Modello di co-coltura senza contatto per lo studio dell'attivazione delle cellule immunitarie innate durante l'infezione da virus respiratorio

Summary

Questo protocollo descrive in dettaglio un'indagine sulle prime interazioni tra cellule epiteliali nasali infettate viralmente e attivazione cellulare innata. I singoli sottoinsiemi di cellule immunitarie possono essere distinti in base alla loro attivazione in risposta alle infezioni virali. Possono quindi essere ulteriormente studiati per determinare i loro effetti sulle prime risposte antivirali.

Abstract

Le prime interazioni tra lo strato epiteliale nasale e le cellule immunitarie innate durante le infezioni virali rimangono un'area poco esplorata. Il significato della segnalazione dell'immunità innata nelle infezioni virali è aumentato sostanzialmente poiché i pazienti con infezioni respiratorie che mostrano un'elevata attivazione innata delle cellule T mostrano un esito migliore della malattia. Quindi, sezionare queste prime interazioni immunitarie innate consente di chiarire i processi che le governano e può facilitare lo sviluppo di potenziali bersagli terapeutici e strategie per smorzare o addirittura prevenire la progressione precoce delle infezioni virali. Questo protocollo descrive un modello versatile che può essere utilizzato per studiare la diafonia precoce, le interazioni e l'attivazione delle cellule immunitarie innate da fattori secreti da cellule epiteliali delle vie aeree infettate viralmente. Utilizzando un virus influenzale H3N2 (A/Aichi/2/1968) come modello di virus rappresentativo, l'attivazione cellulare innata delle cellule mononucleate del sangue periferico co-coltivate (PBMC) è stata analizzata utilizzando la citometria a flusso per studiare i sottoinsiemi di cellule che vengono attivate dai fattori solubili rilasciati dall'epitelio in risposta all'infezione virale. I risultati dimostrano la strategia di gating per differenziare i sottoinsiemi di cellule e rivelano le chiare differenze tra le popolazioni attivate di PBMC e il loro crosstalk con il controllo e l'epitelio infetto. I sottoinsiemi attivati possono quindi essere ulteriormente analizzati per determinare le loro funzioni e i cambiamenti molecolari specifici delle cellule. I risultati di tale indagine crosstalk possono scoprire fattori importanti per l'attivazione di popolazioni cellulari innate vitali, che sono utili nel controllare e sopprimere la progressione dell'infezione virale. Inoltre, questi fattori possono essere universalmente applicati a diverse malattie virali, in particolare ai virus emergenti di recente, per smorzare l'impatto di tali virus quando circolano per la prima volta in popolazioni umane ingenue.

Introduction

I virus respiratori sono forse tra i patogeni più diffusi che causano gravi oneri sanitari ed economici. Dai periodici focolai globali di ceppi epidemici emergenti (ad esempio, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) ai ceppi stagionali di influenza ogni anno, i virus sono una minaccia costante per la salute pubblica. Sebbene i vaccini costituiscano la maggior parte della risposta a queste sfide globali per la salute pubblica, fa riflettere notare che queste contromisure sono semplicemente reattive ^1,2. Inoltre, un ritardo tra l'emergere di un nuovo ceppo infettivo e il successo dello sviluppo del suo vaccino è inevitabile³, portando a un periodo in cui le misure disponibili per frenare la diffusione del virus sono altamente limitate.

Questi ritardi sono ulteriormente enfatizzati dai costi che vengono inflitti alla società, economicamente e socialmente. L'influenza stagionale da sola è responsabile di circa 8 miliardi di dollari di costi indiretti, 3,2 miliardi di dollari di spese mediche e 36,3 mila morti negli Stati Uniti d'America ogni anno⁴. Questo prima di considerare i costi di ricerca necessari per finanziare lo sviluppo del vaccino. Le epidemie hanno effetti ancora più gravi sulla società, aggravati dal crescente tasso di globalizzazione ogni anno, come evidenziato dalle interruzioni globali causate dall'emergere e dalla rapida diffusione del coronovirus della sindrome respiratoria acuta grave 2 (SARS-CoV-2)^5,6,7.

Studi recenti hanno dimostrato che i pazienti infetti che hanno una maggiore popolazione di cellule T innate attivate tendono ad avere un esito migliore della malattia ^8,9,10. Inoltre, la popolazione innata di cellule T è classificata in più sottogruppi: le cellule T invarianti associate alla mucosa (MAIT), le cellule T Vδ1 γδ, le cellule T Vδ2 γδ e le cellule T natural killer (NKT). Questi sottogruppi di cellule T innate mostrano anche eterogeneità all'interno delle loro popolazioni, aumentando la complessità delle interazioni tra le popolazioni cellulari coinvolte nella risposta immunitaria innata¹¹. Quindi, il meccanismo che attiva queste cellule T innate e la conoscenza dei sottogruppi specifici di cellule T innate possono fornire una diversa via di ricerca per ridurre gli effetti infettivi di questi virus sull'ospite umano, specialmente durante il periodo di sviluppo del vaccino.

Le cellule epiteliali infettate dall'influenza producono fattori che attivano rapidamente le cellule T innate 12,13,14. Basandosi su questa scoperta, questo modello di co-coltura Air-Liquid Interface (ALI) senza contatto mira a imitare le prime interazioni chimiche (mediate da fattori solubili rilasciati dallo strato epiteliale infetto) tra lo strato epiteliale nasale infetto e le PBMC durante l'infezione precoce. La separazione fisica tra lo strato epiteliale nasale (coltivato su inserti di membrana) e le PBMC (nella camera sottostante) e l'integrità epiteliale prevengono l'infezione diretta delle PBMC da parte del virus, consentendo uno studio dettagliato degli effetti dei fattori solubili derivati dall'epitelio sulle PBMC. I fattori identificati possono quindi essere ulteriormente studiati per il loro potenziale terapeutico nell'indurre l'appropriata popolazione di cellule T innate che possono proteggere dall'infezione influenzale. Questo documento ha quindi dettagliato i metodi per stabilire una co-coltura per lo studio dell'attivazione innata delle cellule T da fattori solubili derivati dall'epitelio.

Protocol

NOTA: fare riferimento alla Tabella 1 per le ricette dei supporti utilizzati in questo protocollo.
NOTA: hNECS coltivati su transwell a 12 pozzetti sono stati trovati per crescere in uno spessore più ottimale per i fattori solubili per raggiungere facilmente la camera basale quando infettati dal virus dell'influenza. Quindi si raccomanda l'uso di transwell di dimensioni 12-well per la co-coltura.

