Summary
A pontuação sistemática da inflamação intestinal usando um sistema gratuito assistido por computador é uma ferramenta poderosa para comparar quantitativamente alterações histopatológicas em modelos de colite caracterizados pela presença de úlceras e alterações inflamatórias. A avaliação do escore da colite histológica fortalece as observações clínicas e facilita a interpretação dos dados.
Abstract
Os modelos de colite murina são ferramentas que são amplamente empregadas em estudos focados na compreensão da patobiologia de distúrbios intestinais inflamatórios. No entanto, ainda não se devem definir normas robustas para quantificação objetiva e reprodutível da gravidade da doença. A maioria dos métodos de análise de colites baseia-se na pontuação histológica limitada de pequenos segmentos do intestino, levando a análises parciais ou tendenciosas. Aqui, combinamos aquisição de imagem de alta resolução e análise longitudinal de todo o cólon para quantificar lesões intestinais e ulceração no modelo induzido de sulfato de sódio dextran (DSS) de colite murina. Este protocolo permite a geração de resultados objetivos e reprodutíveis sem um extenso treinamento de usuários. Aqui, fornecemos detalhes abrangentes sobre a preparação da amostra e a análise de imagens usando exemplos de dados da colite induzida pelo DSS. Este método pode ser facilmente adaptado a outros modelos de colite murina que têm inflamação significativa associada à lesão mucosa. Demonstramos que a fração de mucosa inflamada/ferida e erodida/ulcerada em relação ao comprimento completo do cólon faz um paralelo com os achados clínicos, como a perda de peso em meio à progressão da doença induzida pelo DSS. Este protocolo histológico fornece um tempo confiável e um auxílio econômico para padronizar as análises da atividade da doença de forma imparcial nos experimentos de colite do DSS.
Introduction
A barreira epitelial gastrointestinal desempenha um papel fundamental na separação de antígenos luminosos e patógenos dos compartimentos de tecidosubjacentes 1. Lesões epiteliais e feridas mucosas observadas em condições patológicas como doença inflamatória intestinal (DII), isquemia ou lesão cirúrgica estão associadas a sintomas clínicos que incluem diarreia, perda de peso, sangue nas fezes e dor abdominal. Em resposta à lesão, as células epiteliais migram e proliferam para re-epitelializar e reparar defeitos da barreira mucosa. Resolução de inflamação e restituição da integridade mucosa são cruciais para restabelecer a homeostase e a função mucosa intestinal2,3,4.
Vários modelos animais têm sido empregados para estudar os mecanismos moleculares subjacentes que estão associados com os danos à barreira epitelial intestinal. Modelos bem estabelecidos e facilmente aplicáveis de colite quimicamente induzida são amplamente utilizados, particularmente em estudos relacionados a lesões inflamatórias como o DII. Um modelo comum, reprodutível e confiável de colite murina emprega sulfato de sódio dextran (DSS) mediado lesão cólon e inflamação. A gravidade da doença varia dependendo da cepa do camundongo, dose de DSS, comprimento da administração do DSS e peso molecular de DSS5,6,7.
O dano mucosa intestinal durante a colite DSS é geralmente avaliado usando o Índice de Atividade da Doença (DAI), um escore composto determinado pela perda de peso, conteúdo sanguíneo fecal e consistência das fezes. O teor de sangue fecal pode ser microscópico (detectado usando um teste de ácido guaiaco) ou macroscópico; a consistência fecal é classificada como dura, macia ou líquida (ou seja, diarreia)5,8. A pontuação desses parâmetros clínicos pode ser subjetiva e pode variar dependendo da experiência e viés do usuário, embora, no geral, os dados forneçam informações confiáveis e, portanto, amplamente utilizados pelos pesquisadores do IBD. Em contraste, não há um método geralmente aceito para avaliação histológica de danos mucosos. Mais comumente, as áreas selecionadas do cólon são inspecionadas por um patologista treinado e pontuadas com base em vários parâmetros que geralmente incluem lesão cripíplica e infiltração de leucócitos9,10,11. No entanto, como o número de parâmetros investigados e a quantidade de tecido analisado varia consideravelmente entre os relatórios individuais, a comparabilidade de muitos estudos publicados é limitada. Para reduzir o viés do observador e melhorar a concordância entre estudos, um protocolo de pontuação histológica ideal deve: 1) incluir toda a extensão do cólon, uma vez que a inflamação mucosa intestinal é mais frequentemente variável e as lesões de salto são comuns, 2) limitar a análise a parâmetros específicos de chave e facilmente interpretáveis para reduzir a subjetividade, 3) facilitar o processamento rápido e consistente de grandes números de amostras e 4) usar ferramentas amplamente disponíveis e acessíveis para aquisição, análise e apresentação de dados.
