Summary
Les embryons/larves de poisson zèbre se développent à l’extérieur et sont optiquement transparents. La bioaccumulation des microplastiques chez les poissons aux premiers stades de leur cycle biologique est facilement évaluée à l’autise avec des microbilles marqués par fluorescence.
Abstract
En tant que nouveau type de polluant environnemental, le microplastique a été largement présent dans le milieu aquatique et constitue une menace élevée pour les organismes aquatiques. La bioaccumulation des microplastiques joue un rôle clé dans leurs effets toxiques; cependant, en tant que particules, leurs bioaccumulations sont différentes de celles de nombreux autres polluants. Décrit ici est une méthode réalisable pour déterminer visuellement l’accumulation et la distribution des microplastiques dans les embryons de poissons zèbres ou les larves à l’aide de microplastiques fluorescents. Les embryons sont exposés à différentes concentrations (0,1, 1 et 10 mg/L) de microplastiques fluorescents d’un diamètre de 500 nm pendant 120 h. Les résultats montrent que les microplastiques peuvent se bioaccumuler dans les embryons/larves de poisson zèbre d’une manière dépendante de la concentration. Avant l’éclosion, une forte fluorescence se retrouve autour du chorion embryonnaire; tandis que chez les larves de poissons zèbres, le sac vitellin, le péricarde et le tractus gastro-intestinal sont les principaux sites accumulés de microplastiques. Les résultats démontrent l’absorption et l’internalisation des microplastiques chez le poisson zèbre aux premiers stades de sa vie, ce qui fournira une base pour mieux comprendre l’impact des microplastiques sur les animaux aquatiques.
Introduction
Depuis leur première synthèse dans les années 1900, les plastiques sont largement utilisés dans divers domaines, ce qui entraîne une croissance rapide de la production mondiale1. En 2018, environ 360 millions de tonnes de plastiques ont été produites dans le monde2. Les plastiques dans l’environnement naturel se dégraderont en particules fines en raison de processus chimiques, physiques ou biologiques3. En général, les particules fines de plastique de <5 mm sont définies comme des microplastiques4. Les microplastiques sont également conçus pour des applications spécifiques, telles que les microbilles de produits cosmétiques5. En tant que contaminants quasi permanents, les microplastiques s’accumulent dans l’environnement et ont attiré de plus en plus l’attention des scientifiques, des décideurs et du public1,6. Des études antérieures ont documenté que les microplastiques pouvaient causer des effets indésirables chez les poissons, tels que des dommages gastro-intestinaux7,la neurotoxicité8,la perturbation endocrinienne9,le stress oxydatif10 et les dommages à l’ADN11. Cependant, la toxicité des microplastiques n’a pas été entièrement révélée jusqu’à présent12,13.
Les embryons de poisson zèbre offrent de nombreux avantages expérimentaux, y compris la petite taille, la fécondation externe, la transparence optique et les grandes couvées, et sont considérés comme un organisme modèle idéal pour étudier in vivo les effets des polluants sur les poissons aux premiers stades de leur vie. En outre, seules des quantités limitées de substances d’essai sont nécessaires pour l’évaluation des réponses biologiques. Ici, les embryons de poisson zèbre sont exposés à différentes concentrations de microplastiques (0,1, 1, 10 mg/L) pendant 5 jours, et la bioaccumulation et la distribution des microplastiques dans les embryons/larves de poissons zèbres sont évaluées. Ce résultat fera progresser notre compréhension de la toxicité des microplastiques pour les poissons, et la méthode décrite ici peut potentiellement être généralisée pour déterminer l’accumulation et la distribution d’autres types de matériaux fluorescents dans les premiers stades de vie du poisson zèbre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Les poissons zèbres adultes sont originaires du China Zebrafish Resource Center (Wuhan, Chine). Les expériences ont été menées conformément au guide national « Ligne directrice sur les animaux de laboratoire pour l’examen éthique du bien-être des animaux (GB/T35892-2018).
1. Collecte d’embryons
- Maintenir les poissons dans des réservoirs en verre de 20 L avec un système d’eau du robinet filtré au charbon de combustion (pH 7,0 ± 0,2) à une température constante (28 ± 0,5 °C) sur une photopériode de 14:10 h clair : foncé.
