Summary
Gli embrioni/larve zebrafish si sviluppano esternamente e sono otticamente trasparenti. Il bioaccumulo delle microplastiche nei pesci nelle prime fasi della vita viene facilmente valutato con microperline etichettate fluorescentmente.
Abstract
Come nuovo tipo di inquinante ambientale, la microplastica è stata ampiamente trovata nell'ambiente acquatico e rappresenta un'alta minaccia per gli organismi acquatici. Il bioaccumulo delle microplastiche svolge un ruolo chiave nei loro effetti tossici; tuttavia, come particolato, i loro bioaccumulamenti sono diversi da molti altri inquinanti. Descritto qui è un metodo fattibile per determinare visivamente l'accumulo e la distribuzione di microplastiche negli embrioni di zebrafish o larve utilizzando microplastiche fluorescenti. Gli embrioni sono esposti a diverse concentrazioni (0,1, 1 e 10 mg/L) di microplastiche fluorescenti con un diametro di 500 nm per 120 h. Nei risultati viene dimostrato che le microplastiche possono bioaccumulare in embrioni/larve di zebrafish in modo dipendente dalla concentrazione. Prima della schiusa, si trova una forte fluorescenza attorno al coro embrionale; mentre nelle larve di zebrafish, il sacco tuorlo, il pericardio e il tratto gastrointestinale sono i principali siti accumulati di microplastiche. I risultati dimostrano l'assorbimento e l'internalizzazione delle microplastiche nei pesci zebra nelle prime fasi della vita, che forniranno la base per una migliore comprensione dell'impatto delle microplastiche sugli animali acquatici.
Introduction
Sin dalla prima sintetizzata nel 1900, le materie plastiche sono ampiamente utilizzate in vari campi, con conseguente rapida crescita della produzione globale1. Nel 2018, circa 360 milioni di tonnellate di plastica sono state prodotte in tutto il mondo2. Le plastiche nell'ambiente naturale si degradano a particelle fini a causa di processi chimici, fisici o biologici3. Generalmente, le particelle di plastica fine < di dimensioni di 5 mm sono definite come microplastiche4. Le microplastiche sono anche progettate per applicazioni specifiche, come le microperline dei prodotti cosmetici5. Poiché i contaminanti quasi permanenti, le microplastiche si accumulano nell'ambiente e hanno attirato una crescente attenzione da parte di scienziati, responsabili politicie pubblico 1,6. Studi precedenti hanno documentato che le microplastiche potrebbero causare effetti avversi nei pesci, come dannigastrointestinali 7,neurotossicità8,alterazione endocrina9,stress ossidativo10 e danni al DNA11. Tuttavia, la tossicità delle microplastiche non è stata finora completamente rivelata12,13.
Gli embrioni zebrafish offrono molti vantaggi sperimentali, tra cui piccole dimensioni, fertilizzazione esterna, trasparenza ottica e grandi frizioni, ed è considerato un organismo modello ideale per studiare in vivo gli effetti degli inquinanti sui pesci nelle prime fasi della vita. Inoltre, sono necessarie solo quantità limitate di sostanze di prova per la valutazione delle risposte biologiche. Qui, gli embrioni di zebrafish sono esposti a diverse concentrazioni di microplastiche (0,1, 1, 10 mg/L) per 5 giorni e vengono valutati il bioaccumulo e la distribuzione di microplastiche negli embrioni/larve di zebrafish. Questo risultato farà progredire la nostra comprensione della tossicità delle microplastiche per i pesci, e il metodo qui descritto può potenzialmente essere generalizzato per determinare l'accumulo e la distribuzione di altri tipi di materiali fluorescenti nelle prime fasi di vita del pesce zebra.
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Protocol
I pesci zebra adulti provengono dal China Zebrafish Resource Center (Wuhan, Cina). Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la guida nazionale "Laboratory Animal Guideline for Ethical Review of Animal Welfare (GB/T35892-2018).
1. Raccolta embrionale
- Mantenere il pesce in vasche di vetro da 20 L con sistema di acqua del rubinetto filtrata a carbone (pH 7,0 ± 0,2) a temperatura costante (28 ± 0,5 °C) su un fotoperiodo di 14:10 h di luce: scuro.
- Nutrire il pesce due volte al giorno con Artemia nauplii. Si raccomanda di dare al massimo il 3% di peso del pesce al giorno e di mangiarlo entro 5 minuti ogni volta14.
- Trasferire zebrafish adulti ben sviluppati (con una lunghezza del corpo di 3-4 cm) nel serbatoio di deposizione delle uova con un rapporto tra un maschio e due femmine la notte prima dell'allevamento.
