斑马鱼早期荧光微塑料的积累和分布

Summary

斑马鱼胚胎/幼虫在外部发育，具有光学透明度。在鱼类早期生命阶段，微塑料的生物积累很容易用荧光标记的微珠进行评估。

Abstract

微塑料作为一种新型的环境污染物，在水生环境中得到广泛应用，对水生生物构成极大威胁。微塑料的生物积累在其毒性作用中起着关键作用：然而，作为颗粒物，它们的生物累积与许多其他污染物不同。本文描述的是一种可行的方法，可以直观地确定使用荧光微塑料在斑马鱼胚胎或幼虫中的微塑料的积累和分布。胚胎暴露在直径为500纳米、时速为120小时的荧光微塑料的不同浓度（0.1、1和10毫克/升）中。结果表明，微塑料可以以依赖浓度的方式在斑马鱼胚胎/幼虫中生物积累。孵化前，在胚胎周围发现强烈的荧光：而在斑马鱼幼虫中，蛋黄囊、腹腔和胃肠道是微塑料的主要积累部位。结果表明，斑马鱼在早期生活阶段吸收和内化微塑料，这将为更好地了解微塑料对水生动物的影响提供依据。

Introduction

自20世纪首次合成以来，塑料在各个领域得到广泛应用，导致^{全球产量快速增长}。2018年，全球塑料产量约为^3.6亿吨。自然环境中的塑料会因化学、物理或生物过程而降解为细颗粒^。一般来说，大小 <为5毫米的精细塑料颗粒定义为微塑料^4。微塑料也设计用于特定的应用，如来自化妆品的微珠^5。微塑料作为近乎永久性的污染物，在环境中积累，越来越受到科学家、决策者^{和公众的关注。}先前的研究表明，微塑料可对鱼类造成不良影响，如胃肠道损伤^7、神经毒性^8、内分泌中断^9、氧化应激¹⁰和DNA损伤^11。然而，微塑料的毒性至今尚未完全暴露^出来。

斑马鱼胚胎具有小尺寸、外部受精、光学透明度和大离合器等多种实验优势，被认为是研究早期污染物对鱼类影响的理想模型生物体。此外，评估生物反应只需要有限的测试物质。在这里，斑马鱼胚胎暴露在不同浓度的微塑料（0.1，1，10毫克/升）5天，并评估斑马鱼胚胎/幼虫微塑料的生物积累和分布。这一结果将促进我们对微塑料对鱼类毒性的理解，此处描述的方法可能被推广，以确定斑马鱼早期生命阶段其他类型的荧光材料的积累和分布。

Protocol

成年斑马鱼起源于中国斑马鱼资源中心（中国武汉）。这些实验是按照国家指南"动物福利伦理审查实验室动物指南（GB/T35892-2018）进行的。

1. 胚胎收集

1. 在20升玻璃罐中保持鱼，在14：10 h光照下，在恒温下（28±0.5°C）重新循环木炭过滤的自来水系统（pH 7.0±0.2）： 黑暗。
2. 每天用 阿泰米亚·瑙普利喂鱼两次。建议每天以最多3%的鱼体重食用，每次¹⁴分钟应在5分钟内食用。
3. 在繁殖前一天晚上，将发育良好的成年斑马鱼（体长为3-4厘米）以一男两女的比例转移到产卵池中。
   注：第二天早上，鱼在光循环开始后开始产卵。
4. 使用巴斯德移液器收集鸡蛋。用 10% Hank 的溶液冲洗几次，然后使用显微镜检查受精。受精卵经过约 2 小时后期（ hpf ），可以清楚地识别^{15 。}
5. 将受精胚胎孵化在含有 200 mL 的 200 mL 的 10% Hank 溶液中的受精胚胎中，在 28 °C 时使用 1% 的甲基蓝色进行消毒。 不超过 1 胚胎/2 mL 溶液的加载速率。
   注：10% 汉克的解决方案由 137 m M NaCl、5.4 mM KCl、0.25 mM 纳₂HPO 4、0.44mM_{KH 2}PO_4、1.3mM 卡Cl_2、1.0mm MgSO₄和 4.2 m M 纳赫科₃组成。

2. 准备微塑料悬架

1. 将标称直径为 500 nm（激发/排放：460/500 nm）的绿色荧光标记聚苯乙烯珠 （10 毫克/mL） 的库存溶液声化，10 分钟。
2. 用 10% Hank 的解决方案稀释库存解决方案，以产生所需的暴露解决方案（0.1、1 和 10 毫克/升）。
3. 在暴露前，请始终准备微塑料的暴露解决方案。
   注：在评估微塑料的毒性作用时应谨慎，因为商业颗粒配方中存在防腐剂，如阿齐德钠，对不同的生物体 ^有毒。因此，在进行毒性实验之前，应去除这些添加剂或在控制中说明。

3. 微塑料暴露

1. 随机选择6个新受精胚胎（4 hpf），然后转移到每口6井板包含5mL的微塑料溶液，具有不同的浓度。包括包含 10% 汉克解决方案的控制组。
   1. 每次治疗使用三脚架井（共18个胚胎）。
2. 在同一光下孵化胚胎：与成人一样的暗周期和温度（见1.2），每12小时观察一次。立即将死者移走。
3. 每 24 小时更新 90% 的微塑料解决方案。在暴露期间，鱼不喂食。
   注：一般来说，胚胎的孵化开始于48马力，完成于约72马力。

