Summary
여기에서, 우리는 마우스에 있는 상처 감염에서 세균성 분산을 평가하기 위한 ex vivo 및 생체 내 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 국소 항균 및 항 생물막 요법의 효능을 테스트하거나 다른 세균성 균주 또는 종의 분산 용량을 평가하는 데 활용 될 수 있습니다.
Abstract
생물막 관련 감염은 비 치유 당뇨병 발 궤양, 만성 부비동염, 재발성 중이염 미디어 등과 같은 다양한 만성 질환에 연루되어 있습니다. 이러한 감염 내의 미생물 세포는 항생제를 방지하고 면역 세포가 감염을 지우는 것을 방지할 수 있는 세포외 중합체 물질(EPS)에 의해 보호됩니다. 이 장애물을 극복하기 위하여는, 연구원은 잠재적인 치료로 분산 에이전트를 개발하기 시작했습니다. 이들 제제는 생물막 EPS 내의 다양한 성분을 표적으로 하여 구조를 약화시키고 박테리아의 분산을 시정하여 이론적으로 항생제 효능및 면역통전을 개선할 수 있다. 상처 감염에 대한 분산제의 효능을 결정하기 위해, 우리는 생체 내 생체 및 생체내 생물막 분산을 측정하는 프로토콜을 개발했습니다. 우리는 생물막 관련 만성 상처 감염을 만들기 위하여 잘 기술된 마우스 외과 절개 모형을 이용합니다. 생체 내분산을 모니터링하려면 루시파라제를 표현하는 세균균균으로 상처를 감염시킵니다. 일단 성숙한 감염이 설치되면, 우리는 생물막 EPS의 성분을 저하시키는 효소를 포함하는 용액으로 상처를 관개합니다. 그런 다음 상처 및 여과 기관의 발광 신호의 위치와 강도를 모니터링하여 달성된 분산 수준에 대한 정보를 제공합니다. 생물막 분산증의 전 생체 생체 분석의 경우, 감염된 상처 조직은 생체막 분해 효소 용액에 침수되며, 그 후 박테리아 부하가 조직에 남아 있는 용액의 세균 부하에 비해 평가된다. 두 프로토콜 모두 강점과 약점을 가지고 있으며 분산 치료의 효능을 정확하게 결정하는 데 최적화 될 수 있습니다.
Introduction
전 세계적으로 항생제 내성의 상승은 다양한 세균 감염을 치료하는 항생제 옵션의 부족으로 이어지고 있다1. 항생 저항 이외에, 박테리아는 생물막 관련 생활양식2를채택하여 항생 내성을 얻을 수 있습니다. 생물막은 다당류, 세포외 DNA, 지질 및 단백질3의매트릭스에 의해 보호되는 미생물의 공동체이며, 집단적으로 세포외 중합체 물질 (EPS)이라고 합니다. 항생 저항 위기가 계속됨에 따라 항생제의 사용을 연장하거나 항생제의 효능을 강력하게 하는 새로운 전략이 절실히 필요합니다. 바이오필름 방지 제는 하나의 유망한 솔루션4.
제안된 상이한 항생물막 전략 중, 생물막 EPS의 상이한 성분을 표적으로 하는 분산제의 활용은 치료개발5의최전선에 있다. 글리코사이드 하이드로라스(GH)는 분산제의 이러한 클래스 중 하나입니다. GH는 EPS에 구조적 무결성을 제공하는 다당류 내에서 다른 결합의 분열을 촉매하는 효소의 큰 클래스입니다. 우리 그룹은 다른 사람뿐만 아니라, GH가 효과적으로 생물막을 저하시키고, 분산을 유도하고, 생체 외와 생체 내6,7,8,9,10,11모두에서 다양한 세균성 종에 대한 항생제 효능을 향상시킬 수 있음을 보여주었습니다.
바이오필름 분산에 대한 관심이 증가함에 따라 분산 효능을 평가하는 효과적인 방법을 개발하는 것이 중요합니다. 여기서, 우리는 생쥐의 분산제를 가진 생물막 관련 상처 감염의 치료를 위한 상세한 프로토콜을 제시하고, 분산 효능의 평가, 생체 내 및 전 생체 내. 전반적인 목표는 바이오필름 분산을 효과적이고 효율적으로 측정하기 위해 전임상 모델과 함께 사용할 수 있는 효과적인 방법을 제공하는 것입니다.
뮤린 외과 절제 감염 모형은 생물막 관련 감염을 설치하기 위하여 이 연구 결과에서 이용되었습니다. 우리는 15 년 이상이 모델을 사용하고 광범위하게 우리의관찰을 발표했다7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21. 일반적으로, 이것은 박테리아가 상처 침대에 국소남아 생물막 관련 (EPS에 둘러싸인 집계에서 본 박테리아) 최대 3 주 지속되는 만성 감염을 설정하는 비 치명적인 감염 모델입니다. 그러나, 마우스가 면역 타협하는 경우에 (타입-1 당뇨병과 같은), 그(것)들은 이 모형에 있는 치명적인 전신 감염을 개발하기에 더 취약해질 수 있습니다.
