Summary
Her presenterer vi en protokoll for Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), en ikke-kontakt skanning sonde teknikk som tillater nanoskala bildebehandling av stereocilia bunter i levende auditive hårceller.
Abstract
Indre ørehårceller oppdager lydinduserte forskyvninger og transduserer disse stimuliene til elektriske signaler i en hårbunt som består av stereocilia som er ordnet i rader med økende høyde. Når stereocilia er avbøyd, sleper de på små (~ 5 nm i diameter) ekstracellulære spisskoblinger som kobler sammen stereocilia, som formidler krefter til de mekanosensitive transduksjonskanalene. Selv om mekanaltransduksjon har blitt studert i levende hårceller i flere tiår, kan de funksjonelt viktige ultrastrukturelle detaljene i mekanotransduksjonsmaskineriet på spissene av stereocilia (for eksempel spisskoblingsdynamikk eller transduksjonsavhengig stereocilia-ombygging) fortsatt bare studeres i døde celler med elektronmikroskopi. Teoretisk sett har skannesondeteknikker, for eksempel atomkraftmikroskopi, nok oppløsning til å visualisere overflaten av stereocilia. Men uavhengig av bildemodus skader selv den minste kontakten til atomkraftmikroskopisonden med stereociliabunten vanligvis bunten. Her presenterer vi en detaljert protokoll for hopping sonde ion ledningsmikroskopi (HPICM) avbildning av levende gnagere auditive hårceller. Denne ikke-kontakt skanning sonde teknikken tillater tidsforløp bildebehandling av overflaten av levende celler med en kompleks topografi, som hårceller, med enkelt nanometer oppløsning og uten å gjøre fysisk kontakt med prøven. HPICM bruker en elektrisk strøm som passerer gjennom glass nanopipetten for å oppdage celleoverflaten i nærheten av pipetten, mens et 3D-posisjonerende piezoelektrisk system skanner overflaten og genererer bildet. Med HPICM kunne vi avbilde stereociliabunter og koblingene som knytter stereocilia sammen i levende auditive hårceller i flere timer uten merkbar skade. Vi forventer at bruken av HPICM vil tillate direkte utforskning av ultrastrukturelle endringer i stereocilia av levende hårceller for bedre forståelse av deres funksjon.
Introduction
Til tross for at stereociliabunter i de hørbare hårcellene er store nok til å visualiseres ved optisk mikroskopi og avbøyes i levende celler i et patchklemmeeksperiment, kan de essensielle strukturelle komponentene i transduksjonsmaskineriet som spisskoblinger bare avbildes med elektronmikroskopien i døde celler. I pattedyrets auditive hårceller er transduksjonsmaskineriet plassert i de nedre endene av spisskoblingene, det vil si ved spissene på den kortere raden stereocilia1 og regulert lokalt gjennom signalering på spissene til stereocilia2,3. Likevel er etikettfri bildebehandling av overflatestrukturene på dette stedet i levende hårceller ikke mulig på grunn av de små størrelsene på stereocilia.
Pattedyret cochlea har to typer auditive sensoriske celler: indre og ytre hårceller. I de indre hårcellene er stereocilia lengre og tykkere sammenlignet med de i de ytre hårcellene4. Den første og andre raden av stereocilia har en diameter på 300-500 nm i mus eller rotte indre hårceller. På grunn av lysets diffraksjon er maksimal oppløsning oppnåelig med en etikettfri optisk mikroskopi ca. 200 nm. Derfor er visualisering av individuelle stereocilia innen første og andre rad i den indre hårcellebunten relativt enkel med optisk mikroskopi. I motsetning har stereocilia med kortere rad i de indre hårcellene og alle stereocilia i de ytre hårcellene diametre rundt 100-200 nm og kan ikke visualiseres med optisk mikroskopi5. Til tross for den siste tidens fremgang innen avbildning med superoppløsning, vedvarer denne grunnleggende begrensningen i alle optiske etikettfrie bilder. Alle nåværende kommersielt tilgjengelige superoppløsningsteknikker krever en slags fluorescerendemolekyler 6, noe som begrenser deres applikasjoner. I tillegg til begrensninger på grunn av behovet for spesifikke fluorescerende merkede molekyler, har eksponering for intens lysbestråling vist seg å indusere cellulær skade og kan påvirke cellulære prosesser, noe som er en stor ulempe når du studerer levende celler7.
Vår nåværende kunnskap om de ultrastrukturelle detaljene i hårcelle stereocilia bunter har blitt oppnådd for det meste med ulike elektronmikroskopi (EM) teknikker, for eksempel skanning elektronmikroskopi (SEM), overføring elektronmikroskopi (TEM), frysefraktur EM, og nylig med 3D-teknikker som seriell seksjonering med fokusert ionstråle eller kryo-EM tomografi8,9,10,11,12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 ,12, 14,15,16. Dessverre krever alle disse EM-teknikkene kjemisk eller kryofixation av prøven. Avhengig av tidsskalaen til fenomenene, gjør dette kravet en studie av de dynamiske prosessene på spissen av stereocilia enten umulig eller veldig arbeidsintensiv.
Det er gjort begrenset innsats for å avbilde hårbunter av levende hårceller med atomkraftmikroskopi (AFM)17,18. Siden AFM opererer i fysiologiske løsninger, kan det i teorien visualisere dynamiske endringer i stereociliabuntene av levende hårceller over tid. Problemet ligger i prinsippene for høyoppløselig AFM, noe som innebærer viss fysisk kontakt mellom AFM-sonden og prøven, selv i den minst skadelige "tapping"-modusen 19. Når AFM-sonden møter et stereocilium, krasjer den vanligvis mot den og skader strukturen til hårbunten. Som et resultat er denne teknikken ikke egnet for visualisering av levende, eller til og med faste, hårceller bunter17,18. Problemet kan delvis lindres ved å bruke en stor ballformet AFM-sonde som bare pålegger hydrodynamiske krefter til overflaten avprøven 20. Men selv om en slik sonde er ideelt egnet til å teste mekaniske egenskaper tilprøven 21, gir den bare en submikrometeroppløsning når du forestiller deg organet til Corti22 og gjelder fortsatt prøven en kraft som kan være betydelig for de svært følsomme stereociliabuntene.
