Summary
Здесь мы представляем протокол для микроскопии ионной проводимости Hopping Probe (HPICM), бесконтактного метода сканирования, который позволяет наноразмерную визуализацию пучков стереоцилий в живых слуховых волосковых клетках.
Abstract
Волосковые клетки внутреннего уха обнаруживают звуковые смещения и преобразуют эти стимулы в электрические сигналы в пучке волос, который состоит из стереоцилий, расположенных в рядах увеличивающейся высоты. Когда стереоцилии отклоняются, они тянут крошечные (~ 5 нм в диаметре) внеклеточные кончиковые звенья, соединяющие стереоцилии, которые передают силы механочувствительным каналам трансдукции. Хотя механотрансдукция изучалась в живых волосковых клетках в течение десятилетий, функционально важные ультраструктурные детали механотрансдукционного механизма на кончиках стереоцилий (такие как динамика кончиковых звеньев или трансдукционно-зависимое ремоделирование стереоцилий) все еще могут быть изучены только в мертвых клетках с помощью электронной микроскопии. Теоретически, методы сканирования зондов, такие как атомно-силовая микроскопия, имеют достаточное разрешение для визуализации поверхности стереоцилий. Однако, независимо от режима визуализации, даже малейший контакт зонда атомно-силовой микроскопии со пучком стереоцилий обычно повреждает пучок. Здесь мы представляем подробный протокол для микроскопии ионной проводимости прыжкового зонда (HPICM) визуализации слуховых волосковых клеток живых грызунов. Этот бесконтактный метод сканирования зонда позволяет проводить покадровую визуализацию поверхности живых клеток со сложной топографией, такой как волосковые клетки, с разрешением в один нанометр и без физического контакта с образцом. HPICM использует электрический ток, проходящий через стеклянную нанопипетку, для обнаружения поверхности ячейки в непосредственной близости от пипетки, в то время как пьезоэлектрическая система 3D-позиционирования сканирует поверхность и генерирует ее изображение. С помощью HPICM мы смогли визуализировать пучки стереоцилий и звенья, соединяющие стереоцилии в живых слуховых волосковых клетках в течение нескольких часов без заметных повреждений. Мы ожидаем, что использование HPICM позволит непосредственно исследовать ультраструктурные изменения в стереоцилиях живых волосковых клеток для лучшего понимания их функции.
Introduction
Несмотря на то, что пучки стереоцилий в слуховых волосковых клетках достаточно велики, чтобы их можно было визуализировать оптической микроскопией и отклонять в живых клетках в эксперименте с зажимом, основные структурные компоненты механизма трансдукции, такие как кончиковые звенья, могут быть изображены только с помощью электронной микроскопии в мертвых клетках. В слуховых волосковых клетках млекопитающих механизм трансдукции расположен на нижних концах кончиковых звеньев, т. е. на кончиках стереоцилий более короткого ряда1 и регулируется локально через сигнализацию на кончиках стереоцилий2,3. Тем не менее, безметочная визуализация поверхностных структур в этом месте в живых волосковых клетках невозможна из-за небольших размеров стереоцилий.
Улитка млекопитающих имеет два типа слуховых сенсорных клеток: внутренние и наружные волосковые клетки. Во внутренних волосковых клетках стереоцилии длиннее и толще по сравнению с стереоцилиями во внешних волосковых клетках4. Первый и второй ряд стереоцилий имеют диаметр 300-500 нм во внутренних волосковых клетках мыши или крысы. Благодаря дифракции света максимальное разрешение, достижимое при оптической микроскопии без меток, составляет примерно 200 нм. Следовательно, визуализация отдельных стереоцилий в пределах первого и второго рядов внутреннего пучка волосковых клеток относительно проста с помощью оптической микроскопии. Напротив, более короткие рядные стереоцилии во внутренних волосковых клетках и все стереоцилии наружных волосковых клеток имеют диаметр около 100-200 нм и не могут быть визуализированы с помощью оптической микроскопии5. Несмотря на недавний прогресс в области визуализации со сверхвысоким разрешением, это фундаментальное ограничение сохраняется в любой оптической визуализации без меток. Все современные коммерчески доступные методы сверхвысокого разрешения требуют каких-то флуоресцентных молекул6,что ограничивает их применение. В дополнение к ограничениям из-за необходимости специфических флуоресцентно помеченных молекул, было показано, что воздействие интенсивного светового облучения вызывает повреждение клеток и может влиять на клеточные процессы, что является большим недостатком при изучении живых клеток7.
Наши текущие знания об ультраструктурных деталях пучков стереоцилий волосковых клеток были получены в основном с помощью различных методов электронной микроскопии (ЭМ), таких как сканирующая электронная микроскопия (SEM), просвечивающая электронная микроскопия (TEM), замораживание-разрушение EM, а в последнее время с помощью 3D-методов, таких как последовательное сечение с фокусированным ионным пучком или крио-ЭМ томография8,9,10,11,12,13, 14,15,16. К сожалению, все эти методы ЭМ требуют химической или криофиксации образца. В зависимости от временной шкалы явлений это требование делает изучение динамических процессов на кончиках стереоцилий либо невозможным, либо очень трудоемким.
Ограниченные усилия были предприняты для изображения волосяных пучков живых волосковых клеток с помощью атомно-силовой микроскопии (AFM)17,18. Поскольку AFM работает в физиологических растворах, теоретически он может визуализировать динамические изменения в пучках стереоцилий живых волосковых клеток с течением времени. Проблема заключается в принципах АСМ высокого разрешения, которые подразумевают определенный физический контакт между зондом АСМ и образцом даже в наименее повреждающем режиме «постукивания»19. Когда зонд AFM сталкивается со стереоцилием, он обычно разбивается о него, повреждая структуру пучка волос. В результате данная методика не подходит для визуализации живых, или даже фиксированных, пучков волосковых клеток17,18. Проблема может быть частично облегчена с помощью большого шарообразного зонда AFM, который накладывает только гидродинамические силы на поверхность образца20. Однако, несмотря на то, что такой зонд идеально подходит для проверки механических свойств образца21,он обеспечивает только субмикрометровое разрешение при визуализации органа Corti22 и по-прежнему применяет к образцу силу, которая может быть существенной для высокочувствительных пучков стереоцилий.
