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Neuroscience

लाइव स्तनधारी श्रवण बाल कोशिकाओं में नैनोस्केल संकल्प के साथ स्टीरियोसिलिया बंडल इमेजिंग

Published: January 21, 2021 doi: 10.3791/62104
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Department of Physiology, College of Medicine, University of Kentucky, 2Universidad Nacional de Colombia

Summary

यहां हम Hopping प्रोब आयन कंडक्टेंस माइक्रोस्कोपी (HPICM), एक गैर संपर्क स्कैनिंग जांच तकनीक है कि लाइव श्रवण बाल कोशिकाओं में स्टीरियोसिलिया बंडलों के नैनोस्केल इमेजिंग की अनुमति देता है के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।

Abstract

इनर इयर हेयर सेल्स ध्वनि-प्रेरित विस्थापन का पता लगाते हैं और इन उत्तेजनाओं को बालों के बंडल में विद्युत संकेतों में स्थानांतरित करते हैं जिसमें स्टीरियोसिलिया होता है जो बढ़ती ऊंचाई की पंक्तियों में व्यवस्थित होते हैं। जब स्टीरियोसिलिया को विक्षेपित किया जाता है, तो वे छोटे (~ 5 एनएम व्यास में) एक्स्ट्रासेलुलर टिप लिंक पर स्टरेसिलिया को जोड़ने के लिए मिलते हैं, जो मशीनोसेटिव ट्रांसडक्शन चैनलों को बलों को व्यक्त करते हैं। यद्यपि दशकों से जीवित बाल कोशिकाओं में मेकानोट्रांसडक्शन का अध्ययन किया गया है, लेकिन स्टीरियोसिलिया (जैसे टिप लिंक गतिशीलता या ट्रांसडक्शन-निर्भर स्टीरियोसिलिया रीमॉडलिंग) के सुझावों पर मेकानोट्रांसडक्शन मशीनरी के कार्यात्मक रूप से महत्वपूर्ण अल्ट्रास्ट्रक्चरल विवरण का अध्ययन अभी भी केवल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ मृत कोशिकाओं में किया जा सकता है। सैद्धांतिक रूप से, स्कैनिंग जांच तकनीकों, जैसे परमाणु बल माइक्रोस्कोपी, स्टीरियोसिलिया की सतह की कल्पना करने के लिए पर्याप्त संकल्प है । हालांकि, इमेजिंग मोड से स्वतंत्र, यहां तक कि स्टीरियोसिलिया बंडल के साथ परमाणु बल माइक्रोस्कोपी जांच का जरा सा संपर्क आमतौर पर बंडल को नुकसान पहुंचाता है। यहां हम लाइव कृंतक श्रवण बाल कोशिकाओं की हॉपिंग प्रोब आयन कंडक्शन माइक्रोस्कोपी (एचपीआईसीएम) इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह गैर-संपर्क स्कैनिंग जांच तकनीक एक जटिल स्थलाकृति के साथ जीवित कोशिकाओं की सतह की समय चूक इमेजिंग की अनुमति देती है, जैसे बाल कोशिकाएं, एकल नैनोमीटर संकल्प के साथ और नमूने के साथ शारीरिक संपर्क बनाए बिना। HPICM पिपेट के करीब आसपास सेल की सतह का पता लगाने के लिए ग्लास नैनोपिपेट से गुजरने वाले विद्युत प्रवाह का उपयोग करता है, जबकि एक 3डी-पोजिशनिंग पीजोइलेक्ट्रिक सिस्टम सतह को स्कैन करता है और इसकी छवि उत्पन्न करता है। HPICM के साथ, हम स्टीरियोसिलिया बंडलों और लिंक को ध्यान देने योग्य क्षति के बिना कई घंटों के लिए लाइव श्रवण बाल कोशिकाओं में स्टीरियोसिलिया को जोड़ने के लिए छवि करने में सक्षम थे। हम आशा करते हैं कि एचपीआईसीएम का उपयोग उनके कार्य की बेहतर समझ के लिए जीवित बाल कोशिकाओं के स्टीरियोसिलिया में अल्ट्रास्ट्रक्चरल परिवर्तनों की सीधी खोज की अनुमति देगा।

Introduction

इस तथ्य के बावजूद कि श्रवण बाल कोशिकाओं में स्टीरियोसिलिया बंडल ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना करने और पैच क्लैंप प्रयोग में जीवित कोशिकाओं में विक्षेपित होने के लिए काफी बड़े हैं, टिप लिंक जैसे ट्रांसडक्शन मशीनरी के आवश्यक संरचनात्मक घटकों को केवल मृत कोशिकाओं में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ इमेज किया जा सकता है। स्तनधारी श्रवण बाल कोशिकाओं में, ट्रांसडक्शन मशीनरी टिप लिंक के निचले सिरों पर स्थित है, यानी, छोटी पंक्ति स्टीरियोसिलिया1 के सुझावों पर और स्टीरियोसिलिया2,3के सुझावों पर सिग्नलिंग के माध्यम से स्थानीय रूप से विनियमित। फिर भी, जीवित बाल कोशिकाओं में इस स्थान पर सतह संरचनाओं की लेबल-मुक्त इमेजिंग स्टीरियोसिलिया के छोटे आकार के कारण संभव नहीं है।

स्तनधारी कोचलिया में दो प्रकार की श्रवण संवेदी कोशिकाएं होती हैं: आंतरिक और बाहरी बाल कोशिकाएं। भीतरी बाल कोशिकाओं में, स्टीरियोसिलिया बाहरी बाल कोशिकाओं 4 में उन लोगों की तुलना मेंलंबेऔर मोटे हैं। स्टीरियोसिलिया की पहली और दूसरी पंक्ति में माउस या चूहे के भीतरी बाल कोशिकाओं में 300-500 एनएम का व्यास होता है। प्रकाश के विवर्तन के कारण, लेबल-मुक्त ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ प्राप्त अधिकतम संकल्प लगभग 200 एनएम है। इसलिए, आंतरिक बाल कोशिका बंडल की पहली और दूसरी पंक्तियों के भीतर व्यक्तिगत स्टीरियोसिलिया का दृश्य ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ अपेक्षाकृत आसान है। इसके विपरीत, आंतरिक बाल कोशिकाओं में छोटी पंक्ति स्टीरियोसिलिया और बाहरी बाल कोशिकाओं के सभी स्टीरियोसिलिया का व्यास 100-200 एनएम के आसपास होता है और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी5के साथ कल्पना नहीं की जा सकती है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग में हालिया प्रगति के बावजूद, यह मौलिक सीमा किसी भी ऑप्टिकल लेबल-मुक्त इमेजिंग में बनी हुई है। सभी वर्तमान व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों को किसी प्रकार के फ्लोरोसेंट अणुओं की आवश्यकता होतीहै,जो उनके अनुप्रयोगों को सीमित करते हैं। विशिष्ट फ्लोरोसेंटली टैग किए गए अणुओं की आवश्यकता के कारण सीमाओं के अलावा, सेलुलर क्षति को प्रेरित करने के लिए तीव्र प्रकाश विकिरण के संपर्क में दिखाया गया है और सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकता है, जो लाइव कोशिकाओं का अध्ययन करते समय एक बड़ा नुकसान है7।

हेयर सेल स्टीरियोसिलिया बंडलों के अल्ट्रास्ट्रक्चरल विवरणों का हमारा वर्तमान ज्ञान ज्यादातर विभिन्न इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) तकनीकों के साथ प्राप्त किया गया है, जैसे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम), ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएमई), फ्रीज-फ्रैक्चर ईएम, और हाल ही में 3डी तकनीकों के साथ जैसे केंद्रित आयन बीम या क्रायो-ईएम टोमोग्राफी8,9,10,11,13, 14,15,16. दुर्भाग्य से, इन सभी EM तकनीकों के नमूने के रासायनिक या क्राइसोफिकेशन की आवश्यकता होती है। घटना के समय पैमाने के आधार पर, यह आवश्यकता स्टीरियोसिलिया के सुझावों पर गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करती है या तो असंभव या बहुत श्रम गहन।

परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम)17,18के साथ जीवित बाल कोशिकाओं के बालों के बंडलों को चित्रित करने के लिए सीमित प्रयास किए गए हैं । चूंकि एएफएम शारीरिक समाधानों में संचालित होता है, इसलिए यह सिद्धांत रूप में, समय के साथ जीवित बाल कोशिकाओं के स्टीरियोसिलिया बंडलों में गतिशील परिवर्तनों की कल्पना कर सकता है। समस्या उच्च संकल्प AFM के सिद्धांतों में निहित है, जो AFM जांच और नमूने के बीच कुछ शारीरिक संपर्क का तात्पर्य है, यहां तक कि कम से हानिकारक "दोहन" मोड19में । जब एएफएम जांच में स्टीरियोसिलियम का सामना करना पड़ता है, तो यह आमतौर पर इसके खिलाफ दुर्घटनाग्रस्त हो जाता है, बालों के बंडल की संरचना को नुकसान पहुंचाता है। नतीजतन, यह तकनीक लाइव, या यहां तक कि तय कल्पना के लिए उपयुक्त नहीं है, बाल कोशिकाओंबंडलों 17,18। एक बड़ी गेंद के आकार की एएफएम जांच का उपयोग करके समस्या को आंशिक रूप से समाप्त किया जा सकता है जो नमूना20की सतह पर केवल हाइड्रोडायनामिक बल लगाता है। हालांकि, भले ही इस तरह की जांच आदर्श रूप से नमूना21के यांत्रिक गुणों का परीक्षण करने के लिए अनुकूल है, यह केवल एक उप-माइक्रोमीटर रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है जब कोर्टी22 के अंग इमेजिंग और अभी भी नमूना एक बल है कि अत्यधिक संवेदनशील stereocilia बंडलों के लिए पर्याप्त हो सकता है पर लागू होता है ।