Skanning av ionledningsmikroskopi (SICM) er en versjon av skanningssondemikroskopi som bruker en glasspipetteprobe fylt med en ledende løsning23. SICM oppdager overflaten når pipetten nærmer seg cellen og den elektriske strømmen gjennom pipetten minker. Siden dette skjer i god tid før du berører cellen, er SICM ideell for ikke-kontaktavbildning av levende celler i fysiologisk løsning24. Den beste oppløsningen av SICM er i rekkefølge av enkle nanometer, noe som gjør det mulig å løse individuelle proteinkomplekser ved plasmamembranen til en levende celle25. Men i likhet med andre skannesondeteknikker, kan SICM bare avbilde relativt flate overflater. Vi overvant denne begrensningen ved å oppfinne mikroskop for hoppingssondeledningsmikroskop (HPICM)26, der nanopipetten nærmer seg prøven ved hvert bildepunkt (figur 1A). Ved hjelp av HPICM kunne vi avbilde stereociliabunter i levende auditive hårceller med nanoskalaoppløsning27.
En annen grunnleggende fordel med denne teknikken er at HPICM ikke bare er et bildeverktøy. I motsetning til andre skannesondeteknikker er HPICM/SICM-sonden en elektrode som er mye brukt i cellefysiologi for elektriske opptak og lokal levering av ulike stimuli. Ionkanalaktivitet forstyrrer vanligvis ikke HPICM-avbildning, fordi den totale strømmen gjennom HPICM-sonden er flere størrelsesordener større enn den ekstracellulære strømmen som genereres av de største ionkanalene25. HPICM tillater imidlertid presis posisjonering av nanopipetten over en struktur av interesse og påfølgende enkanals patch-clamp-opptak fra denne strukturen28. Slik fikk vi de første foreløpige opptakene av enkanalsaktivitet på spissene til den ytre hårcellen stereocilia29. Det er verdt å nevne at selv en stor strøm gjennom nanopipetten ikke kan produsere betydelige endringer av potensialet over plasmamembranen på grunn av enorm elektrisk shunt av det ekstracellulære mediet. Imidlertid kan individuelle ionkanaler aktiveres mekanisk ved flyt av væske gjennom nanopipetten30 eller kjemisk ved lokal påføring av en agonist31.
I HPICM genereres bildet når en nanopipette nærmer seg prøven sekvensielt på et tidspunkt, trekker seg tilbake og deretter beveger seg i sideretningen for å gjenta tilnærmingen (Figur 1A). En patchklemmeforsterker bruker hele tiden spenning på en AgCl-ledning i pipetten (figur 1B) for å generere en strøm på ~ 1 nA i badeløsningen. Verdien av denne strømmen når pipetten er borte fra overflaten av cellen, bestemmes som en referansestrøm (Iref, Figur 1C). Deretter beveger pipetten seg i Z-aksen for å nærme seg prøven til strømmen reduseres med en mengde som er forhåndsdefinert av brukeren (setpoint), vanligvis 0,2%-1% av Iref (Figur 1C, toppsporing). Systemet lagrer deretter Z-verdien for øyeblikket som høyden på prøven, sammen med X- og Y-koordinater for dette bildepunktet. Deretter trekkes pipetten bort fra overflaten (Figur 1C, bunnspor) med en hastighet definert av brukeren, vanligvis 700-900 nm/ms. Etter tilbaketrekning flyttes pipetten (eller i vårt tilfelle prøven - se figur 1B) sidelengs til neste bildepunkt, en ny referansestrømverdi oppnås, og pipetten nærmer seg igjen prøven, og gjentar prosessen. X-Y-bevegelsen til pipetten foretrekkes i et oppreist mikroskopoppsett som vanligvis brukes til opptak av hårcellemekanotransduksjonsstrømmene. I denne innstillingen nærmer HPICM-sonden seg hårcellebuntene ikke fra toppen, men i en vinkel32. Den beste oppløsningen av HPICM-avbildning oppnås imidlertid i et invertert mikroskopoppsett (Figur 1A,B), der bevegelsen av prøven i X-Y-retninger kobles fra Z-bevegelsen til nanopipetten, og dermed eliminerer potensielle mekaniske gjenstander.
Ved hjelp av HPICM fikk vi topografiske bilder av mus og rotte indre og ytre hårcelle stereocilia bunter, og til og med visualisert koblingene mellom stereocilia som er ca 5 nm i diameter26,27. Suksessen til hårcellebuntavbildning med denne teknikken er avhengig av flere faktorer. For det første bør støyen (variansen) til nanopipettestrømmen være så liten som mulig for å tillate lavest mulig settpunkt for HPICM-avbildning. Et lavt settpunkt gjør det mulig for HPICM-sonde å "føle" stereocilia-overflate i større avstand og i alle vinkler mot probetilnærmingen, og forbedrer overraskende X-Y-oppløsningen til HPICM-avbildning (se Diskusjon). For det andre bør vibrasjonene og driften i systemet reduseres til mindre enn 10 nm, siden de bidrar direkte til bildeartefaktene. Til slutt, selv om HPICM-sonden og prøvetrinnet flyttes i Z- og X-Y-akser av de kalibrerte feedback-kontrollerte piezo-aktuatorene som har en nøyaktighet på et enkelt nanometer eller bedre, bestemmer diameteren på nanopipettespissen spredningen av strømmen (sensorvolum) og dermed oppløsningen (Figur 1A). Derfor, før du forestiller levende hårceller, er det viktig å trekke de tilstrekkelige pipettene, nå ønsket oppløsning med kalibreringsprøver og oppnå lav støy i opptakssystemet.
I minst et par tiår har SICM-teknikken ikke vært kommersielt tilgjengelig, og den har utviklet seg av bare få laboratorier i verden med det ledende laboratoriet til Prof. Korchev i Imperial College (UK). Nylig ble flere SICM-systemer kommersielt tilgjengelige (se Tabell over materialer), som alle er basert på de opprinnelige HPICM-prinsippene. Imidlertid krever avbildning av stereociliabunter i hårcellene flere tilpassede modifikasjoner som er teknisk utfordrende (eller til og med umulige) i de lukkede "klare" systemene. Derfor er det nødvendig med litt komponentintegrasjon. Siden HPICM-oppsettet representerer en patchklemmerigg med strengere vibrasjons- og driftkrav og en piezodrevet bevegelse av HPICM-sonden og prøven (figur 1D), er denne integrasjonen relativt enkel for enhver forsker, som er dyktig i patchklemming. Imidlertid vil en forsker uten riktig bakgrunn definitivt trenge litt trening i elektrofysiologi først. Til tross for gjenværende utfordringer som å øke hastigheten på avbildning (se Diskusjon), har vi vært i stand til å bilde stereocilia bunter i levende hårceller med nanoskala oppløsning uten å skade dem.