이 보고서에서, 우리는 상처에서 박테리아의 분산을 평가하기위한 프로토콜을 제공합니다, 모두 생체 내 및 전 생체. 두 프로토콜 모두 분산제의 효능을 검사하고 자신의 강점과 약점을 가지고 사용하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어 생체 내에서 분산을 평가하면 분산 후 신체의 다른 부위에 박테리아가 퍼지는 것과 숙주가 어떻게 반응하는지에 대한 중요하고 실시간 정보를 제공할 수 있습니다. 한편, 분산전 생체내 를 평가하는 것은 조직이 별도로 테스트될 수 있는 여러 부분으로 나눌 수 있으므로, 따라서 요구되는 마우스의 수를 감소시키기 때문에 다중 제제, 투여량 또는 제형을 선별하는 것이 더 바람직할 수 있다. 여러 에이전트를 평가할 때, 당사는 일반적으로 이전에 설명된 6,9,22와같이 시험관 내 분산을 측정합니다. 그런 다음 가장 효과적인 ex vivo를 테스트하고 매우 유망한 에이전트의 제한된 수에 대한 생체 내 테스트를 예약합니다.
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Protocol
이 동물 프로토콜은 텍사스 공과대학 건강 과학 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 번호 07044)에 의해 검토되고 승인되었습니다. 이 연구는 건강의 국가 학회의 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 지침에 있는 권고에 따라 엄격하게 수행되었습니다.
1. 마우스 감염에 대한 박테리아 준비
참고 : 여기에서 우리는 슈도모나스 아에루기노사로만마우스를 감염시키는 것을 설명합니다. 그러나, 그밖 세균성 종은 감염을 일으키는 원인이 되기 위하여 이용될 수 있습니다. 세균균균및재료는 재료표에 상세하다.
- 이전에설명된바와 같이 이러한 실험에 대해 발광 플라스미드 pQF50-lux23을 운반하는 슈도모나스 아에루기노사 야생형 균주 PAO1을 사용한다.
- 당황 한 에를렌 마이어 플라스크에서 P. aeruginosa 균주를 성장, 루리아 - 베르타니 (LB) 국물에 200 rpm에서 흔들어 와 함께 16 받는 시간 20 시간. 플라스미드의 유지보수를 위해 PAO1(pQF50-lux)의 야간 문화에 100 μg/mL의 최종 농도를 추가합니다.
- 100 μg/mL 암피실린의 최종 농도를 가진 10mL의 LB 국물을 함유한 Erlenmeyer 플라스크에 하룻밤 문화의 100 μL을 첨가하여 서브컬쳐 P. aeruginosa. 그런 다음 37°C에서 2-2.5h를 흔들어 서 서, 0.4의 OD600 nm로 성장한 다음, 약 104세포의 감염 용량에 대해 3회 연속적으로 희석(1:10)한다.
2. 바이오필름 분산 효소 제제
참고: 이 연구를 위해 우리는 분산 처리를 위해 "GH"로 지칭될 동등한 부분 아밀라제및 셀룰라아제(각 의 5%)의 10% 용액을 사용합니다.
- 아밀라제(바실러스 서브틸리스로부터)및 곰팡이 셀룰라아제(아스퍼질러스 니제르출신)의10% GH 용액(w/v)을 1x 인산완충액 식염수(PBS)로 희석한다. PBS를 차량 제어 처리로 사용합니다.
- 효소 활성화를 위해 모든 트리트먼트를 37°C로 30분 간 데우습니다.
3. 실험 동물 및 수술 전 설정
- 12h 빛/어두운 사이클과 음식과 물에 대한 적절한 접근이 있는 환경 제어 조건에서 케이지당 5마리의 쓰레기 메이트인 하우스 마우스.
- 바람직하게는, 8 주에서 10 주 사이에서 여성 스위스 웹스터 마우스를 사용합니다.
- 투여할 적정량을 결정하기 위해 마우스를 계량한다.
- 100 mg/kg 케타민 10 mg/kg 자일라진의 관면 주사로 마취를 투여하십시오.
- 아이 크림 (예 : 새로 고침 P.M.)을 면 봉면을 사용하여 눈에 조심스럽게 바르면 건조함을 줄입니다.
- 수술 내내 호흡속도, 피부 색채 및 체온을 포함한 생리학적 파라미터를 모니터링한다.
4. 등쪽 전체 두께 절제 수술
- 발가락 핀치및 호흡률 및 노력의 모니터링에 의해 마취의 수술 평면을 평가합니다. 등쪽 표면을 면도하고 10분 동안(또는 제품의 지침에 따라) 탈필 크림을 바르면 부드럽게 제거하여 피부가 건조하도록 합니다.
- 통증 관리를 위해, 리도카인0.05 mL을 멸종시킬 영역으로 피하투여하고, 0.02mL의 부프레노르핀을 목 의 스크러프에 피하한다. 통증 관리에 도달 할 수 있도록 10 분 기다립니다.