Сканирующая ионно-проводящая микроскопия (SICM) представляет собой версию сканирующей зондовой микроскопии, в которой используется стеклянный пипеточный зонд, заполненный проводящим раствором23. SICM обнаруживает поверхность, когда пипетка приближается к ячейке и электрический ток через пипетку уменьшается. Поскольку это происходит задолго до прикосновения к клетке, SICM идеально подходит для бесконтактной визуализации живых клеток в физиологическомрастворе 24. Наилучшее разрешение SICM составляет порядка одного нанометра, что позволяет разрешать отдельные белковые комплексы на плазматической мембране живой клетки25. Однако, подобно другим методам сканирования зондов, SICM способен отображать только относительно плоские поверхности. Мы преодолели это ограничение, изобретя прыгающий зондовый ионный электропроводный микроскоп (HPICM)26,в котором нанопипетка приближается к образцу в каждой точке визуализации(рисунок 1A). Используя HPICM, мы смогли изобразить пучки стереоцилий в живых слуховых волосковых клетках с наноразмерным разрешением27.
Еще одним фундаментальным преимуществом этого метода является то, что HPICM является не только инструментом визуализации. В отличие от других методов сканирования, зонд HPICM / SICM является электродом, широко используемым в физиологии клеток для электрических записей и локальной доставки различных стимулов. Активность ионных каналов обычно не мешает визуализации HPICM, потому что общий ток через зонд HPICM на несколько порядков больше, чем внеклеточный ток, генерируемый крупнейшими ионными каналами25. Тем не менее, HPICM позволяет точно позиционировать нанопипетту над интересующей структурой и последующую одноканальную запись патч-зажима из этой структуры28. Так мы получили первые предварительные записи одноканальной активности на кончиках стереоцилии наружных волосковых клеток29. Стоит отметить, что даже большой ток через нанопипетку не может произвести значительные изменения потенциала через плазматическую мембрану из-за огромного электрического шунта внеклеточной среды. Однако отдельные ионные каналы могут быть активированы механически протеканием жидкости через нанопипетку30 или химически локальным применением агониста31.
В HPICM изображение генерируется, когда нанопипетка последовательно приближается к образцу в одной точке, втягивается, а затем движется в боковом направлении, чтобы повторить подход(рисунок 1A). Зажимной усилитель постоянно подает напряжение на провод AgCl в пипетке(рисунок 1B)для генерации тока ~1 нА в растворе ванны. Значение этого тока, когда пипетка находится вдали от поверхности ячейки, определяется как опорный ток(Iref, рисунок 1C). Затем пипетка перемещается по оси Z, чтобы приблизиться к образцу до тех пор, пока ток не уменьшится на величину, предопределенную пользователем (заданное значение), обычно 0,2%-1% от Iref (рисунок 1C,верхняя трассировка). Затем система сохраняет значение Z в этот момент как высоту образца вместе с координатами X и Y этой точки изображения. Затем пипетку убирают от поверхности(рисунок 1С,нижняя трассировка) со скоростью, определенной пользователем, обычно 700-900 нм/мс. После втягивания пипетка (или, в нашем случае, образец – см. Рисунок 1В)перемещается латерально к следующей точке визуализации, получается новое значение опорного тока, и пипетка вновь приближается к образцу, повторяя процесс. Движение пипетки X-Y предпочтительно в вертикальном микроскопе, который обычно используется для записи токов механотрансдукции волосковых клеток. В этом случае зонд HPICM приближается к пучкам волосковых клеток не сверху, а подуглом 32. Однако наилучшее разрешение визуализации HPICM достигается в установке инвертированного микроскопа(рисунок 1A,B),где движение образца в направлениях X-Y отделено от Z-движения нанопипетки, тем самым устраняя потенциальные механические артефакты.
Используя HPICM, мы получили топографические изображения пучков стереоцилий внутренних и наружных волосковых клеток мыши и крысы и даже визуализировали связи между стереоцилиями, которые составляют около 5 нм в диаметре26,27. Успех визуализации пучков волосковых клеток с помощью этой техники зависит от нескольких факторов. Во-первых, шум (дисперсия) тока нанопипетки должен быть как можно меньше, чтобы обеспечить минимально возможное заданное значение для визуализации HPICM. Низкое заданное значение позволяет зонду HPICM «ощущать» поверхность стереоцилий на большем расстоянии и под любым углом к приближению зонда и, что удивительно, улучшает разрешение X-Y изображений HPICM (см. Обсуждение). Во-вторых, вибрации и дрейфы в системе должны быть уменьшены до менее чем 10 нм, поскольку они вносят непосредственный вклад в артефакты изображения. Наконец, несмотря на то, что зонд HPICM и ступень образца перемещаются по осям Z и X-Y калиброванными пьезоприводами с обратной связью, которые имеют точность один нанометр или лучше, диаметр наконечника нанопипетки определяет распространение тока (чувствительный объем) и, следовательно, разрешение(рисунок 1A). Поэтому, прежде чем визуализировать живые волосковые клетки, жизненно важно вытащить адекватные пипетки, достичь желаемого разрешения с калибровочными образцами и достичь низкого уровня шума в системе записи.
По крайней мере, пару десятилетий техника SICM не была коммерчески доступна, и она разрабатывалась лишь несколькими лабораториями в мире с ведущей лабораторией профессора Корчева в Имперском колледже (Великобритания). Недавно несколько систем SICM стали коммерчески доступными (см. Таблицу материалов),все из которых основаны на оригинальных принципах HPICM. Тем не менее, визуализация пучков стереоцилий в волосковых клетках требует нескольких пользовательских модификаций, которые технически сложны (или даже невозможны) в закрытых «готовых к работе» системах. Поэтому необходима некоторая интеграция компонентов. Поскольку установка HPICM представляет собой патч-зажим с более строгими требованиями к вибрации и дрейфу и пьезоприводным движением зонда HPICM и образца(рисунок 1D),эта интеграция относительно проста для любого исследователя, который владеет зажимом патча. Тем не менее, ученый без надлежащего образования определенно нуждается в некоторой подготовке в области электрофизиологии в первую очередь. Несмотря на остающиеся проблемы, такие как увеличение скорости визуализации (см. Обсуждение),мы смогли визуализировать пучки стереоцилий в живых волосковых клетках с наноразмерным разрешением, не повреждая их.
В этой статье представлен подробный протокол для выполнения успешной визуализации HPICM живых слуховых пучков волосковых клеток у молодых послеродовых кохлеарных эксплантов крыс или мышей с использованием нашей специальной системы. Интегрированные компоненты перечислены в Таблице материалов. В документе также описываются распространенные проблемы, с которыми можно столкнуться, и способы их устранения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование проводилось в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию Национальными институтами здравоохранения. Все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Кентукки (протокол 00903M2005).
