Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Positron Emission Tomography Imaging för In Vivo-mätning av Myelin-innehåll i Lysolecithin Rat-modellen av multipel skleros

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/62094
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1
1Laboratory of Nuclear Medicine (LIM-43), Departamento de Radiologia e Oncologia, Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, 2Nuclear Medicine Division, Hospital Sirio-Libanes

ERRATUM NOTICE

Summary

Detta protokoll har som mål att övervaka in vivo myelin förändringar (demyelination och remyelination) genom positron utsläpp tomografi (PET) imaging i en djurmodell av multipel skleros.

Abstract

Multipel skleros (MS) är en neuroinflammatorisk sjukdom med expanderande axonal och neuronal degeneration och demyelination i centrala nervsystemet, vilket leder till motoriska dysfunktioner, psykisk funktionsnedsättning och kognitiv försämring under MS progression. Positron emission tomography (PET) är en bildteknik som kan kvantifiera cellulära och molekylära förändringar in vivo.

Radiotracers med affinitet till intakt myelin kan användas för in vivo imaging av myelin innehåll förändringar över tid. Det är möjligt att upptäcka antingen en ökning eller minskning av myelinhalten, vilket innebär att denna bildteknik kan upptäcka demyelination och remyelinationsprocesser i centrala nervsystemet. I detta protokoll visar vi hur man använder PET imaging för att upptäcka myelin förändringar i lysolecithin råtta modell, som är en modell av focal demyelination lesion (framkallas av stereotaktisk injektion) (dvs en modell av multipel skleros sjukdom). 11 (11) C- PIB PET imaging utfördes vid baslinjen och 1 vecka och 4 veckor efter stereotaxic injektion av lysolecithin 1% i rätt striatum (4 μL) och corpus callosum (3 μL) av råtta hjärnan, möjliggör kvantifiering av focal demyelination (injektionsstället efter 1 vecka) och remyelination processen (injektionsställe vid 4 veckor).

Myelin PET imaging är ett intressant verktyg för att övervaka in vivo förändringar i myelin innehåll som kan vara användbart för övervakning av demyelinating sjukdom progression och terapeutiskt svar.

Introduction

Multipel skleros (MS) är en neuroinflammatorisk sjukdom som påverkar centrala nervsystemet, kännetecknad av inflammation, demyelination och axonal förlust1. Prognosen för denna sjukdom varierar även med framsteg i behandlingen, och det är en av de vanligaste orsakerna till neurologiska underskott hos ungdomar1. Diagnos av MS är baserat på kriterierna för klinisk manifestation och visualisering av karakteristiska skador av magnetic resonance imaging (MRI)2,3.

Positron utsläpp tomografi (PET) kan vara ett användbart verktyg för in vivo övervakning av MS progression och terapeutiska effekter. Pittsburgh sammansatt B radiotracer (PIB) märkt med kol-11(11C-PIB) används ofta för att kvantifiera β-amyloid plack; men under det senaste decenniet har det studerats för att kvantifiera myelininnehåll och visa dynamisk demyelination och remyelination4,5,6.

Olika amyloid PET-spårämnen (11C-PIB, 18F-florbetaben,18F-florbetapir, 18F-flutemetamol) kan användas för att kvantifiera myelin och ge viktig information om sjukdomsprogression och terapeutisktsvar,vilket möjliggör identifiering av demyelination och remyelinationsprocesser, utan störningar av neuroinflammation, vilket kan uppstå med konventionella magnetiska resonansbilder (MRI) 7 . Amyloid PET imaging visade minskad tracer upptag i aktiva MS patienter jämfört med icke-aktiva patienter som kan förklaras av tidiga vit fråga skador hos de aktiva patienterna8. Lägre amyloid tracer upptag var också associerad med kognitiv nedgång i en uppföljande studie, visar denna teknik att vara ett värdefullt verktyg för att studera patofysiologi av sjukdomen och kliniska resultat9.

Lysolecithin (LPC) råttmodell är en kemisk inducerad modell av multipel skleros, där det injicerade toxinet, LPC, inducerar ett högt svar av makrofager som resulterar i ökad inflammation och följaktligen demyelination10,11. Demyelinationen vänds snabbt, i ungefärligt 4 veckor, som gör detta en bra modellera för att utvärdera demyelination och remyelination bearbetar i gnagare. Denna modell har redan utvärderats med HJÄLP av PET-avbildning, med goda resultat och korrelation med post-mortem essäer12.