4. 微塑料分布评估

1. 在24，48，72，96和120小时后受精，随机选择胚胎/幼虫（从三个复制品各一个），并冲洗10%汉克的解决方案。
2. 将幼虫转移到培养皿中，并暴露在0.016%的三卡因麻醉中。
   1. 准备三叶草的库存溶液：4毫克三卡因粉末溶解在100mL的双蒸馏水中，用三卡因-HCl（pH 9.0）将pH值调整到7.0。将库存溶液存放在冰箱中。
   2. 准备工作解决方案。将库存解决方案稀释到所需的浓度 （0.016%）在室温下用10%汉克的溶液^14。
3. 安排胚胎/幼虫并准备观察。
4. 使用荧光显微镜观察鱼，使用成像软件观察图像。
5. 用 ImageJ 量化鱼的荧光强度。

Representative Results

荧光微塑料的分布和积累表现在图1和表1中。未曝光组（控制）中未观察到可见荧光。然而，在接触不同浓度的微塑料（24 hpf）后，在胆汁周围发现荧光积累。在幼虫中也检测到绿色荧光，荧光水平似乎以浓度和时间依赖的方式增加。蛋黄囊、腹腔和胃肠道是微塑料的主要积累部位（图2）。

图1：斑马鱼胚胎/幼虫中荧光聚苯乙烯微塑料的分布（40×）。 鱼是从对照组或在0.1、1和10毫克/升的500纳米微塑料中接触的组中取样的。 比例杆100 μm 请单击此处查看此图的更大版本。

图2：斑马鱼幼虫微塑料堆积部位（40×）。 这种幼虫从以10毫克/升接触500纳米微塑料的组中取样120小时。 请单击此处查看此图的较大版本。

浓度	胚胎		幼虫
（毫克/升）	24 马力	48马力a	48马力 b	72 马力	96 马力	120马力
续。	1.2±0.1	2.6±0.3	2.2	3.0±0.2	2.6±0.7	3.3±0.3
1	1.2±0.2	5.0±0.1	5.3	7.5±0.5	8.7±0.5	10.0±1.9
0.1	7.0±0.9	26.1±2.9	8.9	18.4±0.7	16.3±2.8	25.7±2.7
10	9.1±1.1	82.3±5.3	30.4	32.7±3.2	41.6±0.4	44.1±0.9
a：只评估了两个胚胎： b：只评估了一只幼虫。

表1：接触荧光微塑料后斑马鱼荧光水平的变化（n=3）。 由于胆汁对荧光微塑料吸收的影响，数据被分为两部分，即胚胎（孵化前）和幼虫（孵化后）。

Discussion

根据《保护用于科学目的的动物的准则》，如欧盟2010/63/欧盟指令，在能够独立喂养（受精后5天^）17岁之前，对斑马鱼早期生命阶段的实验，动物伦理许可不是强制性的。然而，最佳福利做法对于优化斑马鱼的使用非常重要，例如，麻醉和安乐死的人道方法应引起关注。乙基3-氨基苯甲酸酯（MS-222，或三甲酸酯），在大多数实验室中经常使用的制剂，在这里用于麻醉和安乐死。

在显微镜下观察之前，胚胎和幼虫应进行冲洗，因为吸收在外部表面的微塑料可能会干扰结果。此外，胚胎/幼虫的自流，特别是蛋黄囊周围的自流，偶尔报告，可能是有问题的。许多生物分子的存在，如叶黄素，烟酰胺-腺苷二氯酰胺（NAD），芳香氨基酸，脂质素，先进的糖化终端产品，和拼贴画的存在，将发出光时兴奋在适当的波长。

值得注意的是，微塑料作为颗粒污染物，其大小被认为是生物利用和^{毒性的决定}性因素之一。这里使用的微塑料的名义直径为500纳米，与胚胎胆汁的孔径大小（在300纳米至1 μm范围内^）19进行比较。因此，这些微塑料不会轻易通过斑马鱼的胆汁。一贯地，在孵化前胚胎中很少可见荧光（图1）。由于胆汁将作为对抗大尺寸粒子的有效屏障，因此可能需要在暴露前进行减压过程。胆汁可以很容易地使用钳子去除，但当胚胎被批量处理时，用质酶进行酶去深处理是首选。然而，尽管去角质会增加生物利用性，并有助于高通量物质毒性筛查，但更建议具有胆汁完好无损的胚胎在考虑"真实"世界中的暴露状况时评估污染物的生态毒性。

虽然在调查微塑料对鱼类的不利影响方面已作出相当大的努力，但目前的知识，包括生物积累知识，仍然有限，甚至相互矛盾。这些跨研究不一致主要归因于粒子属性的差异，包括大小、密度和表面特征（例如表面电荷）。微塑料在溶液中的行为对生物利用性也至关重要。应在暴露持续时间内跟踪微塑料的物理化学特征，并记录可能发生的聚集现象。事实上，对于需要长时间悬挂微塑料的暴露，建议使用磁条发出声波或搅拌。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Nikon, Japan	Eclipse Ti-S
Green fluorescently labeled polystyrene beads	Phosphorex, USA	2103A
Tricaine	Sigma-Aldrich, USA	A5040