1. Istituzione dello strato di alimentazione 3T3

1. Stabilimento a partire da scorte congelate
   1. Scongelare una crioviale di fibroblasti NIH / 3T3 da scorte congelate. Aggiungere il contenuto della crioviale a 2 ml di Minimal Essential Media (DMEM) completo di Dulbecco e risospescere le cellule.
   2. Centrifugare per 5 minuti a 300 × g e temperatura/pressione ambiente (rtp), ed eliminare il surnatante. Risospesce le celle in DMEM completo.
   3. Conta le cellule usando la colorazione blu trypan. Aggiungere 10 μL di tripano blu a 10 μL della sospensione cellulare risospesa. Mescolare accuratamente e aggiungere 10 μL della sospensione a un emocitometro per contare le cellule.
   4. Cellule di semi ad una densità di 1 × 10⁴ cellule/cm² in un piatto di coltura appropriato (ad esempio, pallone T75). Incubare il matraccio di coltura risultante per 3 giorni a 37 °C in un'atmosfera di CO_{2 al} 5%.
2. Trattamento con mitomicina C
   1. A 3 giorni, assicurarsi che la confluenza sia del 60% -80%, rimuovere il mezzo e lavare le cellule con 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
      NOTA: è importante che lo strato di alimentazione 3T3 non raggiunga la piena confluenza; in caso contrario, il trattamento con mitomicina C non sarà efficace.
   2. Aggiungere il DMEM completo integrato con mitomicina C al matraccio e incubare per 3,5 ore a 37 °C in un'atmosfera di CO_{2 al} 5%. Rimuovere il mezzo contenente mitomicina C e lavare le cellule 2x con 1x PBS.
3. Semina di cellule 3T3 in piastre a 6 pozzetti
   1. Aggiungere 3 mL di 1x tripsina-EDTA al pallone per 3-5 minuti per dissociare le cellule. Raccogliere le cellule dissociate in un tubo fresco da 15 ml. Centrifugare il tubo da 15 ml per 5 min a 300 × g, rtp; scartare il surnatante. Risospesce le celle in DMEM completo.
   2. Conta le cellule usando la colorazione blu trypan. Seminare le cellule in una piastra a 6 pozzetti a 7,5 × 10 5-2,5 × 10⁶ cellule/ pozzetto. Incubare la piastra durante la notte a 37 °C in un'atmosfera di CO_{2 al} 5%.
      NOTA: lo strato di alimentazione 3T3 è considerato pronto se le cellule sono sane. A questo punto, seminare le cellule staminali /progenitrici epiteliali nasali umane (hNESPC) sullo strato di alimentazione per l'espansione.
   3. Aggiungere DMEM completo al pallone e incubare a 37 ° C, 5% CO² durante la notte per le cellule 3T3 per recuperare dal trattamento con mitomicina C.

2. Istituzione della coltura di cellule epiteliali nasali umane (hNEC)

NOTA: I campioni clinici devono essere ottenuti da pazienti privi di sintomi di infezione del tratto respiratorio superiore.

1. Trasformazione del tessuto nasale in sospensione unicellulare
   1. Lavare il tessuto nasale in 1x PBS di Dulbecco (dPBS) (PBS senza Mg²⁺ e Ca²⁺) contenente 100 μL/mL di una miscela antibiotico-antimicotica. Tagliare il tessuto in piccoli frammenti e trattare il campione in 10 mg/mL di proteasi neutra durante la notte a 4 °C con agitazione.
   2. Centrifugare per 5 minuti a 200 × g e rimuovere il surnatante dopo la centrifugazione. Incubare il pellet in 1-2 ml di 1x tripsina-EDTA (37 °C, 15 min), e spegnere aggiungendo un volume di siero bovino fetale pari al 10% del volume nel tubo.
   3. Dissociare meccanicamente il tessuto digerito in aggregati unicellulari mediante pipettaggio, quindi far passare la sospensione risultante attraverso un filtro cellulare da 70 μm. Risospesce le celle in DMEM completo.
      NOTA: Dopo questo passaggio, la sospensione cellulare è una miscela di cellule terminalmente differenziate e cellule staminali che sono indicate come cellule staminali / progenitrici epiteliali nasali umane (hNESPC). L'obiettivo dei passaggi successivi è quello di selezionare e arricchire la popolazione hNESPC dalla miscela di diverse popolazioni cellulari.
2. Semina di una sospensione a cella singola sullo strato di alimentazione 3T3 per la selezione di hNESPC
   1. Centrifugare la sospensione cellulare dal punto 2.1.3 (300 × g, 5 min, rtp) e rimuovere il surnatante. Risospese le cellule in 3-5 mL di mezzo 3.
      NOTA: Medium 3 è formulato per promuovere la crescita selettiva delle hNESPC.
   2. Conta le cellule tramite la colorazione blu tripano. Semina 1 x 10⁶ celle in 2mL di mezzo 3 per pozzetto su piastra a 6 pozzetti contenente lo strato di alimentazione 3T3 preparato dopo aver rimosso il supporto nella piastra a 6 pozzetti. Incubare la co-coltura risultante a 37 °C in un'atmosfera di CO_{2 al} 5%.
      NOTA: Dopo la semina, fare attenzione a non agitare la piastra in quanto ciò influenzerà l'attacco degli hNESPC.
   3. Cambiare il mezzo 3 (2 ml) ogni 2-4 giorni rimuovendo completamente il vecchio mezzo e sostituendolo con il mezzo fresco 3.
      NOTA: Il mezzo viene modificato per reintegrare i nutrienti e per evitare che condizioni eccessivamente acide influenzino negativamente la crescita delle hNESPC. L'intervallo tra ogni cambiamento di mezzo dipende da quanto acido (giallo) diventa il mezzo. Gli intervalli dovrebbero essere accorciati se il mezzo diventa acido rapidamente.
   4. Dopo 7-10 giorni, osservare che le hNESPC sono ad una confluenza adatta per trasferirle su inserti a membrana. Vedere la Figura 1 per la morfologia rappresentativa delle hNESPC in 3 diversi timepoint (2 giorni, 5 giorni e 10 giorni).
3. Trasferimento di hNESPC su inserti a membrana
   NOTA: A causa del trattamento con mitomicina C, lo strato di alimentazione 3T3 si degraderà lentamente durante il periodo di espansione hNESPC. Ciò si tradurrà in un'adesione indebolita alla superficie del pozzo, consentendo il loro spostamento mediante lavaggio con una pipetta, lasciando dietro di sé solo le hNESPC sane.
   1. Rimuovere il mezzo e aggiungere 500 μL di 1x dPBS a ciascun pozzetto. Lavare le celle 3x con una micropipetta per rimuovere le celle 3T3 e scartare 1x dPBS. Osservare al microscopio che le hNESPC rotonde rimangono mentre lo strato di alimentazione 3T3 a forma di mandrino viene spostato.
   2. Aggiungere 500 μL di un reagente di disassociazione cellulare per pozzetto e incubare a 37 °C in un'atmosfera di CO_{2 al} 5% per 5-10 minuti, o fino a quando le hNESPC si sono staccate dalla superficie del pozzo.
   3. Raccogliere la sospensione hNESPC, la centrifuga (300 × g, 5 min, rtp) e rimuovere il surnatante.
   4. Risospesso il pellet in mezzo 3. Conta le cellule tramite la colorazione blu tripano. Seme 3 × 10⁴ cellule in 150 μL di mezzo 3 per inserto di membrana (piastra a 24 pozzetti) o 1 × 10⁵ cellule in 300 μL di mezzo 3 per inserto di membrana (piastra a 12 pozzetti) (Figura 2). Incubare le cellule a 37 °C in un'atmosfera di CO_{2 al} 5%.
   5. Cambiare il mezzo (medio 3) delle camere apicali e basali ogni 2 giorni. Navigare tra i bracci di supporto dell'inserto a membrana per accedere alla camera basale, rimuovere il vecchio mezzo e quindi reintrodurre il mezzo fresco con lo stesso metodo. Sebbene la camera apicale sia facilmente accessibile, fare attenzione a non disturbare lo strato hNESPC in crescita.
      NOTA: Non disturbare il mezzo nella camera apicale per almeno 2 giorni dopo la semina poiché le cellule hanno bisogno di tempo per attaccarsi alla membrana.
4. Differenziazione delle hNESPC in hNEC
   1. Quando le hNESPC raggiungono il 100% di confluenza (circa 3-7 giorni dalla semina sull'inserto a membrana), iniziare la coltura ALI. Cambiare il mezzo basale in mezzo di differenziazione e rimuovere il mezzo dalla camera apicale. Aggiungere il mezzo alla camera basale senza aggiungerlo alla camera apicale quando si cambia il mezzo ogni 2-3 giorni, come indicato nella Figura 3 e nel passaggio 2.3.5.
      NOTA: Medium viene cambiato in medium di differenziazione per promuovere la differenziazione degli hNESPC in hNEC in ALI. Le hNESPC impiegano circa 3-4 settimane per raggiungere la piena maturità per diventare hNEC in ALI, a quel punto le cellule sarebbero cresciute in un multistrato con diverse popolazioni di cellule in ogni strato. Le ciglia dovrebbero anche essere osservate con un ingrandimento di 400x (le ciglia possono essere identificate dal loro movimento di battito, che fa apparire il campo del microscopio come se stesse vibrando). A questo punto, le cellule sono pronte per essere utilizzate per gli esperimenti di co-coltura. Fare riferimento alla Figura 4 per la sezione trasversale di uno strato hNEC completamente differenziato.
   2. Dopo aver ottenuto hNEC maturi, lavare le cellule nella camera apicale 3x con 1x dPBS a intervalli di 2-3 giorni per 1 settimana prima dell'esperimento di co-coltura. Sinergizzare la fase di lavaggio con i cambiamenti del mezzo basale ed eseguire i lavaggi come segue.
      1. Aggiungere 50 μL (24-well)/150 μL (12-well) di 1x dPBS nella camera apicale dell'inserto a membrana e incubare le cellule a 37 °C per 10 min. Rimuovere il dPBS dopo 10 minuti di incubazione per rimuovere il muco accumulato e le cellule morte nel corso della differenziazione.
         NOTA: A seconda della natura dell'esperimento, la soluzione di bicarbonato di sodio può essere utilizzata per lavare completamente lo strato di muco. Tuttavia, per l'infezione virale negli esperimenti di co-coltura, lo strato di muco viene trattenuto e solo il muco in eccesso viene rimosso con il lavaggio dPBS. Questa ritenzione è quella di imitare lo strato di muco fisiologico presente sull'epitelio nasale che interagirà con l'infezione virale in arrivo.

3. Misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER)

NOTA: La conferma dell'integrità epiteliale è importante per garantire che si ottenga uno strato epiteliale intatto e sano. Uno strato epiteliale intatto viene determinato attraverso la misurazione TEER eseguita su 4 pozzi casuali utilizzando un voltohmmetro.

1. Risciacquare l'elettrodo con etanolo al 70% e sterilizzarlo con luce ultravioletta per 15 minuti prima dell'uso per garantire la sterilità. Risciacquare con 1x dPBS dopo la sterilizzazione.
2. Aggiungere 100 μL (per 24 pozzetti) o 300 μL (per 12 pozzetti) di 1x dPBS alla camera apicale dell'inserto a membrana. Incubare la piastra a 37 °C per 10 min; quindi, rimuovere il dPBS.
3. Per ogni pozzetto da misurare, preparare un pozzo inutilizzato con 1 mL (per 24 pozzetti) o 3 mL (per 12 pozzetti) di terreno di differenziazione preriscaldato (a 37 °C). Posizionare l'inserto a membrana nel pozzetto preparato e aggiungere 200 μL (per 24 pozzetti) o 600 μL (per 12 pozzetti) di mezzo di differenziazione preriscaldato alla camera apicale. Equilibrare a 37 °C (soggetto alla temperatura di incubazione del tipo di virus aggiunto, ad esempio 35 °C per l'influenza) per 15 min.
   NOTA: Preparare un blank (inserto a membrana vuoto) allo stesso modo per il calcolo del TEER.
4. Equilibrate anche un tubo da 15 mL di mezzo di differenziazione preriscaldato alla stessa temperatura per 15 minuti. Posizionare gli elettrodi nel tubo da 15 ml e accendere il voltohmmetro.
   NOTA: A questo punto, la lettura dovrebbe essere 0 resistenza, in quanto gli elettrodi sono nello stesso mezzo. Se si ottiene qualsiasi altra lettura, equilibrare l'elettrodo nel tubo da 15 ml fino a quando la lettura è 0.
5. Partendo dal bianco, posizionare gli elettrodi in ciascun pozzetto in modo tale che un elettrodo sia immerso nel mezzo della camera apicale e l'altro nel mezzo della camera basale. Registrare la lettura solo quando si ottiene una lettura costante per un periodo di almeno 5 min.
6. Dopo ogni misurazione, lavare l'elettrodo con PBS prima della misurazione successiva. Per ogni pozzo testato, prendere misure per tre campioni in diverse posizioni della membrana. Per calcolare il TEER netto di ciascun campione, sottrarre la resistenza di fondo, data dall'inserto a membrana vuota, da ogni misurazione.
7. Calcola la lettura totale del TEER per un pozzo usando la seguente equazione:
   Integrità epiteliale (Ωcm²) = Net TEER(ohm) × Area della membrana (cm²)
   NOTA: I valori TEER delle hNEC per gli esperimenti di infezione virale devono essere >1000 Ωcm² 13,15,16. 

4. Isolamento dei monociti del sangue periferico e delle cellule NK

NOTA: I campioni di sangue devono essere ottenuti da volontari sani e utilizzati lo stesso giorno di isolamento.