Aqui descrevemos uma técnica para processar todo o cólon ou segmentos longos do intestino delgado em uma configuração de "rolo suíço", juntamente com o uso de um sistema gratuito de pontuação assistida por computador para analisar inflamação e dano mucosal intestinal por causa de colite induzida pelo DSS.
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Protocol
Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais da Universidade de Michigan.
1. Colheita de tecidos
- Eutanize camundongos humanamente usando anestesia isoflurane seguida de luxação cervical, de acordo com protocolos aprovados. Para todos os experimentos em animais, a aprovação foi obtida por um conselho de revisão certificado de acordo com as diretrizes nacionais e institucionais para o manejo animal.
- Coloque o mouse em uma almofada dissecando em uma posição supina. Imobilize as extremidades do rato usando agulhas G de 20 G x 1/2 polegadas.
- Usando fórceps e tesouras, faça uma pequena incisão na pele abdominal e puxe-a para o lado para expor o peritônio.
- Abra a cavidade abdominal com uma incisão midline no peritônio do osso púbico para as laterais do abdômen.
- Remova cuidadosamente tecidos e órgãos até que o intestino grosso seja visualizado. Corte o osso pélvico em ambos os lados do cólon para visualizar totalmente o órgão, estendendo-se do ânus em direção ao ceco.
- Remova suavemente a gordura, pequenas veias e artérias presas ao cólon, ao mesmo tempo em que disseca cuidadosamente o órgão, cortando apenas proximal ao ânus e apenas distal ao ceco.
NOTA: O cólon dissecado deve permanecer em temperatura ambiente enquanto completa o procedimento de rolo suíço. - Lave cuidadosamente o cólon com 1x PBS, usando uma agulha de gavage de plástico flexível inserida através do ânus para remover o conteúdo fecal.
- Posicione o cólon em linha reta, e abra longitudinalmente ao longo da artéria mesentérica. Bissecte o cólon longitudinalmente do distal até a extremidade proximal(Figura 1A). Uma metade do tecido pode ser usada para análise histológica, enquanto a outra pode ser processada para mancha ocidental, PCR ou enrolada em um segundo rolo suíço para microscopia de imunofluorescência congelada fresca12.
2. Preparação de rolos suíços
- Corte tecido extra do cólon proximal usando uma lâmina de barbear até que aproximadamente a mesma largura ao longo do comprimento de todo o cólon seja obtida.
- Alinhe o cólon para expor o lúmen voltado para cima, e achate o tecido completamente usando uma agulha de gavage flexível. Adicione mais PBS, se necessário, para manter o tecido úmido durante todo o procedimento.
- Remova o excesso de PBS usando uma limpeza de papel. Com uma seringa e agulha de gavage, adicione 10% de solução de formalina tamponada neutra sobre o tecido por 2-3 minutos para fixar e achatar o tecido.
- Use fórceps retos para pegar a extremidade do cólon distal e torcer o cólon em círculos concêntricos do final distal ao proximal(Figura 1B).
NOTA: É possível empurrar para trás o interior do rolo suíço enquanto rola usando o dedo indicador para garantir que o tecido esteja dentro do rolo. - Insira uma agulha de 27 G para fixar o cólon no meio para manter sua forma de rolo suíço(Figura 1C).
- Coloque o rolo suíço com a agulha em um de incorporação dentro de um recipiente de espécime histológico.
NOTA: O tecido deve ser orientado em paralelo com relação ao antes da fixação(Figura 1D). - Fixar o tecido em solução de formalina tamponada 10% neutra durante a noite a 4 °C13.
- Após a fixação durante a noite, lave o tecido 3x com PBS.