Här presenterar vi protokollet för myelin PET imaging med 11C-PIB i lysolecithin råtta modell, visar denna bildteknik som ett användbart verktyg för in vivo mätning av myelin innehåll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden utfördes i enlighet med riktlinjerna från Det nationella rådet för kontroll av djurförsök (CONCEA, Brasilien) och godkändes av etikkommittén för djurforskning vid Medicinska skolan vid Universitetet i Sao Paulo (CEUA-FMUSP, Brasilien - protokollnummer: 25/15).

OBS: I detta protokoll visar vi hur man inducerar en lysolecithin råtta modell av multipel skleros och hur man förvärvar och analyserar myelin PET bilder.

1. Beredning av lysolecithinlösning

  1. Väg lysolecithin (L-α-Lysophosphatidylcholine från äggula) på en analytisk skala med hjälp av ett koniskt plaströr (1,5 ml).
  2. Tillsätt steril saltlösning till röret för att göra 1% lösning (till exempel: väg 1 mg lysolecithin och lös upp det med 100 μL saltlösning) och lös lysolecitan genom att skaka röret (skaka från sida till sida och inte vrida från topp till botten).
  3. Förbered lösningen strax innan du startar induktion av djurmodellen (fyll inte på den slutliga färdiga lösningen).

2. Lysolecithin råtta modell - Stereotaxisk kirurgi

  1. Använd hanråttor från Wistar som väger mellan 220 och 270 g. Använd handskar och mask under alla procedurer.
  2. Inducera anestesi med 5% isofluran blandat i 100% O2 (1 L/min) med hjälp av en induktionslåda. Kontrollera om djuret bedövas genom att observera frånvaron av rörelse (endast andning ska observeras).
  3. Placera djuret i stereotaxisk apparat på en värmeplatta. Fäst djurets näsa och öron på utrustningen.
    OBS: Detaljer om hur man utför stereotaxisk kirurgi finns i JoVE Science Education Database. Neurovetenskap. Gnagare stereotaxisk kirurgi. JoVE, Cambridge, MA, 2021.
    1. Övervaka anestesin för hela proceduren (inklusive kirurgi och bildförvärv). För att justera isoflurankoncentrationen, observera djurets andningshastighet. En snabb andningshastighet kräver högre koncentration och en långsam andningshastighet kräver lägre bedövningskoncentration.
  4. Injicera smärtstillande medel (ketoprofen - 5 mg/ kg) subkutant (späd medicinen till 1 ml i saltlösning, detta hjälper till att hydrera djuret).
  5. Sätt ögonkräm i djurets ögon för att skydda mot uttorkning.
  6. Använd en 0,5% klorhexidinlösning för att rengöra snittområdet.
  7. Injicera 100 μL lidokainhydroklorid 2% subkutant i snittet.
  8. Raka skallområdet.
  9. Använd sterila instrument för denna procedur.
  10. Använd en skalpell, gör ett snitt på ca 2 cm i huden över skallen.
  11. Blotta skallen med Bulldog-klämmor.
  12. Använd en bomullspinne för att rengöra skallområdet med 1% väteperoxidas.
  13. Hitta och markera bregman (en stereotaxisk råtta hjärnatlas kan hjälpa till att identifiera Bregma).
  14. Placera Hamilton-sprutan (μL-neurosprutor) vid knät.
  15. Använd bregma och en stereotaxisk atlas som referens, placera Hamilton-sprutan vid följande koordinater: Antero-posterior: -0,30 mm, latero-lateral: -3,0 mm och ventral tills den rör skallbenet och markera skallen och notera koordinatorienteringen på papper.
  16. Borra skallen vid den markerade koordinaten. Var försiktig med dura mater (skadlig dura mater kan orsaka mycket blödning).
  17. Fyll Hamilton-sprutan med 7 μL lysolecitanlösning (1% i saltlösning). En större volym kan placeras i sprutan, men endast 7 μL injiceras (ta ut bubblorna ur sprutan för att mäta volymen korrekt).
  18. Placera Hamilton-sprutan vid de tidigare koordinaterna för att starta läkemedelsinjektionen (totalt 7 μL i 3 olika ventrala stereotaktiska koordinater). Med tanke på de tidigare noterade koordinaterna, sänk Hamilton sprutan till ventral koordinat -5,0 mm.
  19. Injicera mycket långsamt 2 μL lysolecithinlösning (1 μL/10 min). Vänta 3 min.
  20. Ta nålen upp till nästa ventrala stereotaxiska koordinat (-4,2 mm) och injicera långsamt 2 μL lysolecithinlösning (1 μL/ 10 min). Vänta 3 min.
  21. Injicera den tredje ventrala koordinaten -3,0 mm (3 μL lysolecithinlösning - 1 μL/ 10 min).
  22. Vänta 5 min och ta sedan bort Hamilton sprutan från hjärnan.
  23. Suturera huden.
  24. Ta bort djuret från stereotaktiska apparaten och låt djuret vakna.
  25. Återvänd djuret till hemburen, håll djuret ensamt och under övervakning för att kontrollera tecken på obehag.
  26. Injicera subkutan smärtstillande medel (ketoprofen - 5 mg/kg) utspädd i saltlösning, vid 24 timmar och 48 timmar efter operationen.