1. Raccogliere 30-40 ml di sangue intero da ciascun donatore in 10 ml di provette per la raccolta del sangue.
2. Isolare i PBMC utilizzando la centrifugazione a gradiente di densità e ottenere PBMC dal buffy coat dopo i passaggi seguenti (vedere anche la Tabella dei materiali).
   1. Mescolare accuratamente ~ 10 ml di sangue dal tubo di raccolta del sangue in un vacutainer prima di diluire con un volume uguale di soluzione salina bilanciata (PBS).
   2. Aggiungere 15 mL di gradiente di densità medio alla base di un tubo da 50 mL.
      NOTA: Il rapporto tra gradiente di densità medio e sangue diluito deve essere 2:3-3,5.
   3. Strato 35 mL di sangue diluito sul mezzo gradiente di densità con una pistola a pipetta (con l'impostazione di erogazione impostata al minimo possibile) inclinando il tubo di 45° e permettendo al sangue diluito di cadere a goccia sulla parete interna del tubo in modo che lo strato di gradiente di densità medio non sia disturbato.
   4. Centrifuga lisata a 500 × g, 18-20 °C per 30 min (freno: spento). Rimuovere con cura e scartare lo strato di plasma superiore senza disturbare lo strato inferiore.
   5. Trasferire il buffy coat in un nuovo tubo senza mescolare lo strato di globuli rossi, lo strato medio di densità sfumata o il buffy coat. Una volta che il buffy coat è stato raccolto in un nuovo tubo da 50 mL, ricaricare il volume a 50 mL con 1x PBS.
   6. Centrifugare lisare a 800 × g, 18-20 °C, 8 min (freno: spento), e rimuovere il surnatante con una pistola a pipetta. Risospesciare il pellet cellulare con 50 mL di 1x PBS e centrifugare a 120 × g, 18-20 °C, 10 min per rimuovere le piastrine.
   7. Scartare il surnatante mediante pipettaggio, senza disturbare il pellet cellulare.
      NOTA: Poiché il pellet cellulare potrebbe essere sciolto, è sconsigliabile scartare il surnatante versando.
   8. Risospesciare il pellet cellulare con un supporto RPMI (Roswell Park Memorial Institute) completo. Eseguire un conteggio cellulare aggiungendo 10 μL di acido acetico al 3% con blu di metilene a 10 μL della sospensione cellulare risospesa. Mescolare accuratamente e aggiungere 10 μL della miscela a un emocitometro per contare le cellule.
3. PBMC diluiti con RPMI completo medio ad una densità di 2 × 10⁶/mL (per 24 pozzetti) o 4 × 10⁶/mL (per 12 pozzetti).

5. Infezione virale hNEC e transizione alla co-coltura hNEC:PBMC

NOTA: H3N2 (A/Aichi/2/1968) è usato come ceppo rappresentativo dell'infezione in questo protocollo. La molteplicità dell'infezione (MOI) di 0,1 è usata come MOI rappresentativa in questo protocollo.

1. Giorno 0 (Infezione da hNEC)
   NOTA: Un pozzo delle hNEC cresciuto dallo stesso donatore viene utilizzato per ottenere un conteggio cellulare rappresentativo per ogni pozzo utilizzato nell'esperimento.
   1. Nel pozzetto rappresentativo, aggiungere 150 μL di 1x tripsina-EDTA alla camera apicale dell'inserto a membrana e 350 μL di 1x tripsina-EDTA alla camera basale, e incubare a 37 °C per 10 minuti, o fino a quando le cellule si staccano dalla membrana.
   2. Lavare le cellule sulla membrana tubando su e giù e raccogliere la sospensione in un tubo centrifugo da 1,5 ml. Aggiungere 200 μL di DMEM completo per estinguere l'attività della tripsina. Conta le cellule tramite la colorazione blu tripano per ottenere il conteggio delle cellule per pozzo.
   3. Calcolare il MOI richiesto del virus in base al numero di cellule per pozzetto e diluire lo stock di virus di conseguenza con RPMI completo sul ghiaccio.
      NOTA: MOI 0,1 di 1,26 × 10⁶ hNEC per pozzetto = 1,26 × 10⁵ particelle virali H3N2 per pozzetto in 30 μL (per 24 pozzetti)/100 μL (per 12 pozzetti)
   4. Per i pozzetti rimanenti per l'esperimento di infezione, aggiungere 50 μL (per 24 pozzetti)/150 μL (per 12 pozzetti) di 1x dPBS nelle camere apicali degli inserti di membrana, incubare a 37 °C per 10 minuti e rimuovere 1x dPBS.
   5. Cambiare il mezzo basale negli inserti a membrana per completare il mezzo RPMI trasferendo gli inserti su una nuova piastra con RPMI completo aggiunto ai pozzetti (350 μL (per 24-well)/700 μL (per 12-well)).
      NOTA: quando gli hNESPC si sono completamente differenziati in hNEC, sono tolleranti/permissivi a supporti diversi per un massimo di 72 ore, senza modifiche alla morfologia o all'organizzazione quando il mezzo è passato a RPMI¹². RPMI viene utilizzato per supportare la crescita e il mantenimento della popolazione PBMC.
   6. Aggiungere i 30 μL (per 24-well)/100 μL (per 12-well) preparati dell'inoculo virale nella camera apicale dell'inserto di membrana, incubare a 35 °C in un'atmosfera di CO_{2 al} 5% per 1 ora e rimuovere l'inoculo virale dalla camera apicale.
   7. Cambiare il mezzo basale dell'inserto a membrana in un mezzo RPMI fresco completo e incubare a 35 °C in un'atmosfera di CO_{2 al} 5% per 24 ore.
2. Giorno 1 (istituzione della co-coltura hNECs + PBMC)
   1. Seminare il numero richiesto di PBMC in 150 μL (per 24 pozzetti)/300 μL (per 12 pozzetti) di mezzo RPMI completo aggiungendo direttamente la sospensione PBMC nella camera basale di ciascun pozzetto di hNEC non infetti o infetti dal giorno 0 (1,5 × 10⁶ per piastre a 24 pozzetti e 3 × 10⁶ per piastre a 12 pozzetti). Incubare a 37 °C per 24/48 h.
      NOTA: Il volume finale nella camera basale dopo l'istituzione della cocoltura è di 500 μL (per 24 pozzetti)/1000 μL (per 12 pozzetti).
3. Giorni 2-3 (raccolta di PBMC 48/72 h infezione post-virale)
   1. Raccolta di supernatanti apicali (infezione post-virale 48/72 h)
      1. Aggiungere 50 μL (per 24 pozzetti)/150 μL (per 12 pozzetti) di 1x dPBS a ciascuna camera apicale e incubare a 37 °C per 10 min. Raccogliere 1x dPBS in tubi da 1,5 mL. Aliquota 25 μL (per 24 pozzetti)/50 μL (per 12 pozzetti) del surnatante per il saggio della placca in un nuovo tubo da 1,5 mL e congelare immediatamente sia il materiale che le aliquote a -80 °C.
   2. Raccolta di RNA cellulare da hNECs (infezione post-virale 48/72 h)
      1. Trasferire l'inserto della membrana in un pozzo pulito, aggiungere 300 μL (per 24-well)/600 μL (per 12-well) di tampone di lisi dell'RNA alla camera apicale e incubare a rtp per 5 min. Raccogliere il surnatante in un tubo di centrifuga da 1,5 ml e conservarlo a -80 °C fino all'estrazione dell'RNA per l'analisi molecolare.
   3. Raccolta PBMC (48/72 h infezione post-virale)
      1. Con l'ampia base di una punta di pipetta sterile, raschiare delicatamente la superficie del pozzo per rimuovere i PBMC attivati che potrebbero essere aderenti alla superficie del pozzo. Raccogliere il mezzo basale contenente PBMC in un tubo di centrifuga da 2 ml.
      2. Lavare i pozzetti 2x con 300 μL di 1x dPBS e raccogliere il lavaggio nello stesso tubo da 2 mL. Centrifugare il tubo da 2 mL (500 × g, 5 min, rtp) e raccogliere il surnatante in un tubo fresco da 2 ml senza disturbare il pellet cellulare. Conservare il surnatante a -80 °C per l'analisi delle citochine e delle chemochine; risospese il pellet di cella in 200 μL di 1x dPBS.