स्कैनिंग आयन कंडिशन माइक्रोस्कोपी (एसआईसीएम) स्कैनिंग प्रोब माइक्रोस्कोपी का एक संस्करण है जो एक कंडक्टिव सॉल्यूशन23से भरे ग्लास पिपेट जांच का उपयोग करता है। SICM सतह का पता लगाता है जब पिपेट सेल के पास पहुंचता है और पिपेट के माध्यम से बिजली का करंट कम हो जाता है। चूंकि यह कोशिका को छूने से पहले अच्छी तरह से हो रहा है, इसलिए एसआईसीएम शारीरिक समाधान24में जीवित कोशिकाओं के गैर-संपर्क इमेजिंग के लिए आदर्श रूप से अनुकूल है। एसआईसीएम का सबसे अच्छा संकल्प एकल नैनोमीटर के क्रम पर है, जो जीवित कोशिका25की प्लाज्मा झिल्ली पर व्यक्तिगत प्रोटीन परिसरों को हल करने की अनुमति देता है। हालांकि, अन्य स्कैनिंग जांच तकनीकों के समान, SICM केवल अपेक्षाकृत सपाट सतहों को छवि देने में सक्षम है। हमने हॉपिंग प्रोब आयन कंडक्शन माइक्रोस्कोप (एचपीआईसीएम)26की खोज करके इस सीमा को पार कर लिया, जिसमें नैनोपिपेट प्रत्येक इमेजिंग पॉइंट(चित्रा 1 ए)पर नमूने के पास पहुंचता है। HPICM का उपयोग करना, हम नैनोस्केल संकल्प27के साथ लाइव श्रवण बाल कोशिकाओं में स्टीरियोसिलिया बंडलों छवि करने में सक्षम थे ।

इस तकनीक का एक और मौलिक लाभ यह है कि एचपीआईसीएम न केवल एक इमेजिंग उपकरण है। अन्य स्कैनिंग जांच तकनीकों के विपरीत, एचपीआईसीएम/एसआईसीएम जांच एक इलेक्ट्रोड है जो विद्युत रिकॉर्डिंग और विभिन्न उत्तेजनाओं के स्थानीय वितरण के लिए सेल फिजियोलॉजी में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है । आयन चैनल गतिविधि आमतौर पर एचपीआईसीएम इमेजिंग में हस्तक्षेप नहीं करती है, क्योंकि एचपीआईसीएम जांच के माध्यम से कुल वर्तमान सबसे बड़े आयन चैनलों द्वारा उत्पन्न बाह्य वर्तमान से बड़े परिमाण के कई आदेश हैं25। हालांकि, HPICM इस संरचना28से ब्याज की संरचना और बाद में एकल चैनल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग पर नैनोपिपेट की सटीक स्थिति की अनुमति देता है। इस तरह हमने बाहरी हेयर सेल स्टीरियोसिलिया29के सुझावों पर एकल चैनल गतिविधि की पहली प्रारंभिक रिकॉर्डिंग प्राप्त की । यह उल्लेखनीय है कि नैनोपिपेट के माध्यम से एक बड़ा वर्तमान भी बाहुलकर माध्यम के भारी विद्युत शंट के कारण प्लाज्मा झिल्ली में क्षमता के महत्वपूर्ण परिवर्तन का उत्पादन नहीं कर सकता है। हालांकि, व्यक्तिगत आयन चैनलों को नैनोपिपेट30 के माध्यम से तरल के प्रवाह या रासायनिक रूप से एक एगोनिस्ट31के स्थानीय अनुप्रयोग द्वारा यांत्रिक रूप से सक्रिय किया जा सकता है।

एचपीआईसीएम में, छवि तब उत्पन्न होती है जब एक नैनोपिपेट क्रमिक रूप से एक बिंदु पर नमूने के पास जाता है, वापस ले जाता है, और फिर दृष्टिकोण(चित्र 1 ए)को दोहराने के लिए पार्श्व दिशा में जाता है। एक पैच क्लैंप एम्पलीफायर लगातार स्नान समाधान में ~ 1 एनए की धारा उत्पन्न करने के लिए पिपेट(चित्रा 1B)में एजीसीएल तार पर वोल्टेज लागू करता है। इस धारा का मूल्य जब पिपेट कोशिका की सतह से दूर होता है तो संदर्भ वर्तमान(आईरेफरी, चित्रा 1सी)के रूप में निर्धारित किया जाता है। फिर, पिपेट जेड एक्सिस में नमूना से संपर्क करने के लिए चलता है जब तक कि वर्तमान उपयोगकर्ता (सेटपॉइंट) द्वारा पूर्वनिर्धारित राशि से कम न हो जाए, आमतौर पर आईरेफरी (चित्रा 1C, शीर्ष ट्रेस) का0.2%-1%। सिस्टम तो नमूना की ऊंचाई के रूप में इस पल में जेड मूल्य बचाता है, एक साथ एक्स और वाई इस इमेजिंग बिंदु के निर्देशांक के साथ । फिर, पिपेट को उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित गति पर सतह(चित्रा 1C,नीचे ट्रेस) से दूर कर दिया जाता है, आमतौर पर 700-900 एनएम/एमएस। पीछे हटने के बाद, पिपेट (या, हमारे मामले में, नमूना - चित्रा 1Bदेखें) को बाद में अगले इमेजिंग पॉइंट पर ले जाया जाता है, एक नया संदर्भ वर्तमान मूल्य प्राप्त किया जाता है, और पिपेट एक बार फिर नमूना का उपयोग करता है, प्रक्रिया को दोहराता है। पिपेट के एक्स-वाई आंदोलन को एक ईमानदार माइक्रोस्कोप सेटअप में पसंद किया जाता है जिसका उपयोग आमतौर पर हेयर सेल मेकेनोट्रांजेक्शन धाराओं की रिकॉर्डिंग के लिए किया जाता है। इस सेटिंग में, HPICM जांच बाल कोशिका बंडलों ऊपर से नहीं बल्कि एक कोण३२पर दृष्टिकोण । हालांकि, एचपीआईसीएम इमेजिंग का सबसे अच्छा संकल्प एक उल्टे माइक्रोस्कोप सेटअप(चित्रा 1A,बी)में हासिल किया जाता है, जहां एक्स-वाई दिशाओं में नमूने की आवाजाही नैनोपिपेट के जेड-मूवमेंट से डी-युग्मित होती है, जिससे संभावित यांत्रिक कलाकृतियों को नष्ट किया जाता है।

एचपीआईसीएम का उपयोग करके, हमने माउस और चूहे के भीतरी और बाहरी बाल कोशिका स्टीरियोसिलिया बंडलों की स्थलाकृतिक छवियां प्राप्त कीं, और यहां तक कि स्टीरियोसिलिया के बीच संबंधों की कल्पना की जो व्यास26,27में लगभग 5 एनएम हैं। इस तकनीक के साथ हेयर सेल बंडल इमेजिंग की सफलता कई कारकों पर निर्भर करती है। सबसे पहले, नैनोपिपेट वर्तमान का शोर (विचरण) एचपीआईसीएम इमेजिंग के लिए सबसे कम संभव सेटपॉइंट की अनुमति देने के लिए जितना संभव हो उतना छोटा होना चाहिए। एक कम सेटपॉइंट एचपीआईसीएम जांच को बड़ी दूरी पर और जांच दृष्टिकोण के किसी भी कोण पर "भावना" स्टीरियोलिया सतह की अनुमति देता है और आश्चर्यजनक रूप से, एचपीआईसीएम इमेजिंग के एक्स-वाई संकल्प में सुधार करता है (चर्चादेखें)। दूसरा, सिस्टम में कंपन और बहाव को 10 एनएम से कम किया जाना चाहिए, क्योंकि वे सीधे इमेजिंग कलाकृतियों में योगदान देते हैं। अंत में, भले ही HPICM जांच और नमूना चरण जेड और एक्स-वाई कुल्हाड़ियों में अंशांकित प्रतिक्रिया नियंत्रित पीजो एक्ट्यूएटर द्वारा स्थानांतरित कर रहे हैं, जिनमें एक नैनोमीटर या बेहतर की सटीकता है, नैनोपिपेट टिप का व्यास वर्तमान (संवेदन मात्रा) के प्रसार को निर्धारित करता है और इसलिए संकल्प(चित्रा 1A)। इसलिए, लाइव हेयर कोशिकाओं को इमेजिंग करने से पहले, पर्याप्त पिपेट खींचना, अंशांकन नमूनों के साथ वांछित संकल्प तक पहुंचना और रिकॉर्डिंग सिस्टम में कम शोर प्राप्त करना महत्वपूर्ण है।