Dette dokumentet presenterer en detaljert protokoll for å utføre vellykket HPICM-avbildning av levende auditive hårcellebunter i unge postnatal rotte- eller muskochleaut utviser ved hjelp av vårt tilpassede system. De integrerte komponentene er oppført i Materialliste. Avisen beskriver også vanlige problemer som kan oppstå, og hvordan du feilsøker dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien ble utført i samsvar med anbefalingene i Veiledningen for pleie og bruk av laboratoriedyr ved National Institutes of Health. Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Kentucky (protokoll 00903M2005).
1. Produksjon og testing av nanopipetter
- Lag et program i mikropipettetrekkeren for å oppnå pipetter med motstand mellom 200 og 400 MΩ, som tilsvarer indre spissdiametre på ca. 50-70 nm. Parametrene vil avhenge av mikropipettetrekkeren. For å få korte pipetter med ikke-fleksible fine spisser, sjekk i bruksanvisningen til pulleren.
- Bruk borosilikatglass kapillærer med ytre / indre diametre på 1/0,58 mm og en indre filament for å lette fylling. Lengden på pipetten er avgjørende fordi den bestemmer frekvensen av pipettens laterale mekaniske resonans. Jo lenger pipetten er, jo lavere er resonansfrekvensen, og jo vanskeligere er å unngå denne resonansen.
MERK: Brukeren bør prøve å produsere den korteste pipetten holderen kan godta. Lengden på nanopipetter i dette eksperimentet er vanligvis 15-25 mm (Figur 2A). - Fyll nanopipetten opp til midtpunktet (Figur 2A) med en badeløsning, enten Leibovitz L-15 eller med Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) supplert med 20 mM D-glukose (for å justere osmolariteten). For å unngå potensielle gjenstander, bruk den samme løsningen som skal brukes i badekaret til opptak.
- Bruk et optisk mikroskop med en forstørrelse på 10x, se etter bobler på tuppen av pipetten (Figur 2B). Boblene vil forhindre gjeldende strømning. Det er vanskeligere å fjerne bobler i pipettene som er trukket flere timer før eksperimentet. Derfor anbefales det å trekke nye pipetter med hvert eksperiment.
- Når pipetten er fri for bobler, monterer du den i HPICM pipetteholderen (Figur 2C).
- Plasser prøven (vevs- eller kalibreringsstandard) på det spesialbygde kammeret og tilsett 4 ml av den ovennevnte badeløsningen.
- Plasser det spesialbygde kammeret på HPICM-scenen og introduser jordelektroden i løsningen.
- Kontroller at spenningen som påføres pipetten av patchklemmeforsterkeren er null.
- Flytt pipetten i Z til den berører væsken.
- Sett forsterkerforskyvningen til null, og legg deretter til +100 mV for å kontrollere pipettestrømmen.
- Beregn motstanden og diameteren på pipetten, basert på Ohms lov:
R = V/I
der R er motstanden (MOhm), V er spenningen som påføres nanopipetten (mV) og jeg er strømmen som strømmer gjennom nanopipetten (nA).- Beregn pipettens indre diameter som beskrevet andre steder i henhold til følgende formel12:
ID-tips = 1000/ √R
MERK: Den ideelle motstandsverdien er mellom 200 og 400 MΩ. Pipetter med en motstand høyere enn 400 MΩ kan føre til en ustabil strøm på grunn av deres lille størrelse (< 50 nm indre diameter). Tvert imot er pipetter med motstand mindre enn 200 MΩ for store (> 70 nm indre diameter) og vil ikke løse små funksjoner. Det anbefales å begynne å forestille seg med pipettene på 200 MΩ motstand, da de er lettere å produsere og har en tendens til å gi mindre elektrisk støy.
- Beregn pipettens indre diameter som beskrevet andre steder i henhold til følgende formel12:
2. Minimere prøvedrift og vibrasjoner
MERK: For å redusere den mekaniske støyen i systemet under bildebehandling, monter prøvene på de spesialbygde kamrene som bruker tykke glasssklier (~1,2 mm):
- Fjern glassdelen av en 50 mm glassbunnsfat, slik at plastveggene er intakte.
- Lim plastdelen av cellekulturretten på toppen av den tykke glasssklie med silisiumlim.
- Monter kalibreringsprøven midt i kammeret (på toppen av glasssklie) ved hjelp av enten silisiumlim eller tynt dobbeltsidig tape.
- Fest kammeret godt fast på HPICM-scenen ved hjelp av dobbeltsidig tape.
- Under bildebehandling lukker du Faraday-buret og dekker det med et teppe for å minimere elektrisk interferens og termisk drift, tilsvarende.
3.Teste oppløsningen med AFM-kalibreringsstandarder
MERK: Det anbefales på det sterkeste å bilde AFM-standarder (se Materialtabell) før du ser på levende celler for å feilsøke systemet og teste oppløsningen i X-Z-Y-aksene. Kalibreringsstandardene har silisiumdioksidstolper og hull i forskjellige former, men faste høyder/dybder (dvs. 20 eller 100 nm) på en silisiumbrikke på 5 x 5 mm. Fra og med 100 nm kalibreringsstandarden anbefales det å garantere at Z-oppløsningen er under 100 nm. Etter å ha oppnådd et vellykket høyoppløselig bilde av søylene eller hullene i denne kalibreringsprøven (figur 3A), flytt til 20 nm-standarden. Hvis avbildningen av sistnevnte standard er vellykket (Figur 3B), vil oppløsningen i Z-aksen garantert være under 20 nm og egnet for avbildning av hårcellestereociliabuntene12. Følgende trinn brukes til å bilde begge kalibreringsstandardene.
- Fest kalibreringsstandarden til kammeret med silisiumlim.
- Tilsett 4 ml HBSS i kammeret for å dekke kalibreringsprøven. Fest deretter kammeret til XY-trinnet i HPICM-oppsettet ved hjelp av dobbeltsidig tape.
- Klem den magnetiske holderen til jordelektroden til scenen i nærheten av kammeret og senk elektroden ned i badeløsningen (Figur 1B).
- Monter nanopipetten i holderen, senk den ned i badeløsningen, og sett strømmen til ~1 nA ved å følge trinnene som er beskrevet i avsnitt 1.
- Plasser nanopipetten omtrent over midten av kalibreringsstandarden ved hjelp av en kurs patch-clamp manipulator. Visuell inspeksjon er vanligvis nok for denne posisjoneringen, siden området dekket av silisiumdioksidstrukturer er relativt stort (1 x 1 mm). I motsetning til organet til Corti-utvisning (se nedenfor), er kalibreringsstandarden ikke-gjennomsiktig, og derfor er en mer presis posisjonering styrt av optisk avbildning ikke mulig for denne prøven.
