Summary
Hier beschrijven we ex vivo en in vivo methoden voor het beoordelen van bacteriële dispersie van een wondinfectie bij muizen. Dit protocol kan worden gebruikt om de werkzaamheid van topische antimicrobiële en antibiofilmtherapieën te testen, of om de dispersiecapaciteit van verschillende bacteriestammen of soorten te beoordelen.
Abstract
Biofilm-gerelateerde infecties zijn betrokken bij een breed scala aan chronische aandoeningen zoals niet-genezende diabetische voetzweren, chronische sinusitis, terugkerende otitis media en nog veel meer. Microbiële cellen binnen deze infecties worden beschermd door een extracellulaire polymere stof (EPS), die kan voorkomen dat antibiotica en gastheerimmuuncellen de infectie verwijderen. Om dit obstakel te overwinnen, zijn onderzoekers begonnen met het ontwikkelen van dispergeermiddelen als potentiële therapieën. Deze middelen richten zich op verschillende componenten in de biofilm EPS, verzwakken de structuur en initiëren de verspreiding van de bacteriën, wat theoretisch de potentie van antibiotica en immuunklaring kan verbeteren. Om de werkzaamheid van dispersiemiddelen voor wondinfecties te bepalen, hebben we protocollen ontwikkeld die biofilmdispersie zowel ex vivo als in vivo meten. We gebruiken een muis chirurgisch excisiemodel dat goed is beschreven om biofilm-geassocieerde chronische wondinfecties te creëren. Om de dispersie in vivote controleren, infecteren we de wonden met bacteriële stammen die luciferase uitdrukken. Zodra volwassen infecties zijn vastgesteld, irrigeren we de wonden met een oplossing die enzymen bevat die componenten van de biofilm EPS afbreken. Vervolgens monitoren we de locatie en intensiteit van het lichtgevende signaal in de wond en filteren we organen om informatie te geven over het bereikte verspreidingsniveau. Voor ex vivo analyse van biofilmdispersie wordt geïnfecteerd wondweefsel ondergedompeld in biofilmafbrekende enzymoplossing, waarna de bacteriële belasting die in het weefsel achterbleef, versus de bacteriële belasting in oplossing, wordt beoordeeld. Beide protocollen hebben sterke en zwakke punten en kunnen worden geoptimaliseerd om de effectiviteit van dispersiebehandelingen nauwkeurig te bepalen.
Introduction
De toename van antibioticaresistentie wereldwijd leidt tot een gebrek aan antibioticaopties om een verscheidenheid aan bacteriële infecties te behandelen1. Naast antibioticaresistentie kunnen bacteriën antibioticatolerantie krijgen door een biofilm-geassocieerde levensstijl aan te nemen2. Een biofilm is een gemeenschap van micro-organismen die worden beschermd door een matrix van polysachariden, extracellulair DNA, lipiden en eiwitten3, gezamenlijk de extracellulaire polymere stof (EPS) genoemd. Naarmate de antibioticaresistentiecrisis voortduurt, zijn nieuwe strategieën nodig die het gebruik van antibiotica verlengen of de werkzaamheid ervan versterken. Anti-biofilmmiddelen zijn een veelbelovende oplossing4.
Onder de verschillende anti-biofilmstrategieën die zijn voorgesteld, loopt het gebruik van dispergeermiddelen, die zich richten op verschillende componenten van de biofilm EPS, voorop in de therapeutische ontwikkeling5. Glycosidehydrolasen (GH) zijn zo'n klasse van dispergeermiddel. GH zijn een grote klasse enzymen die het decolleté van verschillende bindingen binnen de polysachariden katalyseren die structurele integriteit bieden aan de EPS. Onze groep, evenals anderen, hebben aangetoond dat GH biofilms effectief kan afbreken, dispersie kan induceren en de werkzaamheid van antibiotica kan verbeteren voor een aantal verschillende bacteriesoorten, zowel in vitro als in vivo6,7,8,9,10,11.
Met een groeiende interesse in biofilm dispersie, is het belangrijk om effectieve methoden te ontwikkelen die de dispersie-werkzaamheid beoordelen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de behandeling van biofilm-geassocieerde wondinfecties met een dispergeermiddel bij muizen, en de beoordeling van de dispersie-werkzaamheid, in vivo en ex vivo. Het algemene doel is om effectieve methoden te bieden die kunnen worden gebruikt met preklinische modellen om biofilmdispersie effectief en efficiënt te meten.
Een murien chirurgisch excisie infectiemodel werd in deze studies gebruikt om een biofilm-geassocieerde infectie vast te stellen. We gebruiken dit model al meer dan 15 jaar en publiceerden onze observaties uitgebreid7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Over het algemeen is dit een niet-dodelijk infectiemodel waarbij bacteriën gelokaliseerd blijven in het wondbed en biofilm-geassocieerd zijn (bacteriën gezien in aggregaten omringd door EPS), waardoor een chronische infectie wordt opgezet die tot 3 weken duurt. Als muizen echter immuungecompromitteerd zijn (met type 1 diabetes bijvoorbeeld), kunnen ze vatbaarder worden voor het ontwikkelen van een fatale systemische infectie in dit model.
