Summary
在这里，我们描述了 前活体 和 体内 方法，以评估细菌分散从伤口感染在小鼠。该协议可用于测试局部抗菌和抗生物膜疗法的疗效，或评估不同细菌菌株或物种的分散能力。
Abstract
生物膜相关感染与各种慢性疾病有关，如非愈合性糖尿病足溃疡、慢性鼻窦炎、复发性中耳炎介质等。这些感染中的微生物细胞受细胞外聚合物（EPS）的保护，它可以防止抗生素和宿主免疫细胞清除感染。为了克服这一障碍，研究人员已经开始开发分散剂作为潜在的治疗方法。这些制剂针对生物膜EPS中的各种成分，削弱结构，并启动细菌的分散，从理论上讲，这可以提高抗生素的效力和免疫清除。为了确定分散剂对伤口感染的疗效，我们制定了测量前 活体 和 体内生物膜分散的方案。我们使用鼠标手术切除模型，该模型已被很好地描述，以创建生物膜相关的慢性伤口感染。为了监测 体内的分散，我们用表达红十字路西法酶的细菌菌株感染伤口。一旦成熟感染已经确定，我们灌溉伤口的溶液含有酶，降解生物膜EPS的成分。然后，我们监测伤口和过滤器官中发光信号的位置和强度，以提供有关达到的分散水平的信息。对于生物膜分散的 活体 分析，受感染的伤口组织被淹没在生物膜降解酶溶液中，之后对组织中剩余的细菌负荷与溶液中的细菌负荷进行评估。这两种协议都有优点和缺点，可以优化，以帮助准确确定分散治疗的功效。
Introduction
全世界抗生素耐药性上升，导致缺乏抗生素治疗各种细菌感染的选择。除了抗生素耐药性外，细菌还可以通过采用与生物膜相关的生活方式2获得抗生素耐受性。生物膜是由多糖、细胞外DNA、脂质和蛋白质3的基质保护的微生物群落，统称为细胞外聚合物（EPS）。随着抗生素耐药性危机的继续，迫切需要延长抗生素使用或提高抗生素疗效的新战略。反生物膜制剂是一个有前途的解决方案4。
在已提出的不同反生物膜策略中，针对生物膜EPS不同成分的分散剂的利用处于治疗开发的前沿。糖苷水解（GH）是此类分散剂之一。GH 是一大类酶，它催化多糖内部不同键的，为 EPS 提供结构完整性。我们的小组，以及其他人，已经表明，GH可以有效地降解生物膜，诱导分散和提高抗生素疗效的一些不同的细菌物种，无论是体外和体内6，7，8，9，10，11。
随着人们对生物膜分散性的兴趣日益浓厚，开发评估分散疗效的有效方法非常重要。在这里，我们提出了一个详细的协议，用于治疗生物膜相关伤口感染与分散剂在小鼠，并评估分散效力， 在体内 和 前活体。总体目标是提供有效的方法，可用于前科模型，以有效和高效地测量生物膜的分散。
在这些研究中使用了一种穆林手术切除感染模型来建立与生物膜相关的感染。我们使用这个模型已超过15年，并广泛发表我们的观察7，9，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21。一般来说，这是一种非致命性感染模式，细菌保持局部化到病床上，并且与生物膜相关（在EPS包围的聚合物中看到的细菌），建立一种持续长达3周的慢性感染。然而，如果小鼠免疫功能低下（例如1型糖尿病），它们可能更容易在这种模式下出现致命的全身感染。
在这份报告中，我们提供了评估细菌从伤口中传播的协议，无论是体内还是前体内。这两种协议都可用于检查分散剂的功效，并有自己的长处和短处。例如，评估体内的分散性可以提供重要的实时信息，说明细菌在分散后扩散到身体其他部位，以及宿主的反应。另一方面，评估分散前活体可能更可取地筛选多种制剂、剂量或配方，因为组织可以分为多个部分，可以单独测试，从而减少所需的小鼠数量。在评估多个制剂时，我们通常测量分散首先体外，如前所述的6，9，22。然后，我们测试最有效的前活体和储备在体内测试为有限的数量非常有前途的代理。
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Protocol
该动物协议由得克萨斯理工大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会（协议编号07044）审查和批准。这项研究是严格按照《国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南》中的建议进行的。
1. 为小鼠感染准备细菌
注：在这里，我们描述感染小鼠只与 伪多莫纳斯阿鲁吉诺萨。然而，其他细菌物种可能被用来引起感染。细菌菌株和材料详见 材料表。
- 使用伪多莫纳斯阿鲁吉诺萨野生型菌株PAO1携带发光质粒pQF50-lux23为这些实验，如前所述7。
- 在困惑的埃伦迈尔烧瓶中生长 P. aeruginosa 菌株，在 200 rpm 时摇晃，在卢里亚-贝尔塔尼 （LB） 肉汤中以 37 °C 的速度生长 16 至 20 小时。将 100μg/mL 的安非他明最终浓度添加到 PAO1 （pQF50-lux） 的过夜培养中，以维护质粒。
