Summary
Zebravisembryo's/larven ontwikkelen zich extern en zijn optisch transparant. De bioaccumulatie van microplastics in vissen in vroege levensfasen wordt gemakkelijk beoordeeld met fluorescerend gelabelde microbeads.
Abstract
Als nieuw type milieuverontreinigende stof is microplastic op grote schaal aangetroffen in het aquatisch milieu en vormt het een grote bedreiging voor in het water levende organismen. De bioaccumulatie van microplastics speelt een sleutelrol in hun toxische effecten; als deeltjes verschillen hun bioaccumulaties echter van veel andere verontreinigende stoffen. Hier beschreven is een haalbare methode om de accumulatie en distributie van microplastics in zebravisembryo's of larven visueel te bepalen met behulp van fluorescerende microplastics. Embryo's worden gedurende 120 uur blootgesteld aan verschillende concentraties (0,1, 1 en 10 mg/L) fluorescerende microplastics met een diameter van 500 nm. In de resultaten is aangetoond dat microplastics op een concentratieafhankelijke manier kunnen bioaccumuleren in zebravisembryo's/larven. Vóór het uitkomen wordt sterke fluorescentie gevonden rond het embryonale koraal; terwijl in zebravislarven de dooierzak, het pericard en het maagdarmkanaal de belangrijkste geaccumuleerde locaties van microplastics zijn. De resultaten tonen de opname en internalisering van microplastics in zebravissen in vroege levensfasen aan, wat de basis zal vormen voor een beter begrip van de impact van microplastics op waterdieren.
Introduction
Sinds de eerste synthetiseren in de jaren 1900, kunststoffen worden veel gebruikt op verschillende gebieden, wat resulteert in een snelle groei van de wereldwijde productie1. In 2018 werd wereldwijd ongeveer 360 miljoen ton kunststoffen geproduceerd2. De kunststoffen in de natuurlijke omgeving zullen afbreken tot fijne deeltjes als gevolg van chemische, fysische of biologische processen3. Over het algemeen worden fijne plastic deeltjes <5 mm groot gedefinieerd als microplastics4. Microplastics zijn ook ontworpen voor specifieke toepassingen, zoals microbeads uit cosmetische producten5. Als bijna permanente verontreinigingen worden microplastics opgehoopt in het milieu en hebben ze steeds meer aandacht getrokken van wetenschappers, beleidsmakers en het publiek1,6. Eerdere studies documenteerden dat microplastics nadelige effecten bij vissen kunnen veroorzaken, zoals gastro-intestinale schade7, neurotoxiciteit8, hormoonontregeling9, oxidatieve stress10 en DNA-schade11. De toxiciteit van microplastics is tot nu toe echter niet volledig aangetoond12,13.
Zebravisembryo's bieden veel experimentele voordelen, waaronder kleine afmetingen, externe bevruchting, optische transparantie en grote koppelingen, en worden beschouwd als een ideaal modelorganisme voor het in vivo bestuderen van de effecten van verontreinigende stoffen op vissen in vroege levensfasen. Bovendien zijn slechts beperkte hoeveelheden teststoffen nodig voor de evaluatie van biologische reacties. Hier worden zebravisembryo's gedurende 5 dagen blootgesteld aan verschillende concentraties microplastics (0,1, 1, 10 mg/L) en worden de bioaccumulatie en distributie van microplastics in zebravisembryo's/larven geëvalueerd. Dit resultaat zal ons begrip over de toxiciteit van microplastics voor vissen bevorderen, en de hier beschreven methode kan mogelijk worden gealdaliseerd om de accumulatie en distributie van andere soorten fluorescerende materialen in de vroege levensfasen van zebravissen te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Volwassen zebravissen zijn afkomstig van het China Zebrafish Resource Center (Wuhan, China). De experimenten zijn uitgevoerd in overeenstemming met de nationale gids "Laboratory Animal Guideline for Ethical Review of Animal Welfare (GB/T35892-2018).
1. Embryo's verzamelen
- Houd vissen in glazen tanks van 20 L met recirculerend koolstofgefilterd leidingwatersysteem (pH 7,0 ± 0,2) bij een constante temperatuur (28 ± 0,5 °C) op een fotoperiode van 14:10 uur licht: donker.
- Voer vis tweemaal daags met Artemia nauplii. Het wordt aanbevolen dat het voedsel wordt gegeven met maximaal 3% visgewicht per dag en moet binnen 5 minuten per keer worden gegeten14.