In dit rapport bieden we protocollen voor het beoordelen van de verspreiding van bacteriën uit een wond, zowel in vivo als ex vivo. Beide protocollen kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van een dispergeermiddel te onderzoeken en hebben hun eigen sterke en zwakke punten. Het beoordelen van dispersie in vivo kan bijvoorbeeld belangrijke, realtime informatie opleveren over de verspreiding van bacteriën naar andere delen van het lichaam na dispersie en hoe de gastheer reageert. Aan de andere kant kan het beoordelen van dispersie ex vivo wenselijker zijn voor het screenen van meerdere middelen, doses of formuleringen, omdat het weefsel kan worden onderverdeeld in meerdere secties die afzonderlijk kunnen worden getest, waardoor het aantal benodigde muizen wordt verminderd. Bij het beoordelen van meerdere middelen meten we meestal dispersie eerst in vitro zoals eerder beschreven 6,9,22. Vervolgens testen we de meest effectieve ex vivo en reserveren we in vivo testen voor een beperkt aantal veelbelovende middelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit dierprotocol is beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Texas Tech University Health Sciences Center (protocolnummer 07044). Deze studie is uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de Nationale Instituten voor Gezondheid.
1. Bacteriën voorbereiden op muizeninfecties
OPMERKING: Hier beschrijven we het infecteren van muizen alleen met Pseudomonas aeruginosa. Andere bacteriesoorten kunnen echter worden gebruikt om infectie te veroorzaken. Bacteriële stammen en materialen worden beschreven in de tabel met materialen.
- Gebruik Pseudomonas aeruginosa wild-type stam PAO1 met de luminescentie plasmide pQF50-lux23 voor deze experimenten zoals eerder beschreven7.
- Kweek P. aeruginosa stammen in verbijsterde Erlenmeyer kolven, met schudden bij 200 tpm, in Luria-Bertani (LB) bouillon bij 37 °C gedurende 16 tot 20 uur. Voeg een eindconcentratie van 100 μg/ml ampicilline toe aan de nachtcultuur van PAO1 (pQF50-lux) voor het behoud van de plasmide.
- Subcultuur P. aeruginosa door 100 μL van de nachtcultuur toe te voegen aan een Erlenmeyerkolf met 10 ml LB bouillon met een eindconcentratie van 100 μg/ml ampicilline. Groei vervolgens gedurende 2-2,5 uur bij 37 °C met schudden, tot een OD600 nm van 0,4 en verdun vervolgens drie keer serieel (1:10) voor een infecterende dosis van ongeveer 104 cellen.
2. Bereiding van biofilmdispersie-enzym
OPMERKING: Voor deze studie gebruiken we een 10% oplossing van gelijke delen amylase en cellulase (5% van elk), die "GH" zal worden genoemd, voor de dispersiebehandeling.
- Gebruik een 10% GH-oplossing (m/v) amylase (van Bacillus subtilis) en schimmel cellulase (uit Aspergillus niger) verdund in 1x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS). Gebruik PBS als behandeling voor voertuigbesturing.
- Verwarm alle behandelingen tot 37 °C gedurende 30 minuten voor enzymactivering.
3. Proefdieren en preoperatieve opstelling
- Huismuizen, 5 nestgenoten per kooi, in omgevingsgecontroleerde omstandigheden, met 12 uur licht/donker cycli en goede toegang tot voedsel en water.
- Gebruik bij voorkeur vrouwelijke Zwitserse Webster-muizen, tussen de 8 en 10 weken oud.
- Weeg muizen om de juiste hoeveelheid anesthesie te bepalen om toe te dienen.
- Anesthesie toedienen door de intraperitoneale injectie van 100 mg/kg ketamine 10 mg/kg xylazine.
- Breng oogcrème (bijv. Refresh P.M.) voorzichtig aan op het oog met een wattenstaafje om de droogheid te verminderen.
- Bewaak fysiologische parameters, waaronder ademhalingsfrequentie, huidskleuring en lichaamstemperatuur tijdens de operatie.
4. Dorsale volledige dikte excisie chirurgie
- Beoordeel het chirurgische anesthesievlak door teenknijpen en monitoring van de ademhalingsfrequentie en inspanning. Scheer het dorsale oppervlak en breng een ontharingscrème aan gedurende 10 minuten (of volgens de instructies van het product), waarna voorzichtig wordt verwijderd, zodat de huid droog is.
- Voor pijnbestrijding, toegediend 0,05 ml lidocaïne subcutaan in het te verwijderen gebied, en injecteer 0,02 ml buprenorfine subcutaan in het nekvel. Wacht 10 minuten om ervoor te zorgen dat de pijnbestrijding is bereikt.
- Desinfecteer voor de excisie het dorsale oppervlak met een alcoholdoekje en teken een cirkel met een diameter van 1,5 cm naar het achterste deel van de rug. Zorg voor een steriel chirurgisch veld tijdens de hele procedure en gebruik autoclaafinstrumenten en steriele handschoenen. Om besmetting te beperken, voert u de operatie uit met een brandende Bunsen-brander en gebruikt u schoon gereedschap voor elk dier.
- Dien een volledige dikte, excisionale huidwond toe aan het niveau van panniculus spier met chirurgische schaar.