कुछ दशकों से, SICM तकनीक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है और यह इंपीरियल कॉलेज (यूके) में प्रो कोरचेव की अग्रणी प्रयोगशाला के साथ दुनिया में केवल कुछ प्रयोगशालाओं द्वारा विकसित किया गया है । हाल ही में, कई एसआईसीएम सिस्टम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो गए (सामग्री की तालिकादेखें), जिनमें से सभी मूल एचपीआईसीएम सिद्धांतों पर आधारित हैं। हालांकि, बाल कोशिकाओं में इमेजिंग स्टीरियोलिया बंडलों को बंद "रेडी-टू-गो" सिस्टम में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण (या असंभव भी) कई कस्टम संशोधनों की आवश्यकता होती है। इसलिए, कुछ घटक एकीकरण की आवश्यकता है। चूंकि एचपीआईसीएम सेटअप अधिक कठोर कंपन और बहाव आवश्यकताओं और एचपीआईसीएम जांच और नमूना(चित्रा 1D)के एक पीजो-चालित आंदोलन के साथ एक पैच क्लैंप रिग का प्रतिनिधित्व करता है, इसलिए यह एकीकरण किसी भी शोधकर्ता के लिए अपेक्षाकृत आसान है, जो पैच क्लैंपिंग में कुशल है। हालांकि, उचित पृष्ठभूमि के बिना एक वैज्ञानिक निश्चित रूप से पहले इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता होगी । इमेजिंग की गति बढ़ाने (चर्चादेखें) जैसी शेष चुनौतियों के बावजूद, हम उन्हें नुकसान पहुंचाए बिना नैनोस्केल संकल्प के साथ जीवित बाल कोशिकाओं में स्टीरियोसिलिया बंडलों को छवि बनाने में सक्षम रहे हैं।

यह कागज हमारे कस्टम सिस्टम का उपयोग करके युवा प्रसवोत्तर चूहे या माउस कॉकलियर एक्सप्लांट में लाइव श्रवण हेयर सेल बंडलों की सफल एचपीआईसीएम इमेजिंग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। एकीकृत घटक सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध हैं। कागज भी आम समस्याओं का वर्णन है कि सामना किया जा सकता है और कैसे उंहें समस्या निवारण के लिए ।

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Protocol

यह अध्ययन राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों की प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के अनुसार किया गया था । सभी पशु प्रक्रियाओं को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा केंटकी विश्वविद्यालय (प्रोटोकॉल 00903M2005) में अनुमोदित किया गया था।

1. नैनोपिपेट्स का निर्माण और परीक्षण

  1. 200 और 400 एमΩ के बीच प्रतिरोध के साथ पिपेट प्राप्त करने के लिए माइक्रोपिपेट पुलर में एक कार्यक्रम बनाएं, जो लगभग 50-70 एनएम के आंतरिक टिप व्यास से मेल खाता है। पैरामीटर माइक्रोपिपेट पुलर पर निर्भर करेंगे। गैर-लचीला ठीक सुझावों के साथ छोटे पिपेट प्राप्त करने के लिए, पुलर के परिचालन मैनुअल में जांच करें।
  2. 1/0.58 मिमी के बाहरी/भीतरी व्यास और भरने की सुविधा के लिए एक आंतरिक फिलामेंट के साथ बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं का उपयोग करें। पिपेट की लंबाई महत्वपूर्ण है क्योंकि यह पिपेट के पार्श्व यांत्रिक प्रतिध्वनि की आवृत्ति निर्धारित करता है। अब पिपेट है, कम सुनाई देती आवृत्ति है और कठिन इस गूंज से बचने के लिए है।
    नोट: उपयोगकर्ता को सबसे कम पिपेट का निर्माण करने की कोशिश करनी चाहिए जो धारक स्वीकार कर सकता है। इस प्रयोग में नैनोपिपेट्स की लंबाई आमतौर पर 15-25 मिमी(चित्रा 2 ए) होतीहै।
  3. एक स्नान समाधान के साथ अपने मध्य बिंदु(चित्रा 2A)तक नैनोपिपेट भरें, या तो लीबोविट्ज के एल-15 या हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के साथ 20 mM डी-ग्लूकोज (ऑस्मोलैरिटी को समायोजित करने के लिए) के साथ पूरक। संभावित कलाकृतियों से बचने के लिए, उसी समाधान का उपयोग करें जिसका उपयोग रिकॉर्डिंग के लिए स्नान में किया जाएगा।
  4. 10x के आवर्धन के साथ ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, पिपेट(चित्रा 2B)की नोक पर किसी भी बुलबुले की जांच करें। बुलबुले वर्तमान प्रवाह को रोकेंगे। प्रयोग से कई घंटे पहले खींचे गए पिपेट में बुलबुले को हटाना कठिन है। इसलिए, हर प्रयोग के साथ नए पिपेट खींचने की सिफारिश की जाती है।
  5. एक बार जब पिपेट बुलबुले से मुक्त हो जाता है, तो इसे एचपीआईसीएम पिपेट धारक(चित्रा 2सी)में माउंट करें।
  6. कस्टम-निर्मित कक्ष पर नमूना (ऊतक या अंशांकन मानक) रखें और उपरोक्त स्नान समाधान के 4 एमएल जोड़ें।
  7. कस्टम निर्मित चैंबर को एचपीआईसीएम स्टेज पर रखें और घोल में ग्राउंड इलेक्ट्रोड पेश करें।
  8. सुनिश्चित करें कि पैच क्लैम्प एम्पलीफायर द्वारा पिपेट पर लागू किया जा रहा वोल्टेज शून्य है।
  9. पिपेट को जेड में तब तक ले जाएं जब तक कि यह तरल को छू न जाए।
  10. एम्पलीफायर ऑफसेट को शून्य पर सेट करें और फिर पिपेट करंट की जांच करने के लिए +100 एमवी जोड़ें।
  11. ओम के कानून के आधार पर पिपेट के प्रतिरोध और व्यास की गणना करें:
    R = V/I
    जहां आर प्रतिरोध (MOhm) है, वी नैनोपिपेट (एमवी) के लिए लागू वोल्टेज है और मैं नैनोपिपेट (एनए) के माध्यम से बहने वाली धारा है।
    1. निम्नलिखित सूत्र12के अनुसार कहीं और वर्णित पिपेट के आंतरिक व्यास की गणना करें :
      आईडीटिप = 1000/ √R
      नोट: आदर्श प्रतिरोध मूल्य 200 और 400 एमΩ के बीच है। 400 एमΩ से अधिक प्रतिरोध वाले पिपेट अपने छोटे आकार (< 50 एनएम आंतरिक व्यास) के कारण अस्थिर धारा का कारण बन सकते हैं। इसके विपरीत, 200 एमΩ से छोटे प्रतिरोधों के साथ पिपेट बहुत बड़े हैं (> 70 एनएम आंतरिक व्यास) और छोटी सुविधाओं को हल नहीं करेंगे। इसके 200 MΩ प्रतिरोध के पिपेट के साथ इमेजिंग शुरू करने की सिफारिश की, क्योंकि वे निर्माण करने के लिए आसान कर रहे हैं और कम बिजली शोर प्रदान करते हैं।

2. नमूना बहाव और कंपन को कम करना

नोट: इमेजिंग के दौरान सिस्टम में यांत्रिक शोर को कम करने के लिए, कस्टम-निर्मित कक्षों पर नमूनों को माउंट करें जो मोटी ग्लास स्लाइड (~ 1.2 मिमी) का उपयोग करते हैं:

  1. एक ५० मिमी ग्लास-नीचे पकवान से कांच के हिस्से को हटा दें, प्लास्टिक की दीवारों को बरकरार छोड़ दें ।
  2. सिलिकॉन गोंद के साथ मोटी ग्लास स्लाइड के शीर्ष पर सेल कल्चर डिश के प्लास्टिक के हिस्से को गोंद करें।
  3. या तो सिलिकॉन गोंद या पतली दो तरफा टेप का उपयोग कर चैंबर के बीच में अंशांकन नमूना माउंट (ग्लास स्लाइड के शीर्ष पर) ।
  4. दो तरफा टेप का उपयोग करके एचपीआईसीएम चरण पर कक्ष को मजबूती से सुरक्षित करें।
  5. इमेजिंग के दौरान, फैराडे पिंजरे को बंद करें और तदनुसार विद्युत हस्तक्षेप और थर्मल बहाव को कम करने के लिए इसे कंबल के साथ कवर करें।

3.एएफएम अंशांकन मानकों के साथ संकल्प का परीक्षण

नोट: सिस्टम को परेशान करने और एक्स-जेड-वाई अक्षों में इसके संकल्प का परीक्षण करने के लिए लाइव कोशिकाओं को इमेजिंग करने से पहले एएफएम मानकों (सामग्रियों की तालिकादेखें) को दृढ़ता से इमेजिंग करने की सिफारिश की जाती है। अंशांकन मानकों में सिलिकॉन डाइऑक्साइड के खंभे और विभिन्न आकृतियों के छेद होते हैं लेकिन 5 x 5 मिमी सिलिकॉन चिप पर निश्चित ऊंचाइयों/गहराई (यानी, 20 या १०० एनएम) होते हैं । 100 एनएम अंशांकन मानक के साथ शुरू करने की सिफारिश की है, गारंटी है कि जेड संकल्प 100 एनएम से नीचे है। इस अंशांकन नमूने(चित्रा 3 ए)में खंभे या छेद की एक सफल उच्च-संकल्प छवि प्राप्त करने के बाद, 20 एनएम मानक पर जाएं। यदि उत्तरार्द्ध मानक की इमेजिंग सफल होती है (चित्र 3 बी),तो जेड एक्सिस में संकल्प 20 एनएम से नीचे होने की गारंटी है और हेयर सेल स्टीरियोसिलिया बंडलों की इमेजिंग के लिए उपयुक्त है12. निम्नलिखित चरणों का उपयोग अंशांकन मानकों दोनों को छवि देने के लिए किया जाता है।