6. Citometria a flusso

NOTA: questa sezione del protocollo viene continuata direttamente dalla sezione precedente utilizzando la sospensione della cella PBMC dal passaggio 5.3.3.2. Garantire un'esposizione minima alla luce durante i passaggi seguenti in questa sezione. Un pannello campione di marcatori di colorazione superficiale è disponibile nella Tabella 2.

1. Colorazione superficiale
   1. Trasferire il pellet di cella PBMC risospeso in una piastra del pozzo inferiore a 96 V. Centrifugare lisare a 800 × g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.
   2. Incubare tutti i PBMC (ad eccezione di quelli "non macchiati") con 100 μL di una macchia di vitalità per 15 minuti a rtp. Ricarica fino a 200 μL con 150 μL di buffer MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting). Centrifugare lisare a 800 × g per 3 minuti e scartare il surnatante.
   3. Preparare un pannello di anticorpi coloranti superficiali di interesse con opportuni rapporti di diluizione e un volume finale di 50 μL per reazione (rabbocco con tampone MACS per ottenere il volume finale). Eseguire la colorazione superficiale aggiungendo 50 μL della miscela di anticorpi preparata alle cellule utilizzando una pipetta multicanale. Incubare a 4 °C per 15 minuti al buio.
   4. Lavare aggiungendo 150 μL di buffer MACS. Centrifugare lisare a 800 × g per 3 minuti e scartare il surnatante. Se non è richiesta la colorazione intracellulare, procedere direttamente all'incubazione di 15 minuti nel passaggio 6.3.
2. Colorazione intracellulare (se necessario)
   1. Aggiungere 100 μL di una soluzione di fissazione e permeabilizzazione a ciascun pozzetto. Incubare a 4 °C per 20 minuti al buio. Riempire i pozzetti con 100 μL di 1x buffer MACS.
   2. Centrifugare (800 × g, 3 min, 25 °C) e rimuovere il surnatante. Ripetere il lavaggio aggiungendo 200 μL di 1x tampone di lavaggio permeabilizzazione. Centrifugare (500 × g, 3 min, 25 °C) e rimuovere il surnatante.
   3. Preparare le diluizioni per il pannello anticorpale di interesse per ottenere un volume finale di 50 μL utilizzando 1x tampone di lavaggio a permeabilizzazione. Incubare sul ghiaccio per 30 minuti al buio. Aggiungere 200 μL di 1x tampone di lavaggio a permeabilizzazione.
   4. Centrifugare le cellule (800 × g, 3 min, 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospesciare le cellule in 100 μL di tampone di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza.
3. Pipettare 200 μL di una soluzione di lisatura in ciascun pozzetto. Incubare per 15 minuti a rtp. Centrifugare lisare a 800 × g per 3 minuti ed eliminare il surnatante.
4. Risospesare i pellet di cella in 200 μL di tampone MACS. Eseguire la citometria a flusso secondo le impostazioni descritte in precedenza¹³ o conservare a 4 °C al buio.

7. Determinazione dei livelli di citochine e chemochine

1. Elaborare 25 μL del surnatante a camera basale utilizzando un test multisala immunologico secondo il protocollo¹⁸ del produttore.
2. Calcola la concentrazione di ciascun analita utilizzando il software di gestione multiplex utilizzando un algoritmo di adattamento della curva (5 parametri) per la curva standard.

8. Valutazione della contaminazione virale

1. Estrarre l'RNA virale utilizzando un kit di estrazione su 4 set di soluzioni: la soluzione H3N2 di riserva, la diluizione MOI 0.1 per l'infezione, le diluizioni seriali 10x del MOI 0.1 e il mezzo basale dai campioni (infezione post-virale sia 48 che 72 h)¹².
2. Selezionare il gene non strutturale (NS1) e la matrice (M1) come bersagli per la reazione a catena della polimerasi (PCR) (vedere la Tabella dei materiali per i primer utilizzati nell'esperimento rappresentativo).
3. Eseguire la PCR a trascrizione inversa (RT-PCR) (42 °C, 60 min) per convertire l'RNA virale in cDNA prima di eseguire la PCR quantitativa (qPCR) per misurare i livelli di NS1 e M1 come proxy per la presenza virale e correlare i livelli alla curva standard ottenuta dalla RT-qPCR eseguita sulla diluizione seriale 10x dell'aliquota MOI 0.1. Fare riferimento alla Tabella 3 per la composizione delle miscele di reazione e utilizzare le seguenti condizioni: preincubazione a 95 °C per 10 minuti, seguita da un'amplificazione in 3 fasi per 40 cicli: 95 °C per 10 s, 60 °C per 10 s, 72 °C per 30 s; curva di fusione: 95 °C per 10 s, 65°C per 60 s e 97 °C per 1 s.