- 亚文化 P. aeruginosa 将 100 μL 的隔夜文化添加到 Erlenmeyer 烧瓶中，该烧瓶含有 10 毫升 LB 汤，最终浓度为 100 μg/mL 安皮西林。然后在37°C时以37°C的速度生长2-2.5小时，达到0.4的OD 600 nm， 然后连续稀释（1：10），感染剂量约为104 个细胞。
2. 生物膜分散酶的制备
注意：对于这项研究，我们使用10%的相同部分淀粉酶和细胞酶溶液（各5%）的溶液，这将被称为"GH"，用于分散治疗。
- 使用10%的GH溶液（w/v）淀粉酶（来自 杆菌亚蒂利斯）和真菌细胞酶（来自 阿斯珀吉卢斯尼格尔）稀释在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）。使用 PBS 作为车辆控制处理。
- 将所有治疗加热至 37 °C，30 分钟用于酶激活。
3. 实验动物和术前设置
- 在环境控制条件下，每笼5只小鼠，有12小时的光/暗循环，并适当获得食物和水。
- 最好使用8至10周大的瑞士雌性韦伯斯特小鼠。
- 称量小鼠以确定适当的麻醉量来管理。
- 通过100毫克/千克氯胺酮10毫克/千克西拉津的腹内注射进行麻醉。
- 使用棉签小心地将眼霜（例如，刷新 P.M）涂抹在眼睛上，以减少干燥。
- 在整个手术过程中监测生理参数，包括呼吸速率、肤色和体温。
4. 多萨尔全厚切除手术
- 通过脚趾捏和呼吸速率和努力监测麻醉手术平面。剃下后表面，涂抹10分钟（或按照产品的说明），然后轻轻取出，确保皮肤干燥。
- 对于疼痛管理，将0.05毫升的利多卡因皮下注射到要切除的区域，并将0.02毫升丁丙诺啡皮下注射到颈部的擦伤中。等待10分钟，以确保疼痛管理达到。
- 切除前，使用酒精拭子对背部表面进行消毒，并将直径为 1.5 厘米的圆圈绘制到背部的后部。在整个手术过程中保持无菌手术场，并使用自片仪器和无菌手套。为了限制污染，请用点燃的 Bunsen 燃烧器进行手术，并为每只动物使用清洁工具。
- 用手术剪刀将全厚、切除的皮肤伤口施用到泛尼库鲁肌肉的水平。
- 切除后，立即用半可渗透聚氨酯敷料盖住伤口。
- 在敷料下的100μL PBS中注射约104 个CFU细菌，在伤口床上，以建立感染。
注：伤口也可以同时感染多种细菌和/或真菌，或将预先形成的生物膜12，甚至从患者身上提取的脱行组织放在伤口床上。 - 感染后，将老鼠放入笼子里，用加热垫和监测器，直到它们恢复右反射。
注意：确保老鼠不会感冒，因为这样会导致死亡。 - 建立48小时的伤口感染。
- 每天检查粘合敷料是否有眼泪和不粘附的区域，如果需要，请更换。
5. 体内 分散治疗
注：在这里，我们通过应用一系列3个局部伤口灌溉解决方案（图1）来描述分散剂的管理。但是，该协议可以适应其他类型的交付，如应用凝胶，面霜或敷料。
- 在进行治疗时，将小鼠置于异氟烷麻醉下（每分钟氧气3%和1升）。
- 准备三个1mL注射器，配25G针，每只小鼠含有200μL的治疗。
- 通过小心地抬起和用钳子捏紧皮肤，将200μL的酶溶液或PBS控制注射到伤口上，稍微高于伤口，朝向动物头部。小心地将注射器刺穿抬起的皮肤，并慢慢在敷料和伤口床之间注射溶液。本研究中使用的敷料通常粘附在病床和周围组织上。
- 为了确保整个病床被溶液覆盖，用钳子轻轻抬起敷料，将其从病床上拉开，同时慢慢注射溶液。
- 治疗后，将老鼠放回笼子里30分钟。
- 在接触治疗30分钟后，用异氟兰重新麻醉小鼠，用注射器吸气溶液，确保穿刺在同一区域。
注意：这种吸气溶液包含分散的细菌细胞，可用于各种下游分析。 - 以第一种灌溉方法管理第二次和第三次灌溉处理，每次都使用新的注射器。
6. 体内 分散成像和分析
注意：如果利用发光菌株引发感染，则可以使用 Vivo 成像系统 （IVIS） 可视化伤口的分散。
- 图像小鼠在治疗前后，在10和20小时治疗后（图2和补充图1）。
- 在小鼠麻醉时进行成像，将它们单独放入 IVIS 中，并在波长为 560 nm 的 5s 中分别成像 5s。保存图像以供进一步分析。
注：最佳波长和曝光时间将取决于使用的记者以及 IVIS 仪器和成像软件。 - 要进行分析，请打开 IVIS 软件中的图像，并选择工具调色板中要分析的区域。
- 为了说明背景，在照片的背景上放置一个圆圈，然后为每只鼠标在伤口床顶部放置相同大小的圆圈。
- 要上传测量值，请选择 视图 ->感兴趣区域 （ROI） 测量 ，并将测量表上传到电子表格。从每个伤口床测量中减去背景圆读数，以计算每个样本的发光度。计算百分比发光变化：
治疗前投资回报率-治疗后/治疗前投资回报率）x 100。
注意：应同时分析控制和处理小鼠，以正常化可能影响图像采集或辐射的变量。
7. 通过确定CFU来评估分散性
- 通过麻醉下注射0.2mL的五巴比妥钠（如致命加）与100毫克/千克氯胺酮10毫克/千克西拉津，人道地安乐死小鼠。
- 首先用无菌钳子轻轻取出敷料，然后用无菌手术剪刀在伤口床周围切开伤口床组织。用钳子轻轻抬起伤口床的一端，同时用剪刀将样本从肌肉层中切开/ 挑逗。