3. PET-förvärv

  1. Ta 7 till 20 MBq 11C-PIB-radioaktivitet i en spruta (1 ml är den högsta tillåtna volymen för intravenös injektion hos råttor).
  2. Söv djuret med 5% isofluran blandat i 100% O2 (1 L/min) med hjälp av induktionslådan.
  3. Injicera 11C-PIB (radioaktivitet definierad i punkt 4.1 ovan) i råttans penis ven eller svans ven (båda administreringsplatserna är bra, beslutet är ett personligt val. Vi råder bara att inte använda en retro-orbital injektion eftersom platsen är för nära regionen av intresse (hjärnan) och kan försämra bildkvaliteten.
    OBS: Bildförvärv av baslinjens tidpunkt utförs före stereotaxisk injektion och de andra 2 tidpunkterna vid 1 vecka och 4 veckor efter operationen.
  4. Ta bort djuret från anestesi så att djuret kan vakna (lämna djuret på en varm kudde tills det är helt vaken).
  5. Återvänd djuret till hemburen.
  6. Vänta 30 minuter på nästa steg.
  7. Söv råttorna med 5% isofluran blandat i 100% O2 (1 L/min) med hjälp av en induktionslåda.
  8. Öppna PET-skannerprogramvaran.
  9. Välj Skanna > Husdjursklar.
  10. Fullständig huvudprövare, studie-ID, serie-ID, djur-ID, djurvikt (g) och ytterligare anteckningar. Välj Nästa.
    OBS: Använd punkt (.) för decimaltal i djurvikten.
  11. Redigera ROI-området för skanning (vanligtvis mellan 3 och 8). Detta är det område som kommer att inkluderas i bilden (områden mellan siffrorna 3 och 8 på sängkåpan visas i den slutliga bilden).
  12. Placera den bedövade råttan på en vanlig råttbädd på PET-skannern och slå på anestesin (3% isofluran i 100% O2 är en bra början, och då bör anestesihastigheten justeras vid behov). För att justera anestesin, kontrollera övervakningsdata för skannerprogramvaran för att verifiera att djuret andas i en konstant och långsam rytm.
    OBS: Slå på vakuumpumpen i kombination med det aktiverade kolfiltret för att samla in isoflurangasöverskott (om pumpen är tillgänglig).
  13. Applicera ögonkräm för att skydda djurets ögon.
  14. Tryck in djurbädden i PET-skannern.
  15. Fullständig aktivitetsinformation, aktivitetskalibreringstid, isotop (C-11) och skanningstid (20 minuter). Välj Starta genomsökning.
    OBS: Ett meddelande om flyttbädd för sällskapsdjur visas, och djurbädden kommer att flytta in i utrustningen och stanna vid den tidigare valda ROI-positionen. Anskaffningstiden börjar räkna ner och antalet räkningar per sekund visas (CPS).
  16. I skannerprogramvaran navigerar du till fliken Bildskärm till vänster på skärmen och kontrollerar ändra tröskel till andningsparametrar ändra (BPM).
    Obs: Ett fönster dyker upp, komplett med tröskelparameter (500). Välj OK.
  17. Navigera till 0% POWER för att ändra temperaturparametrar för att värma djuret under skanning. Ett fönster kommer att dyka upp; slutföra parametern (80 - 100). Välj OK.
    OBS: Välj mellan 80 och 100% effekt baserat på rumstemperaturförhållanden (desto mer kraft, desto varmare blir den).
  18. Navigera tillbaka till fliken SCAN.
  19. Navigera till konfigurationsverktyget (kugghjulsikonen) och slutför injektionstid, återstående aktivitet, återstående aktivitetskalibreringstid. Välj Spara.
    Ett fönster visas "Är du säker på att du vill ändra protokollmetadata?" > JA
  20. Navigera tillbaka till monitorfliken (kontrollera djurets andningsparametrar, och vid behov öka eller minska isoflurankoncentrationen - vanligtvis räcker 3% i 100% O2).
  21. När PET-förvärvet är klart visas Pet Ready-meddelandet på fliken Skanna, kolla Arrow Out Icon (till vänster om konfigurationsverktyget) för att flytta ut djurbädden.
  22. Ta bort djuret från anestesi och låt vakna på en varm kudde.
  23. Om du vill rekonstruera bildennavigerar du till fliken Rekonstruera.
  24. Kontrollera plusikonen längst ner till vänster på skärmen och välj den studiefil som ska rekonstrueras. Välj Nästa.
  25. Navigera till energiupplösningsverktyget. Ett fönster kommer att dyka upp. Konfigurera energitoppen (keV) till utrustningsparametern (baserat på månatlig kvalitetskontroll). Välj Stäng.
    OBS: Energitoppen kan ändras varje månad när du utför månatliga utrustningskalibrering.
  26. Behåll alla andra parametrar som standard (isometrisk voxelstorlek: 400 mm; antal iterationer: 30; Energiresolution: 30 procent; Spara endast den senaste iterationen. avmarkEra Behåll binära data) .
  27. Markera Lägg till.
    OBS: Ett fönster dyker upp "Rekonstruktionen lades till i kön och startar när de andra är klara". Välj OK. En fil visas i rekonstruktionslistan på fliken Rekonstruera och statusen visas som väntande eller % (förlopp) eller klar.