9. Analisi della placca

1. Giorno 0: semina MDCK (Madin Darby Canine Kidney) in piastre a 24 pozzetti
   1. Rimuovere il mezzo da un pallone T75 di celle MDCK confluenti. Lavare 2x con 1x PBS per rimuovere tutte le tracce di siero. Tripsinizzare le cellule MDCK aggiungendo 10 ml di tripsina e incubando a 37 °C in un'atmosfera di CO₂ al 5% per 20-30 minuti fino a quando le cellule si staccano.
      NOTA: non toccare il pallone in quanto ciò potrebbe causare aggregazione.
   2. Pipettare la sospensione cellulare in un tubo da 15 mL contenente 2 mL di Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM) completo. Centrifugare (300 × g, 5 min, rtp) e rimuovere il surnatante.
   3. Risospesere le celle in 6 mL di EMEM completo. Conta le cellule con la colorazione blu del tripano.
   4. Diluire la sospensione cellulare MDCK ad una concentrazione di 1 × 10⁵ cellule/mL e seminare 1 mL della sospensione diluita in ciascun pozzetto di una piastra sterile a 24 pozzetti. Incubare a 37 °C in un'atmosfera di CO_{2 al} 5% per 24 ore per ottenere un monostrato confluente di cellule MDCK in ciascun pozzetto.
2. Giorno 1: infezione delle cellule MDCK
   1. Preparare il mezzo di infezione. Rimuovere il mezzo dal monostrato MDCK nella piastra a 24 pozzetti e lavare 2 volte con 1x dPBS. Per il secondo lavaggio, lasciare il PBS nei pozzetti mentre si preparano le diluizioni seriali del virus.
   2. Scongelare i campioni di virus sul ghiaccio e diluirli in serie in una piastra a 24 pozzetti per ottenere diluizioni seriali da ^10-1 a ^10-6.
      NOTA: Ad esempio, riempire ogni pozzetto in una piastra a 24 pozzetti con 270 μL di terreno di infezione.
   3. Aggiungere 30 μL del campione di virus al primo pozzetto della fila. Con una nuova punta della pipetta, mescolare bene e trasferire al pozzo successivo nella fila per diluire il campione di 10 volte. Procedere fino a quando non è stata raggiunta una diluizione ^{di 10-6} ; eseguire i passaggi 9.2.1-9.2.3 per tutti i campioni di virus.
   4. Rimuovere PBS dalla piastra MDCK e infettare in duplice copia con 100 μL delle diluizioni virali preparate. Per i pozzetti di controllo, aggiungere 100 μL del mezzo di infezione (senza il campione virale). Incubare a 35 °C in un'atmosfera di CO_{2 al} 5% per 1 ora, agitando la piastra per eliminare i punti asciutti ogni 15 minuti.
   5. Rimuovere l'inoculo virale e aggiungere 1 mL di rivestimento liquido per ciascun pozzetto. Incubare a 35 °C in un'atmosfera di CO_{2 al} 5% per 72 ore.
3. Giorno 4 (72 h post-infezione): visualizzazione della placca
   1. Rimuovere la sovrapposizione liquida e fissare le cellule con il 4% di formaldeide in 1x PBS per 1 ora. Rimuovere la soluzione di formaldeide e lavare una volta con 1x PBS o acqua distillata.
   2. Macchiare le cellule fisse aggiungendo una soluzione viola cristallina all'1% per 15 minuti. Rimuovere il colorante viola cristallino e lavare le cellule con acqua corrente. Asciugare la piastra a rtp.
   3. Una volta asciutto, conta le placche e calcola il titolo virale secondo la seguente formula:
      Numero di placche × fattore di diluizione = numero di placche - unità formanti in 100 μL

Representative Results

Sebbene le cellule T convenzionali costituiscano il principale repertorio di risposta immunitaria adattativa contro l'infezione virale per facilitare la clearance virale, la popolazione innata di cellule T lavora su uno spettro più ampio per sopprimere la carica virale per una clearance efficace in una fase successiva. Pertanto, questo protocollo crea specificamente una condizione robusta per studiare le cellule T innate, la loro attivazione e la loro popolazione funzionale a seguito dell'infezione influenzale, senza bisogno di campioni di cellule epiteliali e immunitarie dello stesso donatore. Questo protocollo può essere applicato anche ad altri virus, anche se può essere limitato ai virus a rilascio apicale, cioè nessun virus deve entrare nello strato basale per entrare in contatto con il compartimento PBMC.

Sulla base dei risultati rappresentativi nella Figura 1, questo protocollo può aiutare a ottenere popolazioni hNESPC cresciute da una sospensione cellulare primaria in uno strato di alimentazione 3T3. La Figura 1 fornisce un esempio della progressione prevista delle hNESPC man mano che crescono sullo strato di alimentazione 3T3. Queste cellule saranno utilizzate per la differenziazione nella coltura ALI per ottenere hNEC multistrato, complete di cellule funzionali ciliate e calici (Figura 4). Utilizzando gli hNEC, l'attivazione innata delle cellule T può essere studiata utilizzando la citometria a flusso. I risultati mostrati nella Figura 5 mostrano il rilevamento di cellule MAIT, cellule γδ-T e popolazioni di cellule NK, che sono state significativamente aumentate in co-colture che coinvolgono hNEC infettate dal virus dell'influenza. Questa configurazione può quindi essere applicata ad altri ceppi del virus dell'influenza per stuzzicare la popolazione universale tra i ceppi, così come altri virus e la loro capacità di attivare popolazioni di cellule T innate. Inoltre, il pannello di rilevazione può anche essere personalizzato in base alla popolazione di cellule immunitarie innate di interesse per osservare la loro rispettiva attivazione in condizioni di co-coltura con cellule epiteliali infette.

Figura 1: hNESPC coltivati su uno strato di alimentazione 3T3 a 2/5/10 giorni dalla semina. Giorno 2: Nota le isole di hNESPC (un esempio è delimitato con una freccia bianca) che dovrebbero essere osservate 2 giorni dopo la semina sullo strato di alimentazione 3T3. Giorno 5: Gli isolotti osservati il giorno 2 dovrebbero ora essere più grandi (esempi di isole di hNESPC sono delimitati da cerchi verdi) e lo strato 3T3 dovrebbe essere osservato come degenerativo. Giorno 10: Gli hNECPS dovrebbero dominare l'intera piastra con poche o nessuna cella 3T3 visibile. Barre di scala per il giorno 2 e il giorno 5 = 50 μm in base a un ingrandimento di 200x, barra di scala per il giorno 10 = 100 μm in base a un ingrandimento di 100x. Abbreviazione: hNESPC = cellule staminali/progenitrici dell'epitelio nasale umano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Diagrammi dei pozzi per inserti a membrana in piastre a 24 pozzetti e 12 pozzetti. Notare il volume medio da utilizzare per ogni compartimento. Le hNESPC sono seminate nelle camere apicali degli inserti a membrana. Abbreviazione: hNESPC = cellule staminali/progenitrici dell'epitelio nasale umano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Diagrammi di pozzo per inserti a membrana in piastre a 24 pozzetti e 12 pozzetti per l'istituzione di co-colture ALI. Notare il volume medio da utilizzare per ogni compartimento. Notare le differenze nel volume medio da utilizzare per i diversi intervalli (2 giorni/3 giorni) tra i cambi medi. Abbreviazione: ALI = interfaccia aria-liquido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: β4-Tubulina e MUC5AC co-macchia di uno strato hNEC. β4-Tubulina è macchiata di verde, mentre MUC5AC è macchiata di rosso. I nuclei sono colorati di blu con DAPI. MUC5AC indica la presenza di cellule caliciformi produttrici di muco, mentre β4-tubulina indica la presenza di ciglia sulle cellule ciliate. Barra di scala = 20 μm in base all'ingrandimento 600x. Abbreviazioni: hNEC = cellula epiteliale nasale umana; MUC5AC = mucina 5AC; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Risultati rappresentativi delle PBMC incubate con o senza epitelio nasale o epitelio infetto da influenza per 24 ore. L'attivazione di cellule MAIT, Vδ1 T, Vδ2 T e cellule NK è stata determinata da marcatori specifici del tipo di cellula, tra cui Vα 7.2 TCR, Vδ1 TCR, Vδ2 TCR, CD56 e CD69. I valori sopra le porte indicano la percentuale di cellule CD69-positive. Abbreviazioni: PBMC = cellule mononucleate del sangue periferico; Epith = epitelio nasale; FLU-Epith = epitelio infetto da influenza; MAIT = cellule T invarianti associate alla mucosa; NK = natural killer; TCR = recettore delle cellule T; CD = cluster di differenziazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Medio	Ricetta	Composizione	Commenti
Medio 3	DMEM/Miscela di nutrienti F-12	500 ml
	Fattore di crescita epiteliale umano	5 ng/ml
	Insulina	2,5 μg/mL
	Tossina del colera	0,1 nM
	Idrocortisone	0,5 μg/mL
	3,3',5-triiodo-l-tironina	2 nM
	Supplemento N-2	5 ml	10 μL/mL
	Antibiotico-Antimicotico	5 ml
Mezzi di differenziazione	PneumaCult-ALI Mezzo Basale	441 ml
	PneumaCult-ALI 10x Supplemento	50 ml
	Soluzione di idrocortisone (200x)	2,5 ml
	0,2% (2 mg/mL; 1000 UI/mL) di sale sodico di eparina in soluzione salina tamponata con fosfato	1 ml
	Antibiotico-Antimicotico (100x)	5 ml
	Supplemento di manutenzione PneumaCult-ALI (100x)	500 μL	Solo da aggiungere subito prima dell'uso
Complete Dulbecco's Minimal Essential Medium (DMEM)	DMEM/Alto glucosio	450 ml
	Siero bovino fetale inattivato termicamente	50 ml
	Antibiotico-Antimicotico (100x)	5 ml
Completo Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medio	RPMI 1640 (w L-Glutammina)	445 ml
	Siero bovino fetale inattivato termicamente	50 ml
	Antibiotico-Antimicotico (100x)	5 ml
Complete Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM)	EMEM (w L-Glutammina)	450 ml
	Siero bovino fetale inattivato termicamente	50 ml
Infezione Media	EMEM (w L-Glutammina)	4 ml
	TPCK Tripsina (500 μg/mL)	8 μL	Concentrazione finale di tripsina TPCK di 1 μg/mL
Buffer di smistamento delle celle ad attivazione magnetica	1x PBS	498 ml
	0,5 M EDTA	2 ml
	BSA (Grado di coltura tissutale)	2,5 g
Mitomicina C-supplemented DMEM completo	DMEM completo	10 ml
	Mitomicina C	500 μL	Mitomicina C (10 μg/mL)