  1. सिलिकॉन गोंद के साथ कक्ष में अंशांकन मानक संलग्न करें।
  2. अंशांकन नमूने को कवर करने के लिए चैंबर में एचबीएसएस के 4 एमएल जोड़ें। फिर, दो तरफा टेप का उपयोग कर HPICM सेटअप के XY चरण के लिए चैंबर सुरक्षित।
  3. कक्ष के पास मंच पर जमीन इलेक्ट्रोड के चुंबकीय धारक क्लैंप और स्नान समाधान(चित्रा 1B)में इलेक्ट्रोड विसर्जित कर दिया ।
  4. नैनोपिपेट को धारक में माउंट करें, इसे स्नान समाधान में विसर्जित करें, और धारा 1 में वर्णित चरणों के बाद अपने वर्तमान को ~ 1 एनए में सेट करें।
  5. कोर्स पैच-क्लैंप मैनिपुलेटर का उपयोग करके अंशांकन मानक के केंद्र से लगभग ऊपर नैनोपिपेट की स्थिति रखें। दृश्य निरीक्षण आमतौर पर इस स्थिति के लिए पर्याप्त होता है, क्योंकि सिलिकॉन डाइऑक्साइड संरचनाओं द्वारा कवर किया गया क्षेत्र अपेक्षाकृत बड़ा (1 x 1 मिमी) है। कोर्टी एक्सप्लांट (नीचे देखें) के अंग के विपरीत, अंशांकन मानक गैर-पारदर्शी है और इसलिए, इस नमूने के लिए ऑप्टिकल इमेजिंग द्वारा निर्देशित अधिक सटीक स्थिति संभव नहीं है।
  6. वास्तविक समय में एक ऑसिलोस्कोप पर जेड पीजो एक्ट्यूएटर के सेंसर से सिग्नल की निगरानी करते समय सेटपॉइंट बढ़ाएं। एक स्थिर दोहराने योग्य जेड दृष्टिकोण चक्र (जैसा कि चित्रा 1C, नीचे) स्थापितकरने के बाद, अस्थिरता के बिंदु से ठीक ऊपर मूल्य के लिए सेटपॉइंट को कम करें। यह प्रक्रिया इस विशेष नैनोपिपेट के लिए इष्टतम सेटपॉइंट सुनिश्चित करेगी।
  7. पिपेट को एक पैच क्लैंप माइक्रोमैनीपुलेटर के साथ ~ 5 माइक्रोन/एस की गति से नीचे ले जाएं जब तक कि यह नमूना तक न पहुंच जाए। इस समय, वास्तविक समय जेड पोजिशनिंग सिग्नल(चित्रा 1C)का निचला स्तर बढ़ेगा, यह दर्शाता है कि नमूना सतह को "संवेदन" के कारण नैनोपिपेट वापस ले लिया गया है। नैनोपिपेट के किसी भी आगे के आंदोलन के परिणामस्वरूप जेड-पोजिशनिंग सिग्नल की और सकारात्मक पारी होगी।
    नोट: जेड पीजो एक्ट्यूएटर आंदोलन की ऊपरी सीमा से अधिक न होने के लिए सावधान रहें।
  8. कम रिज़ॉल्यूशन पर इमेजिंग शुरू करें (तालिका 1देखें)। एएफएम मानक के असमान बढ़ते होने के कारण, ब्याज के क्षेत्र का उच्चतम बिंदु अज्ञात हो सकता है। इसलिए, पिपेट रिऐक्शन (हॉप आयाम) के आयाम को कम से कम 200-500 एनएम तक सेट करें।
    1. एक बार इमेजिंग क्षेत्र में नमूने के उच्चतम बिंदु की पहचान की है, हॉप आयाम कम। एक छोटा हॉप आयाम तेजी से स्कैनिंग की अनुमति देता है, जिसे बहाव के कम प्रभाव और कम कंपन के कारण उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए पसंद किया जाता है।
  9. पिपेट को एक नए एक्स-वाई स्थान पर ले जाने से पहले, नमूने के साथ किसी भी अवांछित टकराव को रोकने के लिए जेड एक्सिस में लगभग 200 माइक्रोन को वापस लें।
    नोट: ऐसे मामलों में जब नैनोपिपेट अंशांकन मानक के केंद्र के साथ गठबंधन नहीं किया जाता है, तो यह संभव है कि स्कैनिंग सतह सुविधाओं के क्षेत्र से शुरू होती है।
  10. ब्याज का क्षेत्र पाए जाने के बाद, उच्च संकल्प पर इमेजिंग शुरू करें (तालिका 1देखें)।

4. कॉकलियर एक्सप्लांट्स को सुरक्षित करने के लिए कस्टम-निर्मित कक्ष बनाना

नोट: कस्टम-निर्मित क्लैंपिंग सिस्टम के साथ कक्षों में कॉकलियर एक्सप्लांट माउंट करें जो या तो लचीले ग्लास पिपेट (चरण 4.1)(चित्रा 4A)या दंत सोता (चरण 4.2)(चित्रा 4B)का उपयोग करते हैं। ग्लास पिपेट चैंबर को निष्फल किया जा सकता है और कॉर्टी के सुसंस्कृत अंगों के लिए उपयोग किया जा सकता है, जबकि दंत सोता चैंबर नमूने की अधिक सुरक्षित होल्डिंग और बढ़ते के दौरान स्टीरियोसिलिया बंडल ओरिएंटेशन पर नियंत्रण प्रदान करता है। इन कस्टम निर्मित कक्षों को पहले से तैयार करने की आवश्यकता है, लेकिन उन्हें कई इमेजिंग सत्रों में साफ और फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. लचीले ग्लास पिपेट का उपयोग करके एक कक्ष बनाएं
    1. एक पिपेट पुलर का उपयोग करके ग्लास केशिकाओं से दो पतले और लचीले ग्लास फाइबर खींचें। हमारे खींचे गए ग्लास फाइबर आमतौर पर लंबाई में 1 से 2 सेमी मापते हैं और काफी लचीले होते हैं।
    2. एक ग्लास कवरलिप के शीर्ष पर सिलिकॉन इलास्टोमर की एक छोटी सी बूंद रखें। व्यास में 2 सेमी के कवरस्लिप का उपयोग करें।
    3. सिलिकॉन ड्रॉप पर दो ग्लास फाइबर के सिरों को रखें और फाइबर को उन दोनों के बीच अलग करने की एक छोटी डिग्री(चित्रा 4A)की व्यवस्था करें।
    4. इलास्टोमर (1 से 3 मिनट) को जल्दी से ठीक करने के लिए कवरलिप को गर्म प्लेट पर रखें।
    5. सिलिकॉन इलास्टोमर की एक छोटी राशि (1-3 माइक्रोन) का उपयोग करके धारा 2 में वर्णित कक्ष के ग्लास बॉटम पर कवरलिप को गोंद करें और इसे रात भर ठीक करने की अनुमति दें।
  2. दंत सोता का उपयोग कर एक कक्ष बनाना:
    1. प्लास्टिक की दीवारों को बरकरार छोड़कर 50 एमएम ग्लास-बॉटम डिश के ग्लास वाले हिस्से को हटा दें। फिर सिलिकॉन गोंद के साथ 1.2 मिमी मोटी ग्लास स्लाइड के शीर्ष पर सेल कल्चर डिश के प्लास्टिक हिस्से को गोंद करें।
    2. माउंट एक प्लास्टिक कवरलिप (6.5 x 6.5 मिमी) कक्ष के केंद्र में एक ही गोंद के साथ। फिर पिछले एक के शीर्ष पर एक और कवरलिप के साथ प्रक्रिया दोहराएं।
    3. सिलिकॉन गोंद के साथ दो छोटे टंगस्टन या सोने पर चढ़ाया तारों (लंबाई के 12 मिमी और व्यास में ~ 0.5 मिमी) माउंट, कवर स्लाइड के विपरीत पक्षों में हर एक। उन्हें अभी तक पर्याप्त गोंद (> 10-15 मिमी) कवर स्लाइड(चित्रा 4B)से ।
    4. दो दंत सोता किस्में अलग और उन्हें कवर स्लाइड के शीर्ष पर जगह है और एक गाँठ बनाकर तारों के लिए उन्हें सुरक्षित। दोनों किस्में(चित्रा 4B,छोटे तीर) के बीच एक छोटा सा अंतर छोड़ दें।
  3. हर उपयोग के बाद कक्षों को साफ करें
    1. धीरे ठीक चिमटी का उपयोग कर चैंबर से ऊतक को हटा दें और हल्के से पीछे छोड़ दिया किसी भी ऊतक अवशेषों परिमार्जन ।
    2. 70% इथेनॉल के साथ पहले चैंबर कुल्ला और फिर आसुत पानी के साथ।
    3. जरूरत पड़ने पर कुल्ला चक्र दोहराएं।
    4. चैंबर को एक फिल्टर पेपर पर उल्टा रखें ताकि इसे अगले प्रयोग तक सूखने दिया जा सके। जब तक इमेजिंग के बाद कोर्टी के अंग की खेती की योजना नहीं बनाई जाती, तब तक कक्षों को निष्फल करने की आवश्यकता नहीं है।