- Breng goed ontwikkelde volwassen zebravissen (met een lichaamslengte van 3-4 cm) over in de paaitank in een verhouding van één mannetje tot twee vrouwtjes de nacht voor de fokkerij.
OPMERKING: De volgende ochtend beginnen de vissen te spawnen na het begin van de lichtcyclus. - Verzamel eieren met een Pasteur pipet. Spoel meerdere keren met de oplossing van 10% Hank en controleer vervolgens met een microscoop op bevruchting. Bevruchte eieren ondergaan de decolletéperiode na ongeveer 2 uur na de bevruchting (hpf) en kunnen duidelijk worden geïdentificeerd15.
- Incubeer de bevruchte embryo's in een bekerglas van 500 ml met 200 ml 10% Hanks oplossing met 1% methyleenblauw voor desinfectie bij 28 °C. Beladingssnelheid van 1 embryo/2 ml oplossing niet overschrijden.
OPMERKING: 10% Hank's oplossing bestaat uit 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4,0,44 mM KH2PO4,1,3 mM CaCl2,1,0 mM MgSO4 en 4,2 mM NaHCO3.
2. Bereiding van microplastic suspensussingen
- Soniceer de stamoplossing van groene fluorescerend gelabelde polystyreenparels (10 mg/ml) met een nominale diameter van 500 nm (excitatie/emissie: 460/500 nm) gedurende 10 minuten.
- Verdun de stamoplossing met de oplossing van 10% Hank om de gewenste belichtingsoplossingen (0,1, 1 en 10 mg/L) te produceren.
- Bereid altijd de belichtingsoplossingen van microplastics voor op de blootstelling.
OPMERKING: Voorzichtigheid is geboden bij het beoordelen van de toxische effecten van microplastics, omdat de aanwezigheid van conserveermiddelen, zoals natrium azide, in de commerciële deeltjesformuleringen giftig kan zijn voor verschillende organismen 16. Daarom moeten deze additieven worden verwijderd of verantwoord in de controles voordat een toxiciteitsexperiment wordt uitgevoerd.
3. Blootstelling aan microplastics
- Selecteer willekeurig 6 nieuw bevruchte embryo's (4 hpf) en breng vervolgens over in elke put van 6-putplaat met 5 ml microplastic-oplossingen met verschillende concentraties. Neem de controlegroepen op die de oplossing van 10% Hank bevatten.
- Gebruik drievoudputten (met in totaal 18 embryo's) voor elke behandeling.
- Incubeer de embryo's onder hetzelfde licht: donkere cyclus en temperatuur als volwassenen (zie 1.2) en observeer elke 12 uur. Verwijder de doden onmiddellijk.
- Vernieuw de microplastic oplossingen 90% om de 24 uur. Tijdens de blootstellingsperiode worden de vissen niet gevoerd.
OPMERKING: Over het algemeen begint het uitkomen van embryo bij 48 hpf en voltooit het bij ongeveer 72 hpf.
4. Beoordeling van de verdeling van microplastics
- Selecteer bij 24, 48, 72, 96 en 120 uur na de bevruchting willekeurig de embryo's/larven (één van de drie replica's) en spoel met 10% Hanks oplossing.
- Breng de larven over in een petrischaal en stel bloot aan 0,016% tricaine voor anesthesie.
- Bereid de stamoplossing van tricaïne: 4 mg tricaïnepoeder wordt opgelost in 100 ml dubbel gedestilleerd water en stel de pH in op 7,0 met Tris-HCl (pH 9,0). Bewaar de voorraadoplossing in de vriezer.
- Bereid de werkoplossing voor. Verdun de stamoplossing tot de gewenste concentratie (0,016%) met 10% Hank's oplossing bijkamertemperatuur 14.
- Schik de embryo's/larven en bereid je voor op observatie.
- Observeer de vis met een fluorescentiemicroscoop en beeld met beeldvormingssoftware.
- Kwantificeer de fluorescentie-intensiteit bij vissen met ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De verdeling en accumulatie van fluorescerende microplastics zijn weergegeven in figuur 1 en tabel 1. Er wordt geen zichtbare fluorescentie waargenomen in de onbelichte groep (controle). Er wordt echter een opeenhoping van fluorescentie gevonden rond het koraal na blootstelling aan verschillende concentraties microplastics (24 hpf). Groene fluorescentie wordt ook gedetecteerd bij larven en de fluorescentieniveaus lijken op een concentratie- en tijdsafhankelijke manier toe te nemen. De dooierzak, het pericard en het maagdarmkanaal zijn de belangrijkste geaccumuleerde locaties van microplastics (figuur 2).