Tabella 1: Ricetta per i media utilizzati.

Marcatore di superficie cellulare	Fluoroforo
Vδ1 Recettore delle cellule T (TCR)	Isotiocianato di fluoresceina (FITC)
Vδ2 TCR	Peridina-cholorphyll-protein (PerCP)
CD3 ·	V500 ·
CD8 ·	Colorante allococianina-cianina 7 (APC-Cy7)
CD14 ·	Ficoeritrina (PE)-CF594
CD56 ·	Ficoeritrina (PE)-Cianina 7 (Cy7)
CD69 ·	Viola brillante 421 (BV421)
CD83 ·	Alloficocianina (APC)
CD161 ·	Viola brillante 605 (BV605)
Vα 7,2	Ficoeritrina (PE)
CD38 ·	Brillante UltraViolet 395 (BUV395)

Tabella 2: Marcatori di colorazione superficiale del campione.

Miscela di reazione qPCR	qPCR Master Mix	5 μL
	Acqua senza nucleasi	3 μL
	Primer in avanti (1 mM)	0,5 μL
	Primer inverso (1 mM)	0,5 μL
	cDNA (12,5 ng/μL)	1 μL
	Volume totale di reazione	10 μL
Miscela di reazione RT-PCR	RT-PCR 5x Buffer	2,5 μL
	Primer casuali (500 ng/μL)	0,2 μL
	Inibitore della RNasi	0,625 μL
	Miscela dNTP	2,5 μL
	Trascrittasi inversa	0,5 μL
	RNA (200 ng/μL)	1 μL
	Acqua senza nucleasi	12,675 μL
	Volume totale di reazione	20 μL

Tabella 3: Ricetta per miscele di reazioni di reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR) e PCR quantitativa (qPCR).

Discussion

Le risposte immunitarie innate contro i virus sono un campo di studio poco studiato nella gestione antivirale. Le cellule epiteliali delle vie aeree e le cellule immunitarie innate lavorano di concerto per sopprimere la replicazione virale durante un'infezione, oltre a servire come determinante della risposta adattativa iperattiva se la carica virale non viene tenuta sotto controllo 12,13,17. Tuttavia, lo sviluppo di un modello umano rilevante per lo studio del crosstalk immunitario epiteliale-innato per studiare l'attivazione delle cellule immunitarie innate per conferire una risposta antivirale appropriata rimane una sfida. Quindi, questo modello di co-coltura ALI rappresenta una tecnica versatile che può essere utilizzata per valutare tutta una serie di interazioni tra lo strato epiteliale nasale e le cellule immunitarie. Poiché questo modello combina hNEC differenziate in vitro, analisi di attivazione PBMC tramite citometria a flusso e infezione virale, molti dei passaggi cruciali sono stati chiaramente delimitati per garantire il successo di questo protocollo. Inoltre, ulteriori modifiche possono essere apportate anche alla parte delle vie aeree coinvolta in cui possono essere utilizzate cellule differenziate in vitro sia dalle vie aeree superiori che da quelle inferiori, aggiungendo un altro livello di versatilità al protocollo.

Tuttavia, quando si lavora con la diafonia delle cellule epiteliali-immunitarie nell'infezione virale, è fondamentale che i virus non interagiscano direttamente con i PBMC per identificare i primi fattori solubili locali derivati dall'epitelio rilasciati dalle hNEC. Pertanto, questo modello è più adatto per esaminare i virus con rilascio virale polarizzato, in cui i virus fuoriescono solo dalla superficie apicale nella camera apicale, ad esempio i virus dell'influenza¹² e il virus SARS-CoV-2¹⁹. Inoltre, per evitare perdite di virus a rilascio apicale nella camera basale compromettendo l'esperimento, è vitale uno strato epiteliale intatto di spessore sufficiente. Pertanto, è importante eseguire la misurazione TEER e la quantificazione dell'RNA virale per garantire che i risultati siano privi di perdite virali nella camera basale 13,16,20. Una lettura TEER di >1000 implica un multistrato intatto di cellule adatte a virus a rilascio polarizzato; il mezzo basale deve essere privo di qualsiasi contaminazione virale da RNA 13,15,16. Tuttavia, l'utilità del modello per i virus a rilascio bidirezionale, come i rinovirus, rimane da esplorare¹⁶. Tali virus non si limitano a rilasciare la loro progenie in modo polarizzato e possono rilasciare bidirezionalmente nuovi virus nelle regioni apicali e basali dell'epitelio. È necessaria un'ulteriore ottimizzazione prima che questo modello possa essere applicato ai virus con rilascio non polarizzato.