1. Производство и тестирование нанопипет
- Создайте программу в съемнике микропипетки для получения пипеток с сопротивлением от 200 до 400 МОм, что соответствует внутренним диаметрам наконечника примерно 50-70 нм. Параметры будут зависеть от съемника микропипетки. Чтобы получить короткие пипетки с негибкими тонкими наконечниками, ознакомьтесь с руководством по эксплуатации съемника.
- Используйте боросиликатные стеклянные капилляры с наружным/внутренним диаметром 1/0,58 мм и внутренней нитью накала для облегчения наполнения. Длина пипетки имеет решающее значение, поскольку она определяет частоту бокового механического резонанса пипетки. Чем длиннее пипетка, тем ниже резонансная частота и тем труднее избежать этого резонанса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователь должен попытаться изготовить самую короткую пипетку, которую может принять держатель. Длина нанопипеток в этом эксперименте обычно составляет 15-25 мм(рисунок 2А). - Заполните нанопипетку до ее средней точки(рисунок 2A)раствором для ванны, либо L-15 Лейбовица, либо сбалансированным солевым раствором Хэнка (HBSS), дополненным 20 мМ D-глюкозы (для регулировки осмолярности). Чтобы избежать потенциальных артефактов, используйте тот же раствор, который будет использоваться в ванне для записей.
- Используя оптический микроскоп с увеличением в 10 раз, проверьте наличие пузырьков на кончике пипетки(рисунок 2B). Пузырьки будут препятствовать течению тока. Сложнее удалить пузырьки в пипетках, которые были вытянуты за несколько часов до эксперимента. Поэтому рекомендуется тянуть новые пипетки с каждым экспериментом.
- Как только пипетка освободится от пузырьков, установите ее в держатель пипетки HPICM(рисунок 2C).
- Поместите образец (тканевый или калибровочный стандарт) в специально изготовленную камеру и добавьте 4 мл вышеупомянутого раствора для ванны.
- Поместите изготовленную по индивидуальному заказу камеру на ступень HPICM и вставьте заземляющий электрод в раствор.
- Убедитесь, что напряжение, подаваемое на пипетку усилителем патч-зажима, равно нулю.
- Перемещайте пипетку в Z, пока она не коснется жидкости.
- Установите смещение усилителя на ноль, а затем добавьте +100 мВ, чтобы проверить ток пипетки.
- Рассчитайте сопротивление и диаметр пипетки, основываясь на законе Ома:
R = V/I
где R — сопротивление (MOhm), V — напряжение, приложенное к нанопипетке (мВ), а I — ток, протекающий через нанопипетку (nA).- Рассчитайте внутренний диаметр пипетки, как описано в другом месте, по следующей формуле12:
IDНаконечник = 1000/ √R
ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальное значение сопротивления составляет от 200 до 400 МОм. Пипетки с сопротивлением выше 400 МОм могут привести к нестабильному току из-за их небольшого размера (< внутреннего диаметра 50 нм). Напротив, пипетки с сопротивлением менее 200 МОм слишком велики (внутренний диаметр > 70 нм) и не решают мелкие особенности. Рекомендуется начинать съемку с пипеток сопротивления 200 МОм, так как они проще в изготовлении и, как правило, обеспечивают меньше электрического шума.
- Рассчитайте внутренний диаметр пипетки, как описано в другом месте, по следующей формуле12:
2. Минимизация дрейфа и вибраций образцов
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить механический шум в системе во время визуализации, установите образцы на специально изготовленные камеры, в которых используются толстые стеклянные слайды (~1,2 мм):
- Снимите стеклянную часть с тарелки со стеклянным дном диаметром 50 мм, оставив пластиковые стенки нетронутыми.
- Приклейте пластиковую часть чашки для культивирования клеток поверх толстого стеклянного слайда силиконовым клеем.
- Установите калибровочный образец в середине камеры (поверх стеклянного слайда) с помощью силиконового клея или тонкой двусторонней ленты.
- Надежно закрепите камеру на ступени HPICM с помощью двусторонней ленты.
- Во время съемки закройте клетку Фарадея и накройте ее одеялом, чтобы свести к минимуму электрические помехи и тепловой дрейф соответственно.
3.Тестирование разрешения с помощью калибровочных стандартов AFM
ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется создавать изображения стандартов AFM (см. Таблицу материалов) перед визуализацией живыхклеток, чтобы устранить неполадки системы и проверить ее разрешение по осям X-Z-Y. Калибровочные стандарты имеют столбы диоксида кремния и отверстия различной формы, но фиксированные высоты / глубины (т. Е. 20 или 100 нм) на кремниевом чипе 5 x 5 мм. Рекомендуется начиная со стандарта калибровки 100 нм, чтобы гарантировать, что разрешение Z ниже 100 нм. После успешного получения изображения с высоким разрешением стоек или отверстий в данном калибровочном образце(рисунок 3А),перейдите к стандарту 20 нм. Если визуализация последнего стандарта является успешной(фиг.3B),разрешение по оси Z гарантированно будет ниже 20 нм и подходит для визуализации пучков стереоцилий волосковых клеток12. Следующие шаги используются для получения изображения обоих калибровочных стандартов.
- Прикрепите калибровочный стандарт к камере с помощью силиконового клея.
- Добавьте 4 мл HBSS в камеру, чтобы покрыть калибровочный образец. Затем закрепите камеру на ступени XY установки HPICM с помощью двусторонней ленты.
- Зажмите магнитный держатель заземленного электрода к ступени возле камеры и погрузите электрод в раствор ванны(рисунок 1B).
- Установите нанопипетку в держатель, погрузите ее в раствор ванны и установите ее ток на ~1 нА, следуя шагам, описанным в разделе 1.
- Расположите нанопипетку примерно над центром калибровочного стандарта с помощью манипулятора с зажимом курса. Для такого позиционирования обычно достаточно визуального осмотра, так как площадь, покрытая структурами диоксида кремния, относительно велика (1 х 1 мм). В отличие от органа эксплантов Корти (см. ниже), калибровочный стандарт является непрозрачным и, следовательно, для этого образца невозможно более точное позиционирование с помощью оптической визуализации.