- 将伤口床上的组织置于预标记和预称的 2 mL 均质化管中，其中含有 1 mL 的 PBS。插入样品后再次称重管子，然后轻轻倒置 3-5 次，冲洗掉任何分散或松散粘附的细菌，并去除 PBS。添加1毫升的新鲜PBS。
- 为了收获脾脏，将小鼠置于超精解剖位置，并将四肢固定在解剖表面，从而固定在安全状态。浸泡用70%乙醇解剖的区域，以消毒该地区，防止毛皮对样品进行污染物。
- 小心地用手术剪刀在下腹部的真皮上切开一个小切口垂直于中线，确保将皮肤拉起并远离内脏。继续切口内部，沿中线，直到胸骨达到。一旦腹腔暴露，内部器官可见，轻轻地将脾脏从结缔组织中分离出来，并放置在一个单独的同质化管中。
- 称脾脏和冲洗与PBS，如描述的伤口床组织。
注：其他感兴趣的器官也可以同样收获。- 在做最初的切口时，注意避免刺穿肠道或其他器官。
- 使用台面同质化剂在 2 mL 预填充珠磨管中均质样品，在 60 年代以 5 米/s 的速度均质化两次。
- 要列举 CFU，在选择性 agar 上连续稀释样品和点板。对于串行稀释，将样品的 100 μL 移液器放入 900 μL 的 PBS 中，放入 1.5 mL 管中，涡流并重复 5 次。派佩特 10 μL 的每个稀释到一个阿加板，如 图 3所示。
注意：如果需要更精确的 CFU 量度，则将样品每次稀释的 100 μL 分布到单独的 agar 板上。
8. 分散的外活体 评估 （图4）
- 伤口小鼠和感染约104 PAO1如上所述，然后安乐死48小时后感染。
- 使用无菌技术，小心地用钳子取出敷料，不要打扰病床。
- 使用无菌手术剪刀将伤口床的周长从未受感染的皮肤上切开，用钳子将伤口床的一端和剪刀抬起来，从下面的肌肉层和周围未受感染的组织中清除受感染的伤口组织。将伤口床样本分成相等的部分或使用整体。
- 将伤口组织放入空的、预称的 2 mL 珠磨同质管中。然后在添加样品后再次称重管子。计算样本的重量：：
添加样本后的重量-重量后再添加样本。 - 加入 1 mL 的 PBS，轻轻倒置管 3-5 次，冲洗样品并去除任何浮石细胞。删除并丢弃 PBS。
- 在样品中加入 1 mL 的 GH 处理（或 PBS 作为负控制），在 37 °C 处孵育 2 小时，在 80 rpm 时摇晃。
- 取出生物膜分散溶液，放入单独的 1.5 mL 管中。这包含分散的细胞。
- 将 1 mL 的 PBS 添加到剩余的组织样本中，然后轻轻倒置 3-5 次，以冲洗掉任何剩余的分散细胞。删除并丢弃 PBS。
- 在剩余组织中加入 1 mL 的 PBS，然后使用台式同质化剂在 5 米/s 下均质化 60s。
- 通过将 100 μL 的样品放入 1.5 mL 管中的 900 μL PBS 中，并重复 5 次，共稀释 6 次，从而连续稀释分散的细胞和均质组织样本的溶液。
- 斑板 10 μL 的每个稀释到媒体选择性 agar （例如， 伪多莫纳斯隔离阿加为 P. aeruginosa），并在 37 °C 过夜孵育板。
- 计算 CFU 并计算"百分比分散"为 （超自然物质中的 CFU/ （超自然物质中的 CFU+ 生物膜组织中的 CFU）） x 100。
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Representative Results
在这个实验中，8-10周大的瑞士雌性韦伯斯特小鼠感染了携带发光质粒pQF50-lux的PAO1的104 个CFU。如上所述，感染允许建立48小时之前，管理3×30分钟的治疗PBS（车辆控制）或10%GH（治疗），以消化生物膜EPS。小鼠在治疗后（0 h）和治疗后10小时和20小时进行成像预处理。 图2A 和 补充图1 显示伤口内已建立的感染，产生明亮的生物发光信号。GH 治疗 （0 h） 后，可立即可直观地将细菌从伤口床上分散，但 PBS 治疗后无法可视化。需要注意的是，在以前的研究中，我们早在GH治疗7小时后就检测到血液和脾脏中的细菌。细菌传播到器官也可以看到，把鼠标放在其一侧成像，如 图2A的下面板所示。
PBS和GH处理小鼠的图像显示，与治疗前相比，治疗后20小时亮度信号增加（图2B）。我们假设这是由于灌水引起的生物膜机械中断的溶液。治疗后20小时，老鼠被安乐死，伤口床和脾脏被收集起来，以列举CFU/gram组织。虽然伤口床的细菌负荷相似（图2C），但细菌只在GH处理小鼠的脾脏中检测到（图2D），表明分散的细菌传播。
此前，我们已经表明，GH治疗可以分解细菌的聚集物，提高CFU计数21。这可以解释GH治疗小鼠伤口的细菌负荷略有增加。最后，虽然GH治疗的伤口床的CFU/克稍高，但生物发光变化率较低。这些结果表明，用CFU计数确认发光的重要性。这些具有代表性的结果提供了一个数据示例，这些数据可以通过使用上述协议来收集。