- 절제하기 전에 알코올 면봉을 사용하여 소독 면을 소독하고 1.5cm 직경원을 뒤쪽의 후방 부분으로 그립니다. 시술 내내 멸균 수술장을 유지하고 오토클레이브 기기와 멸균 장갑을 사용하십시오. 오염을 제한하려면 조명이 설치된 분젠 버너로 수술을 수행하고 각 동물에 대한 깨끗한 도구를 사용합니다.
- 외과 가위를 가진 panniculus 근육의 수준에 전체 두께, 흥분 피부 상처를 관리합니다.
- 절제 후, 반투과성 폴리우레탄 드레싱으로 상처를 즉시 덮습니다.
- 드레싱 아래, 상처 침대에 100 μL PBS에 박테리아의 약104 CFU를 주입하여 감염을 확립하십시오.
참고: 상처는 또한 박테리아 및/또는 곰팡이의 다중 종에 동시에 감염될 수 있고, 또는 전형성된생물막(12)또는환자(19)로부터추출한 탈량 조직을 상처 침대에 배치하여 감염될 수 있다. - 감염 후, 그들은 그들의 오른쪽 반사를 회복 할 때까지 가열 패드와 케이지에 마우스를 배치하고 모니터.
참고: 쥐가 감기에 가지 않도록 하십시오. - 48 h에 대한 상처 감염을 설정합니다.
- 매일 접착제 드레싱을 검사하여 눈물과 비 준수 부위를 검사하고 필요한 경우 교체하십시오.
5. 생체 분산 치료
참고: 여기서는 일련의 3개의 국소 상처 관개솔루션(그림 1)을적용하여 분산제의 투여를 설명한다. 그러나, 프로토콜은 젤, 크림 또는 드레싱의 적용과 같은 다른 유형의 전달에 맞게 조정할 수 있다.
- 치료를 투여하는 동안 마우스를 이소플루란 마취 (산소 분당 3 %와 1 L)에 놓습니다.
- 각 마우스에 대해 200 μL의 처리가 포함된 25G 바늘로 3개의 1mL 주사기를 준비합니다.
- 효소 용액 또는 PBS 제어200 μL을 조심스럽게 들어 올리고 동물의 머리쪽으로 상처 위에 약간 위에 집게로 피부를 꼬집어 상처에 주입하십시오. 조심스럽게 해제 된 피부를 통해 주사기를 관통하고 천천히 드레싱과 상처 침대 사이의 용액을 주입. 이 연구에서 활용 드레싱은 종종 상처 침대와 주변 조직을 모두 부착합니다.
- 상처 침대 전체가 용액으로 덮여 있는지 확인하기 위해, 부드럽게 집게로 드레싱을 들어 올리고 상처 침대에서 꺼내서 천천히 용액을 주입합니다.
- 치료 후, 30 분 동안 자신의 케이지에 다시 마우스를 배치합니다.
- 치료에 노출 된 후 30 분 후에 이소플루란으로 마우스를 다시 마취하고 주사기로 용액을 흡습하여 이전과 동일한 부위에 구멍을 뚫으십시오.
참고: 이 흡량제 용액에는 분산된 세균 세포가 포함되어 있으며, 이는 다양한 다운스트림 분석을 위해 저장될 수 있습니다. - 매번 새로운 주사기를 사용하여 두 번째 및 세 번째 관개 처리를 첫 번째로 관리합니다.
6. 생체 분산 이미징 및 분석
참고: 박테리아의 발광 균주가 감염을 개시하기 위하여 이용되는 경우에, In Vivo 화상 진찰 시스템 (IVIS)는 상처 침대에서 분산을 시각화하기 위하여 이용될 수 있습니다.
- 심상 마우스는 치료 직전과 10 시간 및 20 h 후 처리(도 2 및 보충 도 1)에서처리한다.
- 마우스가 IVIS에 개별적으로 배치하고 560 nm의 파장에서 5 s에 대해 각각 을 이미징하여 마취 하에있는 동안 이미징을 수행합니다. 추가 분석을 위해 이미지를 저장합니다.
참고: 최적의 파장 및 노출 시간은 사용된 리포터와 IVIS 기기 및 이미징 소프트웨어에 따라 달라집니다. - 분석을 위해 IVIS 소프트웨어에서 이미지를 열고 도구 팔레트에서 분석할 영역을 선택합니다.
- 배경을 고려하려면 사진 의 배경에 원을 배치한 다음 각 마우스의 상처 침대 위에 동일한 크기의 원을 놓습니다.
- 측정 값을 업로드하려면 ROI >(관심 영역 보기) 측정을 선택하고 측정 테이블을 스프레드시트에 업로드합니다. 각 상처 침대 측정에서 백그라운드 원을 빼서 각 샘플에 대한 발광을 계산합니다. 다음과 같은 백분율 발광을 계산합니다.
ROI 전 치료-ROI 후 치료/ROI 전처리) x 100.
참고: 제어 및 처리된 마우스는 이미지 획득 또는 광채에 영향을 미칠 수 있는 변수에 대해 정규화하기 위해 동시에 분석되어야 합니다.