5. कोर्टी के कृंतक अंग को विच्छेदन करना

  1. 13अन्य जगहों पर विस्तार से वर्णित युवा प्रसवोत्तर कॉकलियर एक्सप्लांट्स का विच्छेदन करें ।
  2. HPICM इमेजिंग के लिए, प्रसवोत्तर दिनों 3 और 6 (P3-6) के बीच चूहों से Corti के अंग विच्छेदन, और प्रसवोत्तर दिनों 3 और 8 (P3-8) के बीच चूहों से ।
    नोट: पुराने बाल कोशिकाओं विच्छेदन के दौरान नुकसान के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं और इसलिए, घंटे के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है लंबे समय चूक HPICM इमेजिंग ।
  3. एचपीआईसीएम इमेजिंग से पहले टेक्टरियल झिल्ली को हटाना न भूलें।
  4. विच्छेदन के तुरंत बाद, धारा 4 में वर्णित कक्षों में से एक में ऊतक को सुरक्षित करें, या तो इसे लचीले ग्लास पिपेट के नीचे रखें या दो दंत सोता किस्में(चित्रा 4)के नीचे। कमरे के तापमान स्नान समाधान के 4 एमएल के साथ इन कक्षों को पूर्व-भरें (बुलबुला गठन को कम करने के लिए)।

6. श्रवण बाल कोशिकाओं की इमेजिंग

  1. डबल-तरफा टेप का उपयोग करके एक्स-वाई पीजो चरण पर कॉर्टी के एक हौसले से अलग अंग के साथ चैंबर माउंट करें और सुनिश्चित करें कि यह एक्स और वाई अक्षों(चित्रा 1B)में चैंबर बहाव को कम करने के लिए दृढ़ता से सुरक्षित है।
  2. एक नया नैनोपिपेट रखने और सही पिपेट प्रतिरोध की जांच करने के लिए धारा 1 में चरणों का पालन करें।
  3. पैच क्लैंप माइक्रोमैनिपलेटर का उपयोग करके, एक उल्टे माइक्रोस्कोप में कोर्टी एक्सप्लांट के अंग को देखते हुए, हेयर सेल क्षेत्र पर नैनोपिपेट की स्थिति।
  4. जांच करें कि ऑसिलोस्कोप पर वास्तविक समय वर्तमान और जेड पोजिशनिंग सिग्नल (जैसा कि चित्र 1 सी में) रिकॉर्ड करके सिस्टम 0.5%या उससे कम के सेटपॉइंट के साथ स्थिर है। अगर जेड सिग्नल स्थिर नहीं है तो पैच क्लैम्प एम्पलीफायर के लो-पास फिल्टर की कटऑफ फ्रीक्वेंसी को कम करने की कोशिश करें। हालांकि, यह जेड पीजो एक्ट्यूएटर के रिस्पांस टाइम से कम नहीं हो सकता (विलंबित वर्तमान रीडिंग के कारण नमूने के साथ पिपेट टकराव से बचने के लिए)।
    नोट: व्यवहार में, इस फ़िल्टर की 5 किलोहर्ट्ज सेटिंग इष्टतम पाई जाती है। यदि जेड-सिग्नल अभी भी अस्थिर है, तो नैनोपिपेट को बदलना बेहतर है।
  5. एक बार एक स्थिर रिकॉर्डिंग हासिल हो जाने के बाद, इष्टतम सेटपॉइंट निर्धारित करें और ऊपर दिए गए चरणों 3.6-3.7 में वर्णित एचपीआईसीएम पिपेट के साथ नमूने से संपर्क करें।
  6. सबसे पहले, कम से कम 6 से 8 माइक्रोन के हॉप आयाम का उपयोग करके कम रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग (तालिका 1देखें) करें। बाल कोशिका स्टीरियोलिया बंडलों जैसे लंबी संरचनाओं को छवि बनाने के लिए, सुनिश्चित करें कि हॉप आयाम इन संरचनाओं के साथ टकराव से बचने के लिए पर्याप्त है।
    नोट: यदि हॉप आयाम पर्याप्त नहीं है, तो पिपेट एक स्टीरियोसिलियम पर कूदने में सक्षम नहीं होगा और एक आसन्न टक्कर होगी। स्टीरियोसिलियम से एचपीआईसीएम जांच की टक्कर से बालों के बंडल को नुकसान पहुंच सकता है। इसलिए, उन मामलों में जब स्टीरियोसिलिया बंडल की ऊंचाई अनिश्चित होती है, तो एक बड़ा हॉप आयाम का उपयोग करें।
  7. पहले प्रदर्शन और/या स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी(चित्रा 5)के साथ प्राप्त छवियों का अध्ययन करके Corti के अंग की स्थलाकृति से परिचित हो जाओ ।
    नोट: यदि HPICM छवि हर इमेजिंग बिंदु में 1 μm से छोटी ऊंचाइयों के साथ एक समान है, तो पिपेट की संभावना ग्लास बॉटम को स्कैन कर रही है न कि ऊतक। वैकल्पिक रूप से, पिपेट बाल कोशिकाओं से दूर कॉकलियर एक्सप्लांट के एक अलग क्षेत्र पर "भूमि" हो सकता है।
  8. यदि पिपेट को एक नए एक्स-वाई स्थान पर ले जाने की आवश्यकता है, तो ऊतक के भीतर किसी भी लंबी सुविधाओं के साथ टकराव से बचने के लिए इसे लगभग 500 एनएम वापस लें। बाल कोशिकाओं के साथ ब्याज के क्षेत्र में पाया जाता है जब तक कम संकल्प HPICM इमेजिंग दोहराएं।
  9. ब्याज के क्षेत्र में पाए जाने के बाद, एक उच्च संकल्प पर इमेजिंग शुरू करें (तालिका 1देखें)। एक पूरे बाल बंडल इमेजिंग करते समय 15 मिनट से कम खर्च करने की कोशिश करें।
    नोट: जीवित ऊतक में हेयर सेल बंडल अभी भी नहीं हैं, लेकिन उनके अभिविन्यास को बदल सकते हैं, उदाहरण के लिए, अंतर्निहित सहायक कोशिकाओं में आकार परिवर्तन के कारण। इसलिए, छवियों आंदोलन कलाकृतियों प्रदर्शन कर सकते है अगर छवि अधिग्रहण बहुत धीमी है ।
  10. एक बार फिर, उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए हॉप आयाम को कम करने से पहले कम-रिज़ॉल्यूशन छवियों में सबसे ऊंची विशेषताओं का निर्धारण करें। पूरे हेयर सेल बंडल को कवर करने वाले ब्याज के क्षेत्र के लिए, हॉप आयाम को 4-5 माइक्रोन तक कम करें, जबकि बंडल के भीतर अपेक्षाकृत छोटे और "फ्लैट" क्षेत्र के लिए (उदाहरण के लिए, 2 x 2 माइक्रोन) हॉप आयाम को और भी कम कर देते हैं, 1 माइक्रोन से कम हो जाते हैं, जिससे इमेजिंग की गति और संकल्प में वृद्धि होती है।

7. इमेज प्रोसेसिंग

नोट: इमेजिंग कलाकृतियों HPICM इमेजिंग में आम हैं। उनमें से कुछ को छवि अधिग्रहण मापदंडों द्वारा ठीक किया जा सकता है, जबकि अन्य को एक विशेष एसआईटीएम दर्शक के साथ या इमेजजे या मैटलैब जैसे अधिक सामान्य डेटा-प्रसंस्करण कार्यक्रमों के साथ पोस्ट-प्रोसेसिंग की आवश्यकता होती है। यहां हम सबसे आम कलाकृतियों का वर्णन करते हैं और हम उन्हें SICM दर्शक के साथ कैसे ठीक करते हैं।

  1. ढलान सुधार करें
    नोट: यह एक शुरुआत के लिए स्पष्ट नहीं है, लेकिन मानव आंख एक कोशिका की सतह पर उप माइक्रोमीटर आकार सुविधाओं को हल नहीं कर सकते, अगर इमेजिंग क्षेत्र के बराबर या बड़े आकार की एक समग्र ढलान है(चित्रा 3A,बी,छोड़ दिया) । इसलिए, एक इमेज्ड क्षेत्र (एचपीआईसीएम 3डी छवि डेटा को एक विमान में फिट करके) की औसत ढलान निर्धारित करना आवश्यक है और इसे एचपीआईसीएम छवि(चित्र 3 ए,बी,मध्य) से घटाना आवश्यक है।
    1. SICM दर्शक के साथ एक छवि खोलने के लिए खुला क्लिक करें।
    2. इमेज करेक्शन टैब चुनें।
    3. सही ढलान टैब का चयन करें।
    4. एक स्वचालित ढलान सुधार के लिए सही ढलान बटन दबाएं।
  2. लाइन अलाइनमेंट करें
    नोट: जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, यांत्रिक और/या थर्मल बहाव के साथ-साथ सेल आंदोलन कलाकृतियां एचपीआईसीएम इमेजिंग में एक महत्वपूर्ण समस्या का प्रतिनिधित्व करती हैं । प्रति मिनट माइक्रोमीटर से कम की गति वाला एक छोटा सा बहाव आमतौर पर नियमित पैच क्लैंप सेटअप में ध्यान देने योग्य नहीं होता है। फिर भी, यह एचपीआईसीएम इमेजिंग में कई दसियों नैनोमीटर की कलाकृतियों का उत्पादन कर सकता है, जो एचपीआईसीएम के संकल्प से काफी बड़ा है। इसलिए, इमेजिंग के दौरान दो पड़ोसी एचपीआईसीएम स्कैन लाइनों के बीच जेड एक्सिस में अचानक छलांग लगाना असामान्य नहीं है। यह इन पड़ोसी स्कैन लाइनों में शुरू (और/या समाप्त) जेड मूल्यों के बीच मतभेदों का विश्लेषण करके सही किया जा सकता है ।
    1. SICM दर्शक के साथ एक छवि खोलने के लिए खुला क्लिक करें।
    2. इमेज करेक्शन टैब चुनें।
    3. सही ढलान टैब का चयन करें।
    4. गठबंधन करने के लिए लाइनों की चौड़ाई चुनें। एक स्वचालित लाइन संरेखण सुधार के लिए बटन बटनडिस्ट्रिपलाइनफिट पर दबाएं।
  3. शोर में कमी प्रदर्शन
    नोट: एचपीआईसीएम के साथ छवियों को प्राप्त करते समय, नैनोपिपेट वर्तमान में छोटे उतार-चढ़ाव से नैनोपिपेट नमूने की सतह से दूर रुक सकता है, विशेष रूप से कम सेटपॉइंट के साथ। यह छवि में छोटे सफेद डॉट्स की उपस्थिति में परिणाम है। इस इमेजिंग आर्टिफैक्ट को सही करने के लिए, पड़ोसियों की तुलना में जेड-वैल्यू के साथ इमेजिंग पॉइंट्स की पहचान करना और इस मूल्य को पड़ोसियों के औसत से बदलना आवश्यक है। यह एक समायोज्य औसत फिल्टर द्वारा किया जाता है।
    1. SICM दर्शक के साथ एक छवि खोलने के लिए खुला क्लिक करें।
    2. इमेज प्रोसेसिंग टैब चुनें।
    3. शोर कम करने टैब का चयन करें।
    4. पिक्सल निकालने के लिए थ्रेसहोल्ड फ़िल्टर (μm) सेट करें.