- Увеличьте заданное значение при мониторинге сигнала от датчика Z-пьезопривода на осциллографе в режиме реального времени. После установления стабильного повторяемого цикла подхода Z (как на рисунке 1C,внизу) уменьшите заданное значение до значения, которое чуть выше точки нестабильности. Эта процедура обеспечит оптимальное заданное значение для этой конкретной нанопипетки.
- Перемещайте пипетку вниз со скоростью ~5 мкм/с с помощью микроманипулятора зажимного зажима, пока она не достигнет образца. В этот момент нижний уровень сигнала позиционирования Z в реальномвремени (рисунок 1C)увеличится, что указывает на то, что нанопипетка изымается из-за «зондирования» поверхности образца. Любое дальнейшее движение нанопипетки приведет к дальнейшему положительному сдвигу сигнала Z-позиционирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не превысить верхний предел движения Z-пьезопривода. - Начните обработку изображений с низким разрешением (см. таблицу 1). Из-за неравномерного монтажа стандарта AFM самая высокая точка интересующей области может быть неизвестна. Поэтому установите амплитуду втягивания пипетки (амплитуду прыжка) не менее 200-500 нм.
- Как только самая высокая точка образца в области визуализации идентифицирована, уменьшите амплитуду прыжка. Меньшая амплитуда прыжка позволяет быстрее сканировать, что предпочтительно для изображений с высоким разрешением из-за уменьшения эффектов дрейфов и снижения вибрации.
- Прежде чем переместить пипетку в новое место X-Y, втяните ее примерно на 200 мкм по оси Z, чтобы предотвратить нежелательные столкновения с образцом.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случаях, когда нанопипетка не выровнена с центром калибровочного стандарта, возможно, что сканирование начинается только с области поверхностных особенностей. - После того, как интересующая область найдена, начните съемку с более высоким разрешением (см. таблицу 1).
4. Изготовление камер на заказ для крепления кохлеарных эксплантов
ПРИМЕЧАНИЕ: Установите кохлеарные экспланты в камерах с помощью специально изготовленных зажимных систем, в которых используются либо гибкие стеклянные пипетки (этап 4.1)(рисунок 4A),либо зубная нить (этап 4.2)(рисунок 4B). Стеклянная пипеточная камера может быть стерилизована и использована для культивируемых органов Корти, в то время как камера зубной нити обеспечивает более надежное удержание образца и контроль над ориентацией пучка стереоцилий во время монтажа. Эти специально изготовленные камеры должны быть подготовлены заранее, но они могут быть очищены и повторно использованы в нескольких сеансах визуализации.
- Сделайте камеру с помощью гибких стеклянных пипеток
- Вытяните два тонких и гибких стеклянных волокна из стеклянных капилляров с помощью съемника пипетки. Наши вытянутые стеклянные волокна обычно имеют длину от 1 до 2 см и довольно гибкие.
- Поместите небольшую каплю силиконового эластомера поверх стеклянной крышки. Используйте чехлы диаметром 2 см.
- Поместите концы двух стеклянных волокон на силиконовую каплю и расположите волокна так, чтобы они имели небольшую степень разделения между ними(рисунок 4А).
- Поместите крышку на горячую плиту, чтобы быстро вылечить эластомер (от 1 до 3 мин).
- Приклейте крышку на стеклянное дно камеры, описанной в разделе 2, используя небольшое количество (1-3 мкл) силиконового эластомера и позволяя ему отверждаться в течение ночи.
- Изготовление камеры с использованием зубной нити:
- Снимите стеклянную часть стеклянной тарелки толщиной 50 мм, оставив пластиковые стенки нетронутыми. Затем приклейте пластиковую часть чашки для культивирования клеток поверх стеклянного слайда толщиной 1,2 мм с силиконовым клеем.
- Установите одну пластиковую крышку (6,5 х 6,5 мм) с тем же клеем к центру камеры. Затем повторите процесс с другой крышкой поверх предыдущей.
- Установите две небольшие вольфрамовые или позолоченные проволоки (12 мм длиной и ~ 0,5 мм в диаметре) с силиконовым клеем, каждая из которых находится на противоположных сторонах направляющих крышки. Приклейте их достаточно далеко (> 10-15 мм) от направляющих(рисунок 4В).
- Отделите две нити зубной нити и поместите их поверх направляющих крышки и закрепите их на проводах, сделав узел. Оставьте небольшой зазор между обеими нитями(рисунок 4B,короткие стрелки).
- Очищайте камеры после каждого использования
- Аккуратно удалите ткань из камеры с помощью тонкого пинцета и слегка соскоблите остатки ткани, оставшиеся позади.
- Промыть камеру сначала 70% этанолом, а затем дистиллированной водой.
- При необходимости повторите цикл ополаскивания.
- Поместите камеру вверх ногами на фильтровальную бумагу, чтобы она высохла до следующего эксперимента. Камеры не нуждаются в стерилизации, если только культивирование органа Корти не планируется после визуализации.
5. Рассечение органа грызунов Корти
- Выполняют рассечение молодых послеродовых кохлеарных эксплантов, как подробно описано в другом месте13.
- Для визуализации HPICM рассекайте орган Корти у мышей между постнатальными днями 3 и 6 (P3-6) и у крыс между постнатальными днями 3 и 8 (P3-8).
ПРИМЕЧАНИЕ: Старые волосковые клетки более восприимчивы к повреждению во время рассечения и, следовательно, не могут использоваться для многочасовой покадровой визуализации HPICM. - Не забудьте удалить текториальную мембрану перед визуализацией HPICM.
- Сразу после рассечения закрепите ткань в одной из камер, описанных в разделе 4, либо поместив ее под гибкие стеклянные пипетки, либо под две нити зубной нити(рисунок 4). Предварительно заполните эти камеры 4 мл раствора для ванны комнатной температуры (чтобы свести к минимуму образование пузырьков).
6. Визуализация слуховых волосковых клеток
- Установите камеру со свежеизолированным органом Corti на пьезо-сцену X-Y с помощью двусторонней ленты и убедитесь, что она надежно закреплена, чтобы свести к минимуму дрейф камеры по осям X и Y(рисунок 1B).
- Выполните действия, описанные в разделе 1, чтобы поместить новую нанопипетку и проверить правильность сопротивления пипетки.
- Используя зажимной микроманипулятор, расположите нанопипетку над областью волосковых клеток, наблюдая при этом за органом эксплантата Корти в перевернутом микроскопе.