- Øk settpunktet mens du overvåker signalet fra sensoren til Z piezo-aktuatoren på et oscilloskop i sanntid. Når du har etablert en stabil repeterbar Z-tilnærmingssyklus (som i figur 1C, nederst), reduserer du settpunktet til verdien som er like over ustabilitetspunktet. Denne prosedyren vil sikre det optimale settet for denne spesielle nanopipetten.
- Flytt pipetten ned med en hastighet på ~ 5 μm / s med en patchklemmemikromanipulator til den når prøven. For øyeblikket vil det nederste nivået av sanntids Z-posisjoneringssignalet (figur 1C) øke, noe som indikerer at nanopipetten trekkes tilbake på grunn av "sensing" prøveoverflaten. Videre bevegelse av nanopipetten vil resultere i ytterligere positivt skifte av Z-posisjoneringssignal.
MERK: Pass på at du ikke overskrider den øvre grensen for Z piezo-aktuatorbevegelse. - Start bildebehandling med lav oppløsning (se tabell 1). På grunn av ujevn montering av AFM-standarden kan det høyeste punktet i interesseområdet være ukjent. Sett derfor amplituden for pipettetrekk (hop amplitude) til minst 200-500 nm.
- Når det høyeste punktet i prøven i bildeområdet er identifisert, reduserer du humleamplituden. En mindre humleamplitude gir raskere skanning, som foretrekkes for høyoppløselig bildebehandling på grunn av reduserte effekter av driften og redusert vibrasjon.
- Før du flytter pipetten til et nytt X-Y-sted, må du trekke den tilbake ca. 200 μm i Z-aksen for å forhindre uønskede kollisjoner med prøven.
MERK: I tilfeller der nanopipetten ikke er på linje med midten av kalibreringsstandarden, er det mulig at skanningen starter like utenfor overflateområdet. - Når interesseområdet er funnet, begynner du å se høyere oppløsning (se tabell 1).
4. Lage spesialbygde kamre for å sikre cochleaut-utvisningene
MERK: Monter cochleautene i kamrene med spesialbygde klemmesystemer som bruker enten fleksible glasspipetter (trinn 4.1) (figur 4A) eller tanntråd (trinn 4.2) (Figur 4B). Glasspipettekammeret kan steriliseres og brukes til de kultiverte organene i Corti, mens tanntrådkammeret gir en sikrere oppbevaring av prøven og en kontroll over stereociliabuntens orientering under montering. Disse spesialbygde kamrene må klargjøres på forhånd, men de kan rengjøres og brukes på nytt i flere bildebehandlingsøkter.
- Lag et kammer ved hjelp av fleksible glasspipetter
- Trekk to tynne og fleksible glassfibre fra glasskapillærer ved hjelp av en pipettetrekker. Våre trukket glassfibre måler vanligvis 1 til 2 cm i lengde og er ganske fleksible.
- Legg en liten dråpe silikonelastomer på toppen av en glassdekslelip. Bruk deksler på 2 cm i diameter.
- Plasser endene av to glassfibre på silikondråpen og ordne fibrene for å ha en liten grad av separasjon mellom dem (Figur 4A).
- Plasser dekslene på en varm plate for raskt å herde elastomeren (1 til 3 min).
- Fest dekslene på glassbunnen på kammeret som er beskrevet i avsnitt 2, ved hjelp av en liten mengde silikonelastomer og la den herdes over natten.
- Å lage et kammer ved hjelp av tanntråd:
- Fjern glassdelen av en 50 mm glassbunnsfat, slik at plastveggene er intakte. Lim deretter plastdelen av cellekulturretten på toppen av en 1,2 mm tykk glasssklie med silisiumlim.
- Monter ett plastdeksle (6,5 x 6,5 mm) med samme lim til midten av kammeret. Gjenta deretter prosessen med en annen coverlip på toppen av den forrige.
- Monter to små wolfram- eller gullbelagte ledninger (12 mm lengde og ~ 0,5 mm i diameter) med silisiumlim, hver på motsatte sider av dekselsklier. Lim dem langt nok (> 10-15 mm) fra deksellysbildene (Figur 4B).
- Skill to tanntrådstrenger og legg dem på toppen av dekselsklier og fest dem til ledningene ved å lage en knute. La det være et lite mellomrom mellom begge trådene (Figur 4B, korte piler).
- Rengjør kamrene etter hver bruk
- Fjern forsiktig vevet fra kammeret ved hjelp av fine pinsett og skrap lett eventuelle vevrester som er igjen.
- Skyll kammeret først med 70% etanol og deretter med destillert vann.
- Gjenta skyllesyklusen om nødvendig.
- Plasser kammeret opp ned på et filterpapir for å la det tørke til neste eksperiment. Kamrene trenger ikke å steriliseres, med mindre dyrking av Cortis organ er planlagt etter avbildningen.
5. Dissekere gnagerorganet i Corti
- Utfør disseksjon av de unge postnatale cochlea explants som beskrevet i detalj andre steder13.
- For HPICM-avbildning dissekerer du Cortis organ fra mus mellom postnatal dag 3 og 6 (P3-6), og fra rotter mellom barseldager 3 og 8 (P3-8).
MERK: Eldre hårceller er mer utsatt for skaden under disseksjonen, og kan derfor ikke brukes i timelange perioder med HPICM-avbildning. - Ikke glem å fjerne tectorialmembranen før HPICM-avbildning.
- Umiddelbart etter disseksjonen fester du vevet i et av kamrene som er beskrevet i avsnitt 4, enten ved å plassere det under de fleksible glasspipettene eller under de to tanntrådstrengene (figur 4). Fyll disse kamrene med 4 ml av romtemperaturbadløsningen (for å minimere bobledannelse).
6. Bildebehandling av de hørbare hårcellene
- Monter kammeret med et nyisolert organ av Corti på X-Y piezo-scenen ved hjelp av dobbeltsidig tape og sørg for at det er godt festet for å minimere kammerdrift i X- og Y-akser (Figur 1B).
- Følg trinnene i avsnitt 1 for å plassere en ny nanopipette og se etter riktig pipettemotstand.
- Bruk patch clamp micromanipulator, plasser nanopipette over hårcelleområdet, mens du observerer organet til Corti utviser i et invertert mikroskop.