4. Bildanalys

Obs: Utför bildanalys med hjälp av dedikerad bildanalysprogramvara. I det aktuella protokollet använder demonstrationen ett specifikt program, men om det inte är tillgängligt kan andra alternativ användas.

  1. Öppna PMOD > Säkring .
  2. Navigera till fliken Matchning högst upp på skärmen.
  3. Öppna menyn Läs in inmatning i mitten av skärmen och välj Autodetect-filer, välj PET-fil (DICOM, Interfile eller NifTI), lägg till i markerad, klicka med Åtgärder,Orientera om till Standardorientering, klicka på Läs in och stäng.
  4. Kontrollera om djurets art är korrekt längst ner på skärmen (RAT).
  5. Markera rutan Beskär längst ned till höger på skärmen.
  6. Justera den gula boxstorleken i PET-bilden för att ta hela hjärnan.
  7. Klicka på knappen Styv till höger på skärmen. Klicka på Ja vid bekräftelsefönstret.
  8. Klicka på hjärnverktyget till höger på skärmen för att öppna Referensatlas. Välj Px Rat (W.Schiffer) - T2.
  9. Välj Matcha resultat från fliken Övre högra (fliken Välj bearbetningssteg).
  10. Klicka på Data reslicing (fliken4längst upp till höger).
  11. Justera PET-bilden med referensmallen med hjälp av rotationsverktyget (vit ikon i mitten av PET-bilden). Kontrollera justeringen för 3 anatomiska plan.
  12. Spara samregistreringsfilen (skärmens högra meny).
  13. Välj utdataformat (DICOMor NifTI), katalog- och filprefix. Klicka på Spara.
    Obs: Om samregistrerade utdata sparas som NifTi kommer rubrikbildinformationen att gå förlorad.
  14. Klicka på VOIs-menyn längst ned på skärmen.
  15. Navigera till Mall > Atlas längst ned på skärmen (under VOIs-fönstret).
  16. Välj Px Rat(W.Schiffer) i rullgardinsmenyn.
    Obs: Om du bara behöver analysera specifika VOIs kan du bara välja de hjärnområden som är av intresse. Om du vill ha alla hjärnområden i hjärnatlasen behövs ingen åtgärd.
  17. Klicka på Disposition längst ned på skärmen.
    OBS: VOIs av hjärnområden kommer att visas i VOIs fönster.
  18. Rita manuellt VOI i lesion webbplats och kontralateral hjärnan halvklotet område (11C-PIB låg upptag område och kontralateral hjärnan halvklotet, respektive).
  19. Klicka i området PET-bild med 11C-PIB låg upptag.
  20. Välj Ny VOI > OK.
    OBS: Ett kalkylblad visas
  21. Navigera till SPHERE-ikonen i mitten av skärmen (till vänster om VOIs-fönstret)
    Ett kalkylblad visas.
  22. Välj VOI-namnet: lesion och välj Använd.
    OBS: En sfär visas i den samregistrerade bilden.
  23. Justera sfären i lesionsområdet och justera VOI för alla anatomiska plan.
  24. Klicka på Stäng (längst ned i kalkylbladet).
  25. Välj lesion VOI (från VOIs-listan).
  26. Navigera till VOI-speglingsoperationsikonen (längst upp till höger i VOIs-fönstret) och välj Klona och spegla vänster/höger.
  27. Navigera till Beräkna vald VOI-statistik högst upp i vois-listfönstret. Navigera till Välj statistik som ska beräknas för att välja utdata (till höger om VOI-statistikikonen). Vanligtvis för myelin innehåll kontrollera Statistik för grupp av VOIs, Genomsnitt, SD, Min, Max).
    Ett kalkylblad visas. Standardinställningen Dataenhet är kBq/cc. Till vänster på kalkylbladet (VOI-statistik) kan du kontrollera dataenheten som SUV (Standardized Uptake Value). Om du har slutfört information om administration av radiotracer och bildförvärv korrekt i skannerprogramvaran, som beskrivits tidigare, beräknas SUV-data automatiskt med PMOD-programvara, om inte, kan du redigera informationen.
  28. Navigera till Kopiera med talformatet system lokalt.
    Obs: Kontrollera om all statistik är markerad för att kopiera som utdata (Kontrollera ikonen längst upp på skärmen). Vilka data som ska kopieras beror på vilken dataenhet som väljs.
  29. Klistra in utdata i ett anteckningsblock eller kalkylblad.
    OBS: Var försiktig med programvaruinställningar för prick- och kommasymboler mellan talen. Detta kan skilja sig mellan språkkonfigurationer.
  30. Spara filen med studienamn och detaljer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bild 1 visar illustrativa 11C-PIB PET-bilder med myelinändringar över tid. I baslinjeskanningen kan inga skillnader ses i myelininnehållet (dvs. ingen demyelination finns). I 1-veckors tid-punkt bilden är det möjligt att se focal demyelinated lesion (i den högra halvklotet) som anges av den vita pilen. Bilder presenteras i de 3 anatomiska planen (koronal, axiell och sagittal) och det är möjligt att identifiera den demyelinated lesion i dem alla. 1-veckors bilden är illustrationen av en väl avgränsad lesion på injektionsstället, som representerar rätt modell induktion och bild detektering. I bilden av 4 veckor är ingen lesion synlig längre, vilket indikerar att remyelination har inträffat och myelinhalten är tillbaka till det normala (eller nära det).