- Bedek na excisie onmiddellijk wonden met een semipermeabel polyurethaanverband.
- Injecteer ongeveer 104 KVE bacteriën in 100 μL PBS onder het verband, op het wondbed, om een infectie vast te stellen.
OPMERKING: Wonden kunnen ook worden geïnfecteerd met meerdere soorten bacteriën en/of schimmels tegelijkertijd, of door voorgevormde biofilms12, of zelfs debridement weefsel geëxtraheerd van patiënten19, op het wondbed te plaatsen. - Plaats na infectie muizen in de kooi met verwarmingskussens en controleer totdat ze hun juiste reflex hebben herwonnen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat muizen niet koud worden, omdat dit tot de dood kan leiden. - Stel wondinfecties vast gedurende 48 uur.
- Inspecteer dagelijks kleefverbanden op scheuren en gebieden zonder hechting en indien nodig vervangen.
5. In vivo dispersiebehandeling
OPMERKING: Hier beschrijven we de toediening van de dispergeermiddelen door een reeks van 3 topische wondirrigatieoplossingen aan te brengen (Figuur 1). Het protocol kan echter worden aangepast voor andere soorten levering, zoals het aanbrengen van gels, crèmes of verbanden.
- Plaats muizen onder isofluraan anesthesie (bij 3% en 1 L per minuut zuurstof) tijdens het toedienen van de behandelingen.
- Bereid drie spuiten van 1 ml voor, met naalden van 25 G, die 200 μL behandeling voor elke muis bevatten.
- Injecteer 200 μL enzymoplossing of PBS-controle op de wond door de huid voorzichtig op te tillen en te knijpen met een tang, iets boven de wond naar het hoofd van het dier. Prik de spuit voorzichtig door de opgetilde huid en injecteer langzaam de oplossing tussen het verband en het wondbed. Het verband dat in deze studie wordt gebruikt, hecht zich vaak aan zowel het wondbed als het omliggende weefsel.
- Om ervoor te zorgen dat het hele wondbed bedekt is met een oplossing, tilt u het verband voorzichtig op met een tang, trekt u het weg van het wondbed en injecteert u de oplossing langzaam.
- Plaats muizen na de behandeling 30 minuten terug in hun kooien.
- Na 30 minuten blootstelling aan de behandeling, verdoof de muizen opnieuw met isofluraan en aspireer de oplossing met een spuit, zorg ervoor dat u in hetzelfde gebied prikt als voorheen.
OPMERKING: Deze aangezogen oplossing bevat gedispergeerde bacteriële cellen, die kunnen worden opgeslagen voor verschillende downstream-analyses. - Dien de tweede en derde irrigatiebehandeling toe als de eerste, met elke keer een nieuwe spuit.
6. In vivo dispersie beeldvorming en analyse
OPMERKING: Als een lichtgevende bacteriestam wordt gebruikt om een infectie te initiëren, kan een In Vivo Imaging System (IVIS) worden gebruikt om de verspreiding vanuit het wondbed te visualiseren.
- Afbeelding muizen vlak voor en na de behandeling en bij 10 en 20 uur na de behandeling (figuur 2 en aanvullende figuur 1).
- Voer beeldvorming uit terwijl muizen onder narcose zijn door ze individueel in het IVIS te plaatsen en ze elk gedurende 5 s op een golflengte van 560 nm te plaatsen. Sla afbeeldingen op voor verdere analyse.
OPMERKING: De optimale golflengte en belichtingstijd zijn afhankelijk van de gebruikte verslaggever en het IVIS-instrument en de beeldvormingssoftware. - Open voor analyse afbeeldingen in de IVIS-software en selecteer het gebied dat moet worden geanalyseerd in het toolpalet.
- Om rekening te houden met de achtergrond, plaatst u een cirkel op de achtergrond van een foto en plaatst u vervolgens dezelfde cirkel van dezelfde grootte bovenop het wondbed voor elke muis.
- Als u meetwaarden wilt uploaden, selecteert u ROI-metingen (Region of Interest) weergeven > regio en uploadt u de tabel met metingen naar een spreadsheet. Trek de achtergrondcirkel af van elk van de wondbedmetingen om de luminescentie voor elk monster te berekenen. Bereken percentage luminescentie gewijzigd door:
ROI pre-treatment-ROI nabehandeling/ ROI pre-treatment) x 100.
OPMERKING: Controle- en behandelde muizen moeten tegelijkertijd worden geanalyseerd om te normaliseren op variabelen die van invloed kunnen zijn op het verkrijgen of de uitstraling van het beeld.
7. Dispersie beoordelen door CFU te bepalen
- Humane euthanaseren muizen door de intraperitoneale injectie van 0,2 ml pentobarbitaal natrium (bijv. Fatal Plus) onder anesthesie met 100 mg/kg ketamine 10 mg/kg xylazine.
- Oogst wondbedweefsel door eerst het verband voorzichtig te verwijderen met steriele tang en snijd vervolgens rond de omtrek van het wondbed met een steriele chirurgische schaar. Til voorzichtig het ene uiteinde van het wondbed op met een tang terwijl u een schaar gebruikt om het monster van de spierlaag af te snijden/ plagen.