- Проверьте, стабильна ли система с заданным значением 0,5% или ниже, записав ток в реальном времени и сигнал позиционирования Z на осциллографе (как на рисунке 1C). Если сигнал Z не стабилен, попробуйте уменьшить частоту среза фильтра нижних частот усилителя патч-зажима. Однако оно не может быть ниже времени отклика Z-пьезопривода (во избежание столкновения пипетки с образцом из-за задержки показаний тока).
ПРИМЕЧАНИЕ: На практике оптимальным является установка этого фильтра на частоту 5 кГц. Лучше заменить нанопипетку, если Z-сигнал еще нестабилен. - Как только будет достигнута стабильная запись, определите оптимальное заданное значение и подойдите к образцу с помощью пипетки HPICM, как описано в шагах 3.6-3.7 выше.
- Во-первых, выполняют визуализацию с низким разрешением (см. Таблицу 1),используя амплитуду прыжка от 6 до 8 мкм. Чтобы сфотографировать высокие структуры, такие как пучки стереоцилий волосковых клеток, убедитесь, что амплитуды прыжка достаточно, чтобы избежать столкновения с этими структурами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если амплитуды прыжка недостаточно, пипетка не сможет перепрыгнуть через стереоцилиум и произойдет неизбежное столкновение. Столкновение зонда HPICM со стереоцилием может повредить пучок волос. Поэтому в тех случаях, когда высота пучка стереоцилий неопределенна, используйте большую амплитуду прыжка. - Ознакомиться с топографией органа Корти, сначала выполнив и/или изучив изображения, полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии(рисунок 5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если изображение HPICM однородно с высотой менее 1 мкм в каждой точке визуализации, пипетка, скорее всего, сканирует дно стекла, а не ткань. В качестве альтернативы, пипетка может «приземляться» на другую область кохлеарного эксплантата, вдали от волосковых клеток. - Если пипетку необходимо переместить в новое место X-Y, втяните ее примерно на 500 нм, чтобы избежать столкновений с какими-либо высокими особенностями в ткани. Повторяйте визуализацию HPICM с низким разрешением до тех пор, пока не будет найдена интересующая область с волосковыми клетками.
- После того, как область интереса найдена, запустите визуализацию с более высоким разрешением (см. таблицу 1). Постарайтесь потратить менее 15 минут на визуализацию целого пучка волос.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пучки волосковых клеток в живой ткани не остаются неподвижными, но могут менять свою ориентацию, например, из-за изменения формы в нижележащих поддерживающих клетках. Поэтому изображения могут демонстрировать артефакты движения, если получение изображения происходит слишком медленно. - Еще раз определите самые высокие объекты на изображениях с низким разрешением перед уменьшением амплитуды прыжка для изображений с высоким разрешением. Для интересующей области, охватывающей весь пучок волосковых клеток, уменьшите амплитуду прыжка до 4-5 мкм, в то время как для относительно небольшой и «плоской» области внутри пучка (например, 2 х 2 мкм) уменьшите амплитуду прыжка еще больше, до менее чем 1 мкм, тем самым увеличив скорость и разрешение изображения.
7. Обработка изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Артефакты визуализации распространены в HPICM-визуализации. Некоторые из них могут быть исправлены параметрами получения изображения, в то время как другие требуют постобработки либо с помощью специализированного средства просмотра SICM, либо с помощью более общих программ обработки данных, таких как ImageJ или MatLab. Здесь мы опишем наиболее распространенные артефакты и то, как мы их исправляем с помощью SICM viewer.
- Выполнить коррекцию уклона
ПРИМЕЧАНИЕ: Это не очевидно для новичка, но человеческий глаз не может определить субмикрометровые особенности размера на поверхности клетки, если область визуализации имеет общий наклон равного или большего размера(рисунок 3A,B,слева). Поэтому необходимо определить средний наклон изображенной области (путем подгонки данных 3D-изображения HPICM к одной плоскости) и вычесть его из изображения HPICM(рисунок 3A,B,середина).- Нажмите кнопку Открыть, чтобы открыть изображение с помощью средства просмотра SICM.
- Выберите вкладку Коррекция изображения.
- Выберите вкладку Правильный наклон.
- Нажмите кнопку «Правильный наклон» для автоматической коррекции уклона.
- Выполнение выравнивания линий
ПРИМЕЧАНИЕ: Как упоминалось ранее, механические и/или тепловые дрейфы, а также артефакты движения клеток представляют собой значительную проблему в визуализации HPICM. Небольшой дрейф со скоростью менее микрометра в минуту обычно не заметен в обычной установке патч-зажима. Тем не менее, он может производить артефакты в несколько десятков нанометров в изображениях HPICM, что значительно больше, чем разрешение HPICM. Поэтому нередко можно столкнуться с внезапными скачками оси Z между двумя соседними линиями сканирования HPICM во время визуализации. Это можно исправить, проанализировав различия между начальными (и/или конечными) Z-значениями в этих соседних линиях сканирования.- Нажмите кнопку Открыть, чтобы открыть изображение с помощью средства просмотра SICM.
- Выберите вкладку Коррекция изображения.
- Выберите вкладку Правильный наклон.
- Выберите ширину выравниваемых линий. Нажмите на кнопку ButtonDestripeLineFit для автоматической коррекции выравнивания линии.
- Снижение уровня шума
ПРИМЕЧАНИЕ: При получении изображений с помощью HPICM небольшие колебания тока нанопипетки могут привести к остановке нанопипетки далеко от поверхности образца, особенно при низких заданных значениях. Это приводит к появлению небольших белых точек на изображении. Для того чтобы исправить этот артефакт изображения, необходимо идентифицировать точки визуализации со значением Z, значительно большим, чем у соседей, и заменить это значение средним значением соседей. Это делается с помощью регулируемого медианного фильтра.- Нажмите кнопку Открыть, чтобы открыть изображение с помощью средства просмотра SICM.
- Выберите вкладку Обработка изображений.
- Выберите вкладку Шумоподавление.
