjet til protokollen for at eksemplificere udseendet af resultaterne, når dyrets induktion ikke er godt udført, og for at understrege betydningen af hvert trin i protokollen, fra begyndelsen til slutningen. Der er ingen forskelle i sporstofoptagelsen (H = 2,745, P = 0,267) med optagelsesforhold på 1,06±0,05, 1,02±0,14 og 0,96±0,10 for baseline, 1 uge og 4 ugers PET-billeder.

Figur 2 tilføjer flere oplysninger til resultaterne, hvor figur 2A-oplysninger, hvor den manuelle VOI blev tegnet, baseret på MRI-skabelonreferencen og figur 2B, viser den luksuriøse hurtige blå farvning (for detaljer om luxol hurtig blå farvningsprotokol, se De Paula Faria et al.¹³) fra den injicerede side og ikke-injiceret side 7 dage efter stereotaxisk injektion.

Figur 1: Illustrative ¹¹C-PIB PET-billeder, der viser billeder af baseline, 1 uge og 4 uger efter stereotaktisk injektion. Graferne nederst i figuren repræsenterer kvantificeringen af sporstofoptagelsen (n=4) på forskellige tidspunkter. De to første grafer repræsenterer optagelsesforholdet i den injicerede side til kontralateral side i læsionen og i striatum i en velinduceret model (dvs. rotter, der præsenterer læsion efter lysolecithinin injektion). Den tredje graf (nederst til venstre) viser kvantificeringen af ikke-injiceret striatum (negativ kontrol), og den endelige graf (nederst til højre) repræsenterer ¹¹C-PIB-optagelsen på injektionsstedet af dyr, der ikke præsenterede demyelinerede læsion (dårligt induceret model). Resultaterne præsenteres som middel±SD. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Oplysninger om læsionsplacering. A)Illustrative VOI'er af injiceret side (stiplede linje) og ikke-injiceret side (hvid linje) trukket manuelt baseret på MRI skabelon (region corpus callosum og striatum) på 1 uge efter stereotaktisk injektion. B)Luxol hurtig blå farvning viser afmyelination i den injicerede halvkugle i forhold til den ikke-injicerede side (Top: 40x forstørrelse, bund: 100x forstørrelse). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den største fordel ved at bruge lysolecithin-modellen til at studere multipel sklerose er den hurtige tidslinje for afmyelinering (ca. 1 uge) og remyelination (ca. 4 uger) for at forekomme¹⁴. Denne model kan også induceres i mus¹⁵, men induktion hos rotter er mere fordelagtig for in vivo PET-billeddannelse på grund af rottehjernens større størrelse sammenlignet med mus.

Det første skridt i induktionsmodellen er at være yderst forsigtig. Denne model blev valideret til myelin PET-billeddannelse af de Paula Faria et al.¹⁰ i 2014, og det blev vist, at hastigheden af lysolecithin-injektionen inde i hjernen er afgørende for en velinduceret model. Injektionen skal udføres meget langsomt, 1 μL hver 10 min. for at undgå vævsskader. Lysolecithinopløsningen skal også fremstilles samme dag som den stereotaktiske injektion, helst lige før operationen påbegyndes. Hvis modellen vil blive brugt for første gang i en forskningsgruppe, anbefaler vi, at modellen valideres, før der udføres myelinkvantificering ved PET-billeddannelse. Valideringen skal omfatte post mortem vævsanalyse ved myelin farvning, for eksempel: Luxol hurtig blå histologi, som vist i figur 2, og myelin grundlæggende protein (MPB) immunohistochemistry, i de forskellige tidspunkter beregnet til at blive brugt i in vivo analyse. I resultatafsnittet viste vi en kvantificering af radiotraceroptagelsen, hvor læsionsinduktion ikke var lykkedes godt, og derfor blev forskellene ikke opdaget af ¹¹C-PIB PET-billeddannelse.

Læsionen, der skal kvantificeres ved hjælp af denne teknik, skal være større end PET-scanneropløsningen (ca. 1 mm i præklinisk udstyr og ca. 5 mm i klinisk udstyr).

Når modellen er godt induceret, skal billedbehandlingsproceduren planlægges godt på grund af radiotraceren mærket med kulstof-11, som har en kort halveringstid på 20 minutter. Det prækliniske laboratoriepersonale skal forberede alt nødvendigt materiale, fylde anæstesisystemet, kontrollere, om alt fungerer korrekt, og udskrive de formularer, der skal udfyldes under forsøget. PET-scanneren skal også verificeres forud for forsøget, når al kvalitetskontrol, der er nødvendig i udstyret (afhængig af hvert land), skal udføres for at kontrollere, at scanneren fungerer godt. Efter at have modtaget røbemaskinen til injektion skal målingen af aktiviteten også måles i en kalibreret dosiskalibrator for at sikre den korrekte injicerede dosis og de oplysninger (aktivitet i sprøjten, før og efter injektionen), der er skrevet på formularen, samt det respektive tidspunkt, hvor målingen blev udført. Fastslå, hvilket ur der skal bruges, da det rigtige tidspunkt er tiden på PET-scannerens arbejdsstation, den tid, der vil blive overvejet i henfaldskorrektionen af billederne, derfor skal alle ure, der bruges under eksperimentet, synkroniseres til scannerens arbejdsstationstid.