- Plaats weefsel uit het wondbed in voorgelabelde en voorgewogen homogenisatiebuis van 2 ml met 1 ml PBS. Weeg de buizen opnieuw na het inbrengen van de monsters en keer vervolgens voorzichtig 3-5 keer om om eventuele verspreide of losjes aangehechte bacteriën af te spoelen en de PBS te verwijderen. Voeg 1 ml verse PBS toe.
- Om de milt te oogsten, plaatst u muizen in een liggende anatomische positie en zet u ze vast door hun ledematen vast te pinnen op een dissectieoppervlak. Week het te ontleden gebied met 70% ethanol om het gebied te desinfecteren en te voorkomen dat de vacht het monster verontreinigt.
- Maak voorzichtig een kleine incisie loodrecht op de middellijn met een chirurgische schaar in de dermis van de onderbuik, zorg ervoor dat u de huid op en af trekt van de interne organen. Ga verder met de incisie naar binnen, langs de middenlijn, totdat het borstbeen werd bereikt. Zodra de peritoneale holte werd blootgesteld en de inwendige organen zichtbaar waren, scheid je de milt voorzichtig van het bindweefsel en plaats je deze in een aparte homogenisatiebuis.
- Weeg de milt af en spoel af met PBS, zoals beschreven voor het wondbedweefsel.
OPMERKING: Andere organen van belang kunnen op dezelfde manier worden geoogst.- Let er bij het maken van de eerste incisie op dat u de darmen of andere organen niet doorprikt.
- Homogeniseer monsters in voorgevulde kraalmolenbuizen van 2 ml met behulp van een benchtop homogenisator op 5 m/s gedurende 60 s, tweemaal.
- Om CFU op te sommen, verdun monsters en spotplaat op selectieve agar. Voor seriële verdunning pipeteert u 100 μL van het monster in 900 μL PBS in een buis van 1,5 ml, vortex, en herhaalt u dit 5 keer. Pipet 10 μL van elke verdunning op een agarplaat zoals weergegeven in figuur 3.
OPMERKING: Als een nauwkeurigere CFU-kwantificering vereist is, verdeel dan 100 μL van elke verdunning van het monster over afzonderlijke agarplaten.
8. Ex vivo beoordeling van dispersie ( Figuur4)
- Wond muizen en infecteren met ongeveer 104 PAO1 zoals hierboven beschreven, en euthanaseren vervolgens 48 uur na infectie.
- Verwijder het verband voorzichtig met een tang, met behulp van steriele techniek en zonder het wondbed te verstoren.
- Gebruik een steriele chirurgische schaar om de omtrek van het wondbed weg te snijden van de niet-geïnfecteerde huid door een tang te gebruiken om het ene uiteinde van het wondbed op te tillen en een schaar om geïnfecteerd wondweefsel uit de spierlaag eronder en het omringende niet-geïnfecteerde weefsel te verwijderen. Verdeel gewikkelde bedmonsters in gelijke delen of gebruik ze in hun geheel.
- Plaats wondweefsel in lege, voorgewogen 2 ml kraalmolen homogeniserende buizen. Weeg vervolgens de buizen opnieuw na het toevoegen van het monster. Bereken het gewicht van het monster door:
gewicht na het toevoegen van monster - gewicht voordat u het monster toevoegt. - Voeg 1 ml PBS toe en draai de buis 3-5 keer voorzichtig om om het monster te spoelen en eventuele planktonische cellen te verwijderen. Verwijder en gooi de PBS weg.
- Voeg 1 ml GH-behandeling (of PBS als negatieve controle) toe aan het monster en incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C met schudden bij 80 tpm.
- Verwijder de biofilmdispersieoplossing en plaats deze in een aparte buis van 1,5 ml. Dit bevat de verspreide cellen.
- Voeg 1 ml PBS toe aan het resterende weefselmonster en keer voorzichtig 3-5 keer om om eventuele resterende gedispergeerde cellen af te spoelen. Verwijder en gooi de PBS weg.
- Voeg 1 ml PBS toe aan het resterende weefsel en homogeniseer bij 5 m/s gedurende 60 s met behulp van een benchtop homogenisator.
- Verdun de oplossing van gedispergeerde cellen en het gehomogeniseerde weefselmonster serieel door 100 μL monster in 900 μL PBS in een buis van 1,5 ml te plaatsen en vijf keer te herhalen voor in totaal 6 verdunningen.
- Spotplaat 10 μL van elke verdunning op mediaselectieve agar (bijv. Pseudomonas Isolation Agar voor P. aeruginosa) en incubeer de platen 's nachts bij 37 °C.