- Установите фильтр «Пороговое значение» (мкм) для удаляемых пикселов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, представленный в данной работе, может быть использован для визуализации любых живых клеток со сложной топографией. Следуя этим шагам, мы обычно получаем изображения живых слуховых пучков волосковых клеток крыс(рисунок 6B,D). Несмотря на более низкое разрешение X-Y по сравнению с изображениями SEM, наши изображения HPICM могут успешно разрешать различные ряды стереоцилий, форму кончиков стереоцилий и даже небольшие звенья (~ 5 нм в диаметре), соединяющие соседние стереоцилии(рисунок 6F). Кроме того, изображения HPICM содержат информацию в 3D, которой нет в изображениях SEM. Учитывая бесконтактный характер этого типа метода визуализации, мы также смогли выполнить непрерывную покадровую hpICM-визуализацию одного и того же пучка волосковых клеток в течение нескольких часов (т. Е. 5-6 ч регулярно), не повреждая связность пучка(рисунок 7). Таким образом, HPICM демонстрирует большой потенциал для изучения динамических структурных изменений пучков волосковых клеток с течением времени.
Хотя мы предоставляем несколько диапазонов для размера пипетки, текущего заданного значения, параметров низкого и высокого разрешения и амплитуд прыжка, каждому пользователю может потребоваться немного оптимизировать свои настройки, чтобы получить успешные изображения HPICM пучков живых волосковых клеток. Меньшие заданные значения обеспечивают более высокое качество изображения. Однако при очень низком заданном значении система может интерпретировать небольшие флуктуации тока как сталкивающиеся с поверхностью ячейки, и это приведет к шуму «белой точки» на изображении(рисунок 8А). Аналогичным образом, большие амплитуды прыжка могут увеличивать боковой резонанс пипетки, а также производить шумные пиксели(рисунок 8B). Напротив, если амплитуда прыжка слишком мала или заданное значение слишком велико, нанопипетка может столкнуться с образцом и привести к артефактам визуализации или даже повредить пучок волос(рисунок 8C,D). Мы рекомендуем выполнять визуализацию с более низким разрешением, одновременно настраивая все эти параметры, чтобы свести к минимуму повреждение образца или нанопипетки.
Рисунок 1: Принципы микроскопии ионной проводимости прыгающего зонда (HPICM). Электрическийток, проходящий через нанопипетку, генерирует «чувствительный объем» на кончике пипетки. Чтобы изобразить сложные структуры, такие как пучки стереоцилий волосковых клеток, пипетка приближается к поверхности клетки сверху и втягивается после обнаружения поверхности. После бокового перемещения на каждом шаге пипетка продолжает «прыгать» над образцом, генерируя изображение клетки. Обратите внимание, что амплитуда прыжка должна быть достаточной, чтобы пипетка «поднялась» до стереоцилия. Иллюстрированная амплитуда прыжка будет работать для сканирования слева направо (от самого маленького до самого высокого стереоцилиума, обозначенного стрелкой). Тем не менее, он слишком мал для сканирования справа налево, когда пипетка сначала встречается с самым высоким стереоцилием. (B) Экспериментальная установка. Изготовленная на заказ камера с органом Corti explant установлена на сцене нанопозиционирования XY с отверстием для наблюдения оптической микроскопией. Нанопипетка перемещается отдельным сверхбыстрым Z-пьезоприводом. Чтобы расположить нанопипетку над интересующей областью, Z-привод устанавливается на обычный микроманипулятор (не показан) вместе с зажимным усилителем головной ступени. Заземленный электрод устанавливается на магнитный держатель и вставляется в ванну. (C)Репрезентативные записи тока пипетки(верхний след) и положения Z пипетки (нижний след) во время визуализации. Когда пипетка находится вдали от поверхности ячейки, определяется эталонное значение тока, проходящего через пипетку (Iref). Затем пипетка перемещается в сторону образца (подход). Когда «чувствительный объем» встречается с поверхностью ячейки, ток пипетки начинает уменьшаться. Команда на вывод выдается, когда текущее снижение достигает заданного значения, которое обычно составляет 0,2% - 1% от Iref. (D) Схемы оборудования, которые необходимо добавить к обычной установке патч-зажима для визуализации HPICM. Специальный патч-зажимный усилитель записывает ток нанопипетки (I), который используется контроллером SICM в режиме HPICM для генерации командных сигналов на оси X, Yи Z. Инструментальный усилитель обеспечивает смещение, масштабирование и фильтрацию нижних частот для этих сигналов, если это необходимо. К сожалению, сигналы X/Y/Z от контроллера не могут быть применены непосредственно к пьезоприводам из-за больших погрешностей, вызванных гистерезисом и ползучестью, которые присущи пьезокерамике. Поэтому каждый пьезопривод (этап трансляции)имеет встроенный датчик движения, который посылает сигнал обратной связи на контроллер пропорционально-интегральной производной (PID), который предварительно формирует командный сигнал для исправления этих ошибок. Обратите внимание, что относительно медленные оси X и Y могут использовать PID-контроллеры, встроенные в пьезоусилитель,в то время как более быстрая ось Z требует специального быстрого ПИД-контроллера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Изготовление и наполнение нанопипетки. (A) Нанопипетка длиной около 2 см, заполненная раствором интрапипетки (HBSS). (B) Изображение пузырька (стрелки), которое обычно образуется после заполнения пипетки. Пузырь обычно удаляется в течение нескольких минут после освещения микроскопа (ЖК-цифровой микроскоп в 10 раз). (C) Нанопипетка, установленная в головке SICM. Стрелка указывает на электрод AgCl внутри пипетки. Обратите внимание, что держатель пипетки окрашен в серебристый цвет и заземлен, чтобы свести к минимуму излучающий электрический звукосниматель от Z-пьезопривода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Визуализация калибровочных стандартов AFM для определения адекватной стабильности, виброизоляции и электрического шума в системе. (A)Необработанные (слева), обработанные (посередине) и 3D (справа) изображения калибровочного стандарта HS-100MG. Профиль поверхности стандарта схематически показан вверху. Поскольку стандарт никогда не выравнивается идеально перпендикулярно нанопипетке, коррекция наклона после обработки необходима для выявления небольших вертикальных особенностей образца. (B)Аналогичные необработанные (слева), обработанные (посередине) и 3D (справа) изображения калибровочного стандарта HS-20MG с меньшими углублениями глубиной 20 нм. Обратите внимание, что оттенки серого пикселя на изображении HPICM указывают высоту образца в этой точке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Крепление органа Corti explant. (A) Эксплант удерживается двумя стеклянными пипетками, которые приклеены к чашке Петри со стеклянным дном. (B) Эксплант крепится двумя зубными нитью (короткими стрелками) в изготовленной на заказ камере визуализации. Вставка показывает увеличенное изображение органа Корти. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Навигация зонда HPICM к области волосковых клеток. (A)SEM изображение кохлеарного эксплантата, показывающее ряды внутренних (IHC) и внешних (OHCs) волосковых клеток и различные типы поддерживающих клеток. (B) Репрезентативное HPICM-изображение клеток в органе Колликера. (C) HPICM-изображение клеток Хенсена. Обратите внимание, что эти два типа поддерживающих клеток имеют очень разные формы, что помогает определить, приземлился ли зонд HPICM в область, которая является радиальной или периферической по отношению к волосковым клеткам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Сравнение сканирующей электронной микроскопии (SEM) и скачкообразной зондовой ионной проводимой микроскопии (HPICM), визуализации пучков стереоцилий в молодых постнатальных клетках грызунов. (А,С) Изображения SEM обеспечивают субнанометровое разрешение деталей поверхности, но в ячейках, которые фиксируются и сжимаются из-за высыхания в критической точке. Кроме того, изображения SEM не позволяют проводить 3D-анализ. (Б,Д) Изображения HPICM (слева) имеют худшее разрешение (~ 5-10 нм), но они получены в живых клетках, позволяют проводить покадровую визуализацию и несут информацию о точных высотах, что позволяет 3D-реконструкцию и измерения (справа). (Е,Ф) Внеклеточные связи между стереоцилиями очевидны как в изображениях SEM(E),так и в ИЗОБРАЖЕНИЯХ HPICM(F). Возраст клеток: А, послеродовой день 5 (P5) мыши; B, P6 крыса; Мышь C, P8; D, P5 крыса; Мышь E, P7; и крыса F, P5. Во всех изображениях HPICM оттенки серого пикселя указывают высоту образца в этой точке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Непрерывная покадровая hpICM-визуализация пучка стереоцилий. (A) Обзор внутреннего пучка волосковых клеток крысы P5, показывающий отчетливые стереоцилии с более короткими рядами. (B)Покадровое изображение интересующей области, указанной в пункте (А), в течение шести часов. Обратите внимание, что, в отличие от типичного эксперимента с патч-лагерем, волосковые клетки не показывают признаков ухудшения в течение нескольких часов in vitro. Это связано с тщательным рассечением и отсутствием каких-либо механических нарушений со стороны клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Распространенные артефакты при создании изображений с помощью HPICM. (A) Эффект слишком низкого заданного значения. Изображения HPICM с низким разрешением тех же живых внутренних пучков волосковых клеток у мышей P3, полученные с заданным значением 0,05% (слева) и 0,07% (справа). Обратите внимание на шум белой точки, который исчезает с более высоким заданным значением. (B)Эффект слишком высокой амплитуды прыжка. Шум белой точки также появляется на изображении HPICM внутреннего пучка волосковых клеток крысы P7, полученном с большой амплитудой прыжка 5,8 мкм (слева). Этот шум исчезает, когда один и тот же пучок визуализируется с амплитудой прыжка 3,4 мкм (справа) из-за уменьшения вибраций в системе. (C) Слишком низкая амплитуда прыжка приводит к столкновению зонда HPICM со стереоцилиями и их перетаскиванию (стрелки на левой панели). Увеличение амплитуды прыжка ровно настолько, чтобы «перелезть» через стереоцилии, устраняет этот артефакт (справа), но также может увеличить время изображения, что приводит к заметному дрейфу (вертикальные линии в правой панели). Пучок стереоцилий живой наружной волосковой клетки от крысы P7. (D) Слишком высокое заданное значение приводит к квадратной форме наконечников стереоцилий (стрелок) на изображении HPICM (слева), опять же из-за столкновения нанопипетки со стереоцилиями. Уменьшение заданного значения (с одновременным уменьшением амплитуды надежды на устранение белого шума) улучшает визуализацию (справа). Пучок стереоцилий живой внутренней волосковой клетки от крысы P6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Резолюция | Площадь изображения (мкм) | Боковое разрешение (нм) | Время на изображение (минут) |
| Низкий | 20×20 | ≥300 | ≤20 |
| Низкий | 10×10 | ≥156 | ≤15 |
| Низкий | 5×5 | ≥75 | ≤4 |
| Высокий | 20×20 | ≤200 | ≤20 |
| Высокий | 10×10 | ≤110 | ≤15 |
| Высокий | 5×5 | ≤55 | ≤4 |
Таблица 1: Типичное время получения изображений HPICM в зависимости от размера области изображения и разрешения сканирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для получения успешных изображений HPICM пользователям необходимо установить систему с низким уровнем шума и вибрации и изготовить соответствующие пипетки. Мы настоятельно рекомендуем использовать калибровочные стандарты AFM для проверки стабильности системы перед попыткой выполнения любой визуализации живых клеток. После тестирования разрешения системы пользователи могут рассмотреть возможность визуализации неподвижного органа образцов Корти, чтобы ознакомиться с настройками визуализации, прежде чем пытаться получить какую-либо визуализацию живых клеток.
Оптимальное заданное значение для визуализации варьируется между различными пипетками в зависимости от индивидуальной формы их кончиков (которая неизвестна до тех пор, пока не будет исследована электронной микроскопией) и от количества грязи, прикрепленной к наконечнику, что также непредсказуемо. Нанопипетты с оптимальным заданным значением выше 0,7% следует выбросить.
Во время визуализации живых клеток количество пыли и мусора во внеклеточном растворе со временем увеличивается. Все эти частицы могут оказаться на кончике пипетки, вызывая уменьшение тока и делая невозможным продолжение сканирования ткани — изображение станет полностью белым, так как обратная связь будет «думать», что нанопипетка всегда находится в непосредственной близости от образца. Если это произошло, рекомендуется втянуть пипетку по оси Z из этой области ткани. Это опровержение могло бы очистить «грязь». Если пипетка все еще грязная, необходимо поменять пипетку и переместиться в другую область образца. Затем пользователь может продолжить сканирование ткани.
На сегодняшний день наиболее существенным ограничением HPICM является количество времени, необходимое для получения изображения с высоким разрешением при работе с образцами со сложной топографией. В зависимости от желаемого разрешения, изображения могут занимать до получаса и более. На изображениях, полученных в течение более пятнадцати минут, дрейф может стать очевидным, и конкретные структуры могут быть смещены и их труднее различить. Это происходит потому, что живые клетки постоянно движутся или меняют свою форму с течением времени. Чтобы визуализировать молекулярные события и изменения в структурах клеток с течением времени, необходимы дальнейшие разработки для оптимизации временного разрешения HPICM11.