- Adicione 70% de etanol ao tecido antes do processo de incorporação da parafina. Remova a agulha do rolo suíço antes de prosseguir. O tecido pode ser armazenado em etanol à temperatura ambiente até a incorporação da parafina13.
- Coloque amostras no processador de tecido, incorpore em parafina e prepare seções de 4 μm, montadas em lâminas de microscopia carregadas positivamente(Figura 1E). Este pode ser um ponto de parada opcional.
NOTA: A orientação adequada do tecido é fundamental para alcançar seções adequadas para análise de imagem. A incorporação paralela do rolo suíço no de parafina resultará em seções completas apropriadas para análise de imagem (Figura 1F-1H). As seções oblíquas devem ser evitadas para evitar seções incompletas(Figura 1I-1K). Para obter mais detalhes, consulte a seção Discussão. - Seções de manchas com hematoxilina e eosina (H&E)13.
3. Digitalização e análise digital
NOTA: Para uma avaliação precisa das alterações mucosas, selecione apenas seções que incluam pelo menos 90% do comprimento total do cólon.
- Digitalize seções manchadas usando um scanner de slides ou imager (ver Tabela de Materiais). As imagens produzidas precisam de uma resolução de 0,25 mícrons por pixel com objetivo de 40x e ampliação de 40x.
- Instale e baixe um software apropriado para análise digital de slides digitalizados (ver Tabela de Materiais).
- Abra imagens digitalizadas no software de processamento de imagens(Figura 2A). Verifique se todo o cólon é visível e se não há áreas ausentes da amostra.
- Ative o imager de etiqueta e as ferramentas de barra de escala para identificar corretamente slides digitalizados clicando em Imager Label (Figura 2A).
- Abra a ferramenta de anotações clicando em Anotações,(Figura 2A) e crie 3 camadas diferentes clicando em Nova camada (Figura 2B) para quantificar o comprimento total do rolo suíço, inflamação/lesão e erosão/ulceração. Escolha uma cor diferente para cada camada clicando na cor da camada (Figura 2B).
- Meça o comprimento de cada camada/categoria clicando na ferramenta Caneta (Figura 2A), usando a mucosa muscular como referência:
- Veja a imagem com zoom de 400 μm (ou mais) para facilitar a visualização adequada da mucosa muscular.
NOTA: A ampliação é facilmente controlada usando a roda de rolagem do mouse e precisará ser ajustada conforme necessário enquanto se move através da seção para desenhar todas as linhas. - Clique na ferramenta Caneta para desenhar uma linha seguindo a mucosa muscular (Figura 2A). Mova o ponteiro conforme necessário para visualizar a área adjacente para análise.
NOTA: Cada vez que a caneta é parada, uma pequena região de camada nova será gerada. Ele pode ser visualizado e editado com a guia Regiões de Camada (selecione segmento desejado e clique em Excluir camada em caso de erros ou correções, Figura 2B).
- Veja a imagem com zoom de 400 μm (ou mais) para facilitar a visualização adequada da mucosa muscular.
- Uma vez definidas todas as camadas(Figura 2C),exporte os dados usando o botão Exportar Grade para Arquivo de Texto dentro das opções de regiões de camada(Figura 2B).
NOTA: Salve arquivos com frequência ao criar as camadas para garantir que os dados são armazenados corretamente. - Abra os arquivos de texto e copie os dados com um software de planilha. Total de todos os segmentos de cada região e calcule o percentual de lesão e ulceração em relação ao comprimento total.
- Para calcular o Escore de Colite Histológica (SSC) e avaliar a gravidade da doença, considere três características principais como detalhadas abaixo.
- Verifique se há mucosa intestinal saudável que é caracterizada por células epiteliais organizadas no eixo cripto-luminal, lamina propria com poucas células imunes e mucosa muscular subjacente que interage a mucosa e a submucosa (Figura 3A).
- Verifique se há inflamação/lesão caracterizada por criptas epiteliais atenuadas ou parcialmente ausentes e inflamação mucosa com infiltração de neutrófilo em criptas(Figura 3B).
- Verifique se há presença de erosão/ulceração caracterizada por áreas desprovidas de epitélio superficial ou áreas completamente carentes de criptas epiteliais com ou sem leucócitos associados(Figura 3C).