De representativa diagrammen visar kvantifieringen av bilderna av 4 djur i de 3 olika tidpunkterna. Det första diagrammet visar resultaten från kvantifieringen av lesion (manuell VOI) till kontralateral sida förhållandet visar mer focal myelin förändringar, där lysolecithin injektion utfördes. Det andra diagrammet visar samma kvantifiering, men i striatum (injicerat striatum till kontralateralt förhållande) och i detta fall är skillnaden inte statistiskt signifikant, vilket kan förklaras av den lilla provstorleken och eftersom VOI är större och radioaktivitetskoncentrationen mäts inte bara där lysolecithin injicerades.

Skillnader mellan grupper analyserades av Kruskal Wallis-testet, följt av Dunns test för flera jämförelser och resultaten presenteras som ± SD. I lesion VOI (H = 7.063; P=0,017), i 1-veckorsbilden var tracer upptagsförhållandet (0,90±0,07) 16% lägre än baslinjen (1,07±0,06), med statistisk signifikans (p=0,024). Inga signifikanta skillnader hittades i 4-veckorsbilden (1,01±0,06).

I striatum konstaterades inga statistiska skillnader (H =1,412; P=0,5393). Upptagskvoterna för bilderna var 1,07±0,07 för baslinjen, 1,02±0,07 för 1 vecka och 1,01±0,08 i 4 veckor.

Det tredje diagrammet (nedersta raden, vänster graf) presenterar kvantifieringen av kontralateral striatum (icke injicerad sida). I detta diagram är det möjligt att observera att det inte fanns någon skillnad (P =9397) mellan tidpunkter, vilket innebär att variationen i den injicerade sidan beror på myelinförändringar och inte på tracer upptagsvariation över tid.