- Nourrissez les poissons deux fois par jour avec Artemia nauplii. Il est recommandé que la nourriture soit donnée à max. 3% de poids de poisson par jour et doit être mangée dans les 5 minutes à chaque fois14.
- Transférer des poissons zèbres adultes bien développés (d’une longueur de corps de 3 à 4 cm) dans le réservoir de frai dans un rapport d’un mâle à deux femelles la nuit précédant la reproduction.
REMARQUE: Le lendemain matin, les poissons commencent à frayer après le début du cycle de lumière. - Recueillir les œufs à l’aide d’une pipette Pasteur. Rincez plusieurs fois avec la solution de Hank à 10%, puis vérifiez la fertilisation à l’aide d’un microscope. Les œufs fécondés subissent la période de clivage après environ 2 h après la fécondation (hpf) et peuvent être clairement identifiés15.
- Incuber les embryons fécondés dans un bécher de 500 mL contenant 200 mL de solution de Hank à 10 % avec du bleu de méthylène à 1 % pour la désinfection à 28 °C. Ne pas dépasser un taux de charge de 1 embryo/solution de 2 mL.
NOTE : 10% de la solution de Hank est composée de 137 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 0,25 mM deNa2HPO4,0,44 mMKH2PO4,1,3 mM de CaCl2, 1,0 mM de MgSO4 et 4,2 mM deNaHCO3.
2. Préparation de suspensions microplastiques
- Soniquer la solution mère de billes vertes de polystyrène marqués par fluorescence (10 mg/mL) d’un diamètre nominal de 500 nm (excitation/émission : 460/500 nm) pendant 10 minutes.
- Diluer la solution mère avec la solution de Hank à 10 % pour produire les solutions d’exposition souhaitées (0,1, 1 et 10 mg/L).
- Préparez toujours les solutions d’exposition des microplastiques avant l’exposition.
NOTA : Il faut faire preuve de prudence lors de l’évaluation des effets toxiques des microplastiques, car la présence de conservateurs, tels que l’azide de sodium, dans les formulations commerciales de particules, peut être toxique pour différents organismes 16. Par conséquent, ces additifs doivent être retirés ou comptabilisés dans les témoins avant de mener une expérience de toxicité.
3. Exposition aux microplastiques
- Sélectionnez au hasard 6 embryons nouvellement fécondés (4 hpf), puis transférez dans chaque puits une plaque de 6 puits contenant 5 mL de solutions de microplastiques à différentes concentrations. Inclure les groupes témoins contenant 10 % de la solution de Hank.
- Utilisez des puits triples (avec un total de 18 embryons) pour chaque traitement.
- Incuber les embryons sous la même lumière: cycle sombre et température que les adultes (voir 1.2) et observer toutes les 12 heures. Retirez les morts immédiatement.
- Renouveler les solutions microplastiques 90% toutes les 24 h. Pendant la période d’exposition, les poissons ne sont pas nourris.
REMARQUE: Généralement, l’éclosion de l’embryon commence à 48 hpf et se termine à environ 72 hpf.
4. Évaluation de la distribution des microplastiques
- À 24, 48, 72, 96 et 120 h après la fécondation, sélectionnez au hasard les embryons/larves (un de chacune des trois répétitions) et rincez avec 10 % de la solution de Hank.
- Transférer les larves dans une boîte de Pétri et les exposer à 0,016% de tricaine pour l’anesthésie.
- Préparer la solution mère de tricaine : 4 mg de poudre de tricaine sont dissous dans 100 mL d’eau distillée double, et ajuster le pH à 7,0 avec tris-HCl (pH 9,0). Conservez la solution mère dans le congélateur.
- Préparez la solution de travail. Diluer la solution mère à la concentration souhaitée (0,016%) avec 10% de la solution de Hank à température ambiante14.
- Disposer les embryons/larves et se préparer à l’observation.
- Observez le poisson avec un microscope à fluorescence et imagez avec un logiciel d’imagerie.
- Quantifier l’intensité de fluorescence chez les poissons avec ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La distribution et l’accumulation des microplastiques fluorescents sont illustrées à la figure 1 et au tableau 1. Aucune fluorescence visible n’est observée dans le groupe non exposé (témoin). Cependant, une accumulation de fluorescence est trouvée autour du chorion après exposition à différentes concentrations de microplastiques (24 hpf). La fluorescence verte est également détectée chez les larves, et les niveaux de fluorescence semblent augmenter d’une manière dépendante de la concentration et du temps. Le sac vitellin, le péricarde et le tractus gastro-intestinal sont les principaux sites accumulés de microplastiques (Figure 2).
Figure 1: Répartition des microplastiques fluorescents de polystyrène dans les embryons/larves de poissons zèbres (40×). Les poissons sont échantillonnés dans le groupe témoin, ou les groupes exposés à des microplastiques de 500 nm à 0,1, 1 et 10 mg/L. Échelle barre 100 μm Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Les sites d’accumulation de microplastiques chez les larves de poissons zèbres (40×). Cette larve est prélevée dans le groupe exposé à des microplastiques de 500 nm à 10 mg/L pendant 120 heures. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| concentration | embryon | larve | ||||
| (mg/L) | 24 hpf | 48 hpf a | 48 hpf b | 72 hpf | 96 hpf | 120 hpf |
| Suite. | 1.2±0.1 | 2.6±0.3 | 2.2 | 3.0±0.2 | 2.6±0.7 | 3.3±0.3 |
| 1 | 1.2±0.2 | 5.0±0.1 | 5.3 | 7.5±0.5 | 8.7±0.5 | 10.0±1.9 |
| 0.1 | 7.0±0.9 | 26.1±2.9 | 8.9 | 18.4±0.7 | 16.3±2.8 | 25.7±2.7 |
| 10 | 9.1±1.1 | 82.3±5.3 | 30.4 | 32.7±3.2 | 41.6±0.4 | 44.1±0.9 |
| a: seuls deux embryons ont été évalués; b: une seule larve a été évaluée. | ||||||
Tableau 1 : Variation du niveau de fluorescence chez le poisson zèbre à la suite d’une exposition à des microplastiques fluorescents (n = 3). En raison de l’influence du chorion sur l’absorption des microplastiques fluorescents, les données sont divisées en deux parties, celle des embryons (avant l’éclosion) et celle des larves (après l’éclosion).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selon la ligne directrice sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques, telle que la directive 2010/63/UE de l’UE, l’autorisation d’éthique animale n’est pas obligatoire pour une expérience avec les premiers stades de vie du poisson zèbre jusqu’au stade de la capacité d’alimentation indépendante (5 jours après la fécondation)17. Cependant, les meilleures pratiques en matière de bien-être sont importantes pour optimiser l’utilisation du poisson zèbre et, par exemple, les méthodes humaines d’anesthésie et d’euthanasie devraient être préoccupantes. Le méthanesulfate de 3-aminobenzoate d’éthyle (MS-222, ou tricaine), l’agent couramment utilisé dans la plupart des laboratoires, est employé ici pour l’anesthésie et l’euthanasie.
Avant l’observation au microscope, les embryons et les larves doivent être rincés car les microplastiques adsorbés sur la surface externe pourraient interférer avec les résultats. En outre, l’autofluorescence dans les embryons/larves, particulièrement autour du sac vitellin, qui a été rapporté de temps en temps, pourrait être problématique. La présence de nombreuses biomacromolecules, telles que les flavines, le dinucléotide nicotinamide-adénine (NAD), les acides aminés aromatiques, les lipofuscines, les produits finaux avancés de glycation et le collage, émettra de la lumière lorsqu’elle sera excitée à la longueur d’onde appropriée.
Il est important de noter que, en tant que polluant particulaire, la taille du microplastique est considérée comme l’un des facteurs déterminants de la biodisponibilité et de la toxicité18. Le diamètre nominal du microplastique utilisé ici est de 500 nm, ce qui est comparé à la taille des pores du chorion embryonnaire (dans la plage de 300 nm à 1 μm)19. Par conséquent, ces microplastiques ne devraient pas passer facilement à travers le chorion du poisson zèbre. De façon constante, il y a peu de fluorescence visible dans les embryons avant l’éclosion (Figure 1). Étant donné que le chorion agira comme une barrière efficace contre les particules de grande taille, le processus de déchorionation avant l’exposition peut être nécessaire. Le chorion peut être enlevé facilement à l’aide de la pince, mais la déchorionation enzymatique avec de la pronase est préférable lorsque les embryons sont manipulés en vrac. Cependant, bien que la dchorionation augmente la biodisponibilité et facilite le criblage à haut débit de la toxicité des substances, l’embryon avec le chorion intact est plus recommandé pour évaluer l’écotoxicité des polluants lorsqu’on considère l’état d’exposition dans le monde « réel ».