- Tel de KVE en bereken het 'percentage gedispergeerd' als (CFU in supernatant/ (CFU in supernatans+ CFU in biofilmweefsel)) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit experiment werden 8-10 weken oude vrouwelijke Zwitserse Webster muizen geïnfecteerd met 104 KVE van PAO1 met de luminescentie plasmide pQF50-lux. Zoals hierboven beschreven, mocht een infectie gedurende 48 uur worden vastgesteld voordat 3 x 30 minuten behandelingen van PBS (voertuigcontrole) of 10% GH (behandeling) werden toegediend om de biofilm EPS te verteren. Muizen werden voor de behandeling afgebeeld, direct na de behandeling (0 uur) en om 10 uur en 20 uur na de behandeling. Figuur 2A en aanvullende figuur 1 tonen een vastgestelde infectie in het wondbed die een helder bioluminescent signaal genereert. De verspreiding van bacteriën uit het wondbed kan direct na de GH-behandeling (0 uur) worden gevisualiseerd, maar niet na pbs-behandeling. Opgemerkt moet worden dat we in eerdere studies bacteriën in het bloed en de milt al na 5 uur na GH-behandeling7ontdekten. Bacteriële verspreiding in de organen kan ook worden gezien door de muis op zijn kant te plaatsen voor beeldvorming, zoals weergegeven in het onderste paneel van figuur 2A.
Beelden van zowel de PBS- als gh-behandelde muizen vertoonden een toename van het luminescente signaal na 20 uur na de behandeling in vergelijking met de voorbehandeling (figuur 2B). We veronderstellen dat dit te wijten is aan de mechanische verstoring van de biofilm veroorzaakt door de irrigatie van de oplossing. Om 20 uur na de behandeling werden de muizen geëuthanaseerd en werden de wondbedden en milt verzameld om CFU/gram weefsel op te sommen. Hoewel de bacteriële belastingen in de wondbedden vergelijkbaar waren(figuur 2C),werden bacteriën alleen gedetecteerd in de milt van met GH behandelde muizen(figuur 2D),wat wijst op verspreide verspreiding van de verspreide bacteriën.
Eerder hebben we aangetoond dat GH-behandeling aggregaten van bacteriën kan afbreken, waardoor het aantal CFU's21verbetert. Dit kan de lichte toename van bacteriële belasting in de wondbedden van de met GH behandelde muizen verklaren. Ten slotte, hoewel de met GH behandelde wondbedden iets hogere KVE/gram hadden, was er een lagere procent bioluminescente verandering. Deze resultaten suggereren het belang van het bevestigen van luminescentie met CFU-tellingen. Deze representatieve resultaten geven een voorbeeld van gegevens die kunnen worden verzameld met behulp van de hierboven beschreven protocollen.
Figuur 1. Vaststellen van biofilm-geassocieerde wondinfecties en beoordelen van de werkzaamheid van dispergeermiddelen in vivo. Verbanden werden gecontroleerd op scheuren of verlies van hechting op de huid van de muis voorafgaand aan de behandeling. Gecompromitteerde verbanden werden vervangen. Muizen werden onmiddellijk voorafgaand aan de toediening van de behandeling onder narcose gebracht. 200 μL enzymoplossing, of een voertuigcontrole, werd geïnjecteerd in de ruimte tussen het wondbed en het verband. Het verband werd voorzichtig verhoogd met een tang om ervoor te zorgen dat de hele wond verzadigd was in oplossing. De behandeling werd 30 minuten op het wondbed achtergelaten. Na 30 minuten werd de behandeling met een spuit aangezogen en werd nog eens 200 μL behandeling toegevoegd. Dit werd herhaald voor een totaal van 3 behandelingen. Om de dispersie in realtime te meten, werden muizen voorafgaand aan de behandeling, onmiddellijk na de behandeling (0 uur), 10 uur en 20 uur na de behandeling afgebeeld met IVIS. Om 20 uur na de behandeling werden de muizen geëuthanaseerd en werden de wondbedden en milt verzameld. De monsters werden gespoeld in PBS en vervolgens twee keer gehomogeniseerd in verse PBS bij 5 m/s gedurende 60 s. De monsters werden vervolgens serieel verdund en gevlekt. CFU werden opgesomd en CFU/gram werden berekend. Het niveau van verspreiding van bacteriën uit de wond kan worden beoordeeld door IVIS of door het aantal KVE's te bepalen dat zich systemisch naar de milt verspreidt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Representatieve gegevens tonen aan hoe dispersie in vivo kan worden beoordeeld. Wonden geïnfecteerd met 104 PAO1 (pQF50-lux) gedurende 48 uur werden behandeld met PBS of 10% GH (biofilm dispersie enzymoplossing). PBS-behandeling werd gebruikt als voertuigbesturing. De wondbedden werden behandeld met 3 x 30 min behandelingen. Muizen werden afgebeeld met behulp van IVIS voorafgaand aan de behandeling, onmiddellijk na de behandeling, 10 uur na de behandeling en 20 uur na de behandeling. Opgemerkt moet worden dat de zijaanzichtafbeeldingen afkomstig zijn van verschillende PBS- en GH-behandelde muizen dan die welke worden weergegeven in de bovenaanzichtafbeeldingen (A). De ROIs voor elk voorbehandelingswondbed en elk 20 uur nabehandelingswondbed werden geregistreerd. Procentuele verandering ten opzichte van de voorbehandeling werd berekend als (ROI pre-treatment-ROI post-treatment/ ROI pre-treatment) x 100 (B). Om 20 uur na de behandeling werden muizen geëuthanaseerd. De wondbedden en milt werden verzameld en gewogen om CFU/gram (respectievelijk C en D)te bepalen. N=3. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Seriële verdunning en spotplating. Het gehomogeniseerde monster werd gewerveld en 100 μL werd overgebracht naar een Eppendorf-buis van 1,5 ml met 900 μL PBS. Het monster werd gewerveld en 100 μL werd overgebracht naar een andere Eppendorf-buis van 1,5 ml met 900 μL PBS. Dit proces werd 5 keer herhaald. Vanaf de laatste verdunningsbuis werd 10 μL monster op de agarplaat gevlekt in punt 10-8. Dit werd voortgezet tot verdunning 10-3. Meestal resulteert de verdunning van 10-3 in een gazon met bacteriën op de plek. Sommige organen, die een lage bacteriële belasting hebben, vereisen mogelijk spotplating tot de verdunning van 10-1. Herhaal dit voor elk weefselmonster. Plaats de agarplaat in een incubator bij 37 °C gedurende 24-48 uur, of groei onder omstandigheden die optimaal zijn voor de bacteriële soorten die van belang zijn. Om CFU op te sommen, telt u individuele kolonies bij de laagst mogelijke verdunning en vermenigvuldigt u zich met de juiste verdunningsfactor om CFU/ml te bepalen of gebruikt u weefselgewicht om CFU/g weefsel te berekenen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Het meten van dispersie van geïnfecteerd weefsel ex vivo. Muizen werden geëuthanaseerd en het geïnfecteerde wondweefsel werd aseptisch verwijderd. Het geïnfecteerde weefsel werd in een homogeniserende buis van 2 ml kraalmolen geplaatst en kort gespoeld met PBS. Er werd 1 ml dispergerend middel toegevoegd en het monster werd gedurende 2 uur bij 37 °C geïncubeerd met schudden bij 80 tpm. Na incubatie werd de oplossing met de gedispergeerde cellen verwijderd en in een aparte buis van 1,5 ml geplaatst. Het resterende weefsel werd gespoeld met 1 ml PBS. 1 ml verse PBS werd aan het weefsel toegevoegd en gehomogeniseerd bij 5 m/s gedurende 60 s. De enzymoplossing en het gehomogeniseerde weefsel werden vervolgens serieel verdund en op selectieve agar gevlekt. De CFU werd geïnsenseerd en de dispersie werd berekend als: CFU uit enzymoplossing/ (CFU uit enzymoplossing + KVE uit weefsel) x 100. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullend figuur 1. Meten van in vivo dispersie. Wonden werden gedurende48 uur geïnfecteerd met 10 4 PAO1 (pQF50-lux) en vervolgens behandeld met PBS of 10% GH (biofilm dispersie-enzymoplossing). PBS-behandeling werd gebruikt als voertuigbesturing. De wondbedden werden behandeld met 3 x 30 min irrigatiebehandelingen. Muizen werden afgebeeld met IVIS voorafgaand aan de behandeling, onmiddellijk na de behandeling, 10 uur na de behandeling en 20 uur na de behandeling (A). Om 20 uur na de behandeling werden muizen geëuthanaseerd. De wondbedden en milt werden verzameld en gewogen om CFU/gram (respectievelijk B en C)te bepalen. N=3. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we protocollen die kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van biofilmdispersiemiddelen te bestuderen. Deze protocollen kunnen eenvoudig worden aangepast aan gebruik met verschillende soorten dispergeermiddelen, bacteriesoorten of ex vivo monsters, waaronder klinische debridement monsters. Dit protocol biedt ook een klinisch relevant model om gedispergeerde bacteriële cellen te verzamelen en te bestuderen. Het is aangetoond dat de fenotypen van gedispergeerde bacteriële cellen verschillen van die van planktonische of biofilmcellen 5,24,25,26; de fenotypes van bacteriën die in vivo worden verspreid, moeten echter nog worden beschreven. Als dispergeermiddelen therapeutisch moeten worden gebruikt, is het belangrijk om hun werkzaamheid te bepalen en het fenotype te begrijpen dat deze cellen aannemen. Bovendien kan dit protocol worden gebruikt om te bestuderen hoe variaties in eps-structuur of wijziging van signaleringsroutes de verspreiding beïnvloeden. De verspreiding van P. aeruginosa stammen met mutaties in verschillende exopolysaccharide componenten (bijv. Pel, Psl, Alginaat) kan bijvoorbeeld vergeleken worden met die van wilde stammen.
Over het geheel genomen kan dit protocol worden onderverdeeld in vier hoofdsecties: (1) het vaststellen van een infectie (2) het toedienen van behandeling of (3) het verzamelen van geïnfecteerd weefsel voor ex vivo-behandeling en (4) het bepalen van de dispersie-werkzaamheid. Het kritieke deel van sectie 1 is de succesvolle vaststelling van de infectie in het wondbed. Als luminescente stammen, die antibiotica nodig hebben om plasmidestabiliteit te behouden, worden gebruikt, is het noodzakelijk om de juiste antibiotica toe te voegen bij het cultiveren van de stammen ter voorbereiding op infectie. Er moet ook rekening mee worden gehouden dat de plasmiden mogelijk niet worden gehandhaafd tijdens infectie bij het dier (zonder antibioticadruk), dus de beoordeling van de bacteriële belasting moet niet volledig gebaseerd zijn op IVIS-beeldvorming, maar worden bevestigd door CFU. De entende dosis is ook een cruciale stap om de infectie te initiëren. Voor P. aeruginosa en S. aureus wordt meestal een infectiedosis van 104-5 KVE gebruikt, maar de optimale dosis kan verschillen afhankelijk van de gebruikte bacterie- en muissoorten.