Under erhvervelse af dyrebillede skal temperatur og dyrs vejrtrækning overvåges, og anæstesi justeres efter behov. Temperaturen er placeringsafhængig og bør justeres for dyrets velbefindende. Når billederhvervelsen er færdig, er det vigtigt at holde dyret på en varm pad for at komme sig, før det returneres til buret.

Billedbehandling er afgørende for at få pålidelige resultater fra forsøgene ved hjælp af PET-billedbehandling. Idealet er, at analysatoren ikke er opmærksom på dyregrupperne og/eller behandlingen, og at han/hun allerede har erfaring med PET-billeder med PET-sporstof, der anvendes på en sådan måde, at der sikres perfekt registrering mellem PET-billeddannelse og MR-skabelon. Vi brugte PMOD-softwaren i denne protokol, men hvis denne software ikke er tilgængelig, kan alternativ billedkvantificeringssoftware bruges, selvom der skal lægges vægt på at opnå god hjerneregionsdefinition og kvantificering. For at definere læsionsstedet skal der udvises ekstra omhu for at sikre, at det injicerede sted er inde i den tegnede læsion VOI (en viden om rottehjerne anatomi er nødvendig).

Det er vigtigt at sige, at myelin PET-billeddannelse også kan udføres i andre MS-dyremodeller, der viser uforudsigelige læsioner, som allerede vist af vores gruppe i Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) marmoset model⁵. Som allerede nævnt er den vigtige parameter, der skal overvejes i læsionskvantificering, PET-scanneropløsningen, som er begrænsningen for påvisning af læsioner, der er for små. PET-billeddannelse er en billeddannelsesteknik med dårlig opløsning sammenlignet med andre teknikker såsom MRI, men det er en meget specifik modalitet, og på grund af dette bruger kvantificeringen af PET-billederne en anatomisk skabelon, såsom MRI, til at hjælpe med at tegne interesseregionen, som vist i ovenstående protokol.

Selvom den manuelle tegning af VOI'er er operatørafhængig, er det den bedste mulighed for LPC-dyremodellen, da læsionen kan variere mellem dyr. For at mindske bias i kvantificeringsprocessen er det vigtigt at udføre et spejl VOI, som forklaret i protokollen, som vil være i samme region og af samme størrelse som den injicerede side. Det er også vigtigt at have de stereotaxiske koordinater i tankerne, når man tegner VOI i MRI-skabelonen for at garantere, at den korrekte hjerneregion overvejes. Brug af myelin farvning som en guide til at identificere demyelinated område kan også hjælpe i tegningen, som forklaret i de Paula Faria¹².

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical Balance	Marte	AUWZZOD	max: 220 g- min: 1 mg
Anestesia vaporizer	Nanitech	15800
Beta-cube	Molecubes
Bulldog clamp	Stoelting	5212043P
clorexidine	Rioquimica		0.5%/100 mL
Cotton swabs	johnson e johnson
Dose calibrator	Capintech
Drill	Kinzo powertools	352901	Model Q0M-DC3C
Eppendorf tube	Eppendorf	30125150	1.5 mL
Eye lubricant	ADVFARMA	30049099	vaseline 15 g (pharmaceutical purity)
Fine forceps	Stoelting	52102-38P
Gloves	Descarpack	212101	6.5 size
Heating pad	Softhear
Injection Syringe	Hamilton	80314	10µ, 32ga, model 701
Insuline syringe	BD	328328	1 mL insulin syringes with needle
Isoflurane	Cristália	410525	100 mL , concentration 1 mL/1 mL
Ketoprofen or other analgesic	Sanofi		100 mg/2 mL
lidocaine	Hipolabor	1.1343.0102.001-5	2%/20mL
L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk	Sigma-aldrich	L-4129	25 mg - ≥99%, Type I, powder
Needle holder	Stoelting	5212290P
Oxygen	White Martins	7782-44-7	Compressed gas
PMOD software	PMOD technologies	Version 4.1	module fuse it
Rat anesthesia mask	KOPF	Model 906
Saline	Farmace	0543325/ 14-8	0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Scapel blades	Stoelting	52173-10
Scapel handles	Stoelting	52171P
Scissor	Stoelting	52136-50P
Semi-analytical Balance	Quimis	BK-3000	max:3,100 g; min:0.2 g
shaver	Mega profissional		AT200 model
Stereotactic Apparatus	KOPF	Nodel 900
Universal holder with needle support	KOPF	Model 1772-F1	Hamilton support for 5 and 10 µL