图1。建立生物膜相关伤口感染和评估分散剂 在体内的功效。 在治疗之前，对敷料进行了检查，检查其眼泪或对小鼠皮肤的粘附性是否丧失。妥协的敷料被替换。在治疗前，老鼠被置于麻醉之下。200微升的酶溶液，或车辆控制，被注射到伤口床和敷料之间的空间。敷料用钳子轻轻抬起，以确保整个伤口在溶液中饱和。治疗留在病床上30分钟。30分钟后，用注射器吸气治疗，并添加了200μL的治疗。总共重复了3次治疗。为了实时测量分散性，在治疗前使用 IVIS 对小鼠进行成像，治疗后立即（0 h）、10 h 和 20 h 治疗后进行成像。20小时后，老鼠被安乐死，伤口床和脾脏被收集起来。样品在PBS中冲洗，然后在60年代以5米/s的速度在新鲜PBS中均质两次。然后，样品被连续稀释和斑点镀。列举了CFU，计算了CFU/克。细菌从伤口上扩散的程度可以通过 IVIS 评估或确定系统地传播到脾脏的 CFU 数量。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2。代表性数据演示了如何评估体内的分散性。 感染104 PAO1（pQF50-lux）48小时的伤口用PBS或10%GH（生物膜分散酶溶液）治疗。PBS 处理被用作车辆控制。伤口床经过3×30分钟的治疗。小鼠在治疗前使用 IVIS 进行成像，治疗后立即进行 10 小时，治疗后使用 20 小时。需要注意的是，与头顶视图（A）中显示的图像相比，侧视图图像来自不同的 PBS 和 GH 处理小鼠。记录了每个治疗前病床和每张20小时治疗后伤口床的投资回报率。治疗前变化百分比计算为（治疗前ROI/治疗前ROI）x 100（B）。治疗后20小时，老鼠被安乐死。伤口床和脾脏被收集和称重，以确定CFU/克（C和D，分别）。N=3。请单击此处查看此图的较大版本。
图3。串行稀释和点电镀。 同质化样品被漩涡化，100μL被转移到含有900μL PBS的1.5 mL埃彭多夫管中。样品是漩涡和100μL被转移到另一个1.5 mL埃彭多夫管与900μL的PBS。此过程重复了 5 次。从最后一根稀释管开始，10μL的样品被当场镀在10-8点的阿加板块上。这一直持续到稀释10-3。通常，10-3 稀释会导致现场内的细菌草坪。有些器官细菌负荷低，可能需要点电镀至10-1 稀释。每个组织样本重复上述步骤。将 agar 板放在 37 °C 的孵化器中，持续 24-48 h，或在最适合感兴趣的细菌物种的条件下生长。要列举 CFU，请尽可能以最低稀释率计算单个菌落，并通过适当的稀释因子进行乘以以确定 CFU/mL 或使用组织重量计算组织 CFU/g。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4。测量从受感染组织 前活体的分散。 老鼠被安乐死，受感染的伤口组织被无菌地切除。受感染的组织被放置在2mL珠磨同质管中，并用PBS短暂冲洗。添加了 1 mL 的分散剂，样品在 37 °C 时孵育了 2 小时，在 80 rpm 时摇晃。孵化后，将含有分散细胞的溶液移除并放入单独的 1.5 mL 管中。剩余的组织用1mL的PBS冲洗。1 mL 的新鲜 PBS 被添加到组织中，并在 5 米/s 的 60 年代均质化。酶溶液和同质化组织然后被连续稀释，并斑点镀在选择性阿加。CFU 被列举，分散计算为：酶溶液中的 CFU/ （酶溶液中的 CFU + 组织中的 CFU） x 100。 请单击此处查看此图的较大版本。
补充图1。以 体内 分散测量。 伤口感染了104 PAO1（pQF50-lux）48小时，然后用PBS或10%GH（生物膜分散酶溶液）治疗。PBS 处理被用作车辆控制。伤口床经过3×30分钟的灌溉处理。小鼠在治疗前使用 IVIS 进行成像，治疗后立即进行 10 小时，治疗后使用 20 小时 （A）。治疗后20小时，老鼠被安乐死。伤口床和脾脏被收集和称重，以确定CFU/克 （B和C，分别）。N=3。请单击此处下载此文件。
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Discussion
在这里，我们描述了可用于研究生物膜分散剂功效的协议。这些协议可以很容易地适应使用不同类型的分散剂，细菌物种或前活体样本，包括临床脱尿样本。该协议还提供了一个临床相关的模型，以收集和研究分散的细菌细胞。分散细菌细胞的表型已证明与浮石或生物膜细胞5、24、25、26的表型不同：然而，在体内分散的细菌的表型尚未被描述。如果分散剂要用于治疗，确定其疗效，以及了解这些细胞采用的表型，是重要的。此外，此协议可用于研究 EPS 结构的变化或信号通路的改变如何影响分散。例如，不同外糖成分（如Pel、Psl、阿尔加特）中具有突变的P.aeruginosa菌株的分散性可以与野生菌株进行比较。