Het kritieke deel van sectie 2 is ervoor te zorgen dat het wondbed tijdens de ontwikkeling van infectie en behandeling door het verband wordt bedekt. Als het verband niet goed wordt vastgekleefd, kan de behandeling uit het wondbed lekken en kan het niet effectief zijn. Het verband is ook belangrijk om het wondbed te beschermen tegen mogelijke verontreinigingen en om de contractiele genezing door de muis te belemmeren, wat essentieel is voor het nabootsen van menselijke wondgenezing. Ten slotte is het kritieke deel van sectie 3 het correct behandelen van de verzamelde monsters. Om CFU op te sommen, moet het geïnfecteerde weefsel worden gespoeld met 1 ml PBS voordat nog eens 1 ml PBS wordt toevoeging voor homogenisatie. Meer vezelige organen, zoals de longen, kunnen een grondigere homogenisatie vereisen.
De primaire beperkingen van deze protocollen omvatten de vereiste nauwgezette monitoring van het verband en het gebruik van IVIS om verspreiding in beeld te houden en aannames te doen over dispersie-werkzaamheid. Voor langetermijnstudies kan de hergroei van bont problematisch zijn omdat het de aanhechting van het verband aan de wondplaats kan belemmeren. Verbanden moeten vaak worden vervangen en het verwijderen ervan kan leiden tot accidentele debridement van de wond en kans op besmetting. Om de verspreiding vanuit het wondbed te visualiseren, moet een bioluminescerende bacteriestam worden gebruikt. Als de bacteriële soort van belang een bioluminescente verslaggever mist, is deze optie niet haalbaar. Een andere beperking is het potentieel van de dispersiebehandeling om bacteriëmie te induceren, wat kan leiden tot de dood van de muis. We hebben echter gezien dat gedispergeerde cellen effectief kunnen worden gedood door antibiotica in vivo7.
De representatieve resultaten in figuur 2 illustreren een beperking van IVIS voor het meten van dispersie-werkzaamheid. Ten eerste moet een lichtgevende stam van de bacteriële soorten van belang worden gebruikt. De stam moet een lichtgevend signaal produceren dat helder genoeg is om door meerdere weefsellagen te detecteren om de verspreiding van het wondbed naar andere delen van het lichaam te visualiseren. Er is gesuggereerd dat minimaal ongeveer 106 bacteriën nodig zijn om een lichtgevend signaal te produceren dat sterk genoeg is om te detecteren door IVIS27. Een afname van het luminescente signaal is ook beschreven wanneer bacteriën stationaire fase28ingaan . Dit kan leiden tot een ontkoppeling tussen gemeten ROI's en CFU opgesomd29. Deze beperking kan leiden tot valse aannames wanneer er geen signaal is dat sterk genoeg is voor detectie, maar bacteriën nog steeds aanwezig zijn. Zoals weergegeven in figuur 2B,resulteerden de PBS- en 10% GH-behandelingen in verhoogde luminescentie na de behandeling. Dit is een merkwaardige en consistente observatie, die ook is gezien na het verspreiden van cellen in vitro (Cláudia Marques, Binghamton University, persoonlijke communicatie). Het is mogelijk dat de fysieke verstoring van de biofilm door het toedienen van de behandeling simpelweg cellen verspreidt die stevig waren verpakt, wat resulteert in een verhoogd lichtsignaal. Als alternatief kan dispersiebehandeling biofilmcellen 'ontwaken' die voorheen metabolisch inactief waren, wat resulteerde in verhoogde bioluminescentie. Hoe dan ook, het is cruciaal om de resultaten van IVIS-beeldvorming te bevestigen met CFU-gegevens. Ten slotte is er een heterogene verspreiding van bacteriën in geïnfecteerd wondweefsel30,31. Daarom, als het weefsel ex vivo is verdeeld om meer monsters te leveren, mag niet worden aangenomen dat de bacteriële belasting in elke wondsectie identiek is.
Er zijn wijzigingen en probleemoplossing die kunnen worden uitgevoerd om de beperkingen van deze modellen te overwinnen. Ten eerste moet de tijd die is toegewezen voor blootstelling aan de ontharingscrème mogelijk worden aangepast, afhankelijk van de gebruikte muissoort. 7 minuten wordt bijvoorbeeld meestal gebruikt voor Zwitserse Webster-muizen, terwijl C57BL/6-muizen tot 10 minuten blootstelling nodig hebben om de vacht met succes te verwijderen. Dit is natuurlijk ook afhankelijk van het gebruikte product en de blootstellingstijden mogen nooit hoger zijn dan de instructies van de fabrikant. Als een lang onderzoek (4+ dagen) wordt uitgevoerd, moet mogelijk ontharingscrème opnieuw worden aangebracht om opnieuw gekweekte vacht te verwijderen en een goede afdichting van het verband te garanderen. Als een lichtgevend signaal vervolgens moeilijk te detecteren is, kan de belichtingstijd worden verlengd tijdens IVIS-beeldvorming. De inentingsdosis en infectietijd kunnen ook worden aangepast. Het is belangrijk om een infecterende dosis te gebruiken die niet te hoog is dat het de muis overweldigt, maar ook niet te laag is dat de bacteriën onmiddellijk worden gewist door de immuunrespons.