Poiché questo protocollo prevede il lavoro con campioni umani di individui diversi, non ci sono due campioni di hNEC che mostreranno le stesse proprietà e risposte^12,16. Ad esempio, la viscosità del muco prodotto dallo strato hNEC differenziato terminalmente potrebbe differire notevolmente. La velocità di sviluppo delle ciglia può anche essere diversa. E' quindi importante esercitare un certo livello di flessibilità nell'aderire agli orientamenti stabiliti nel presente protocollo. Mentre è certamente possibile utilizzare linee cellulari epiteliali, questo rimuoverebbe la complessità (muco, interazioni tra diversi tipi di cellule) delle interazioni tra i diversi tipi di cellule dello strato epiteliale, che sarebbe l'ideale per indagare su come la diafonia epiteliale influenza le risposte dei PBMC. Una linea cellulare primaria è necessaria per imitare la fisiologia dei tessuti nasali, dove le cellule sono multistrato e i diversi tipi di cellule sono localizzati nella propria nicchia individuale, anche se la variabilità potrebbe essere un problema. La variabilità in questo senso può essere superata utilizzando il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per differenziare e separare la popolazione eterogenea di cellule.

I tipi di interazioni che possono essere valutati sono infatti limitati dall'origine dei PBMC e degli hNEC. Quando i PBMC e gli hNEC sono ottenuti da donatori diversi, è fondamentale garantire l'integrità e la separazione epiteliale. Quando i PBMC entrano in contatto con le hNEC, potrebbero verificarsi reazioni immunitarie allogeniche. Quindi, le uniche interazioni rilevanti sono interazioni mediate da fattori solubili che possono passare attraverso gli inserti di membrana, come è stato descritto nel protocollo sopra. Tuttavia, quando entrambe le popolazioni di cellule provengono dallo stesso individuo, questo modello ha un ulteriore livello di utilità in quanto le reazioni convenzionali delle cellule immunitarie tra le hNEC e la popolazione PBMC possono ora essere valutate, compresa la citotossicità mediata dalle cellule T e le risposte mediate dagli anticorpi. Inoltre, possono essere eseguiti anche studi epigenetici per esaminare come le modifiche al genoma possono influenzare l'espressione / secrezione del gene / proteina delle citochine.

Inoltre, diverse popolazioni cellulari possono essere aggiunte alla camera basale per indagare ulteriormente una popolazione specifica. Questo può essere eseguito isolando le popolazioni cellulari di interesse (cellule T, cellule NK, monociti) e introducendole nella camera basale invece che nelle PBMC. Tuttavia, questo modello non può essere utilizzato per studiare le interazioni cellulari che richiedono un contatto diretto a causa della separazione delle due popolazioni cellulari da parte della membrana. Come tale, l'indagine delle risposte immunitarie adattative può essere limitata da questo dettaglio. In conclusione, questo modello di co-coltura ALI offre un punto di partenza versatile per l'indagine in vitro della diafonia tra tessuti nasali e cellule immunitarie. Il protocollo descritto in questo manoscritto tenta di fornire una linea guida che sarà utile anche se le popolazioni / condizioni sono alterate.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free	Thermofisher	AM9260G	0.5M EDTA
1.5 mL SafeLock Tubes	Eppendorf	0030120086	1.5mL Centrifuge Tube
10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes	BD	366643	10mL Blood Collection Tubes
10x dPBS	Gibco	14200-075
10x PBS	Vivantis	PC0711
12-well Plate	Corning	3513
12-well Transwell Insert	Corning	3460	membrane insert
1x FACS Lysing Solution	BD	349202
2.0 mL SafeLock Tubes	Eppendorf	0030120094	2 mL centrifuge tube
24-well Plate	Corning	3524
24-well Transwell Insert	Corning	3470
3% Acetic Acid with Methylene Blue	STEMCELL Technologies	07060
3,3',5-triiodo-l-thyronine	Sigma	T-074
37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O	Sigma	533998
5810R Centrifuge	Eppendorf	5811000320
5 mL polypropylene tubes (flow tubes)	BD	352058
70 µm Cell Strainer	Corning	431751
A-4-62 Rotor	Eppendorf	5810709008
Accutase	Gibco	A1110501	Cell Dissociation Reagent
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062
Avicel CL-611	FMC Biopolymer	NA	Liquid Overlay
Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software	Bio-Rad Laboratories, Inc	171STND01	Multiplex Manager Software
Butterfly Needle 21 G	BD	367287
Cholera Toxin	Sigma	C8052
Crystal Violet	Merck	C6158
Cytofix/Cytoperm Solution	BD	554722	Fixation and Permeabilization Solution
Dispase II	Sigma	D4693	Neutral Protease
DMEM/High Glucose	GE Healthcare Life Sciences	SH30243.01
DMEM/Nutrient Mixture F-12	Gibco-Invitrogen	11320033
dNTP Mix	Promega	U1515	dNTP Mix
EMEM (w L-Glutamine)	ATCC	30-2003
EVOM voltohmmeter device	WPI, Sarasota, FL, USA	300523
FACS Lysing Solution	BD	349202	1x Lysing Solution
Falcon tube 15 mL	CellStar	188271	15 mL tube
Falcon tube 50 mL	CellStar	227261	50 mL Tube
Fast Start Essential DNA Probes Master	Roche	6402682001	qPCR Master Mix
Ficoll Paque Premium	Research Instruments	17544203	Density Gradient Media
H3N2 (A/Aichi/2/1968)	ATCC	VR547
H3N2 M1 Forward Primer Sequence	Sigma	5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'
H3N2 M1 Reverse Primer Sequence	Sigma	5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'
H3N2 NS1 Forward Primer Sequence	Sigma	5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'
H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence	Sigma	5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Gibco	10500-064
hNESPCs	Human Donors	NA
Human Epithelial Growth Factor	Gibco-Invitrogen	PHG0314
Hydrocortisone	STEMCELL Techonologies	7925	Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries
Insulin	Sigma	I3536
Lightcycler 96	Roche	5815916001	qPCR Instrument
Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation	Thermofisher	L23105	Viability Stain
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex	Merck Pte Ltd	HCP2MAG-62K-PX23	Immunology Multiplex Assay
Mitomycin C	Sigma	M4287
M-MLV 5x Buffer	Promega	M1705	RT-PCR 5x Buffer
M-MLV Reverse Transcriptase	Promega	M1706	Reverse Transcriptase
N-2 supplement	Gibco-Invitrogen	17502-048
NIH/3T3	ATCC	CRL1658
Perm/Wash Buffer	BD	554723	Permeabilization Wash Buffer
PneumaCult-ALI 10x Supplement	STEMCELL Techonologies	5001
PneumaCult-ALI Basal Medium	STEMCELL Techonologies	5001
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)	STEMCELL Techonologies	5001
Random Primers	Promega	C1181	Random Primers
Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor	Promega	N2511	RNase Inhibitor
RNA Lysis Buffer	Qiagen	Part of 52904
RPMI 1640 (w L-Glutamine)	ATCC	30-2001
STX2 electrodes	WPI, Sarasota, FL, USA	STX2	Electrode
T25 Flask	Corning	430639
T75 Flask	Corning	430641U
TPCK Trypsin	Sigma	T1426
Trypan Blue	Hyclone	SV30084.01
Viral RNA Extraction Kit	Qiagen	52904	Viral RNA Extraction Kit
V-Shaped 96-well Plate	Corning	3894