总体而言，此协议可分为四个主要部分：（1） 建立感染 （2） 管理治疗或 （3） 收集受感染组织进行 外活体 治疗，（4） 确定分散疗效。第1节的关键部分是成功地在病床上建立感染。如果使用需要抗生素来维持质粒稳定的发光菌株，在培养菌株以准备感染时必须添加适当的抗生素。还应考虑在动物感染期间（没有抗生素压力）不能维持质粒，因此对细菌负荷的评估不应完全依赖 IVIS 成像，而应由 CFU 确认。接种剂量也是开始感染的关键步骤。对于 P.aeruginosa 和 S.Aureus， 通常使用104-5 CFU的感染剂量，但最佳剂量可能因所使用的细菌和小鼠物种而异。
第2节的关键部分是确保伤口床在整个感染和治疗过程中被敷料覆盖。如果敷料粘附不当，治疗可能会从病床上泄漏，可能无效。敷料对于保护伤口床免受潜在污染物的伤害，以及损害小鼠的收缩愈合也很重要，而小鼠对模仿人类伤口愈合至关重要。最后，第3节的关键部分是妥善处理收集的样本。为了列举CFU，感染的组织应在添加另外1mL的PBS以实现同质化之前，用1mL的PBS冲洗。更多的纤维器官，如肺，可能需要更彻底的同质化。
这些协议的主要局限性包括需要密切监测敷料和利用 IVIS 图像分散和假设分散有效性。对于长期研究，毛皮的再生长可能是有问题的，因为它会阻碍穿衣粘性到伤口部位。敷料通常需要更换，去除可能导致意外的伤口脱衣和污染的机会。为了可视化伤口床的分散，必须使用生物发光细菌菌株。如果感兴趣的细菌物种缺乏生物发光报告器，此选项是不可行的。另一个限制是分散治疗诱发细菌血症的潜力，这可能导致小鼠死亡。然而，我们已经看到，分散的细胞可以有效地杀死抗生素在体内7。
图2中描述的代表性结果说明了 IVIS 在测量分散疗效方面的限制。首先，必须利用感兴趣的细菌物种的发光菌株。应变必须产生足够明亮的发光信号，通过多层组织检测，以便可视化从伤口床到身体其他部位的分布。有人建议，至少需要大约106种细菌才能产生足够强的发光信号，由IVIS27检测。当细菌进入静止阶段28时，发光信号也减少了。这可能导致测量的投资回报率与列举的CFU之间出现脱节。当信号不够强，无法检测时，这种限制可能导致错误的假设，但细菌仍然存在。如图2B所示，PBS和10%的GH治疗导致治疗后发光增加。这是一个奇怪的和一致的观察，这也看到后，分散细胞在体外（克劳迪娅马奎斯，宾厄姆顿大学，个人沟通）。实施治疗对生物膜的物理破坏可能只会分散紧密包装的细胞，从而增加光信号。或者，分散治疗可以"唤醒"以前代谢不活跃的生物膜细胞，从而增加生物发光。无论哪种方式，使用 CFU 数据确认 IVIS 成像结果都至关重要。最后，受感染的伤口组织内细菌分布异质。因此，如果组织被除以提供更多的样本，则不应假设每个伤口部分的细菌负荷相同。
可以进行修改和故障排除，以克服这些模型的局限性。首先，可能需要根据所使用的鼠标种类调整用于暴露脱脂霜的时间。例如，7分钟通常用于瑞士韦伯斯特小鼠，而C57BL/6小鼠可能需要长达10分钟的接触才能成功去除毛皮。这当然也取决于所使用的产品，曝光时间不应超过制造商的说明。如果进行长期研究（4天以上），可能需要重新涂抹脱皮膏，以去除重新生长的毛皮，并确保敷料的适当密封。其次，如果难以检测发光信号，在 IVIS 成像期间可以增加曝光时间。接种剂量和感染时间也可以调整。重要的是使用感染剂量不是太高，它压倒了小鼠，但也不是太低，细菌立即清除的免疫反应。
在这个协议中，我们描述了用分散剂治疗48小时老伤口感染，因为这是一个时间点，我们已经表明由P.aeruginosa和/或S.金黄色葡萄球菌引起的感染已经建立和生物膜相关的12，15，16。 然而，根据细菌物种的不同，其他时间点可能更理想。理想情况下，一旦发现感染，伤口中的细菌负荷应稳定下来。例如，我们看到，在P.aeruginosa和S.Aureus中，伤口中的细菌负荷在感染后48小时达到约108 CFU/g的组织，并一直保持在该水平，直到伤口关闭。图1说明了需要3 x 30分钟洗涤的溶液的治疗。但是，如果分散剂是另一种形式，则不需要清洗。例如，奶油、凝胶或工程敷料可以简单地放在伤口床的顶部。最后，伤口可以通过各种方式感染，包括给浮石细菌细胞接种，预制生物膜12，甚至感染从另一种动物或人类19，32的脱血组织。我们看到，移植预先成形的生物膜或脱尿样本到病床上，比多种以浮石形式12接种疫苗时，导致更成功的多微生物感染。
总的来说，这些协议描述了研究生物膜分散的方法和治疗性生物膜分散剂的评价。这些模型允许开发复杂的多微生物生物膜相关感染，模仿临床相关的人类感染。我们希望，这些协议将得到利用和完善，以进一步推动抗生物膜分散剂的治疗用途的发展。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家卫生研究院（R21 AI137462-01A1）、泰德·纳什长寿基金会、贾斯珀·L和杰克·丹顿·威尔逊基金会以及国防部（国防部MDRP W0318_19_NM_PP）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 14823434 | Use to complete serial dilutions of samples |
| 25G 58 in needle | Fisher | 14823434 | Attaches to 1 mL syringe |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher | BP1760-5 | Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture |
| Amylase | MP Biomedicals | 2100447 | Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used |
| Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) | ZooPharm | RX216118 | Use as pain mainagement- may use other options |
| Cellulase | MP Biomedicals | 2150583 | Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used |
| Depilatory cream | Walmart | 287746 | Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair |
| Dressing Forceps, Serrated Tips | Fisher | 12-460-536 | Can use other forms of forceps |
| Erlenmeyer flasks baffled 125 mL | Fisher | 101406 | Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria |
| FastPrep-24 Benchtop Homogenizer | MP Biomedicals | 6VFV9 | Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue |
| Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse |
| Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) | Fisher | 15340151 | Used to homogenize samples for plating |
| Isoflurane | Diamond Back Drugs | ||
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN | Sigma Aldrich | K4138 | Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia |
| LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | Add 25 g/L and autoclave |
| Lidocaine 2% Injectable | Diamond Back Drugs | 2468 | Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting |
| Meropenem | Sigma Aldrich | PHR1772-500MG | Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment |
| Non-sterile cotton gauze sponges | Fisher | 13-761-52 | Use to remove the depilatory cream |
| PAO1 pQF50-lux bacterial strain | Ref [13] | N/A | PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results |
| Petri dishes | Fisher | PHR1772-500MG | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Fisher | BP3991 | Dilute 10x to 1x prior to use |
| Polyurethane dressing | Mckesson | 66024007 | Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections |
| Pseudomonas isolation agar | VWR | 90004-394 | Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes |
| Refresh P.M. | Walmart | Use on eyes to reduce dryness during procedure. | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher | 22-363-750 | Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area |
| Straight Delicate Scissors | Fisher | 89515 | Can also use curved scissors |
| Swiss Webster mice | Charles River | 551NCISWWEB | Other mice strains can be used |
| Syring Slip Tip 1 mL | Fisher | 14823434 | Used to administer drugs and enzyme treatment |
References
- Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
- Stewart, P. S.
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
- Rumbaugh, K. P., Sauer, K.
- Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
- Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).
- Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).
- Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
- Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
- Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).
- Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
- Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
- Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
- Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).
- Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129 (2015).
- Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, Sup10 33-43 (2016).
- Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).
- Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
- DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
- Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
- Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462 (2014).
- Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
- Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
- Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
- Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U.
- Stewart, P. S., Franklin, M. J.
- Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).