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Representative Results

इस पेपर में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग जटिल स्थलाकृति के साथ किसी भी जीवित कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है। इन चरणों के बाद, हम नियमित रूप से लाइव चूहा श्रवण हेयर सेल बंडलों(चित्रा 6B,D) कीछवियां प्राप्त करते हैं। एसईएम छवियों की तुलना में कम एक्स-वाई रिज़ॉल्यूशन होने के बावजूद, हमारी एचपीआईसीएम छवियां स्टीरियोसिलिया की विभिन्न पंक्तियों, स्टीरियोसिलिया युक्तियों के आकार और यहां तक कि छोटे लिंक (~ 5 एनएम व्यास में) को जोड़ने वाले आसन्न स्टीरियोसिलिया(चित्रा 6F)को सफलतापूर्वक हल कर सकती हैं। इसके अलावा, HPICM छवियों 3 डी में जानकारी है कि SEM छवियों की कमी है । इमेजिंग तकनीक के इस प्रकार के गैर संपर्क प्रकृति को देखते हुए, हम भी कई घंटे के लिए एक ही बाल सेल बंडल के निरंतर समय चूक HPICM इमेजिंग प्रदर्शन करने में सक्षम थे (यानी, 5-6 घंटे नियमित रूप से) बंडल सामंजस्य(चित्रा 7)को नुकसान पहुंचाए बिना । इस प्रकार, HPICM समय के साथ बाल कोशिका बंडलों के गतिशील संरचनात्मक परिवर्तन के अध्ययन के लिए एक महान क्षमता दर्शाती है।