- Calcular HCS de regiões feridas e ulceradas expressas em percentagem do comprimento total na seguinte fórmula:
NOTA: O HCS combina o percentual de inflamação/lesão e erosão/ulceração adicionando um fator de dois a este último, com base em uma suposição razoável de que a perda completa do epitélio resulta em perda máxima de integridade da barreira e, portanto, pior doença. O HCS representa consistentemente as alterações morfológicas causadas pela colite experimental induzida pelo DSS. Curiosamente, não vimos uma correlação clara entre os números de agregados linfoides colonicos ou folículos e gravidade da doença clínica na colite do DSS e, portanto, não incluímos a quantificação nesta análise. - Tire uma foto das imagens representativas (clique em Snapshot, Figura 2A) e salve. Inclua barras de escala, se necessário, clicando em Show/Hide Scale Bar (Figura 2A).
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Representative Results
Para ilustrar a confiabilidade desta Análise de Pontuação de Collite Histológica no contexto de dano mucosa após o desafio dSS e posterior recuperação da colite, administramos 2,5% de DSS na água potável de oito camundongos machos C57BL6 de 10 semanas de idade por 5 dias seguidos por um período de recuperação com água regular por 5 dias. Não houve alteração no peso corporal durante a administração aguda do DSS, do dia 0 ao 5(Figura 4A). O peso corporal diminuiu drasticamente após o dia 5, quando os ratos começaram a beber água da torneira regular. As fezes de sangue e macios apareceram após 3 dias de administração do DSS e continuaram pelos 3 dias subsequentes na água até o 8º dia do experimento(Figura 4B). Essas observações sugeriram que os efeitos mais prejudiciais da exposição ao DSS foram observados durante o período de recuperação entre os dias 5 e 8. A medição do comprimento do cólon no dia 10 confirmou um encurtamento significativo no final do experimento(Figura 4C). Os cólons foram colhidos nos dias 0, 2, 5, 7, 8 e 10 para fazer rolos suíços de parafina. O tecido foi manchado com H&E e escaneamentos de alta definição(Figura 4D) foram analisados para calcular o Escore de Colite Histológica (Figura 4E) e percentual de lesão e ulceração(Figura 4F).
A Figura 4D mostra arquitetura cripta normal em camundongos C576BL6 não tratados, superficial à mucosa muscular e suportada pela álmina propria (dia 0, seta). Após 2 dias de administração do DSS, o recrutamento de células imunes foi observado (dia 2, seta). No dia 5, as células epiteliais apareceram danificadas, e houve uma infiltração de neutrófilos através do epitélio (criptite) associada à lesão epitelial (dia 5, seta). Do dia 5 ao 8, foram observadas áreas de perda epitelial com inflamação e ulceração (dias 7 e 8, setas). Este último é comumente observado como os ratos bebem água da torneira regular durante a fase de recuperação. Finalmente, as células epiteliais começam a se regenerar e repovoar áreas ulceradas, restaurando lentamente a mucosa colonial no dia 10 (seta).
O HCS espelha de perto a avaliação simples do percentual de inflamação/lesão e erosão/ulceração, e ambos demonstram quantitativamente que há danos significativos no cólon dos camundongos durante a recuperação do DSS no dia 5 a 10, que se correlaciona com erosões epiteliais e infiltração de leucócitos mostradas na Figura 4D. Os dados fornecidos pelo HCS distinguem entre a gravidade da doença no que diz respeito à inflamação associada à lesão epitelial versus erosão/ulceração.
Essas observações demonstram que o sistema de pontuação sistemática do HCS proposto neste protocolo constitui uma ferramenta confiável para quantificar os danos mucosas.