NOTA: La mattina seguente, il pesce inizia a deporre le uova dopo l'inizio del ciclo leggero. - Raccogliere le uova utilizzando una pipetta Pasteur. Risciacquare più volte con la soluzione di Hank al 10%, quindi verificare la fecondazione utilizzando un microscopio. Le uova fecondate subiscono il periodo di scissione dopo circa 2 ore dopo la fecondazione (HPF) e possono essere chiaramente identificate15.
- Incubare gli embrioni fecondati in un bicchiere da 500 mL contenente 200 mL della soluzione del 10% di Hank con 1% di metilene blu per la disinfezione a 28 °C. Non superare una velocità di carico di 1 soluzione embrionale/2 mL.
NOTA: La soluzione di Hank al 10% è composta da NaCl da 137 mM, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4, 0,44 mM KH2PO4,1,3 mM CaCl2,1,0 mM MgSO4 e 4,2 mM NaHCO3.
2. Preparazione di sospensioni in microplastica
- Sonicare la soluzione stock di perline di polistirolo verdi etichettate fluorescentmente (10 mg/mL) con diametro nominale di 500 nm (eccitazione/emissione: 460/500 nm) per 10 minuti.
- Diluire la soluzione stock con la soluzione del 10% Hank per produrre le soluzioni di esposizione desiderate (0,1, 1 e 10 mg/L).
- Preparare sempre le soluzioni di esposizione delle microplastiche prima dell'esposizione.
NOTA: Bisogna prestare attenzione quando si valutano gli effetti tossici delle microplastiche, perché la presenza di conservanti, come l'azide di sodio, nelle formulazioni di particelle commerciali, può essere tossica per diversi organismi 16. Pertanto, questi additivi devono essere rimossi o contabilizzati nei controlli prima di condurre esperimenti di tossicità.
3. Esposizione alla microplastica
- Selezionare casualmente 6 embrioni appena fecondati (4 hpf), quindi trasferirli in ogni pozzo di piastra da 6 porri contenente 5 mL di soluzioni di microplastica con diverse concentrazioni. Includere i gruppi di controllo contenenti la soluzione del 10% di Hank.
- Utilizzare pozzi triplicati (con un totale di 18 embrioni) per ogni trattamento.
- Incubare gli embrioni sotto la stessa luce: ciclo buio e temperatura degli adulti (vedi 1.2) e osservare ogni 12 ore. Rimuovi immediatamente i morti.
- Rinnova le soluzioni di microplastica al 90% ogni 24 ore. Durante il periodo di esposizione, il pesce non viene nutrito.
NOTA: Generalmente, la schiusa dell'embrione inizia a 48 hpf e si completa a circa 72 hpf.
4. Valutazione della distribuzione di microplastiche
- A 24, 48, 72, 96 e 120 ore dopo la fecondazione, selezionare casualmente gli embrioni / larve (uno da ciascuno dei tre replicati) e risciacquare con la soluzione del 10% di Hank.
- Trasferire le larve in una piastra di Petri ed esporre allo 0,016% di tricaina per l'anestesia.
- Preparare la soluzione stock di tricaina: 4 mg di polvere di tricaina viene sciolta in 100 mL di acqua distillata doppia e regolare il pH a 7,0 con Tris-HCl (pH 9.0). Conservare la soluzione stock nel congelatore.
- Preparare la soluzione di lavoro. Diluire la soluzione stock alla concentrazione desiderata (0,016%) con soluzione 10% Hank a temperatura ambiente14.
- Disporre gli embrioni / larve e prepararsi per l'osservazione.
- Osserva il pesce con un microscopio a fluorescenza e un'immagine con il software di imaging.
- Quantificare l'intensità della fluorescenza nei pesci con ImageJ.
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Representative Results
La distribuzione e l'accumulo di microplastiche fluorescenti sono riportati nella figura 1 e nella tabella 1. Non si osserva fluorescenza visibile nel gruppo non esposto (controllo). Tuttavia, si trova un accumulo di fluorescenza che circonda il corore dopo l'esposizione a diverse concentrazioni di microplastiche (24 hpf). La fluorescenza verde viene rilevata anche nelle larve e i livelli di fluorescenza sembrano aumentare in modo dipendente dalla concentrazione e dal tempo. Il sacco tuorlo, il pericardio e il tratto gastrointestinale sono i principali siti accumulati di microplastiche (Figura 2).