यद्यपि हम पिपेट आकार, वर्तमान सेटपॉइंट, कम और उच्च-रिज़ॉल्यूशन पैरामीटर और हॉप आयामों के लिए कई श्रेणियां प्रदान करते हैं, प्रत्येक उपयोगकर्ता को लाइव हेयर सेल बंडलों की सफल एचपीआईसीएम छवियों को प्राप्त करने के लिए अपनी सेटिंग्स को थोड़ा अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। छोटे सेटपॉइंट बेहतर गुणवत्ता वाले चित्रों का उत्पादन करते हैं। हालांकि, बहुत कम सेटपॉइंट के साथ, सिस्टम कोशिका की सतह का सामना करने के रूप में वर्तमान में छोटे उतार-चढ़ाव की व्याख्या कर सकता है और इससे छवि में "सफेद डॉट" शोर हो जाएगा(चित्र 8 ए)। इसी तरह, बड़े हॉप आयाम पिपेट की पार्श्व प्रतिध्वनि को बढ़ा सकते हैं और शोरपिक्सल (चित्रा 8B)का उत्पादन भी कर सकते हैं। इसके विपरीत, यदि हॉप आयाम बहुत छोटा है या सेटपॉइंट बहुत अधिक है, तो नैनोपिपेट नमूने से टकरा सकता है और इमेजिंग कलाकृतियों का कारण बन सकता है या यहां तक कि बालों के बंडल(चित्रा 8C,D)को नुकसान पहुंचा सकता है। हम नमूने या नैनोपिपेट को नुकसान को कम करने के लिए इन सभी मापदंडों को ट्विक करते हुए कम रिज़ॉल्यूशन पर इमेजिंग करने की सलाह देते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: हॉपिंग प्रोब आयन कंडक्टेंस माइक्रोस्कोपी (एचपीआईसीएम) के सिद्धांत। (क)नैनोपिपेट से गुजरने वाला एक विद्युत धारा पिपेट की नोक पर "संवेदन मात्रा" उत्पन्न करती है । बाल कोशिका स्टीरियोसिलिया बंडलों की तरह जटिल संरचनाओं छवि के लिए, ऊपर से सेल की सतह की ओर पिपेट दृष्टिकोण और सतह का पता लगाने के बाद वापस ले लेता है । प्रत्येक चरण में पार्श्व चाल के बाद, पिपेट सेल की छवि उत्पन्न करने वाले नमूने के ऊपर "हॉप" जारी रखता है। ध्यान दें कि हॉप आयाम पिपेट के लिए एक स्टीरियोसिलियम के लिए "चढ़ाई" करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए। सचित्र हॉप आयाम बाएं से दाएं स्कैनिंग (सबसे छोटे से सबसे ऊंचे स्टीरियोसिलियम तक, एक तीर द्वारा इंगित) के लिए काम करेगा। हालांकि, यह दाएं-से-बाएं स्कैनिंग के लिए बहुत छोटा है जब पिपेट सबसे बड़ा स्टीरियोसिलियम पहले मिलता है। (ख)प्रायोगिक सेटअप । कॉर्टी एक्सप्लांट के अंग के साथ एक कस्टम-निर्मित कक्ष ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी अवलोकन के लिए एपर्चर के साथ एक्सवाई नैनोपोजिशनिंग चरण पर रखा जाता है। नैनोपिपेट को एक अलग अल्ट्रा-फास्ट जेड पीजो एक्ट्यूएटर द्वारा स्थानांतरित किया जाता है। ब्याज के क्षेत्र में नैनोपिपेट को स्थान देने के लिए, जेड एक्ट्यूएटर को पैच क्लैम्पर एम्पलीफायर हेडस्टेजके साथ एक पारंपरिक माइक्रोमैनीपुलेटर (नहीं दिखाया गया) पर रखा जाता है। ग्राउंड इलेक्ट्रोड एक चुंबकीय धारक पर रखा जाता है और स्नान में डाला जाता है। (ग)इमेजिंग के दौरान पिपेट करंट(टॉप ट्रेस) और जेड पोजीशन ऑफ पिपेट (बॉटम ट्रेस) की रिप्रेजेंटेटिव रिकॉर्डिंग। जब पिपेट कोशिका की सतह से दूर होता है, तो पिपेट से गुजरने वाले वर्तमान का संदर्भ मूल्य निर्धारित किया जाता है(मैंरेफरी)। फिर, पिपेट को नमूने (दृष्टिकोण) की ओर ले जाया जाता है। जब "संवेदन मात्रा" कोशिका की सतह से मिलती है, तो पिपेट वर्तमान कम होने लगता है। वापसी के लिए आदेश तब जारी किया जाता है जब वर्तमान कमी एक सेटपॉइंट तक पहुंचती है, जो आमतौर पर 0.2% - 1% है जो आई रेफरी का है। (घ)एचपीआईसीएम इमेजिंग के लिए पारंपरिक पैच क्लैंप सेटअप में जोड़े जाने वाले उपकरणों की योजनाबद्धता । एक समर्पित पैच क्लैम्प एम्पलीफायर नैनोपिपेट वर्तमान (I) को रिकॉर्ड करता है जिसका उपयोग एचपीआईसीएम मोड में एसआईसीएम नियंत्रक द्वारा एक्स,वाई और जेड अक्षों को कमांड सिग्नल उत्पन्न करने के लिए किया जाताहै। इंस्ट्रूमेंटेशन एम्पलीफायर जरूरत पड़ने पर इन संकेतों को ऑफसेट, स्केलिंग और कम पास फ़िल्टरिंग प्रदान करता है। दुर्भाग्य से, नियंत्रक से एक्स/वाई/जेड संकेतों को सीधे पीजो एक्ट्यूएटर पर लागू नहीं किया जा सकता है क्योंकि हिस्टीरिया और रेंगने के कारण बड़ी त्रुटियां होती हैं जो पीजो सिरेमिक के लिए अंतर्निहित होती हैं । इसलिए, प्रत्येक पीजो एक्ट्यूएटर (अनुवाद चरण)में एक अंतर्निहित गति सेंसर होता है जो आनुपातिक-अभिन्न-व्युत्पन्न (पीआईडी) नियंत्रक को प्रतिक्रिया संकेत भेजता है जो इन त्रुटियों के लिए सही करने के लिए कमांड सिग्नल को पूर्व-आकार देता है। ध्यान दें कि अपेक्षाकृत धीमी गति से एक्स और वाई अक्ष पीआईडी नियंत्रकों का उपयोग कर सकते हैं जो पीजो एम्पलीफायरमें बनाए जाते हैं, जबकि एक तेज जेड अक्ष को एक समर्पित तेजी से पीआईडी नियंत्रककी आवश्यकता होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: नैनोपिपेट निर्माण और भरने। (A)इंट्रापिपेट समाधान (एचबीबीएस) से भरा लगभग 2 सेमी लंबा नैनोपिपेट। (ख)बुलबुले की एक छवि (तीर) जो आमतौर पर पिपेट भरने के बाद बनती है। बुलबुला आमतौर पर माइक्रोस्कोप रोशनी (10x पर एक एलसीडी डिजिटल माइक्रोस्कोप) के कुछ ही मिनटों के भीतर दूर चला जाता है । (ग)एक नैनोपिपेट SICM सिर में घुड़सवार । तीर पिपेट के अंदर एजीसीएल इलेक्ट्रोड की ओर इशारा करता है। ध्यान दें कि पिपेट धारक चांदी चित्रित है और जेड पीजो एक्ट्यूएटर से रेडिएटिव इलेक्ट्रिकल पिक को कम करने के लिए उड़ान भरी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सिस्टम में पर्याप्त स्थिरता, कंपन अलगाव और विद्युत शोर निर्धारित करने के लिए एएफएम अंशांकन मानकों की इमेजिंग। (A)रॉ (बाएं), पोस्ट प्रोसेस्ड (मिडिल), और 3डी (दाएं) एचएस-100MG अंशांकन मानक की छवियां । मानक की सतह प्रोफ़ाइल शीर्ष पर योजनाबद्ध रूप से दिखाई जाती है। चूंकि मानक नैनोपिपेट के लिए पूरी तरह से लंबवत गठबंधन नहीं है, इसलिए नमूने की छोटी ऊर्ध्वाधर विशेषताओं को प्रकट करने के लिए पोस्ट-प्रोसेसिंग स्लोप सुधार की आवश्यकता होती है। (ख)इसी तरह के कच्चे (बाएं), पोस्ट प्रोसेस्ड (मध्य), और 3डी (दाएं) एचएस-20MG अंशांकन मानक की छवियां हैं जिनमें छोटे, 20-एनएम गहरे इंडेंटेशन हैं। ध्यान दें कि एचपीआईसीएम छवि में पिक्सेल का ग्रेस्केल उस बिंदु पर नमूने की ऊंचाई को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: कोर्टी एक्सप्लांट के अंग का बढ़ना। }एक्सप्लांट में दो ग्लास पिपेट रखे जाते हैं जो ग्लास-बॉटम पेट्री डिश से चिपके होते हैं । (ख)एक्सप्लांट को कस्टम-मेड इमेजिंग चैंबर में दो डेंटल सोता किस्में (छोटे तीर) द्वारा सुरक्षित किया जाता है । इनसेट कोर्टी के अंग की बढ़ाया छवि दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: हेयर सेल क्षेत्र में एचपीआईसीएम जांच का नेविगेशन। (A)कॉकलियर एक्सप्लांट की एसईएम छवि जिसमें आंतरिक (आईएचसी) और बाहरी (OHCs) बाल कोशिकाओं और विशिष्ट प्रकार की सहायक कोशिकाओं की पंक्तियां दिखाई देती हैं । (ख)कोलिकर के अंग में कोशिकाओं की प्रतिनिधि HPICM छवि । (ग)हेनसेन की कोशिकाओं की एक HPICM छवि । ध्यान दें कि इन दो प्रकार की सहायक कोशिकाओं में बहुत अलग आकार होते हैं, जो यह निर्धारित करने में मदद करते हैं कि एचपीआईसीएम जांच एक ऐसे क्षेत्र में उतरा जो बाल कोशिकाओं के लिए रेडियल या परिधीय है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) और हॉपिंग प्रोब आयन कंडक्टेंस माइक्रोस्कोपी (एचपीआईसीएम) इमेजिंग के बीच तुलना युवा प्रसवोत्तर कृंतक आंतरिक बाल कोशिकाओं में स्टीरियोसिलिया बंडलों की इमेजिंग । (A,C) एसईएम छवियां सतह विवरणों का उप-नैनोमीटर संकल्प प्रदान करती हैं, लेकिन उन कोशिकाओं में जो महत्वपूर्ण बिंदु सूखने के कारण तय और सिकुड़ जाती हैं। इसके अलावा, एसईएम छवियां 3डी विश्लेषण की अनुमति नहीं देती हैं। (B,D) HPICM छवियों (बाएं) एक बुरा संकल्प (~ 5-10 एनएम) है, लेकिन वे जीवित कोशिकाओं में प्राप्त कर रहे हैं, समय चूक इमेजिंग की अनुमति है, और सटीक ऊंचाइयों पर जानकारी ले, जो 3 डी पुनर्निर्माण और माप (सही) की अनुमति देता है । (ई,एफ) स्टीरियोसिलिया के बीच बाह्य संबंध एसईएम(ई)और एचपीआईसीएम(एफ)छवियों (तीर) दोनों में स्पष्ट हैं। सेल उम्र: ए, प्रसवोत्तर दिन 5 (P5) माउस; बी, P6 चूहा; सी, पी 8 माउस; डी, P5 चूहा; ई, P7 माउस; और एफ, P5 चूहा। सभी HPICM छवियों में, एक पिक्सेल के ग्रेस्केल उस बिंदु पर नमूने की ऊंचाई को इंगित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: लगातार समय चूक HPICM स्टीरियोसिलिया बंडल की इमेजिंग । (क)P5 चूहे से एक भीतरी बाल कोशिका बंडल का अवलोकन अलग छोटी पंक्ति स्टीरियोसिलिया दिखा । (ख)ब्याज के क्षेत्र की समय चूक इमेजिंग (ए) में छह घंटे के दौरान दर्शाया गया है । ध्यान दें कि, एक ठेठ पैच शिविर प्रयोग के विपरीत, बाल कोशिकाओं को विट्रो में कई घंटे के लिए गिरावट का कोई संकेत नहीं दिखा । यह सावधानीपूर्वक विच्छेदन और कोशिका में किसी भी यांत्रिक गड़बड़ी के अभाव के कारण है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: एचपीआईसीएम के साथ इमेजिंग करते समय आम कलाकृतियां। (A)बहुत कम सेटपॉइंट का प्रभाव। पी 3 चूहों में एक ही लाइव इनर हेयर सेल बंडलों की कम-रिज़ॉल्यूशन एचपीआईसीएम छवियां सेटपॉइंट 0.05% (बाएं) और 0.07% (दाएं) के साथ अधिग्रहीत की गई हैं। एक सफेद डॉट शोर ध्यान दें जो उच्च सेटपॉइंट के साथ गायब हो जाता है। (ख)बहुत अधिक हॉप आयाम का प्रभाव। सफेद डॉट शोर भी 5.8 माइक्रोन (बाएं) के एक बड़े हॉप आयाम के साथ प्राप्त एक P7 चूहा इनर हेयर सेल बंडल की एक HPICM छवि में दिखाई देता है। यह शोर तब गायब हो जाता है जब सिस्टम में कंपन की कमी के कारण एक ही बंडल को 3.4 माइक्रोन (दाएं) के हॉप आयाम के साथ चित्रित किया जाता है। (ग)बहुत कम हॉप आयाम के परिणामस्वरूप एचपीआईसीएम जांच को स्टीरियोसिलिया से टकराने और उन्हें खींचने में (बाएं पैनल पर तीर)। हॉप आयाम बढ़ाना बस "पर चढ़ने" स्टीरियोसिलिया इस विरूपण (दाएं) को समाप्त करता है, लेकिन इमेजिंग समय भी बढ़ा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप एक ध्यान देने योग्य बहाव (सही पैनल में ऊर्ध्वाधर रेखाएं) हो सकती हैं। P7 चूहे से एक जीवित बाहरी बाल कोशिका का स्टीरियोसिलिया बंडल। (घ) बहुत अधिक सेटपॉइंट एक एचपीआईसीएम छवि (बाएं) में स्टीरियोसिलिया युक्तियों (तीर) के एक चुकता आकार का कारण बनता है, फिर से स्टीरियोसिलिया के लिए नैनोपिपेट के टकराने के कारण । कम सेटपॉइंट (सफेद शोर को खत्म करने के लिए आशा आयाम की एक साथ कमी के साथ) इमेजिंग (दाएं) में सुधार करता है। P6 चूहे से एक जीवित आंतरिक बाल कोशिका का स्टीरियोसिलिया बंडल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रस्ताव छवि क्षेत्र (μm) पार्श्व संकल्प (एनएम) प्रति छवि समय (मिनट)
नीचा 20×20 ≥300 ≤20
नीचा 10×10 ≥156 ≤15
नीचा 5×5 ≥75 ≤4
उच्च 20×20 ≤200 ≤20
उच्च 10×10 ≤110 ≤15
उच्च 5×5 ≤55 ≤4

तालिका 1: इमेजिंग क्षेत्र के आकार और स्कैनिंग संकल्प के आधार पर एचपीआईसीएम इमेजिंग का विशिष्ट समय।

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Discussion

सफल एचपीआईसीएम छवियों को प्राप्त करने के लिए, उपयोगकर्ताओं को कम शोर और कम कंपन प्रणाली स्थापित करने और उपयुक्त पिपेट का निर्माण करने की आवश्यकता है। हम दृढ़ता से किसी भी लाइव सेल इमेजिंग करने के प्रयास से पहले प्रणाली की स्थिरता का परीक्षण करने के लिए AFM अंशांकन मानकों के उपयोग की सलाह देते हैं। एक बार सिस्टम के संकल्प का परीक्षण किया जाता है, उपयोगकर्ता किसी भी लाइव सेल इमेजिंग के प्रयास से पहले इमेजिंग सेटिंग्स से परिचित होने के लिए कॉर्टी नमूनों के इमेजिंग फिक्स्ड ऑर्गन पर विचार कर सकते हैं।