Den slutliga grafen, längst ner till höger, visar kvantifieringen av det injicerade området (lesion VOI) hos djur där modellen inte var väl inducerad (förmodligen på grund av snabb lysolecithinjektion, felaktig stereotaxisk manipulering och / eller felaktig lösningsberedning). I det här fallet ses inte det lägre upptaget i 1 veckas tidpunkt, vilket innebär att ingen demyelinationsprocess har inträffat, och det låga upptaget vid 4 veckor kan relateras till en senare demyelinationsprocess eller vävnadsskada, båda situationerna är relaterade till dålig djurmodellinduktion. Detta diagram lades till i protokollet för att exemplifiera utseendet på resultaten när djurets induktion inte är väl utfört och för att betona vikten av varje steg i protokollet, från början till slutet. Det finns inga skillnader i spårupptaget (H = 2,745, P = 0,267) med upptagsförhållanden på 1,06±0,05, 1,02±0,14 och 0,96±0,10 för baslinje, 1 vecka och 4 veckors PET-bilder.

Figur 2 lägger till mer information till resultaten, där figur 2A beskriver var den manuella VOI ritades, baserat på referensen till MRI-mallen och figur 2B visar den luxol snabba blå färgningen (för detaljer om luxol fast blue staining protocol, se De Paula Faria et al.13) från den injicerade sidan och icke injicerad sida vid 7 dagar efter stereotaxisk injektion.

Figure 1
Bild 1:Illustrativ 11C-PIB PET-bilder som visar bilder av baslinjen, 1 vecka och 4 veckor efter stereotaktisk injektion. Diagrammen längst ned i figuren representerar kvantifieringen av spårupptag (n=4) vid olika tidpunkter. De två första diagrammen representerar upptag förhållandet i den injicerade sidan till kontralateral sida i lesion och i striatum i en väl inducerad modell (dvs råttor presenterar lesion efter lysolecithin injektion). Det tredje diagrammet (längst ner till vänster) visar kvantifieringen av icke injicerat striatum (negativ kontroll), och det slutliga diagrammet (längst ner till höger) representerar 11C-PIB-upptaget vid injektionsstället hos djur som inte uppvisade demyelinerad lesion (dåligt inducerad modell). Resultaten presenteras som mean±SD. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Information om lesionsplats. A) Illustrativa VOIs av injicerad sida (streckad linje) och icke-injicerad sida (vit linje) ritas manuellt baserat på MRI mall (regionen corpus callosum och striatum) vid 1 vecka efter stereotaktisk injektion. B) Luxol snabbblå färgning som visar demyelination på det injicerade halvklotet jämfört med den icke injicerade sidan (Topp: 40x förstoring, botten: 100x förstoring). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den största fördelen med att använda lysolecithinmodellen för att studera multipel skleros är den snabba tidslinjen för demyelination (ca 1 vecka) och remyelination (ca 4 veckor) för attinträffa 14. Denna modell kan också induceras hos möss15, men induktion hos råttor är mer fördelaktigt för in vivo PET-avbildning på grund av råtthjärnans större storlek jämfört med möss.

Det första steget i induktionsmodellen är att vara extremt försiktig. Denna modell validerades för myelin PET imaging av de Paula Faria et al.10 i 2014 och det visades att hastigheten på lysolecithin injektionen inuti hjärnan är avgörande för en väl inducerad modell. Injektionen måste utföras mycket långsamt, 1 μL varje 10 min, som ett sätt att undvika vävnadsskador. Lysolecithinlösningen bör också beredas samma dag som den stereotaktiska injektionen, helst strax innan operationen påbörjas. Om modellen kommer att användas för första gången i en forskargrupp rekommenderar vi att modellen valideras innan någon myelin kvantifiering genom PET imaging. Valideringen måste omfatta post-mortem vävnad analys av myelin färgning, till exempel: Luxol snabbblå histologi, som visas i figur 2, och myelin grundläggande protein (MPB) immunohistokemi, i de olika tidpunkter som är avsedda att användas i in vivo analys. I resultat avsnittet visade vi en kvantifiering av radiotracer upptag där lesion induktion inte lyckades väl och därför upptäcktes inte skillnaderna av 11C-PIB PET imaging.

Lesionen som ska kvantifieras med denna teknik måste vara större än PET-skannerupplösningen (ca 1 mm i preklinisk utrustning och ca 5 mm i klinisk utrustning).