Шум тока нанопипетки представляет собой еще одно ограничение, поскольку он устанавливает минимальное практически достижимое заданное значение. Ток, генерируемый нанопипеткой в растворе, быстро затухает (обратный кубическому расстоянию от кончика пипетки), тем самым устанавливая «чувствительный объем», за пределами которого нанопипетка не может «ощущать» поверхность. Ранее мы разработали модель этого явления и показали, что боковое разрешение зонда SICM определяется поперечным сечением этого «чувствительного объема» с поверхностью клетки, которое может быть чрезвычайно малым при низких заданных значениях25. Это особенно важно для визуализации кончиков звеньев волосковых клеток, которые имеют диаметр ~5 нм12,33. На первый взгляд, пипетки с меньшим внутренним диаметром приведут к лучшему разрешению изображения HPICM. Это действительно верно для относительно больших пипеток (>50 нм). Однако уменьшение внутреннего диаметра нанопипетки ниже ~ 50 нм приводит к непропорционально большому увеличению шума пипетки и, следовательно, к потере разрешения при низких заданных значениях, которые необходимы для визуализации пучков стереоцилий. На сегодняшний день мы не знаем, как решить эту проблему, и мы работаем над поиском правильного решения.
Таким образом, в этой статье представлен подробный протокол визуализации пучков стереоцилий в слуховых волосковых клетках живых млекопитающих с помощью HPICM. Самыми большими преимуществами HPICM являются: i) его способность визуализировать наноразмерные структуры без меток на поверхности живых клеток, не касаясь их; и ii) исследовать функцию этих структур с помощью записей зажимов и/или локальной наноразмерной доставки механических или химических стимулов. Насколько нам известно, эти преимущества уникальны для HPICM. Конечно, есть и некоторые недостатки. Во-первых, из-за ограничений на высоту структур, подлежащих изображению, HPICM может не подходить для визуализации чрезвычайно высоких структур, таких как пучки стереоцилий вестибулярных волосковых клеток в ампулах млекопитающих. Во-вторых, HPICM все еще развивается, и необходимы дальнейшие улучшения скорости и разрешения изображений. Однако физические принципы HPICM и наш собственный опыт говорят о том, что это возможно. Мы верим, что HPICM предоставит уникальные данные о функции отдельных белковых комплексов на поверхности стереоцилий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим профессора Юрия Корчева (Имперский колледж, Великобритания) за долгосрочную поддержку и консультации на всех этапах проекта. Мы также благодарим докторов Павла Новака и Андрея Шевчука (Имперский колледж, Великобритания), а также Олега Белова (Национальный исследовательский центр аудиологии, Россия) за помощь в разработке программного обеспечения. Исследование было поддержано NIDCD/NIH (R01 DC008861 и R01 DC014658 до G.I.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analog oscilloscope | B&K Precision | 2160C | Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach |
| AFM calibration standards | TED PELLA Inc | HS-100MG; HS-20MG | These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system |
| Benchtop vibration Isolator | AMETEK/TMC | Everstill K-400 | Active vibration isolation |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments (WPI) | 1B100F-4 | Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | To be added to the bath solution to adjust osmolarity |
| Digitizer | National Instruments Corporation | PCI-6221 | Multi-channel input/output digitizer |
| Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement | Standford Research Systems | SIM900, SIM960, SIM980 | Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers. |
| Faraday cage | AMETEK/TMC | Type II | Required to shield electromagnetic interference |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments (WPI) | FD5040-100 | Used as the dish for the chamber for the tissue |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14025092 | Extracellular (bath) solution |
| Instrumentation amplifier | Brownlee Precision | Model 440 | Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation |
| Laser-based micropipette puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes. |
| Lebovitz's L-15, without phenol red | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 21083027 | Extracellular (bath) solution |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | Used for "course" positioning of the Z piezo actuator |
| Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Inverted optical microscope |
| Patch amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette |
| Piezo amplifier (XY axes) | Physik Instrumente (PI) | E-500.00, E-505.00, E-509.C2A | Amplification and PID control for XY piezo translation stage |
| Piezo amplifier (Z axis) | Piezosystem jena | ENT 400 & 800 | Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA |
| Plastic Coverslips | TED PELLA Inc | 26028 | Used in the fabrication of the chambers for the tissue |
| SICM controller & software* | Ionscope, UK (ionscope.com) | N/A | Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd |
| Silicone elastomer (Sylgard) | World Precision Instruments (WPI) | SYLG184 | Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue |
| Silicon glue | The Dow Chemical Company | 734 | Used to glue the different parts of the chamber for the tissue |
| Tungsten rod | A-M Systems | 717500 | Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue |
| XY piezo nanopositioner | Physik Instrumente (PI) | P-733.2DD | XY translation stage with capacitive sensors |
| Z piezo nanopositioner | Piezosystem jena | RA 12/24 SG | Ring piezoactuator with a strain gage sensor |
| *Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems: NX12-Bio and NX10 SICM, | |||
| Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original | |||
| HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically | |||
| challenging (or even impossible) in the closed “ready-to-go” systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one | |||
| modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration. |
References
- Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
- Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).
- Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).
- Engström, H., Engström, B. Structure of the hairs on cochlear sensory cells. Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction. Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).
- Furness, D. N., Hackney, C. M. Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).
- Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog’s internal ear. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).
- Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea. The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).
- Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. High-resolution structure of hair-cell tip links. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).
- Vélez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells. eLife. 6, 1-22 (2017).
- Ivanchenko, M. V., et al. Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles. Scientific Data. 7 (1), 182 (2020).
- Hadi, S., Alexander, A. J., Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles. Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).
- Metlagel, Z., et al. Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia. Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).
- Langer, M. G., et al. Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy. Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).
- Dufrêne, Y. F. Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy. Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).
- Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy. Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).
- Gavara, N., Chadwick, R. S. Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy. Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).
- Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy. Nature Communications. 8 (1), 1030 (2017).
- Katsuno, T., et al. TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing. JCI Insight. 4 (12), (2019).
- Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. The scanning ion-conductance microscope. Science. 243 (4891), 641-643 (1989).
- Korchev, Y. E., et al. Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells. Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).
- Shevchuk, A. I., et al. Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy. Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).
- Novak, P., et al. Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy. Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).
- Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy. Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).
- Gu, Y., et al. High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function. FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).
- Frolenkov, G. I., et al. Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe. Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).
- Sánchez, D., et al. Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette. Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).
- Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell. Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).
- Shevchuk, A., et al. Angular approach scanning ion conductance microscopy. Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).
- Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium. Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).