- Sjekk om systemet er stabilt med et settpunkt på 0,5% eller lavere ved å registrere sanntidsstrøm og Z-posisjoneringssignal på oscilloskopet (som i figur 1C). Hvis Z-signalet ikke er stabilt, kan du prøve å redusere avskjæringsfrekvensen til lavpassfilteret til patchklemmeforsterkeren. Det kan imidlertid ikke være lavere enn responstiden til Z piezo-aktuatoren (for å unngå pipettekollisjon med prøven på grunn av forsinkede strømavlesninger).
MERK: I praksis er 5 kHz-innstillingen til dette filteret funnet å være optimal. Det er bedre å erstatte nanopipetten, hvis Z-signalet fortsatt er ustabilt. - Når en stabil registrering er oppnådd, bestem det optimale settet og nærme prøven med HPICM pipette som beskrevet i trinn 3.6-3.7 ovenfor.
- Først utfører du bildebehandling med lav oppløsning (se tabell 1), ved hjelp av en hoppamplitude på minst 6 til 8 μm. For å se høye strukturer som hårcelle stereocilia bunter, sørg for at hop amplitude er nok til å unngå kollisjon med disse strukturene.
MERK: Hvis humleamplituden ikke er nok, vil pipetten ikke kunne hoppe over et stereocilium, og det vil være en overhengende kollisjon. Kollisjonen av HPICM-sonden med stereocilium kan skade hårbunten. Derfor, i tilfeller der høyden på stereociliabunten er usikker, bruk en større hop amplitude. - Bli kjent med topografien i Corti-organet ved først å utføre og/eller studere bilder oppnådd med skanning av elektronmikroskopi (figur 5).
MERK: Hvis HPICM-bildet er ensartet med høydene mindre enn 1 μm i hvert bildepunkt, skanner pipetten sannsynligvis glassbunnen og ikke vevet. Alternativt kan pipetten "lande" på en annen region av cochleaut utvise, vekk fra hårcellene. - Hvis pipetten må flyttes til et nytt X-Y-sted, trekker du den tilbake ca. 500 nm for å unngå kollisjoner med høye egenskaper i vevet. Gjenta HPICM-bildebehandling med lav oppløsning til området av interesse med hårcellene er funnet.
- Når interesseområdet er funnet, begynner du å forestille deg med en høyere oppløsning (se tabell 1). Prøv å bruke mindre enn 15 min når du ser på en hel hårbunt.
MERK: Hårcellebuntene i det levende vevet er ikke stille, men kan endre retning, for eksempel på grunn av formendringer i de underliggende støttecellene. Bildene kan derfor vise bevegelsesartefakter hvis bildeinnhentingen er for treg. - Igjen, bestem de høyeste funksjonene i bildene med lav oppløsning før du reduserer hoppamplituden for høyoppløselig bildebehandling. For en interesseregion som dekker hele hårcellebunten, reduser humleamplituden til 4-5 μm, mens for et relativt lite og "flatt" område i bunten (f.eks. 2 x 2 μm) reduserer humleamplituden ytterligere, ned til mindre enn 1 μm, og dermed øker hastigheten og oppløsningen til avbildning.
7. Bildebehandling
MERK: Bildeartefakter er vanlige ved HPICM-avbildning. Noen av dem kan korrigeres av bildeinnsamlingsparametere, mens andre krever etterbehandling enten med en spesialisert SICM-seer eller med mer generelle databehandlingsprogrammer som ImageJ eller MatLab. Her beskriver vi de vanligste gjenstandene og hvordan vi fikser dem med SICM-visning.
- Utfør korrigering av helling
MERK: Det er ikke åpenbart for en nybegynner, men menneskelig øye kan ikke løse undermikrometerstørrelsesfunksjoner på overflaten av en celle, hvis bildeområdet har en samlet helling av samme eller større størrelse (Figur 3A,B, venstre). Derfor er det nødvendig å bestemme gjennomsnittlig helling av et avbildet område (ved å tilpasse HPICM 3D-bildedata til et enkelt plan) og trekke det fra HPICM-bildet (Figur 3A,B, midten).- Klikk Åpne for å åpne et bilde med SICM-visningsprogram.
- Velg kategorien Bildekorrigering .
- Velg kategorien Riktig helling .
- Trykk på riktig hellingsknapp for en automatisk hellingskorrigering.
- Utføre linjejustering
MERK: Som nevnt tidligere representerer mekaniske og/eller termiske drifter samt cellebevegelsesartefakter et betydelig problem ved HPICM-avbildning. En liten drift med en hastighet på mindre enn et mikrometer per minutt er vanligvis ikke merkbar i et vanlig patchklemmeoppsett. Likevel kan det produsere gjenstander av flere titalls nanometer i HPICM-avbildning, som er betydelig større enn oppløsningen til HPICM. Derfor er det ikke uvanlig å støte på plutselige hopp i Z-aksen mellom to nærliggende HPICM-skannelinjer under bildebehandling. Dette kan korrigeres ved å analysere forskjeller mellom å starte (og/eller avslutte) Z-verdier i disse nærliggende skannelinjene.- Klikk Åpne for å åpne et bilde med SICM-visningsprogram.
- Velg kategorien Bildekorrigering .
- Velg kategorien Riktig helling .
- Velg bredden på linjene som skal justeres. Trykk på knappen ButtonDestripeLineFit for en automatisk linjejusteringskorrigering.
- Utfør støyreduksjon
MERK: Mens du skaffer bilder med HPICM, kan små svingninger i nanopipettestrømmen føre til at nanopipetten stopper langt fra overflaten av prøven, spesielt med lave settpunkter. Det resulterer i utseendet på små hvite prikker i bildet. For å korrigere denne bildeartefakten, er det nødvendig å identifisere bildepunktene med Z-verdien betydelig større enn naboenes og erstatte denne verdien med et gjennomsnitt av naboene. Dette gjøres med et justerbart medianfilter.- Klikk Åpne for å åpne et bilde med SICM-visningsprogram.
- Velg kategorien Bildebehandling .
- Velg kategorien Støyreduksjon .
- Angi terskelfilteret (μm) for bildepunktene som skal fjernes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen som presenteres i dette dokumentet, kan brukes til å visualisere alle levende celler med kompleks topografi. Ved å følge disse trinnene får vi rutinemessig bilder av levende rotte auditive hårcellebunter (Figur 6B,D). Til tross for lavere X-Y-oppløsning sammenlignet med SEM-bilder, kan HPICM-bildene våre løse de forskjellige radene med stereocilia, formen på stereociliaspissene og til og med de små koblingene (~ 5 nm i diameter) som forbinder tilstøtende stereocilia (Figur 6F). I tillegg har HPICM-bilder informasjon i 3D som SEM-bilder mangler. Gitt den ikke-kontaktiske karakteren av denne typen bildeteknikk, var vi også i stand til å utføre kontinuerlig tidsforløp HPICM-avbildning av samme hårcellebunt i flere timer (dvs. 5-6 timer regelmessig) uten å skade buntens sammenheng (figur 7). Dermed viser HPICM et stort potensial for studiet av dynamiske strukturelle endringer av hårcellebuntene over tid.