इमेजिंग के लिए इष्टतम सेटपॉइंट विभिन्न पिपेट के बीच भिन्न होता है, जो उनके युक्तियों के व्यक्तिगत आकार के आधार पर होता है (जो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच किए जाने तक अज्ञात है) और टिप से जुड़ी गंदगी की मात्रा पर, जो अप्रत्याशित भी है। 0.7% से अधिक इष्टतम सेटपॉइंट वाले नैनोपिपेट्स को छोड़ दिया जाना चाहिए।

जीवित कोशिकाओं की इमेजिंग के दौरान, समय के साथ बाहुलर समाधान में धूल और मलबे की मात्रा बढ़ जाती है। इन सभी कणों पिपेट की नोक पर खत्म हो सकता है, वर्तमान में कमी के कारण और यह असंभव ऊतक स्कैनिंग जारी रखने के लिए कर रही है-छवि पूरी तरह से सफेद हो जाएगा के बाद से प्रतिक्रिया "लगता है" कि नैनोपिपेट नमूना के आसपास हमेशा है । यदि ऐसा होता है, तो ऊतक के उस क्षेत्र से जेड-एक्सिस में पिपेट को वापस लेने की सिफारिश की जाती है। यह रिऐक्शन "गंदगी" को साफ कर सकता है। यदि पिपेट अभी भी गंदा है, तो पिपेट को बदलना और नमूने के एक अलग क्षेत्र में जाना आवश्यक है। इसके बाद यूजर टिश्यू को स्कैन करना जारी रख सकते हैं ।

आज के रूप में, एचपीआईसीएम की सबसे आवश्यक सीमा जटिल स्थलाकृति के साथ नमूनों के साथ काम करते समय उच्च संकल्प पर एक छवि लेने के लिए आवश्यक समय की राशि है। वांछित संकल्प के आधार पर, छवियों को आधे घंटे या उससे अधिक समय लग सकता है। पंद्रह मिनट से अधिक समय तक प्राप्त छवियों में, बहाव स्पष्ट हो सकता है और विशिष्ट संरचनाओं को स्थानांतरित किया जा सकता है और अंतर करना कठिन हो सकता है। ऐसा इसलिए हो रहा है क्योंकि जीवित कोशिकाएं समय के साथ लगातार आगे बढ़ रही हैं या अपना आकार बदल रही हैं। समय के साथ आणविक घटनाओं और कोशिकाओं की संरचनाओं में परिवर्तन की कल्पना करने के लिए, एचपीआईसीएम11के लौकिक संकल्प को अनुकूलित करने के लिए आगे के विकास की आवश्यकता है।

नैनोपिपेट वर्तमान का शोर एक और सीमा का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि यह न्यूनतम व्यावहारिक रूप से प्राप्त करने योग्य सेटपॉइंट सेट करता है। समाधान में नैनोपिपेट द्वारा उत्पन्न वर्तमान जल्दी से तनु (पिपेट टिप से घन दूरी के विपरीत आनुपातिक), जिससे "संवेदन मात्रा" स्थापित होती है, जिसके आगे नैनोपिपेट सतह को "समझ" नहीं सकता है। हमने पहले इस घटना का एक मॉडल विकसित किया है और दिखाया है कि SICM जांच का पार्श्व संकल्प सेल सतह के साथ इस "संवेदन मात्रा" के क्रॉस-सेक्शन द्वारा निर्धारित किया जाता है, जो कमसेटपॉइंट्स 25पर बहुत छोटा हो सकता है। यह विशेष रूप से इमेजिंग हेयर सेल टिप लिंक के लिए महत्वपूर्ण है जिसका व्यास ~ 5 एनएम12,33है । पहली नज़र में, छोटे आंतरिक व्यास वाले पिपेट के परिणामस्वरूप एचपीआईसीएम इमेजिंग का बेहतर समाधान होगा। यह अपेक्षाकृत बड़े पिपेट (>50 एनएम) के लिए वास्तव में सच है। हालांकि, ~ 50 एनएम से नीचे नैनोपिपेट के आंतरिक व्यास को कम करने के परिणामस्वरूप पिपेट शोर की अउत्पादक रूप से बड़ी वृद्धि होती है और इसलिए, कम सेटपॉइंट्स पर संकल्प का नुकसान जो इमेजिंग स्टीरियोसिलिया बंडलों के लिए आवश्यक हैं। आज की तारीख में हम नहीं जानते कि इस समस्या का समाधान कैसे किया जाए और हम उचित समाधान निकालने पर काम कर रहे हैं ।

संक्षेप में, यह पेपर एचपीआईसीएम के साथ लाइव स्तनधारी श्रवण बाल कोशिकाओं में स्टीरियोसिलिया बंडलों के दृश्य के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। एचपीआईसीएम के सबसे बड़े फायदे हैं: i) उन्हें छूने के बिना जीवित कोशिकाओं की सतह पर लेबल-मुक्त नैनोस्केल संरचनाओं की कल्पना करने की क्षमता; और ii) इन संरचनाओं के कार्य की जांच करने के लिए पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग और/या यांत्रिक या रासायनिक उत्तेजनाओं के स्थानीय नैनोस्केल वितरण के साथ । हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, इन लाभ HPICM के लिए अद्वितीय हैं । बेशक, इसके कुछ नुकसान हैं। सबसे पहले, छवि संरचनाओं की ऊंचाई पर सीमाओं के कारण, एचपीआईसीएम बेहद लंबी संरचनाओं की इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है, जैसे स्तनधारी एम्पुला में वेस्टिबुलर बाल कोशिकाओं के स्टीरियोसिलिया बंडल। दूसरा, HPICM अभी भी विकसित कर रहा है और इमेजिंग की गति और संकल्प में और सुधार की जरूरत है । हालांकि, HPICM के भौतिक सिद्धांतों और हमारे अपने अनुभव का सुझाव है कि यह संभव है । हमें विश्वास है कि HPICM स्टीरियोसिलिया सतह पर व्यक्तिगत प्रोटीन परिसरों के समारोह पर अद्वितीय डेटा प्रदान करेगा ।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है ।

Acknowledgments

हम परियोजना के सभी चरणों में दीर्घकालिक समर्थन और सलाह के लिए प्रो यूरी कोरचेव (इंपीरियल कॉलेज, यूके) को धन्यवाद देते हैं। हम सॉफ्टवेयर विकास के साथ उनकी मदद के लिए डीआरएस पावेल नोवाक और एंड्रयू शेवचुक (इंपीरियल कॉलेज, यूके) के साथ-साथ ओलेग बेलोव (नेशनल रिसर्च सेंटर फॉर ऑडियोलॉजी, रूस) को भी धन्यवाद देते हैं । इस अध्ययन को एनआईडीसीडी/एनआईएच (R01 DC008861 और R01 DC014658 से G.I.F.) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analog oscilloscope B&K Precision 2160C Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach
AFM calibration standards TED PELLA Inc HS-100MG; HS-20MG These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system
Benchtop vibration Isolator AMETEK/TMC Everstill K-400 Active vibration isolation
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments (WPI) 1B100F-4 Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 To be added to the bath solution to adjust osmolarity
Digitizer National Instruments Corporation PCI-6221 Multi-channel input/output digitizer
Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement Standford Research Systems SIM900, SIM960, SIM980 Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.
Faraday cage AMETEK/TMC Type II Required to shield electromagnetic interference
Glass bottom dish World Precision Instruments (WPI) FD5040-100 Used as the dish for the chamber for the tissue
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco, Thermo Fisher Scientific 14025092 Extracellular (bath) solution
Instrumentation amplifier Brownlee Precision Model 440 Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation
Laser-based micropipette puller Sutter Instrument P-2000/G Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.
Lebovitz's L-15, without phenol red Gibco, Thermo Fisher Scientific 21083027 Extracellular (bath) solution
Micromanipulator Scientifica PatchStar Used for "course" positioning of the Z piezo actuator
Microscope Nikon Eclipse TS100 Inverted optical microscope
Patch amplifier Molecular Devices Axopatch 200B The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette
Piezo amplifier (XY axes) Physik Instrumente (PI) E-500.00, E-505.00, E-509.C2A Amplification and PID control for XY piezo translation stage
Piezo amplifier (Z axis) Piezosystem jena ENT 400 & 800 Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA
Plastic Coverslips TED PELLA Inc 26028 Used in the fabrication of the chambers for the tissue 
SICM controller & software* Ionscope, UK (ionscope.com) N/A Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd
Silicone elastomer (Sylgard) World Precision Instruments (WPI) SYLG184 Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue
Silicon glue The Dow Chemical Company 734 Used to glue the different parts of the chamber for the tissue
Tungsten rod A-M Systems 717500 Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue
XY piezo nanopositioner Physik Instrumente (PI) P-733.2DD XY translation stage with capacitive sensors
Z piezo nanopositioner Piezosystem jena RA 12/24 SG Ring piezoactuator with a strain gage sensor
*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:  NX12-Bio and NX10 SICM, 
Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original 
HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically 
challenging (or even impossible) in the closed “ready-to-go” systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one 
modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration. 

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References

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Galeano-Naranjo, C., Veléz-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells. J. Vis. Exp. (167), e62104, doi:10.3791/62104 (2021).

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