Figuur 1: Distributie van fluorescerende polystyreen microplastics in embryo's/larven van zebravissen (40×). De vissen worden bemonsterd uit de controlegroep, of de groepen die worden blootgesteld aan 500 nm microplastics bij 0,1, 1 en 10 mg/L. Schaalbalk 100 μm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De locaties van microplastic accumulatie in zebravislarven (40×). Deze larve wordt gedurende 120 uur bemonsterd uit de groep die wordt blootgesteld aan microplastics van 500 nm bij 10 mg/L. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| concentratie | embryo | larve | ||||
| (mg/L) | 24 pkf | 48 pk per | 48 pk b | 72 pkf | 96 pkf | 120 pkf |
| Cont. | 1.2±0.1 | 2,6±0,3 | 2.2 | 3.0±0.2 | 2,6±0,7 | 3.3±0.3 |
| 1 | 1.2±0.2 | 5,0±0,1 | 5.3 | 7,5±0,5 | 8,7±0,5 | 10.0±1.9 |
| 0.1 | 7,0±0,9 | 26,1±2,9 | 8.9 | 18,4±0,7 uur | 16,3±2,8 | 25,7±2,7 |
| 10 | 9.1±1.1 | 82,3±5,3 | 30.4 | 32,7±3,2 | 41,6±0,4 | 44,1±0,9 |
| a: slechts twee embryo's werden beoordeeld; b: slechts één larve werd beoordeeld. | ||||||
Tabel 1: Verandering van fluorescentieniveau bij zebravissen na blootstelling aan fluorescerende microplastics (n=3). Vanwege de invloed van koraal op de absorptie van fluorescerende microplastics, zijn de gegevens verdeeld in twee delen, die van de embryo's (vóór het uitkomen) en larven (na het uitkomen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Volgens het richtsnoer voor de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt, zoals EU-richtlijn 2010/63/EU, is toestemming voor dierethiek niet verplicht voor een experiment met vroege levensfasen van zebravissen totdat het stadium van onafhankelijke voeding mogelijk is (5 dagen na bevruchting)17. Beste welzijnspraktijken zijn echter belangrijk voor het optimaliseren van het gebruik van zebravissen, en bijvoorbeeld de humane methoden van anesthesie en euthanasie moeten van belang zijn. Ethyl 3-aminobenzoaatmethaansulfaat (MS-222, of tricaïne), het routinematig gebruikte middel in de meeste laboratoria, wordt hier gebruikt voor anesthesie en euthanasie.
Vóór observatie onder de microscoop moeten de embryo's en larven worden gespoeld, omdat de microplastics die op het buitenoppervlak zijn geadsorbeerd, de resultaten kunnen verstoren. Bovendien kan de autofluorescentie in de embryo's / larven, vooral rond de dooierzak, die af en toe is gemeld, problematisch zijn. De aanwezigheid van veel biomacromoleculen, zoals flavinen, nicotinamide-adenine dinucleotide (NAD), aromatische aminozuren, lipofuscinen, geavanceerde glycatie eindproducten en collage, zal licht uitzenden wanneer opgewekt op de juiste golflengte.
Het is belangrijk op te merken dat, als verontreinigende deeltjes, de grootte van microplastic wordt beschouwd als een van de bepalende factoren van biologische beschikbaarheid en toxiciteit18. De nominale diameter van microplastic die hier wordt gebruikt is 500 nm, wat vergelijkbaar is met de poriegrootte van het embryochorion (binnen het bereik van 300 nm tot 1 μm)19. Daarom wordt niet verwacht dat deze microplastics gemakkelijk door het zebravischorion zullen gaan. Consequent is er weinig fluorescentie zichtbaar in de embryo's voordat ze uitkomen (figuur 1). Aangezien het chorion zal fungeren als een effectieve barrière tegen de deeltjes met grote afmetingen, kan het dechorionatieproces vóór blootstelling nodig zijn. Chorion kan gemakkelijk worden verwijderd met behulp van de tang, maar enzymatische dechorionatie met pronase heeft de voorkeur wanneer de embryo's in bulk worden behandeld. Hoewel dechorionatie de biologische beschikbaarheid zal vergroten en de screening met hoge doorvoer op de toxiciteit van stoffen zal vergemakkelijken, wordt het embryo met intact koraal meer aanbevolen om de ecotoxiciteit van verontreinigende stoffen te beoordelen wanneer rekening wordt gehouden met de toestand van blootstelling in de "echte" wereld.