Selv om vi tilbyr flere områder for pipettestørrelse, nåværende settpunkt, parametere med lav og høy oppløsning og hop-amplituder, kan det hende hver bruker må optimalisere innstillingene sine litt for å få vellykkede HPICM-bilder av live hårcellebunter. Mindre settpunkter gir bilder av bedre kvalitet. Men med et svært lavt settpunkt kan systemet tolke små svingninger i strømmen som å møte celleoverflaten, og dette vil føre til "hvit prikk" -støyen i bildet (Figur 8A). På samme måte kan store humleamplituder øke pipettens laterale resonans og også produsere støyende piksler (figur 8B). Hvis hop-amplituden derimot er for liten eller settpunktet er for høyt, kan nanopipetten kollidere med prøven og føre til bildeartefakter eller til og med skade hårbunten (Figur 8C, D). Vi anbefaler at du utfører bildet med lavere oppløsning mens du finjusterer alle disse parametrene for å minimere skade på prøven eller nanopipetten.
Figur 1: Prinsipper for mikroskopi for hoppingssondeledning (HPICM). (A) En elektrisk strøm som passerer gjennom nanopipetten genererer et "sensorvolum" på spissen av pipetten. For å avbilde komplekse strukturer som hårcellestereociliabuntene, nærmer pipetten seg mot celleoverflaten ovenfra og trekker seg tilbake etter å ha oppdaget overflaten. Etter et sideveis trekk på hvert trinn fortsetter pipetten å "hoppe" over prøven som genererer bildet av cellen. Legg merke til at humleamplituden må være tilstrekkelig til at pipetten kan "klatre" til et stereocilium. Illustrert hop-amplitude vil fungere for venstre-mot-høyre-skanning (fra minste til et høyeste stereocilium, indikert med en pil). Den er imidlertid for liten til høyre-mot-venstre-skanning når pipetten først møter det høyeste stereociliumet. (B) Eksperimentelt oppsett. Et skreddersydd kammer med organet Corti explant er montert på et XY nanopositioning stadium med en blenderåpning for optisk mikroskopiobservasjon. Nanopipetten flyttes av en separat ultrarask Z piezo-aktuator. For å plassere nanopipetten over interesseområdet, er Z-aktuatoren montert på en konvensjonell mikromanipulator (ikke vist) sammen med patchklemmeforsterkerhodestet . Jordelektroden er montert på en magnetisk holder og satt inn i badekaret. (C) Representative opptak av pipettestrømmen (toppsporing) og Z-posisjonen til pipetten (bunnsporing) under avbildning. Når pipetten er borte fra celleoverflaten, bestemmes referanseverdien til strømmen som passerer gjennom pipetten (Iref). Deretter flyttes pipetten mot prøven (tilnærming). Når "sensing volume" møter celleoverflaten, begynner pipettestrømmen å avta. Kommandoen for uttak utstedes når den nåværende reduksjonen når et settpunkt, som vanligvis er 0,2% - 1% av jegref. (D) Skjemaer av utstyret som må legges til et konvensjonelt patchklemmeoppsett for HPICM-avbildning. En dedikert patchklemmeforsterker registrerer nanopipettestrømmen (I) som brukes av SICM-kontrolleren i HPICM-modus for å generere kommandosignaler til X-, Y-og Z-akser. Instrumenteringsforsterker gir om nødvendig offset-, skalerings- og lavpassfiltrering til disse signalene. Dessverre kan ikke X/Y/Z-signaler fra kontrolleren påføres direkte på piezo-aktuatorene på grunn av store feil forårsaket av hysterese og krypende som er iboende i piezo keramikk. Derfor har hver piezo-aktuator (oversettelsesstadium) en innebygd bevegelsessensor som sender tilbakemeldingssignal til den proporsjonale integrerte derivatkontrolleren (PID) som forhåndsfigurerer kommandosignalet for å korrigere for disse feilene. Vær oppmerksom på at relativt langsomme X- og Y-akser kan bruke PID-kontrollere som er bygget i piezo-forsterkeren, mens en raskere Z-akse krever en dedikert rask PID-kontroller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Nanopipette fabrikasjon og fylling. (A) En ca. 2 cm lang nanopipette fylt med intrapipetteoppløsningen (HBSS). (B) Et bilde av boblen (pilen) som vanligvis dannes etter at pipetten er fylt. Boblen beveger seg vanligvis bort i løpet av få minutter etter mikroskopbelysning (et digitalt LCD-mikroskop ved 10x). (C) En nanopipette montert i SICM-hodet. Pilen peker mot AgCl-elektroden inne i pipetten. Legg merke til at pipetteholderen er sølvmalt og jordet for å minimere strålings elektrisk opphenting fra Z piezo-aktuatoren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bildebehandling av AFM-kalibreringsstandarder for å bestemme tilstrekkelig stabilitet, vibrasjonsisolasjon og elektrisk støy i systemet. (A) Rå (venstre), etterbehandlede (midtre) og 3D (høyre) bilder av HS-100MG kalibreringsstandarden. Standard overflateprofilen vises skjematisk øverst. Siden standarden aldri er helt vinkelrett på nanopipetten, er det nødvendig med korrigering av skråning etter behandling for å avsløre små vertikale egenskaper i prøven. (B) Lignende rå (venstre), postbehandlede (midt) og 3D (høyre) bilder av HS-20MG kalibreringsstandarden som har mindre, 20 nm dype innrykk. Vær oppmerksom på at gråtoner på en piksel i et HPICM-bilde angir høyden på prøven på det tidspunktet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Montering av organet til Corti utviser. (A) Utløpet holdes av to glasspipetter som limes til den glassbunnede Petri-parabolen. (B) Utvisning er sikret med to tanntrådstrenger (korte piler) i et skreddersydd bildekammer. Innsett viser forstørret bilde av Cortis organ. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Navigasjon av HPICM-sonden til hårcelleområdet. (A) SEM-bilde av cochlea-utvisning som viser rader med indre (IHCer) og ytre (OHCer) hårceller og distinkte typer støtteceller. (B) Representativt HPICM-bilde av cellene i Kollikers organ. (C) Et HPICM-bilde av Hensens celler. Vær oppmerksom på at disse to typene støtteceller har svært forskjellige former, noe som bidrar til å avgjøre om HPICM-sonden landet til et område som er radialt eller perifert for hårcellene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Sammenligning mellom skanning elektronmikroskopi (SEM) og hopping sonde ion ledningsmikroskopi (HPICM) avbildning av stereocilia bunter i unge postnatal gnager indre hårceller. (A,C) SEM-bilder gir sub-nanometeroppløsning av overflatedetaljene, men i cellene som er faste og krympet på grunn av kritisk punkttørking. I tillegg tillater ikke SEM-bilder 3D-analyse. (B,D) HPICM-bilder (venstre) har en dårligere oppløsning (~ 5-10 nm), men de er oppnådd i levende celler, tillater tidsforløpavbildning og bærer informasjon om nøyaktige høyder, noe som tillater 3D-rekonstruksjon og målinger (høyre). (E,F) Ekstracellulære koblinger mellom stereocilia er tydelige i både SEM (E) og HPICM (F) bilder (piler). Celle aldre: A, postnatal dag 5 (P5) mus; B, P6 rotte; C, P8 mus; D, P5 rotte; E, P7 mus; og F, P5 rotte. I alle HPICM-bilder indikerer gråtoner på en piksel høyden på prøven på det tidspunktet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Kontinuerlig tidsforløp HPICM-avbildning av stereociliabunten. (A) En oversikt over en indre hårcellebunt fra P5-rotte som viser distinkte stereociliaer med kortere rad. (B) Tidsforløpavbildning av interesseområdet som er angitt i (A) i seks timer. Legg merke til at i motsetning til et typisk patch camp-eksperiment, viser hårcellene ingen tegn til forverring i flere timer in vitro. Dette skyldes forsiktig disseksjon og fravær av mekaniske forstyrrelser i cellen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Vanlige gjenstander under avbildning med HPICM. (A) Effekt av et for lavt settpunkt. HPICM-bilder med lav oppløsning av de samme levende indre hårcellebuntene i P3-mus ervervet med setpoint 0,05 % (venstre) og 0,07 % (høyre). Legg merke til en hvit punktstøy som forsvinner med høyere settpunkt. (B) Effekt av en for høy hoppamplitude. Hvit prikkstøy vises også i et HPICM-bilde av en P7 rotte indre hårcellebunt oppnådd med en stor humleamplitude på 5,8 μm (venstre). Denne støyen forsvinner når den samme bunten er avbildet med humleamplituden på 3,4 μm (høyre) på grunn av reduksjonen av vibrasjoner i systemet. (C) For lav hoppamplitude fører til at HPICM-sonden kolliderer med stereociliaen og drar dem (piler på venstre panel). Å øke hop-amplituden akkurat nok til å "klatre over" stereocilia eliminerer denne gjenstanden (høyre), men kan også øke bildetiden, noe som resulterer i en merkbar drift (vertikale linjer i høyre panel). Stereocilia bunt av en levende ytre hårcelle fra P7 rotte. (D) For høyt settpunkt fører til en kvadrert form av stereociliaspisser (piler) i et HPICM-bilde (venstre), igjen på grunn av kollisjon av nanopipetten til stereocilia. Avtagende settpunkt (med samtidig reduksjon av håpamplituden for å eliminere hvit støy) forbedrer bildet (høyre). Stereocilia bunt av en levende indre hårcelle fra P6 rotte. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Resolusjon | Bildeområde (μm) | Lateral oppløsning (nm) | Tid per bilde (minutter) |
| Lav | 20×20 | ≥300 | ≤20 |
| Lav | 10×10 | ≥156 | ≤15 |
| Lav | 5×5 | ≥75 | ≤4 |
| Høy | 20×20 | ≤200 | ≤20 |
| Høy | 10×10 | ≤110 | ≤15 |
| Høy | 5×5 | ≤55 | ≤4 |
Tabell 1: Typiske tider med HPICM-avbildning, avhengig av størrelsen på bildeområdet og skanneoppløsningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å oppnå vellykkede HPICM-bilder må brukerne etablere et lavt støy- og lavt vibrasjonssystem og produsere passende pipetter. Vi anbefaler på det sterkeste bruk av AFM-kalibreringsstandarder for å teste stabiliteten til systemet før du prøver å utføre live celleavbildning. Når oppløsningen av systemet er testet, kan brukerne vurdere å avbilde fast organ av Corti-prøver for å bli kjent med bildeinnstillingene før de prøver å se på levende celleavbildning.
Det optimale settet for avbildning varierer mellom forskjellige pipetter, avhengig av den individuelle formen på spissene (det er ukjent til undersøkt av elektronmikroskopi) og på mengden smuss festet til spissen, noe som også er uforutsigbart. Nanopipetter med et optimalt settpunkt høyere enn 0,7% bør kastes.
Under avbildning av levende celler øker mengden støv og rusk i den ekstracellulære løsningen over tid. Alle disse partiklene kan ende opp på spissen av pipetten, noe som forårsaker en reduksjon i strømmen og gjør det umulig å fortsette å skanne vevet - bildet blir helt hvitt siden tilbakemeldingen vil "tenke" at nanopipetten alltid er i nærheten av prøven. Hvis dette skjer, anbefales det å trekke pipetten i Z-aksen fra det området av vevet. Denne tilbaketrekningen kan fjerne "skittenhet". Hvis pipetten fortsatt er skitten, er det nødvendig å bytte pipetten og flytte til et annet område av prøven. Deretter kan brukeren fortsette å skanne vevet.
Per i dag er den viktigste begrensningen i HPICM hvor lang tid det tar å ta et bilde med høy oppløsning mens du arbeider med prøver med kompleks topografi. Avhengig av ønsket oppløsning kan bilder ta opptil en halv time eller mer. I bilder som er anskaffet i mer enn femten minutter, kan driften bli tydelig og spesifikke strukturer kan bli forskjøvet og vanskeligere å skille mellom. Dette skjer fordi levende celler stadig beveger seg eller endrer form over tid. For å visualisere molekylære hendelser og endringer i cellenes strukturer over tid, er det nødvendig med ytterligere utvikling for å optimalisere den tidsmessige oppløsningen til HPICM11.