In dit protocol beschrijven we de behandeling van 48 h-oude wondinfecties met dispergeermiddelen, omdat dit een tijdspunt is dat we infecties hebben aangetoond veroorzaakt door P. aeruginosa en/of S. aureus zijn vastgesteld en biofilm-geassocieerd 12,15,16. Afhankelijk van de bacteriesoort kunnen andere tijdspunten echter beter zijn. Idealiter zou de bacteriële belasting in de wond moeten plateau zodra een infectie is vastgesteld. We hebben bijvoorbeeld gezien dat bij zowel P. aeruginosa als S. aureus de bacteriële belasting in de wond na infectie ongeveer 108 KVE/g weefsel bereikt en op dat niveau blijft tot de wondsluiting. Figuur 1 illustreert de behandeling met een oplossing die 3 x 30 minuten wasbeurten vereist. Als het dispergeermiddel echter in een andere vorm was, zouden de wasbeurten niet nodig zijn. Een crème, gel of bewerkt verband kan bijvoorbeeld gewoon bovenop het wondbed worden geplaatst. Ten slotte kan de wond op verschillende manieren worden geïnfecteerd, waaronder de inenting van planktonische bacteriële cellen, voorgevormde biofilms12of zelfs geïnfecteerd debridementweefsel van een ander dier of mens19,32. We hebben gezien dat het transplanteren van een voorgevormd biofilm- of debridementmonster op het wondbed resulteert in succesvollere polymicrobiële infecties dan wanneer meerdere soorten worden ingeënt in hun planktonische vorm12.
Over het algemeen beschrijven deze protocollen methoden om biofilmdispersie en de evaluatie van therapeutische biofilmdispersiemiddelen te bestuderen. Deze modellen maken de ontwikkeling mogelijk van complexe polymicrobiële biofilm-geassocieerde infecties die klinisch relevante menselijke infecties nabootsen. We hopen dat deze protocollen zullen worden gebruikt en verfijnd om de ontwikkeling van antibiofilmdispersiemiddelen voor therapeutisch gebruik te bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R21 AI137462-01A1), de Ted Nash Long Life Foundation, de Jasper L. en Jack Denton Wilson Foundation en het Department of Defense (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 14823434 | Use to complete serial dilutions of samples |
| 25G 58 in needle | Fisher | 14823434 | Attaches to 1 mL syringe |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher | BP1760-5 | Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture |
| Amylase | MP Biomedicals | 2100447 | Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used |
| Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) | ZooPharm | RX216118 | Use as pain mainagement- may use other options |
| Cellulase | MP Biomedicals | 2150583 | Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used |
| Depilatory cream | Walmart | 287746 | Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair |
| Dressing Forceps, Serrated Tips | Fisher | 12-460-536 | Can use other forms of forceps |
| Erlenmeyer flasks baffled 125 mL | Fisher | 101406 | Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria |
| FastPrep-24 Benchtop Homogenizer | MP Biomedicals | 6VFV9 | Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue |
| Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse |
| Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) | Fisher | 15340151 | Used to homogenize samples for plating |
| Isoflurane | Diamond Back Drugs | ||
| Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN | Sigma Aldrich | K4138 | Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia |
| LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | Add 25 g/L and autoclave |
| Lidocaine 2% Injectable | Diamond Back Drugs | 2468 | Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting |
| Meropenem | Sigma Aldrich | PHR1772-500MG | Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment |
| Non-sterile cotton gauze sponges | Fisher | 13-761-52 | Use to remove the depilatory cream |
| PAO1 pQF50-lux bacterial strain | Ref [13] | N/A | PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results |
| Petri dishes | Fisher | PHR1772-500MG | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Fisher | BP3991 | Dilute 10x to 1x prior to use |
| Polyurethane dressing | Mckesson | 66024007 | Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections |
| Pseudomonas isolation agar | VWR | 90004-394 | Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes |
| Refresh P.M. | Walmart | Use on eyes to reduce dryness during procedure. | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher | 22-363-750 | Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area |
| Straight Delicate Scissors | Fisher | 89515 | Can also use curved scissors |
| Swiss Webster mice | Charles River | 551NCISWWEB | Other mice strains can be used |
| Syring Slip Tip 1 mL | Fisher | 14823434 | Used to administer drugs and enzyme treatment |
References
- Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
- Stewart, P. S.
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
- Rumbaugh, K. P., Sauer, K.
- Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
- Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).
- Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).
- Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
- Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
- Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).
- Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
- Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
- Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
- Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).
- Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129 (2015).
- Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, Sup10 33-43 (2016).
- Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).
- Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
- DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
- Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
- Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462 (2014).
- Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
- Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
- Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
- Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U.
- Stewart, P. S., Franklin, M. J.
- Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).