När modellen är väl inducerad måste avbildningsproceduren vara välplanerad, på grund av radiotracern märkt med kol-11, som har en kort halveringstid på 20 minuter. Den prekliniska avbildningslaboratoriets personal måste förbereda allt nödvändigt material, fylla i anestesisystemet, kontrollera om allt fungerar korrekt och skriva ut de formulär som ska fyllas i under experimentet. PET-skannern bör också kontrolleras före försöket, när alla kvalitetskontroller som behövs i utrustningen (beroende på varje land) måste utföras för att kontrollera att skannern fungerar väl. Efter att ha fått spårämnet för injektion måste mätningen av aktiviteten också mätas i en kalibrerad doskalibrator för att garantera rätt injicerad dos och informationen (aktivitet i sprutan, före och efter injektion) skriven på formuläret, liksom respektive tidpunkt då mätningen utfördes. Fastställa vilken klocka som ska användas, eftersom rätt tid är tiden på PET-skannerns arbetsstation, den tid som kommer att beaktas vid förfallskorrigeringen av bilderna, därför bör alla klockor som används under experimentet synkroniseras med skannerns arbetsstationstid.

Under förvärv av djurbilder bör temperatur och djurandning övervakas och anestesin justeras vid behov. Temperaturen är platsberoende och bör justeras för djurets välbefinnande. När bildförvärvet är klart är det viktigt att hålla djuret på en varm kudde för att återhämta sig innan det returneras till buret.

Bildbehandling är avgörande för att få tillförlitliga resultat från experimenten med PET-avbildning. Idealet är att analysatorn inte är medveten om djurgrupperna och/eller behandlingen och att han/hon redan har erfarenhet av PET-bilder med PET-spåraren som används på ett sådant sätt att perfekt registrering garanteras mellan PET-bildbehandlings- och MR-mallen. Vi använde PMOD-programvaran i detta protokoll, men om den här programvaran inte är tillgänglig kan alternativ bild kvantifiering programvara användas, även om uppmärksamhet måste ägnas åt att uppnå god definition av hjärnregionen och kvantifiering. För definitionen av lesionsplatsen måste extra försiktighet vidtas för att säkerställa att det injicerade området är inuti den ritade lesion VOI (en kunskap om råtta hjärnans anatomi är nödvändig).

Det är viktigt att säga att myelin PET imaging också kan utföras i andra MS djurmodeller, visar oförutsägbara skador, som redan visats av vår grupp i experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) marmoset modell5. Som redan nämnts är den viktiga parametern att överväga vid lesion kvantifiering PET-skanner upplösningen, vilket är begränsningen för upptäckt av skador som är för små. PET-avbildning är en avbildningsteknik med dålig upplösning jämfört med andra tekniker som MRI, men det är en mycket specifik modalitet och på grund av detta använder kvantifiering av PET-bilderna en anatomisk mall, såsom MRI, för att hjälpa till att dra den region av intresse, som visas i ovanstående protokoll.

Även om den manuella ritningen av VOI är operatörsberoende, är det det bästa alternativet för LPC-djurmodellen, eftersom lesionen kan variera mellan djur. För att minska partiskheten i kvantifieringsprocessen är det viktigt att utföra en spegel VOI, som förklaras i protokollet, som kommer att vara i samma region och av samma storlek som den injicerade sidan. Det är också viktigt att ha stereotaxiska koordinater i åtanke när man ritar VOI i MRI-mallen för att garantera att rätt hjärnregion beaktas. Att använda myelinfärgningen som guide för att identifiera det demyelinerade området kan också hjälpa till i ritningen, vilket förklaras i de Paula Faria12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