Hoewel er aanzienlijke inspanningen zijn geleverd om de nadelige effecten van microplastics op vissen te onderzoeken, blijft de huidige kennis, met inbegrip van die van bioaccumulatie, beperkt of zelfs tegenstrijdig. Deze inconsistenties in de verschillende studies worden voornamelijk toegeschreven aan de verschillen in eigenschappen van deeltjes, waaronder grootte, dichtheid en oppervlaktekenmerken (bijvoorbeeld oppervlaktelading). Het gedrag van microplastics in de oplossing is ook van cruciaal belang voor de biologische beschikbaarheid. De fysisch-chemische kenmerken van microplastics moeten gedurende de blootstellingsduur worden gevolgd en het aggregatiefenomeen dat zich kan voordoen, moet worden geregistreerd. In feite wordt sonicatie of roeren met een magnetische staaf aanbevolen voor de blootstellingen waarvoor de microplastics voor een langere periode moeten worden gesuspendeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur verklaart geen concurrerende of financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (21777145, 22076170) en het Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University (IRT_17R97).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Nikon, Japan | Eclipse Ti-S | |
| Green fluorescently labeled polystyrene beads | Phosphorex, USA | 2103A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich, USA | A5040 |
References
- SAPEA (Science Advice for Policy by European Academies). A Scientific Perspective on Microplastics in Nature and Society. , SAPEA. Berlin. (2019).
- Plastics Europe. Plastics-the facts 2019. , Plastics Europe. Brussels. (2019).
- Andrady, A. L. Microplastics in the marine environment. Marine Pollution Bulletin. 62, 1596-1605 (2011).
- Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects and Fate of Microplastic Marine Debris. National Oceanic and Atmospheric Administration Technical Memorandum. , (2009).
- Ivleva, N. P., Wiesheu, A. C., Niessner, R. Microplastic in aquatic ecosystems. Angewandte Chemie International Edition. 56, 1720-1739 (2017).
- Lu, T., et al. Pollutant toxicology with respect to microalgae and cyanobacteria. Journal of Environmental Sciences. 99, 175-186 (2021).
- Huang, J. N., et al. Exposure to microplastics impairs digestive performance, stimulates immune response and induces microbiota dysbiosis in the gut of juvenile guppy (Poecilia reticulata). Science of the Total Environment. 733, 138929 (2020).
- Prüst, M., Meijer, J., Westerink, R. H. S. The plastic brain: neurotoxicity of micro- and nanoplastics. Particle and Fibre Toxicology. 17, 24 (2020).
- Jakubowska, M., et al. Effects of chronic exposure to microplastics of different polymer types on early life stages of sea trout Salmo trutta. Science of the Total Environment. 740, 139922 (2020).
- Qiang, L., Cheng, J. Exposure to polystyrene microplastics impairs gonads of zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 263, 128161 (2021).
- Hamed, M., Soliman, H. A. M., Osman, A. G. M., Sayed, A. E. H. Antioxidants and molecular damage in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) after exposure to microplastics. Environmental Science and Pollution Research. 27, 14581-14588 (2020).
- Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 2776-2796 (2018).
- Ma, H., Pu, S., Liu, S., Bai, Y., Mandal, S., Xing, B. Microplastics in aquatic environments: Toxicity to trigger ecological consequences. Environmental Pollution. 261, 114089 (2020).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio reio). 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Pikuda, O., Xu, E. G., Berk, D., Tufenkji, N. Toxicity assessments of micro- and nanoplastics can be confounded by preservatives in commercial formulations. Environmental Science & Technology Letters. 6, 21-25 (2019).
- Lidster, K., Readman, G. D., Prescott, M. J., Owen, S. F. International survey on the use and welfare of zebrafish Danio rerio in research. Journal of Fish Biology. 90, 1891-1905 (2017).
- Pitt, J. A., et al. Uptake, tissue distribution, and toxicity of polystyrene nanoparticles in developing zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 194, 185-194 (2018).
- Lin, S. J., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9, 1608-1618 (2013).