7. CFU를 결정하여 분산 평가
- 100 mg/kg 케타민 10 mg/kg 자일라진을 가진 마취 하에 펜토바르비탈 나트륨(예를 들어, 치명적인 플러스)의 0.2mL의 관전 주사에 의해 마우스를 인간적으로 안락사시킵니다.
- 먼저 멸균 집게로 드레싱을 부드럽게 제거한 다음 멸균 수술 가위로 상처 침대 둘레를 잘라내어 상처 침대 조직을 수확하십시오. 가위를 사용하여 근육을 잘라내거나 애타게하는 동안 상처 침대의 한쪽 끝을 집게로 부드럽게 들어 올립니다.
- 상처 침대에서 조직을 사전 표지되고 미리 계량한 2mL 균질화 튜브에 PBS 1mL을 함유한다. 샘플을 삽입 한 후 튜브를 다시 계량 한 다음 3-5 번 부드럽게 반전하여 분산되거나 느슨하게 부착 된 박테리아를 헹구고 PBS를 제거하십시오. 신선한 PBS 1mL를 추가합니다.
- 비장을 수확하기 위해 마우스를 수핀 해부학적 위치에 배치하고 해부 표면에 사지를 고정하여 고정하십시오. 면적을 소독하고 모피가 시료를 오염시키는 것을 막기 위해 70%의 에탄올로 해부할 영역을 담급니다.
- 조심스럽게 하복부의 진피에 수술 가위를 가진 중간선에 수직으로 작은 절개를 만들어 내부 장기에서 피부를 위아래로 끌어 당깁니다. 흉골이 도달 할 때까지 중간 선을 따라 내부로 절개를 계속합니다. 복막 구멍이 노출되고 내부 장기가 보이면 비장을 결합 조직으로부터 부드럽게 분리하고 별도의 균질화 튜브에 배치합니다.
- 상처 침대 조직에 대해 설명된 대로 PBS로 비장과 헹구는 무게를 측정합니다.
참고: 관심 있는 다른 장기도 마찬가지로 수확할 수 있습니다.- 초기 절개를 할 때, 내장, 또는 다른 장기를 뚫지 않도록주의하십시오.
- 60s5m/s의 벤치탑 균질화제를 사용하여 2mL 미리 채워진 비드 밀 튜브에서 샘플을 균질화합니다.
- CFU를 열거하려면 선택적 한천에 샘플과 스팟 플레이트를 연속적으로 희석시합니다. 직렬 희석의 경우, 1.5mL 튜브, 소용돌이에서 PBS의 900 μL으로 샘플의 파이펫 100 μL을 반복하고 5회 반복한다. 도 3에도시된 바와 같이 각 희석제의 피펫 10 μL이 한천판에 있다.
참고: 더 정확한 CFU 수량이 필요한 경우 별도의 한천 플레이트에 샘플의 각 희석100 μL을 확산시면 됩니다.
8. 분산의 Ex vivo 평가(그림 4)
- 상기에 설명된 바와 같이 약104 PAO1을 감염시키고 감염 후 48h를 안락사시다.
- 조심스럽게 멸균 기술을 사용하여 상처 침대를 방해하지 않고, 집게로 드레싱을 제거합니다.
- 멸균 수술 가위를 사용하여 침충병침대의 한쪽 끝을 들어 올려 상처 침대와 가위의 한쪽 끝을 들어 올려 감염되지 않은 조직 아래 근육층과 주변의 감염되지 않은 조직으로부터 감염된 상처 조직을 제거하여 감염되지 않은 피부에서 상처 침대의 둘레를 절단하십시오. 상처 침대 샘플을 동일한 부분으로 나누거나 전체를 사용하십시오.
- 상처 조직을 비어 있는 2mL 비드 밀균질화 튜브에 넣습니다. 그런 다음 샘플을 추가 한 후 튜브를 다시 계량합니다. 다음을 통해 샘플의 가중치를 계산합니다.
샘플을 추가 한 후 무게 - 샘플을 추가하기 전에 무게. - PBS 1mL을 추가하고 튜브를 3-5번 부드럽게 반전하여 샘플을 헹구고 판자 세포를 제거합니다. PBS를 제거하고 폐기합니다.
- 1mL의 GH 처리(또는 부정적 대조군으로서 PBS)를 샘플에 넣고 80rpm에서 흔들림을 가진 37°C에서 2시간 동안 배양한다.
- 생물막 분산용액을 제거하고 별도의 1.5mL 튜브에 넣습니다. 여기에는 분산된 셀이 포함됩니다.
- 나머지 조직 샘플에 PBS 1mL을 추가하고 3-5번 부드럽게 반전하여 남은 분산 된 세포를 헹구십시오. PBS를 제거하고 폐기합니다.
- 나머지 조직에 1mL의 PBS를 추가하고 벤치탑 균질화제를 사용하여 60 s에 대해 5m/s에서 균질화하십시오.
- 1.5mL 튜브에서 PBS의 900 μL에 100 μL의 샘플을 배치하고 총 6 희석제에 대해 5회 반복하여 분산 된 세포 및 균질화 조직 샘플의 용액을 연속적으로 희석시.