β (Molecubes NV, Belgien) stöddes av São Paulo Research Foundation, FAPESP - Brasilien (#2018/15167-1). LES har ett doktorandstipendium från FAPESP - Brasilien (#2019/15654-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analytical Balance Marte AUWZZOD max: 220 g- min: 1 mg
Anestesia vaporizer Nanitech 15800
Beta-cube Molecubes
Bulldog clamp Stoelting 5212043P
clorexidine Rioquimica 0.5%/100 mL
Cotton swabs johnson e johnson
Dose calibrator Capintech
Drill Kinzo powertools 352901 Model Q0M-DC3C
Eppendorf tube Eppendorf 30125150 1.5 mL
Eye lubricant ADVFARMA 30049099  vaseline 15 g (pharmaceutical purity)
Fine forceps Stoelting 52102-38P
Gloves Descarpack 212101  6.5 size
Heating pad Softhear
Injection Syringe Hamilton 80314 10µ, 32ga, model 701
Insuline syringe BD 328328 1 mL insulin syringes with needle
Isoflurane Cristália 410525 100 mL , concentration 1 mL/1 mL
Ketoprofen or other analgesic Sanofi 100 mg/2 mL
lidocaine Hipolabor 1.1343.0102.001-5 2%/20mL
L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk Sigma-aldrich L-4129 25 mg - ≥99%, Type I, powder
Needle holder Stoelting 5212290P
Oxygen White Martins 7782-44-7 Compressed gas
PMOD software PMOD technologies Version 4.1 module fuse it
Rat anesthesia mask KOPF Model 906
Saline Farmace 0543325/ 14-8 0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Scapel blades Stoelting 52173-10
Scapel handles Stoelting 52171P
Scissor Stoelting 52136-50P
Semi-analytical Balance Quimis BK-3000 max:3,100 g; min:0.2 g
shaver Mega profissional AT200 model
Stereotactic Apparatus KOPF Nodel 900
Universal holder with needle support KOPF Model 1772-F1 Hamilton support for 5 and 10 µL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oh, J., Vidal-Jordana, A., Montalban, X. Multiple sclerosis: clinical aspects. Current Opinion in Neurology. 31 (6), 752-759 (2018).
  2. Sand, I. K. Classification, diagnosis, and differential diagnosis of multiple sclerosis. Current Opinion in Neurology. 28 (3), 193-205 (2015).
  3. Thompson, A. J., et al. Diagnosis of multiple sclerosis: 2017 revisions of the McDonald criteria. Lancet Neurology. 17 (2), 162-173 (2018).
  4. Veronese, M., et al. Quantification of C-11 PIB PET for imaging myelin in the human brain: a test-retest reproducibility study in high-resolution research tomography. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 35 (11), 1771-1782 (2015).
  5. Carvalho, R. H. F., et al. C-11 PIB PET imaging can detect white and grey matter demyelination in a non-human primate model of progressive multiple sclerosis. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 35, 108-115 (2019).
  6. Stankoff, B., et al. Imaging central nervous system myelin by positron emission tomography in multiple sclerosis using [methyl-(1)(1)C]-2-(4'-methylaminophenyl)- 6-hydroxybenzothiazole. Annals of Neurology. 69 (4), 673-680 (2011).
  7. Faria, D. D. Myelin positron emission tomography (PET) imaging in multiple sclerosis. Neural Regeneration Research. 15 (10), 1842-1843 (2020).
  8. Pietroboni, A. M., et al. Amyloid PET as a marker of normal-appearing white matter early damage in multiple sclerosis: correlation with CSF -amyloid levels and brain volumes. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 46 (2), 280-287 (2019).
  9. Pytel, V., et al. Amyloid PET findings in multiple sclerosis are associated with cognitive decline at 18 months. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 39, (2020).
  10. Faria, D. dP., et al. PET imaging of glucose metabolism, neuroinflammation and demyelination in the lysolecithin rat model for multiple sclerosis. Multiple Sclerosis Journal. 20 (11), 1443-1452 (2014).
  11. Rinaldi, M., et al. Galectin-1 circumvents lysolecithin-induced demyelination through the modulation of microglial polarization/phagocytosis and oligodendroglial differentiation. Neurobiology of Disease. 96, 127-143 (2016).
  12. Faria, D. dP., et al. PET imaging of focal demyelination and remyelination in a rat model of multiple sclerosis comparison of [C-11]MeDAS, [C-11]CIC and [C-11]PIB. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 41 (5), 995-1003 (2014).
  13. Faria, D. dP., et al. PET imaging of focal demyelination and remyelination in a rat model of multiple sclerosis: comparison of [11C]MeDAS, [11C]CIC and [11C]PIB. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 41 (5), 995-1003 (2014).
  14. vander Star, B. J., et al. In Vitro and In Vivo Models of Multiple Sclerosis. CNS & Neurological Disorders-Drug Targets. 11 (5), 570-588 (2012).
  15. Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216 (2015).

Tags

Neurovetenskap Utgåva 168 11C-PIB PET-avbildning myelin multipel skleros molekylär avbildning lysolecithin råtta modell VOI-analys

Erratum

Formal Correction: Erratum: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis
Posted by JoVE Editors on 02/16/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. The citation was updated.

The citation was updated from:

de Paula Faria, D., Cristiano Real, C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).

to:

de Paula Faria, D., Real, C.C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).

Positron Emission Tomography Imaging för <em>In Vivo-mätning</em> av Myelin-innehåll i Lysolecithin Rat-modellen av multipel skleros
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Paula Faria, D., Real, C. C.,… More

de Paula Faria, D., Real, C. C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter