Summary
تتطور أجنة/يرقات حمار وحشي خارجيا وشفافة بصريا. يتم تقييم التراكم الحيوي للبلاستيك الدقيق في الأسماك في مراحل الحياة المبكرة بسهولة باستخدام الميكروبات المسماة بالفلورسنت.
Abstract
وكنوع جديد من الملوثات البيئية، تم العثور على البلاستيك الدقيق على نطاق واسع في البيئة المائية ويشكل تهديدا كبيرا للكائنات المائية. التراكم البيولوجي للبلاستيك الدقيق يلعب دورا رئيسيا في آثارها السامة; ومع ذلك ، كجسيمات ، فإن تراكمها الحيوي يختلف عن العديد من الملوثات الأخرى. الموصوفة هنا هو طريقة مجدية لتحديد بصريا تراكم وتوزيع البلاستيك الدقيق في أجنة حمار وحشي أو اليرقات باستخدام البلاستيك الدقيق الفلورسنت. تتعرض الأجنة لتركيزات مختلفة (0.1 و1 و10 ملغم/لتر) من البلاستيك الدقيق الفلوري بقطر 500 نانومتر لمدة 120 ساعة. ويظهر في النتائج أن البلاستيك الدقيق يمكن أن يتراكم بيولوجيا في أجنة/يرقات حمار وحشي بطريقة تعتمد على التركيز. قبل الفقس ، تم العثور على مضان قوي حول المشيمة الجنينية . بينما في يرقات حمار وحشي ، الكيس الصفار ، التامور ، والجهاز الهضمي هي المواقع الرئيسية المتراكمة من البلاستيك الدقيق. وتبين النتائج استيعاب واستيعاب البلاستيك الدقيق في سمك الحمار الوحشي في مراحل الحياة المبكرة، مما سيوفر أساسا لفهم أفضل لتأثير البلاستيك الدقيق على الحيوانات المائية.
Introduction
منذ توليفها لأول مرة في 1900s، وتستخدم على نطاق واسع البلاستيك في مختلف المجالات، مما أدى إلى النمو السريع للإنتاج العالمي1. في عام 2018 ، تم إنتاج ما يقرب من 360 مليون طن من البلاستيك في جميع أنحاء العالم2. البلاستيك في البيئة الطبيعية سوف تتحلل إلى جزيئات دقيقة بسبب العمليات الكيميائية أو الفيزيائية أو البيولوجية3. عموما، يتم تعريف جزيئات البلاستيك الدقيق <5 ملم في الحجم كما microplastics4. كما تم تصميم البلاستيك الدقيق لتطبيقات محددة، مثل الميكروبات من مستحضرات التجميل5. كما الملوثات شبه دائمة، يتم تراكم البلاستيك الدقيق في البيئة، وجذبت اهتماما متزايدا من العلماء وصانعي السياسات والجمهور1،6. ووثقت الدراسات السابقة أن البلاستيك الدقيق يمكن أن يسبب آثارا سلبية في الأسماك، مثل تلف الجهاز الهضمي7،والسمية العصبية8،واضطراب الغدد الصماء9،والإجهاد التأكسدي10 وتلف الحمض النووي11. ومع ذلك ، فإن سمية البلاستيك الدقيق لم يتم الكشف عنها بالكامل حتى الآن12،13.
توفر أجنة حمار وحشي الكثير من المزايا التجريبية ، بما في ذلك صغر الحجم والإخصاب الخارجي والشفافية البصرية وال براثن كبيرة ، وتعتبر كائنا نموذجيا مثاليا لدراسة آثار الملوثات على الأسماك في مراحل الحياة المبكرة. وبالإضافة إلى ذلك، لا يلزم سوى كميات محدودة من مواد الاختبار لتقييم الاستجابات البيولوجية. هنا ، تتعرض أجنة حمار وحشي لتركيزات مختلفة من البلاستيك الدقيق (0.1 ، 1 ، 10 ملغ / لتر) لمدة 5 أيام ، ويتم تقييم التراكم البيولوجي وتوزيع البلاستيك الدقيق في أجنة / يرقات حمار وحشي. وستؤدي هذه النتيجة إلى تعزيز فهمنا لسمية البلاستيك الدقيق للأسماك، ويمكن تعميم الطريقة الموصوفة هنا لتحديد تراكم وتوزيع أنواع أخرى من المواد الفلورية في مراحل الحياة المبكرة لسمك الحمار الوحشي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
نشأت سمكة الحمار الوحشي البالغة من مركز موارد حمار وحشي الصيني (ووهان، الصين). وقد أجريت التجارب وفقا للدليل الوطني "المبادئ التوجيهية الحيوانية المختبرية للمراجعة الأخلاقية لرعاية الحيوان (GB/T35892-2018).
1. جمع الأجنة
- الحفاظ على الأسماك في خزانات الزجاج 20 لتر مع إعادة تدوير الفحم تصفية نظام مياه الصنبور (درجة الحموضة 7.0 ± 0.2) في درجة حرارة ثابتة (28 ± 0.5 درجة مئوية) على photoperiod من 14:10 ساعة ضوء: الظلام.
- إطعام الأسماك مرتين يوميا مع أرتيميا ناوبلي. من المستحسن أن يتم إعطاء الطعام بحد أقصى 3٪ وزن السمك يوميا ويجب تناوله في غضون 5 دقائق في كل مرة14.
- نقل حمار وحشي الكبار متطورة (مع طول الجسم من 3-4 سم) في خزان التفريخ بنسبة ذكر واحد إلى اثنين من الإناث في الليلة السابقة للتربية.
ملاحظة: في صباح اليوم التالي، تبدأ الأسماك في التفريخ بعد بداية دورة الضوء. - جمع البيض باستخدام ماصة باستور. شطف مع محلول هانك 10٪ عدة مرات، ومن ثم التحقق من الإخصاب باستخدام المجهر. البويضات المخصبة تمر فترة الانقسام بعد ما يقرب من 2 ساعة بعد الإخصاب (hpf) ويمكن تحديدها بوضوح15.
- احتضان الأجنة المخصبة في كوب 500 مل يحتوي على 200 مل من محلول هانك بنسبة 10٪ مع 1٪ من الميثيلين الأزرق للتطهير عند 28 درجة مئوية. لا تتجاوز معدل تحميل محلول جنين/2 مل.
ملاحظة: يتكون الحل هانك 10٪ من 137 MM NaCl، 5.4 M M KCl، 0.25 mM Na2HPO4،0.44 mM KH2PO4، 1.3 mM CaCl2، 1.0 mM MgSO4 و 4.2 mM NaHCO3.
2. إعداد تعليق البلاستيك الدقيق
- Sonicate حل المخزون من حبات البوليسترين الخضراء المسمى فلوريا (10 ملغم / مل) مع قطر اسمي قدره 500 نانومتر (الإثارة / الانبعاثات: 460/500 نانومتر) لمدة 10 دقائق.
- تمييع محلول المخزون مع حل هانك 10٪ لإنتاج حلول التعرض المطلوبة (0.1، 1، و 10 ملغم / لتر).
- إعداد حلول التعرض دائما من البلاستيك الدقيق قبل التعرض.
ملاحظة: يجب توخي الحذر عند تقييم الآثار السامة للبلاستيك الدقيق ، لأن وجود المواد الحافظة ، مثل أزيد الصوديوم ، في تركيبات الجسيمات التجارية ، يمكن أن يكون ساما للكائنات الحية المختلفة 16. ولذلك، ينبغي إزالة هذه المواد المضافة أو حسابها في الضوابط قبل إجراء تجربة السمية.
3. التعرض البلاستيك الدقيق
- اختر عشوائيا 6 أجنة مخصبة حديثا (4 حصانف)، ثم قم بنقلها إلى كل بئر من 6 صفائح تحتوي على 5 مل من المحاليل البلاستيكية الدقيقة بتركيزات مختلفة. تضمين مجموعات التحكم التي تحتوي على حل هانك 10٪.
- استخدم الآبار ثلاثية الليكات (مع ما مجموعه 18 جنينا) لكل علاج.
- احتضان الأجنة تحت نفس الضوء: دورة داكنة ودرجة حرارة الكبار (انظر 1.2) ومراقبة كل 12 ساعة. إزالة الموتى على الفور.
- تجديد حلول البلاستيك الدقيق 90٪ كل 24 ساعة. وخلال فترة التعرض، لا يتم إطعام الأسماك.
ملاحظة: عموما، يبدأ تفقيس الجنين في 48 حصان ويكمل في حوالي 72 حصان.
4. تقييم توزيع البلاستيك الدقيق
- في 24 و 48 و 72 و 96 و 120 ساعة بعد الإخصاب ، اختر عشوائيا الأجنة / اليرقات (واحدة من كل من التكرارات الثلاثة) وشطفها بمحلول هانك بنسبة 10٪.
- نقل اليرقات إلى طبق بيتري وفضح ل tricaine 0.016٪ للتخدير.
- إعداد محلول المخزون من tricaine: 4 ملغ من مسحوق tricaine يذوب في 100 مل من الماء المقطر مزدوجة، وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع تريس-HCl (درجة الحموضة 9.0). تخزين محلول المخزون في الثلاجة.
- إعداد حل العمل. تمييع محلول المخزون للتركيز المطلوب (0.016٪) مع 10٪ حل هانك في درجة حرارة الغرفة14.
- ترتيب الأجنة / اليرقات والاستعداد للمراقبة.
- مراقبة الأسماك مع المجهر fluorescence والصورة مع برامج التصوير.
- قياس كثافة الفلورسينس في الأسماك مع ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر توزيع وتراكم البلاستيك الدقيق الفلوري في الشكل 1 والجدول 1. لا يلاحظ أي مضان مرئي في المجموعة غير المكشوفة (التحكم). ومع ذلك ، تم العثور على تراكم الفلورسينس المحيطة chorion بعد التعرض لتركيزات مختلفة من البلاستيك الدقيق (24 حصان). كما يتم الكشف عن الفلورسينس الأخضر في اليرقات ، ويبدو أن مستويات الفلورسينس تزداد بطريقة تعتمد على التركيز والوقت. كيس الصفار، التامور، والجهاز الهضمي هي المواقع الرئيسية المتراكمة من البلاستيك الدقيق(الشكل 2).
الشكل 1:توزيع البلاستيك الدقيق البوليسترين الفلوري في الأجنة / يرقات حمار وحشي (40×). يتم أخذ عينات من الأسماك من مجموعة التحكم، أو المجموعات المعرضة للبلاستيك الدقيق 500 نانومتر في 0.1 و 1 و 10 ملغم / لتر شريط مقياس 100 ميكرومتر الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مواقع تراكم البلاستيك الدقيق في يرقات حمار وحشي (40×). يتم أخذ عينات من هذه اليرقة من المجموعة المعرضة للبلاستيك الدقيق 500 نانومتر في 10 ملغ / لتر لمدة 120 ساعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تركيز | الجنين | اليرقه | ||||
| (ملغم/لتر) | 24 حصان | 48 حصان أ | 48 حصان ب | 72 حصان | 96 حصان | 120 حصان |
| مقاولات. | 1.2±0.1 | 2.6±0.3 | 2.2 | 3.0±0.2 | 2.6±0.7 | 3.3±0.3 |
| 1 | 1.2±0.2 | 5.0±0.1 | 5.3 | 7.5±0.5 | 8.7±0.5 | 10.0±1.9 |
| 0.1 | 7.0±0.9 | 26.1±2.9 | 8.9 | 18.4±0.7 | 16.3±2.8 | 25.7±2.7 |
| 10 | 9.1±1.1 | 82.3±5.3 | 30.4 | 32.7±3.2 | 41.6±0.4 | 44.1±0.9 |
| أ:تم تقييم جنينين فقط؛ ب:تم تقييم يرقة واحدة فقط. | ||||||
الجدول 1: تغير مستوى الفلورسينس في سمك الحمار الوحشي بعد التعرض للبلاستيك الدقيق الفلوري (n=3). بسبب تأثير الكوريون على امتصاص البلاستيك الدقيق الفلوري ، تنقسم البيانات إلى قسمين ، أي الأجنة (قبل الفقس) واليرقات (بعد الفقس).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وفقا للمبادئ التوجيهية بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية، مثل توجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63/EU، إذن أخلاقيات الحيوان ليست إلزامية لتجربة مع مراحل الحياة المبكرة من حمار وحشي حتى مرحلة كونها قادرة على التغذية المستقلة (5 أيام بعد الإخصاب)17. ومع ذلك، فإن أفضل ممارسات الرعاية الاجتماعية مهمة لتحقيق أقصى استفادة من استخدام سمك الحمار الوحشي، وعلى سبيل المثال، ينبغي أن تكون الطرق الإنسانية للتخدير والقتل الرحيم مثيرة للقلق. إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثانسولفوات (MS-222، أو tricaine)، العامل المستخدم بشكل روتيني في معظم المختبرات، ويستخدم هنا للتخدير والقتل الرحيم.
قبل المراقبة تحت المجهر ، يجب شطف الأجنة واليرقات لأن البلاستيك الدقيق الممتز على السطح الخارجي قد تتداخل مع النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون الفلورة الذاتية في الأجنة / اليرقات ، خاصة حول كيس الصفار ، والتي تم الإبلاغ عنها من حين لآخر ، مشكلة. وجود العديد من الجزيئات الحيوية، مثل flavins، نيكوتيناميد أدينين دينوكليوتيد (NAD)، والأحماض الأمينية العطرية، ليبوفوسينس، والمنتجات النهائية الجليشن المتقدمة، والكولاج، وسوف تنبعث الضوء عندما متحمس في الطول الموجي المناسب.
من المهم ملاحظة أنه ، كما ملوث الجسيمات ، يعتبر حجم البلاستيك الدقيق أحد العوامل الحاسمة للتوافر البيولوجي ، والسمية18. القطر الاسمي للبلاستيك الدقيق المستخدم هنا هو 500 نانومتر ، وهو مقارنة بحجم المسام من المشيمة الجنينية (في حدود 300 نانومتر إلى 1 ميكرومتر)19. لذلك ، لا يتوقع من هذه البلاستيك الدقيق أن تمر بسهولة من خلال المشيمة حمار وحشي. باستمرار، هناك القليل من الفلورسينس مرئية في الأجنة قبل الفقس(الشكل 1). وبما أن الكوريون سيكون بمثابة حاجز فعال ضد الجسيمات ذات الحجم الكبير ، فقد تكون هناك حاجة إلى عملية إزالة المشيمة قبل التعرض. يمكن إزالة المشيمة بسهولة باستخدام ملقط، ولكن يفضل dechorionation الأنزيمية مع pronase عندما يتم التعامل مع الأجنة بكميات كبيرة. ومع ذلك ، على الرغم من أن dechorionation سيزيد من التوافر البيولوجي ويسهل الفحص عالي الإنتاجية لسمية المواد ، يوصى أكثر بالجنين المصاب بالكوريون سليما لتقييم السمية البيئية للملوثات عند النظر في حالة التعرض في العالم "الحقيقي".
10- ورغم بذل جهود كبيرة للتحقيق في الآثار الضارة للبلاستيك الدقيق على الأسماك، فإن المعرفة الحالية، بما في ذلك التراكم الأحيائي، لا تزال محدودة أو حتى متضاربة. وتعزى هذه التناقضات بين الدراسات أساسا إلى الاختلافات في خصائص الجسيمات، بما في ذلك الحجم والكثافة والخصائص السطحية (على سبيل المثال، الشحن السطحي). سلوك البلاستيك الدقيق في الحل أمر بالغ الأهمية للتوافر البيولوجي كذلك. وينبغي تتبع الخصائص الفيزيائية الكيميائية للبلاستيك الدقيق على مدى فترة التعرض، وينبغي تسجيل ظاهرة التجميع التي قد تحدث. في الواقع ، بالنسبة للتعرضات التي تتطلب تعليق البلاستيك الدقيق لفترة طويلة ، يوصى بال sonication أو التحريك باستخدام شريط مغناطيسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحب البلاغ عن أي مصالح منافسة أو مالية.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (21777145، 22076170)، وبرنامج علماء تشانغجيانغ وفريق البحوث المبتكرة في الجامعة (IRT_17R97).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Nikon, Japan | Eclipse Ti-S | |
| Green fluorescently labeled polystyrene beads | Phosphorex, USA | 2103A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich, USA | A5040 |
References
- SAPEA (Science Advice for Policy by European Academies). A Scientific Perspective on Microplastics in Nature and Society. , SAPEA. Berlin. (2019).
- Plastics Europe. Plastics-the facts 2019. , Plastics Europe. Brussels. (2019).
- Andrady, A. L.
- Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects and Fate of Microplastic Marine Debris. National Oceanic and Atmospheric Administration Technical Memorandum. , (2009).
- Ivleva, N. P., Wiesheu, A. C., Niessner, R.
- Lu, T., et al. Pollutant toxicology with respect to microalgae and cyanobacteria. Journal of Environmental Sciences. 99, 175-186 (2021).
- Huang, J. N., et al. Exposure to microplastics impairs digestive performance, stimulates immune response and induces microbiota dysbiosis in the gut of juvenile guppy (Poecilia reticulata). Science of the Total Environment. 733, 138929 (2020).
- Prüst, M., Meijer, J., Westerink, R. H. S. The plastic brain: neurotoxicity of micro- and nanoplastics. Particle and Fibre Toxicology. 17, 24 (2020).
- Jakubowska, M., et al. Effects of chronic exposure to microplastics of different polymer types on early life stages of sea trout Salmo trutta. Science of the Total Environment. 740, 139922 (2020).
- Qiang, L., Cheng, J. Exposure to polystyrene microplastics impairs gonads of zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 263, 128161 (2021).
- Hamed, M., Soliman, H. A. M., Osman, A. G. M., Sayed, A. E. H. Antioxidants and molecular damage in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) after exposure to microplastics. Environmental Science and Pollution Research. 27, 14581-14588 (2020).
- Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 2776-2796 (2018).
- Ma, H., Pu, S., Liu, S., Bai, Y., Mandal, S., Xing, B. Microplastics in aquatic environments: Toxicity to trigger ecological consequences. Environmental Pollution. 261, 114089 (2020).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio reio). 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Pikuda, O., Xu, E. G., Berk, D., Tufenkji, N. Toxicity assessments of micro- and nanoplastics can be confounded by preservatives in commercial formulations. Environmental Science & Technology Letters. 6, 21-25 (2019).
- Lidster, K., Readman, G. D., Prescott, M. J., Owen, S. F. International survey on the use and welfare of zebrafish Danio rerio in research. Journal of Fish Biology. 90, 1891-1905 (2017).
- Pitt, J. A., et al. Uptake, tissue distribution, and toxicity of polystyrene nanoparticles in developing zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 194, 185-194 (2018).
- Lin, S. J., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9, 1608-1618 (2013).