- 각 희석의 현물판 10 μL은 미디어 선택적 한충(예를 들어, P. aeruginosa용슈도모나스 격리 용 한천)에 있으며 하룻밤 사이에 37°C에서 플레이트를 배양한다.
- CFU를 계산하고 '분산 퍼센트'를 계산합니다(상피/ (생물막 조직의 CFU내CFU)의 CFU) x 100.
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Representative Results
이 실험에서, 8-10 주 된 여성 스위스 웹스터 마우스는 발광 플라스미드 pQF50-lux를 운반 PAO1의 104 CFU에 감염되었다. 전술한 바와 같이, 감염은 PBS(차량 제어) 또는 10% GH(치료)의 3 x 30분 치료를 투여하기 전에 48시간 동안 확립하여 생물막 EPS를 소화하도록 허용하였다. 마우스는 치료 후(0h) 및 10시간 및 20h 의 후 처리 후에 직접 전처리를 이미지하였다. 도 2A 및 보충 도 1은 밝은 생물 발광 신호를 생성하는 상처 침대 내의 확립된 감염을 보여준다. 상처 침대에서 박테리아의 분산은 GH 치료 (0 h) 직후에 시각화 할 수 있지만 PBS 치료 후는 시각화 할 수 없습니다. 그것은 이전 연구에서, 우리는 혈액과 비장의 박테리아를 발견 했다 주목 해야 한다 5 h 게시물 GH 치료7. 기관내 세균성 보급은 도 2A의하부 패널에 도시된 바와 같이 이미징을 위해 마우스를 측면에 배치하여 볼 수 있다.
PBS와 GH 처리 마우스 모두에서 이미지는 전처리에 비해 20 시간 후 처리에서 발광 신호의 증가를 입증(도 2B). 우리는 이것이 용액관개에 의한 생물막의 기계적 붕괴 때문이라고 가설합니다. 20 시간 후 치료에서, 마우스는 안락사되었고, 상처 침대와 비장은 조직의 CFU / 그램을 확대하기 위해 수집되었다. 상처 침대에 세균부하가 유사했지만(도2C),박테리아는 GH 처리된 마우스(도2D)의비장에서만 검출되었으며, 분산된 박테리아의 확산을 시사하였다.
이전에는 GH 치료가 박테리아의 골재를 분해하여 CFU 카운트 21을 개선할 수 있음을보여주었습니다. 이것은 GH 처리한 마우스의 상처 침대에 있는 세균성 하중의 약간 증가를 설명할 수 있습니다. 마지막으로, GH 처리된 상처 침대는 약간 더 높은 CFU/그램이 있더라도, 더 낮은 % 생물 발광 변경이 있었습니다. 이러한 결과는 CFU 카운트로 발광을 확인하는 것의 중요성을 시사합니다. 이러한 대표적인 결과는 위에서 설명한 프로토콜을 활용하여 수집할 수 있는 데이터의 예를 제공합니다.
그림 1. 생체필름 관련 상처 감염을 확립하고 생체 내에서 분산제 효능을 평가한다. 드레싱은 치료 하기 전에 마우스의 피부에 눈물 또는 접착의 손실을 검사 했다. 손상된 드레싱이 교체되었습니다. 마우스는 치료 투여 직전에 마취하에 배치되었다. 효소 용액의 200 μL, 또는 차량 제어는 상처 침대와 드레싱 사이의 공간에 주입되었다. 드레싱은 전체 상처가 용액에 포화되었는지 확인하기 위해 집게를 사용하여 부드럽게 제기되었습니다. 치료는 30 분 동안 상처 침대에 남아 있었다. 30 분 후, 치료는 주사기로 흡입되었고, 또 다른 200 μL의 치료가 추가되었습니다. 이것은 총 3 개의 치료를 위해 반복되었습니다. 실시간으로 분산을 측정하기 위해 마우스는 치료 전에 IVIS를 사용하여 이미지화되었고, 즉시 사후 치료(0h), 10h 및 20 h 후 처리하였다. 20 시간 후 치료에서, 마우스는 안락사되었고, 상처 침대와 비장을 수집하였다. 샘플은 PBS에서 헹구고 60 s에 대한 5m / s에서 신선한 PBS에서 두 번 균질화되었습니다. 그런 다음 샘플을 연속적으로 희석하고 도금된 지점을 발견하였다. CFU는 확대되었고 CFU/그램이 계산되었습니다. 상처에서 박테리아의 분산의 수준은 IVIS에 의해 평가하거나 비장에 체계적으로 퍼지는 CFU의 수를 결정해서 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 대표적인 데이터는 생체 내에서 분산을 평가하는 방법을 보여줍니다. 48h용 104PAO1(pQF50-lux)에 감염된 상처는 PBS 또는 10% GH(바이오필름 분산 효소 용액)로 처리하였다. PBS 치료는 차량 제어로 사용되었다. 상처 침대는 3 x 30 분 치료로 처리되었습니다. 마우스는 치료 전 IVIS를 사용하여 이미지화되었고, 즉시 사후 처리, 10시간 후 치료, 20시간 후 치료하였다. 측면 보기 이미지는 오버헤드 뷰 이미지(A)에표시된 것과 는 다른 PBS 및 GH 처리 마우스에서 나온 것입니다. 각 치료 전 상처 침대와 각 20 h 후 상처 침대에 대한 ROI가 기록되었습니다. 전처리로부터의 백분율 변화는 (ROI 전 치료-ROI 후 처리/ROI 전처리) x 100(B)으로계산되었다. 20 시간 후 치료에서, 마우스는 안락사되었다. 상처 침대와 비장 수집 및 CFU / 그램 (C와 D, 각각)을결정하기 위해 무게. N=3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 직렬 희석 및 스팟 도금. 균질화된 시료는 소용돌이와 100 μL을 PBS의 900 μL을 포함하는 1.5mL Eppendorf 튜브로 이송하였다. 샘플은 소용돌이를 가졌고 100 μL은 PBS의 900 μL을 가진 또 다른 1.5 mL Eppendorf 튜브로 이송되었다. 이 과정은 5번 반복되었다. 마지막 희석 튜브를 시작으로 10 μL의 샘플은10-8지점에서 한천 판에 도금되었다. 이것은 희석 10-3까지계속되었다. 전형적으로,10-3 희석은 그 자리 내의 박테리아 잔디를 초래한다. 세균 부하가 적은 일부 장기는10-1 희석까지 스팟 도금이 필요할 수 있습니다. 각 조직 샘플에 대해 반복합니다. 24-48h에 대한 37 °C에서 인큐베이터에 한천 판을 배치하거나 관심의 세균 종에 대한 최적의 조건하에서 성장. CFU를 열거하기 위해 개별 식민지를 가능한 가장 낮은 희석으로 계산하고 적절한 희석 계수에 곱하여 CFU/mL을 결정하거나 조직 중량을 사용하여 CFU/g의 조직을 계산합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 감염된 조직 전 생체로부터 분산을 측정하소. 마우스는 안락사되었고 감염된 상처 조직은 무균적으로 제거되었다. 감염된 조직은 2mL 비드 밀균질화 튜브에 배치하고 PBS로 간략하게 헹구었다. 분산제 1mL을 첨가하고 샘플은 80 rpm에서 흔들림으로 37°C에서 2시간 동안 배양되었다. 인큐베이션 후 분산된 세포를 함유하는 용액을 제거하고 별도의 1.5mL 튜브로 배치하였다. 나머지 조직은 PBS의 1 mL로 헹구었다. 신선한 PBS의 1 mL조직을 첨가하고 60s에 대해 5m/s로 균질화되었다. 효소 용액과 균질화 된 조직은 그 때 일련 희석되고 선택적 한천에 도금된 반점이었습니다. CFU는 효소 용액/(효소 용액의 CFU + 조직에서 CFU) x 100으로부터 CFU를 매독하고 분산시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1. 생체 분산에서 측정. 상처는 48h에 104 PAO1 (pQF50-lux)에 감염된 다음 PBS 또는 10 % GH (생물막 분산 효소 용액)로 치료되었습니다. PBS 치료는 차량 제어로 사용되었다. 상처 침대는 3 x 30 분 관개 처리로 취급되었습니다. 마우스는 치료 전에 IVIS를 사용하여 이미지화되었고, 즉시 사후 처리, 10 시간 후 처리 및 20 시간 후 치료 (A)를촬영하였다. 20 시간 후 치료에서, 마우스는 안락사되었다. 상처 침대와 비장 수집 및 CFU / 그램을 결정하기 위해 무게 (B와 C, 각각). N=3. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 우리는 생물막 분산제의 효능을 연구하기 위해 활용할 수 있는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 임상 탈면 샘플을 포함하여 분산제, 세균성 종 또는 전 생체 샘플의 다른 유형으로 사용하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 분산된 세균 세포를 수집하고 연구하기 위하여 임상적으로 관련있는 모형을 제공합니다. 분산된 세균 세포의 표현형은 판자 또는 생물막 세포의 표현형과 구별되는 것으로 나타났다5,24,25,26; 그러나 생체 내에서 분산된 박테리아의 표현형은 아직 설명되지않았다. 분산제가 치료적으로 사용되는 경우, 이러한 세포가 채택하는 표현형을 이해하는 것 뿐만 아니라 효능을 결정하는 것이 중요합니다. 또한 이 프로토콜은 EPS 구조의 변화 또는 신호 경로의 변화가 분산에 미치는 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 다른 외각막화물 성분(예를 들어, 펠, Psl, Alginate)의 돌연변이를 가진 P. aeruginosa 균주의 분산은 야생형 균주의 균주와 비교될 수 있다.
전반적으로, 이 프로토콜은 4개의 주요 단부로 나눌 수 있습니다: (1) 감염을 확립 (2) 투여 처리 또는 (3) 전 생체 처리를 위한 감염된 조직을 수집하고 (4) 분산 효험을 결정. 섹션 1의 중요한 부분은 상처 침대에 감염의 성공적인 설립이다. 플라스미드 안정성을 유지하기 위해 항생제를 필요로하는 발광 균주가 활용되고 있는 경우 감염 에 대비하여 균주를 배양할 때 적절한 항생제를 추가하는 것이 필수적입니다. 또한 플라스미드가 동물(항생제 압력 없이)에 감염되는 동안 유지되지 않을 수 있으므로 세균 부하의 평가가 IVIS 이미징에 완전히 의존해서는 안되지만 CFU에 의해 확인되어야 합니다. 접종 복용량은 또한 감염을 시작 하는 중요 한 단계. P. aeruginosa 및 S. 아우레우스의 경우, 104-5 CFU의 감염 용량이 전형적으로 사용되지만 사용되는 세균 및 마우스 종에 따라 최적의 용량이 다를 수 있습니다.
섹션 2의 중요한 부분은 상처 침대가 감염 및 치료의 발달을 통해 드레싱에 의해 덮여 있는지 확인하는 것입니다. 드레싱이 제대로 부착되지 않으면 상처 침대에서 치료가 누출 될 수 있으며 효과가 없을 수 있습니다. 드레싱은 또한 잠재적인 오염 물질로부터 보호 상처 침대를 유지 하 고 인간의 상처 치유를 모방하는 데 필수적인 마우스에 의해 수축 치유를 손상하는 데 중요합니다. 마지막으로, 섹션 3의 중요한 부분은 수집된 샘플을 적절히 처리하는 것입니다. CFU를 열거하기 위해, 감염된 조직은 균질화를 위한 PBS의 또 다른 1 mL의 추가하기 전에 PBS의 1 mL로 헹구어야 합니다. 폐와 같은 더 많은 섬유질 기관은 더 철저한 균질화를 요구할 수 있습니다.
이러한 프로토콜의 주요 제한사항은 드레싱에 대한 필요한 면밀한 모니터링과 IVIS의 사용률을 이미지 분산및 분산 효능에 대한 가정을 하는 것을 포함한다. 장기 연구의 경우, 모피의 재성장은 상처 부위에 대한 드레싱 준수를 방해할 수 있기 때문에 문제가 될 수 있습니다. 드레싱은 종종 교체가 필요하며, 제거는 상처의 우발적 인 신부와 오염 의 기회로 이어질 수 있습니다. 상처 침대에서 분산을 시각화하려면 생물 발광 세균 균주를 사용해야합니다. 관심의 세균성 종은 생물 발광 기자부족경우,이 옵션은 실현 가능하지 않습니다. 또 다른 제한은 세균을 유도하는 분산 치료의 잠재력입니다, 이는 마우스의 죽음으로 이어질 수 있습니다. 그러나, 우리는 분산된 세포가 효과적으로 생체7에있는 항생제에 의해 살해될 수 있다는 것을 보았습니다.
도 2에 묘사된 대표적인 결과는 분산 효능을 측정하기 위한 IVIS의 한계를 보여줍니다. 첫째, 관심있는 세균 종의 발광 균주를 활용해야합니다. 균주는 상처 침대에서 신체의 다른 부분으로 분산을 시각화하기 위해 여러 층의 조직을 통해 감지 할 수있을만큼 밝은 발광 신호를 생성해야합니다. IVIS27에의해 검출할 수 있을 만큼 강한 발광 신호를 생성하기 위해서는 최소106개의 박테리아가 필요하다는 것이 제기되고 있다. 발광 신호의 감소는 박테리아가 고정 된 단계28에들어갈 때 또한 설명되었습니다. 이로 인해 측정된 ROI와 CFU열거된 29사이의 연결이 끊어질 수 있습니다. 이 제한은 검출을 위한 충분히 강한 신호가 없을 때 거짓 가정으로 이끌어 낼 수 있습니다, 그러나 박테리아는 아직도 존재합니다. 도 2B에도시된 바와 같이, PBS와 10% GH 치료는 치료 후 발광증가를 초래하였다. 이것은 또한 체외에서 세포를 분산 한 후 볼 수있다 호기심과 일관된 관찰이다 (클라우디아마르케스, 빙엄턴 대학, 개인 통신). 치료를 투여하지 않는 생물막의 물리적 중단이 단순히 단단히 포장된 세포를 확산시켜 광 신호가 증가할 수 있습니다. 대안적으로, 분산 처리는 이전에 신진 대사로 비활성이었다 생물 막 세포를 '각성'할 수, 증가 생물 발광의 결과. 어느 쪽이든, CFU 데이터를 가진 IVIS 화상 진찰의 결과를 확인하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 감염된 상처조직(30,31)내에 박테리아의 이질분포가 있다. 따라서, 조직이 더 많은 샘플을 제공하기 위해 전 비보를 분할하는 경우, 각 상처 섹션의 세균 부하가 동일하다고 가정해서는 안됩니다.
이러한 모델의 한계를 극복하기 위해 수행할 수 있는 수정 및 문제 해결이 있습니다. 첫째, 탈모 크림의 노출에 대해 할당된 시간의 양은 사용되는 마우스 종에 따라 조정되어야 할 수도 있다. 예를 들어, 7 분은 전형적으로 스위스 웹스터 마우스에 사용되며, C57BL/6 마우스는 모피를 성공적으로 제거하기 위해 최대 10분의 노출이 필요할 수 있다. 물론 이것은 또한 사용 된 제품에 따라 달라 집니다., 그리고 노출 시간 제조 업체의 지침을 초과 해서는 안. 긴 연구 (4+ 일)가 수행되는 경우, 탈모 크림은 다시 재배 모피를 제거하고 드레싱의 적절한 씰을 보장하기 위해 다시 적용해야 할 수 있습니다. 다음으로, 발광 신호가 감지하기 어려운 경우, IVIS 이미징 중에 노출 시간을 증가시킬 수 있다. 접종 용량 및 감염 시간도 조정할 수 있습니다. 마우스를 압도하는 것이 너무 높지 않은 감염 용량을 사용하는 것이 중요하지만 박테리아가 면역 반응에 의해 즉시 지워지는 것도 너무 낮지 않습니다.
본 프로토콜에서, 우리는 분산에이전트를 가진 48h-old 상처 감염을 취급하는 것을 기술합니다, 이것은 우리가 P. aeruginosa 및/또는 S. 아우레우스에 기인한 감염을 보여주었기 때문에 및 생물막 관련 12,15,16. 그러나, 세균종에 따라, 다른 시간 점은 더 최적일 지도 모릅니다. 이상적으로, 감염이 확립되면 상처의 세균부하가 고원해야합니다. 예를 들어, 우리는 P. aeruginosa와 S. 아우레우스 모두와 함께, 상처에 있는 세균적 부하는 48 h 감염에 의하여 조직의 대략 10 8 CFU/g에 도달하고 상처 가폐될 때까지 그 수준에 남아 있다는 것을 보았습니다. 도 1은 3 x 30분 세동이 필요한 용액으로 치료를 보여 줍니다. 그러나 분산 에이전트가 다른 형태라면 세정이 필요하지 않습니다. 예를 들어, 크림, 젤 또는 엔지니어링 드레싱은 상처 침대 위에 놓을 수 있습니다. 마지막으로, 상처는 판자 세균 세포의 접종을 포함하는 다양한 방법으로 감염될 수 있고, 미리 형성된생물막(12)또는 다른 동물 또는 인간으로부터 감염된 탈량조직(19,32). 우리는 상처 침대에 미리 형성된 생물막 또는 염기질 샘플을 이식하면 여러 종이 판자 형태로 접종될 때보다 더 성공적인 다중 미생물 감염이 초래되는 것을보았다(12)
전반적으로, 이들 프로토콜은 생물막 분산제 및 치료 생물막 분산제의 평가를 연구하는 방법을 설명합니다. 이 모형은 임상적으로 관련있는 인간 적인 감염을 모방하는 복잡한 다편 미생물 생물막 관련 감염의 발달을 허용합니다. 우리의 희망은 이러한 프로토콜이 치료 용 항 생물막 분산제의 개발을 더욱 강화하기 위해 활용되고 정제될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건원 (R21 AI137462-01A1), 테드 내쉬 롱 라이프 재단, 재스퍼 L. 및 잭 덴튼 윌슨 재단및 국방부 (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP)의 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 14823434 | Use to complete serial dilutions of samples |
| 25G 58 in needle | Fisher | 14823434 | Attaches to 1 mL syringe |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher | BP1760-5 | Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture |
| Amylase | MP Biomedicals | 2100447 | Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used |
| Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) | ZooPharm | RX216118 | Use as pain mainagement- may use other options |
| Cellulase | MP Biomedicals | 2150583 | Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used |
| Depilatory cream | Walmart | 287746 | Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair |
| Dressing Forceps, Serrated Tips | Fisher | 12-460-536 | Can use other forms of forceps |
| Erlenmeyer flasks baffled 125 mL | Fisher | 101406 | Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria |
| FastPrep-24 Benchtop Homogenizer | MP Biomedicals | 6VFV9 | Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue |
| Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse |
| Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) | Fisher | 15340151 | Used to homogenize samples for plating |
| Isoflurane | Diamond Back Drugs | ||
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN | Sigma Aldrich | K4138 | Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia |
| LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | Add 25 g/L and autoclave |
| Lidocaine 2% Injectable | Diamond Back Drugs | 2468 | Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting |
| Meropenem | Sigma Aldrich | PHR1772-500MG | Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment |
| Non-sterile cotton gauze sponges | Fisher | 13-761-52 | Use to remove the depilatory cream |
| PAO1 pQF50-lux bacterial strain | Ref [13] | N/A | PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results |
| Petri dishes | Fisher | PHR1772-500MG | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Fisher | BP3991 | Dilute 10x to 1x prior to use |
| Polyurethane dressing | Mckesson | 66024007 | Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections |
| Pseudomonas isolation agar | VWR | 90004-394 | Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes |
| Refresh P.M. | Walmart | Use on eyes to reduce dryness during procedure. | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher | 22-363-750 | Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area |
| Straight Delicate Scissors | Fisher | 89515 | Can also use curved scissors |
| Swiss Webster mice | Charles River | 551NCISWWEB | Other mice strains can be used |
| Syring Slip Tip 1 mL | Fisher | 14823434 | Used to administer drugs and enzyme treatment |
References
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