Støyen fra nanopipettestrømmen representerer en annen begrensning fordi den setter det minimale praktisk talt oppnåelige settet. Strømmen generert av nanopipetten i løsningen demper raskt (omvendt proporsjonal med kubikkavstanden fra pipettespissen), og etablerer dermed et "sensorvolum", utover hvilket nanopipetten ikke kan "føle" overflaten. Vi har tidligere utviklet en modell av dette fenomenet og vist at den laterale oppløsningen til SICM-sonden bestemmes av tverrsnittet av dette "sensorvolumet" med celleoverflaten, som kan være ekstremt liten ved lave settpunkter25. Dette er spesielt viktig for bildebehandling av hårcellespisskoblinger som har en diameter på ~ 5 nm12,33. Ved første øyekast vil pipettene med mindre indre diameter resultere i bedre oppløsning av HPICM-avbildning. Dette gjelder faktisk for relativt store pipetter (>50 nm). Men å redusere den indre diameteren på nanopipetten under ~ 50 nm resulterer i uprofesjonelt stor økning av pipettestøyen og dermed tap av oppløsning ved lave settpunkter som er avgjørende for avbildning av stereociliabunter. Per i dag vet vi ikke hvordan vi skal løse dette problemet, og vi jobber med å finne den riktige løsningen.
Oppsummert presenterer dette dokumentet en detaljert protokoll for visualisering av stereociliabunter i levende pattedyr auditive hårceller med HPICM. De største fordelene med HPICM er: i) dens evne til å visualisere etikettfrie nanoskalastrukturer på overflaten av levende celler uten å berøre dem; og ii) å sondere funksjonen til disse strukturene med patch klemme opptak og / eller lokal nanoskala levering av mekaniske eller kjemiske stimuli. Så vidt vi vet er disse fordelene unike for HPICM. Selvfølgelig er det noen ulemper. For det første, på grunn av begrensninger på høyden på strukturene som skal avbildes, kan HPICM ikke være egnet for avbildning av ekstremt høye strukturer, for eksempel stereociliabunter av vestibulære hårceller i pattedyrets ampullae. For det andre utvikler HPICM seg fortsatt, og ytterligere forbedringer i hastigheten og oppløsningen til bildebehandling er nødvendig. Imidlertid antyder de fysiske prinsippene til HPICM og vår egen erfaring at det er mulig. Vi tror at HPICM vil gi unike data om funksjonen til individuelle proteinkomplekser på stereociliaoverflaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker prof. Yuri Korchev (Imperial College, UK) for langsiktig støtte og råd gjennom alle stadier av prosjektet. Vi takker også Drs. Pavel Novak og Andrew Shevchuk (Imperial College, UK) samt Oleg Belov (National Research Centre for Audiology, Russland) for deres hjelp med programvareutvikling. Studien ble støttet av NIDCD/NIH (R01 DC008861 og R01 DC014658 til G.I.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analog oscilloscope | B&K Precision | 2160C | Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach |
| AFM calibration standards | TED PELLA Inc | HS-100MG; HS-20MG | These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system |
| Benchtop vibration Isolator | AMETEK/TMC | Everstill K-400 | Active vibration isolation |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments (WPI) | 1B100F-4 | Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | To be added to the bath solution to adjust osmolarity |
| Digitizer | National Instruments Corporation | PCI-6221 | Multi-channel input/output digitizer |
| Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement | Standford Research Systems | SIM900, SIM960, SIM980 | Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers. |
| Faraday cage | AMETEK/TMC | Type II | Required to shield electromagnetic interference |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments (WPI) | FD5040-100 | Used as the dish for the chamber for the tissue |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14025092 | Extracellular (bath) solution |
| Instrumentation amplifier | Brownlee Precision | Model 440 | Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation |
| Laser-based micropipette puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes. |
| Lebovitz's L-15, without phenol red | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 21083027 | Extracellular (bath) solution |
| Micromanipulator | Scientifica | PatchStar | Used for "course" positioning of the Z piezo actuator |
| Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Inverted optical microscope |
| Patch amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette |
| Piezo amplifier (XY axes) | Physik Instrumente (PI) | E-500.00, E-505.00, E-509.C2A | Amplification and PID control for XY piezo translation stage |
| Piezo amplifier (Z axis) | Piezosystem jena | ENT 400 & 800 | Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA |
| Plastic Coverslips | TED PELLA Inc | 26028 | Used in the fabrication of the chambers for the tissue |
| SICM controller & software* | Ionscope, UK (ionscope.com) | N/A | Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd |
| Silicone elastomer (Sylgard) | World Precision Instruments (WPI) | SYLG184 | Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue |
| Silicon glue | The Dow Chemical Company | 734 | Used to glue the different parts of the chamber for the tissue |
| Tungsten rod | A-M Systems | 717500 | Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue |
| XY piezo nanopositioner | Physik Instrumente (PI) | P-733.2DD | XY translation stage with capacitive sensors |
| Z piezo nanopositioner | Piezosystem jena | RA 12/24 SG | Ring piezoactuator with a strain gage sensor |
| *Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems: NX12-Bio and NX10 SICM, | |||
| Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original | |||
| HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically | |||
| challenging (or even impossible) in the closed “ready-to-go” systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one | |||
| modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration. |
References
- Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
- Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).
- Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer. The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).
- Engström, H., Engström, B. Structure of the hairs on cochlear sensory cells. Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction. Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).
- Furness, D. N., Hackney, C. M. Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea. Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).
- Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog’s internal ear. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).
- Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea. The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).
- Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. High-resolution structure of hair-cell tip links. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).
- Vélez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells. eLife. 6, 1-22 (2017).
- Ivanchenko, M. V., et al. Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles. Scientific Data. 7 (1), 182 (2020).
- Hadi, S., Alexander, A. J., Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles. Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).
- Metlagel, Z., et al. Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia. Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).
- Langer, M. G., et al. Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy. Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).
- Dufrêne, Y. F. Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy. Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).
- Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy. Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).
- Gavara, N., Chadwick, R. S. Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy. Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).
- Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy. Nature Communications. 8 (1), 1030 (2017).
- Katsuno, T., et al. TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing. JCI Insight. 4 (12), (2019).
- Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. The scanning ion-conductance microscope. Science. 243 (4891), 641-643 (1989).
- Korchev, Y. E., et al. Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells. Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).
- Shevchuk, A. I., et al. Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy. Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).
- Novak, P., et al. Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy. Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).
- Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy. Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).
- Gu, Y., et al. High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function. FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).
- Frolenkov, G. I., et al. Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe. Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).
- Sánchez, D., et al. Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette. Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).
- Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell. Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).
- Shevchuk, A., et al. Angular approach scanning ion conductance microscopy. Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).
- Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium. Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).