Figura 1: A preparação da amostra é crucial para uma análise precisa dosdados. (A) Cólon distal totalmente estendido e aberto ao longo da artéria mesentérica. (B) Processo de rolagem suíço. (C) Inserção da agulha para segurar a forma suíça de rolo(D)parafina incorporando. (E) Bloco de parafina. (F) Orientação paralela do rolo suíço para evitar seções parciais. (G) Rolo suíço completo, barra de escala: 2 mm. (H) Seção ideal de enigmáticas coloniais, barra de escala: 80 μm. (I) Orientação de rolo suíço oblíquo. (J) Rolo suíço incompleto, barra de escala: 2mm. (K) Seção oblíqua de enigmáticas coloniais, barra de escala: 80 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Avaliação quantitativa de dano mucosal. (A) Barra de ferramentas básica com Snapshot, controle deslizante de zoom, barra de escala de show/ocultação/eixos/grade, imager de etiqueta, anotações e características da ferramenta de caneta, entre outros. (B) Anotações do menu exibindo a cor da camada, nova camada, camada de exclusão, camada de show/oculta, região de exclusão e grade de exportação para botões de arquivo de texto. (C) Visão geral do comprimento total, camadas feridas e ulceradas, barra de escala: 3 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Morfologia da mucosa intestinal do camundongo manchada com hematoxilina & eosina após colite aguda DSS-experimental seguida de recuperação. (A) Células intestinais saudáveis organizadas em enigmáticas coloniais cercadas por órmina propria e separadas da submucosa pela mucosa muscular, barra de escala: 200 μm. (B) Inflamação mucosa aguda ou lesão com infiltração de neutrófilos na mucosa e epitélio criptial, associada à distorção/perda epitelial e epitelial e epitelial, barra de escala: 200 μm. (C) Áreas ulceradas ou erodidas com perda epitelial completa e inflamação associada., barra de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Escore de colite histológica e percentual de lesão e ulceração se correlaciona com peso corporal e índice de fezes durante colite experimental de DSS: (A) Os índices de peso corporal e(B)das fezes são avaliados diariamente em camundongos do tipo selvagem tratados com DSS de 2,5% por 5 dias (linha vermelha), seguidos por 5 dias de recuperação na água (linha preta). Os dados são representativos de dois experimentos independentes com pelo menos 4 camundongos por grupo e são expressos como ± SEM. A significância é determinada pela comparação múltipla de ANOVA e Sidak bidirecional, *p<0.033, **p<0.002 e ***p<0.001. (C) O comprimento do cólon dos camundongos foi medido no dia 10. Os dados são representativos de dois experimentos independentes com pelo menos 3 camundongos por grupo e são expressos como ± sem. A significância é determinada pelo teste t do aluno de duas caudas, ***p<0,001. (D) Foram analisadas seções de tecido manchado de hematoxilina e eosina (H&E) de mucosa cólon para calcular, barras de escala: 60 μm. (E) E ) Escore de Colite Histológica (HCS) e percentual de lesão/ulceração relativa ao comprimento do cólon. Os dados são representativos de dois experimentos com 2 camundongos por grupo e são expressos como ± SEM. A significância é determinada pela comparação múltipla de ANOVA e Tukey unidirecional, *p<0.033, **p<0,002 e ***p<0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nosso sistema de pontuação de colitis histológica constitui uma ferramenta confiável para quantificar inflamação tecidual e danos no intestino. Essa abordagem proporciona uma melhor compreensão do estado histopatológico de todo o órgão sem o viés de seleção de pequenas áreas ou seções incompletas. Entre as etapas críticas para executar com sucesso este protocolo estão a preparação adequada dos rolos suíços que permitem a análise de pelo menos 90% do comprimento do cólon; orientação paralela durante a incorporação e secção de parafinas para garantir seções de tecido reto e uniforme com visões longitudinais de criptas epiteliais; prática e treinamento com supervisão de um patologista experiente para confirmar que os estagiários identificam as diferenças entre inflamação aguda, lesão epitelial e erosão/ulceração; e acesso a um scanner digital de alta resolução.
Pequenos ajustes e solução de problemas são necessários para orientar adequadamente o rolo suíço durante a incorporação da parafina, bem como durante a secção para garantir que o tecido seja orientado paralelamente em relação à fita e lâmina de parafina(Figura 1E-F). A adesão a esta orientação espacial reduzirá o número de seções incompletas. Se o cólon estiver perfeitamente enrolado em si mesmo, as melhores seções, incluindo a maior parte do comprimento do tecido, estarão localizadas perto do meio do rolo suíço(Figura 1F). Coletar várias seções aumenta consideravelmente a chance de obter seções bem orientadas onde toda a extensão das criptas é visível(Figura 1G-H). Evite a secção de rolos suíços oblíquos(Figura 1I-J),caracterizados por criptas em forma circular ou donuts cripto(Figura 1K). Muitas vezes a visualização das seções coletadas sob o microscópio é fortemente recomendada para garantir a técnica adequada. Uma boa seção captura toda a extensão do cólon.
Qualquer instrumento que permita capturar toda a extensão do rolo suíço e forneça a resolução necessária para ampliar o tecido para visualizar a arquitetura criptográfica é adequado para avaliação do HCS. Alguns microscópios permitem a sobreposição de pequenas imagens e reconstroem seções inteiras de tecidos. No entanto, a resolução dessas imagens pode ser fraca depois de aumentar a ampliação para pontuar o tecido. Além disso, a sobreposição de seções pode não ser perfeita, deixando áreas de tecido que não são bem definidas e impossíveis de pontuar com precisão.
Entre as vantagens do protocolo de pontuação proposto aqui estão a classificação do tecido em apenas duas categorias inflamação/lesão ou erosão/ulceração. Isso simplifica e acelera a classificação de danos teciduais, aumentando a reprodutibilidade. O software utilizado para a análise é acessível, gratuito e fácil de usar. O HCS reflete com precisão os danos mucosas, pois permite quantificar áreas ulceradas ao longo de toda a extensão do cólon e fornece apropriadamente mais peso para esta patologia sobre regiões inflamadas e não ulceradas. Isso se reflete claramente quando os dados do HCS são comparados com a porcentagem de lesão/ulceração(Figura 4E-F). A análise de pontuação de cada amostra leva aproximadamente 40 minutos. Com o treinamento adequado, acesso a slides digitalizados, um computador e o software, a maioria dos pesquisadores pode realizar a análise. No entanto, é sempre aconselhável confirmar resultados de pontuação com um patologista para garantir precisão e reprodutibilidade. A avaliação da inflamação intestinal pode ser realizada com qualquer software que permita ampliação de alta resolução de lâminas e medidas de comprimento; no entanto, para simplificar, neste protocolo focamos no software listado na Tabela de Materiais.
Temos usado este sistema de pontuação para analisar com sucesso a doença em vários experimentos de colite DSS. Por exemplo, Kelm et al.14 exploraram a importância da glicosylation do CD44v6, um importante regulador de migração epitelial e proliferação, usando um novo anticorpo (GM35). Eles demonstraram redução da pontuação do índice de atividade da doença e melhoraram o HSC em camundongos desafiados com DSS agudo após o direcionamento de sialyl lewis A glycans on epitelial CD44v6, confirmando a importância da modificação pós-translacional das variantes CD44 para recuperação após lesão induzida pelo DSS14. Em outro exemplo, Reed et al.15 utilizaram um modelo crônico de DSS para estudar lesões mucosas e reparar em camundongos com uma exclusão específica epitelial de CD47, uma proteína transmembrana importante para processos inflamatórios e reparadores. Os exames de cólon foram analisados e pontuados para calcular a porcentagem de lesão e ulceração conforme descrito acima, demonstrando reparação mucosa marcadamente prejudicada em camundongos sem CD4715epitelial . O modelo de colite crônica neste relatório utilizou administração cíclica do DSS para analisar lesões e reparos ao longo do tempo.
Publicações adicionais do nosso grupo e de outros demonstraram as vantagens deste sistema de pontuação e sua correlação com os sintomas clínicos6,16,17. Este protocolo descreve em detalhes como preparar e marcar rolos suíços, usando software gratuito e de fácil acesso. A simplicidade da pontuação aqui proposta baseia-se no uso de apenas duas categorias (inflamação/lesão ou erosão/ulceração) em slides digitalizados para facilitar o processo de pontuação e aumentar a reprodutibilidade. É importante ressaltar que o sistema de pontuação aqui descrito também se correlaciona com parâmetros clínicos de inflamação intestinal. Em conclusão, o Score de Collite Histológica é uma ferramenta que pode ser usada para escorar quantitativamente DSS-colite e pode ser aplicada a outros modelos de colite associados à inflamação e lesão/perda epitelial.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores desejam reconhecer o apoio do financiamento do NIH DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 e dos Serviços de Varredura de Slides da Patologia da Universidade de Michigan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
- Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617 (2012).
- Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
- Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
- Luna, L. G. Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , Blakiston Division. (1968).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).