Bien que des efforts considérables aient été consacrés à l’étude des effets néfastes des microplastiques sur les poissons, les connaissances actuelles, y compris celles sur la bioaccumulation, restent limitées, voire contradictoires. Ces incohérences entre les études sont principalement attribuées aux différences de propriétés des particules, y compris la taille, la densité et les caractéristiques de surface (par exemple, la charge de surface). Le comportement des microplastiques dans la solution est également essentiel à la biodisponibilité. Les caractéristiques physicochimiques des microplastiques devraient être suivies pendant toute la durée d’exposition, et le phénomène d’agrégation qui peut survenir devrait être consigné. En fait, pour les expositions qui nécessitent que les microplastiques soient suspendus pendant une période prolongée, la sonication ou l’agitation avec une barre magnétique est recommandée.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
L’auteur ne déclare aucun intérêt concurrent ou financier.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (21777145, 22076170) et le Programme pour les boursiers de Changjiang et l’équipe de recherche innovante à l’Université (IRT_17R97).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Nikon, Japan | Eclipse Ti-S | |
| Green fluorescently labeled polystyrene beads | Phosphorex, USA | 2103A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich, USA | A5040 |
References
- SAPEA (Science Advice for Policy by European Academies). A Scientific Perspective on Microplastics in Nature and Society. , SAPEA. Berlin. (2019).
- Plastics Europe. Plastics-the facts 2019. , Plastics Europe. Brussels. (2019).
- Andrady, A. L. Microplastics in the marine environment. Marine Pollution Bulletin. 62, 1596-1605 (2011).
- Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects and Fate of Microplastic Marine Debris. National Oceanic and Atmospheric Administration Technical Memorandum. , (2009).
- Ivleva, N. P., Wiesheu, A. C., Niessner, R. Microplastic in aquatic ecosystems. Angewandte Chemie International Edition. 56, 1720-1739 (2017).
- Lu, T., et al. Pollutant toxicology with respect to microalgae and cyanobacteria. Journal of Environmental Sciences. 99, 175-186 (2021).
- Huang, J. N., et al. Exposure to microplastics impairs digestive performance, stimulates immune response and induces microbiota dysbiosis in the gut of juvenile guppy (Poecilia reticulata). Science of the Total Environment. 733, 138929 (2020).
- Prüst, M., Meijer, J., Westerink, R. H. S. The plastic brain: neurotoxicity of micro- and nanoplastics. Particle and Fibre Toxicology. 17, 24 (2020).
- Jakubowska, M., et al. Effects of chronic exposure to microplastics of different polymer types on early life stages of sea trout Salmo trutta. Science of the Total Environment. 740, 139922 (2020).
- Qiang, L., Cheng, J. Exposure to polystyrene microplastics impairs gonads of zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 263, 128161 (2021).
- Hamed, M., Soliman, H. A. M., Osman, A. G. M., Sayed, A. E. H. Antioxidants and molecular damage in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) after exposure to microplastics. Environmental Science and Pollution Research. 27, 14581-14588 (2020).
- Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 2776-2796 (2018).
- Ma, H., Pu, S., Liu, S., Bai, Y., Mandal, S., Xing, B. Microplastics in aquatic environments: Toxicity to trigger ecological consequences. Environmental Pollution. 261, 114089 (2020).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio reio). 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Pikuda, O., Xu, E. G., Berk, D., Tufenkji, N. Toxicity assessments of micro- and nanoplastics can be confounded by preservatives in commercial formulations. Environmental Science & Technology Letters. 6, 21-25 (2019).
- Lidster, K., Readman, G. D., Prescott, M. J., Owen, S. F. International survey on the use and welfare of zebrafish Danio rerio in research. Journal of Fish Biology. 90, 1891-1905 (2017).
- Pitt, J. A., et al. Uptake, tissue distribution, and toxicity of polystyrene nanoparticles in developing zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 194, 185-194 (2018).
- Lin, S. J., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9, 1608-1618 (2013).