Figura 1: Distribuzione di microplastiche fluorescenti in polistirolo negli embrioni/larve di zebrafish (40×). I pesci vengono campionati dal gruppo di controllo o dai gruppi esposti a microplastiche a 500 nm a 0,1, 1 e 10 mg/L. Barra di scala 100 μm Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Figura 2: I siti di accumulo di microplastica nelle larve di zebrafish (40×). Questa larva viene campionare dal gruppo esposto a microplastiche a 500 nm a 10 mg /L per 120 ore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| concentrazione | embrione | larva | ||||
| (mg/L) | 24 CV | 48 CV | 48 CV B | 72 CVF | 96 CVF | 120 CVF |
| Cont. | 1.2±0.1 | 2.6±0.3 | 2.2 | 3.0±0.2 | 2.6±0,7 | 3.3±0.3 |
| 1 | 1.2±0.2 | 5.0±0.1 | 5.3 | 7.5±0.5 | 8.7±0,5 | 10.0±1.9 |
| 0.1 | 7.0±0.9 | 26.1±2.9 | 8.9 | 18.4±0.7 | 16.3±2.8 | 25.7±2.7 |
| 10 | 9.1±1.1 | 82.3±5.3 | 30.4 | 32.7±3.2 | 41.6±0.4 | 44.1±0.9 |
| a:sono stati valutati solo due embrioni; b:è stata valutata una sola larva. | ||||||
Tabella 1: Variazione del livello di fluorescenza nel pesce zebra in seguito all'esposizione a microplastiche fluorescenti (n=3). A causa dell'influenza del coro sull'assorbimento delle microplastiche fluorescenti, i dati sono divisi in due parti, quella degli embrioni (prima della schiusa) e delle larve (dopo la schiusa).
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Discussion
Secondo le linee guida sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici, come la direttiva UE 2010/63/UE, l'autorizzazione all'etica animale non è obbligatoria per un esperimento con le prime fasi di vita del pesce zebra fino alla fase di capacità di alimentazione indipendente (5 giorni dopo la fecondazione)17. Tuttavia, le migliori pratiche di benessere sono importanti per ottimizzare l'uso del pesce zebra e, ad esempio, i metodi umani di anestesia ed eutanasia dovrebbero essere preoccupanti. L'etile 3-amminobenzoato metanosolfato (MS-222, o tricaina), l'agente abitualmente usato nella maggior parte dei laboratori, è impiegato qui per l'anestesia e l'eutanasia.
Prima dell'osservazione al microscopio, gli embrioni e le larve devono essere risciacquati poiché le microplastiche adsorbiti sulla superficie esterna potrebbero interferire con i risultati. Inoltre, l'autofluorescenza negli embrioni / larve, specialmente intorno al sacco vitellino, che è stato segnalato occasionalmente, potrebbe essere problematica. La presenza di molte biomacromolecole, come flavine, nicotinammide-adenina dinucleotide (NAD), amminoacidi aromatici, lipofuscine, prodotti finali avanzati di glicazione e collage, emetterà luce quando eccitata alla lunghezza d'onda appropriata.
È importante notare che, come inquinante del particolato, la dimensione della microplastica è considerata uno dei fattori determinanti della biodisponibilità e della tossicità18. Il diametro nominale della microplastica qui utilizzata è di 500 nm, che è comparativo con la dimensione dei pori del corione embrionale (nell'intervallo da 300 nm a 1 μm)19. Pertanto, queste microplastiche non dovrebbero facilmente passare attraverso il chorion zebrafish. Costantemente, c'è poca fluorescenza visibile negli embrioni prima della schiusa (Figura 1). Poiché il corore fungerà da barriera efficace contro le particelle di grandi dimensioni, il processo di dechorionation prima che possa essere necessaria l'esposizione. Il colino può essere rimosso facilmente usando le forcep, ma la dechorionazione enzimatica con pronasi è preferita quando gli embrioni vengono manipolati alla rinfusa. Tuttavia, sebbene la dechorionation aumenti la biodisponibilità e faciliti lo screening ad alta produttività per la tossicità delle sostanze, l'embrione con coro intatto è più raccomandato per valutare l'ecotossicità degli inquinanti quando si considera la condizione di esposizione nel mondo "reale".
Sebbene siano stati dedicati notevoli sforzi allo studio degli effetti negativi delle microplastiche sui pesci, le attuali conoscenze, compresa quella del bioaccumulo, rimangono limitate o addirittura contrastanti. Queste incongruenze tra studi sono principalmente attribuite alle differenze di proprietà delle particelle, incluse le dimensioni, la densità e le caratteristiche superficiali (ad esempio, la carica superficiale). Anche il comportamento delle microplastiche nella soluzione è fondamentale per la biodisponibilità. Le caratteristiche fisicochimiche delle microplastiche devono essere tracciate per tutta la durata dell'esposizione e il fenomeno di aggregazione che può verificarsi deve essere registrato. Infatti, per le esposizioni che richiedono la sospensione delle microplastiche per un lungo periodo, si raccomanda la sonicazione o l'agitazione con una barra magnetica.
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Disclosures
L'autore non dichiara interessi concorrenti o finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (21777145, 22076170) e dal Programma per studiosi e team di ricerca innovativi di Changjiang in University (IRT_17R97).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Nikon, Japan | Eclipse Ti-S | |
| Green fluorescently labeled polystyrene beads | Phosphorex, USA | 2103A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich, USA | A5040 |
References
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