Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تقييم تشتت بيو فيلم في جروح مورين

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62136
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,2,3
1Department of Surgery, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Immunology and Molecular Microbiology, Texas Tech University Health Sciences Center, 3TTUHSC Surgery Burn Center of Research Excellence, Texas Tech University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

هنا، ونحن نصف السابقين في الجسم الحي وفي أساليب الجسم الحي لتقييم التشتت البكتيري من عدوى الجرح في الفئران. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لاختبار فعالية العلاجات الموضعية المضادة للميكروبات والأغشية الحيوية، أو لتقييم قدرة تشتت السلالات البكتيرية المختلفة أو الأنواع.

Abstract

وتورط العدوى ذات الصلة بيو فيلم في مجموعة واسعة من الحالات المزمنة مثل قرحة القدم السكري غير الشفاء، والتهاب الجيوب الأنفية المزمن، والتهاب الأذن الوسطى المتكرر، وغيرها الكثير. الخلايا الميكروبية داخل هذه العدوى محمية بمادة بوليمرية خارج الخلية (EPS) ، والتي يمكن أن تمنع المضادات الحيوية وتستضيف الخلايا المناعية من إزالة العدوى. للتغلب على هذه العقبة، بدأ المحققون في تطوير عوامل التشتت كعلاجات محتملة. تستهدف هذه العوامل مكونات مختلفة داخل EPS بيو فيلم، وإضعاف الهيكل، والشروع في تشتت البكتيريا، والتي يمكن نظريا تحسين فعالية المضادات الحيوية وإزالة المناعة. لتحديد فعالية عوامل التشتت لالتهابات الجروح ، قمنا بتطوير بروتوكولات تقيس تشتت بيو فيلم في الجسم الحي السابق وفي الجسم الحي. نحن نستخدم نموذج استئصال الماوس الجراحية التي تم وصفها بشكل جيد لخلق التهابات الجروح المزمنة المرتبطة بيو فيلم. لرصد التشتت في الجسم الحي، نصيب الجروح بسلالات بكتيرية تعبر عن لوسيفيراز. بمجرد أن تنشأ العدوى الناضجة ، نروي الجروح بمحلول يحتوي على إنزيمات تتحلل مكونات EPS بيو فيلم. ثم نراقب موقع وشدة الإشارة الإنارة في الجرح وتصفية الأعضاء لتوفير معلومات حول مستوى التشتت الذي تم تحقيقه. لتحليل الجسم الحي السابق لتشتت بيو فيلم ، يتم غمر أنسجة الجرح المصابة في محلول الإنزيم المهين للبيو فيلم ، وبعد ذلك يتم تقييم الحمل البكتيري المتبقي في الأنسجة ، مقابل الحمل البكتيري في المحلول. كلا البروتوكولين لديها نقاط القوة والضعف ويمكن تحسينها للمساعدة في تحديد بدقة فعالية العلاجات التشتت.

Introduction

ارتفاع مقاومة المضادات الحيوية في جميع أنحاء العالم يؤدي إلى عدم وجود خيارات المضادات الحيوية لعلاج مجموعة متنوعة من الالتهابات البكتيرية1. بالإضافة إلى مقاومة المضادات الحيوية، يمكن للبكتيريا الحصول على تحمل المضادات الحيوية من خلال اعتماد نمط الحياة المرتبطة بيو فيلم2. بيو فيلم هو مجتمع من الكائنات الحية الدقيقة التي تحميها مصفوفة من السكريات، الحمض النووي خارج الخلية، الدهون، والبروتينات3،تسمى مجتمعة مادة البوليمر خارج الخلية (EPS). ومع استمرار أزمة مقاومة المضادات الحيوية، هناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات جديدة تطيل أمد استخدام المضادات الحيوية أو تعمل على فعاليتها. عوامل مكافحة بيو فيلم هي واحدة واعدة الحل4.

من بين مختلف استراتيجيات مكافحة بيو فيلم التي تم اقتراحها، واستخدام عوامل التشتت، والتي تستهدف مكونات مختلفة من EPS بيو فيلم، هي في طليعة التنمية العلاجية5. الهدرلاسات الجليكوزيدية (GH) هي واحدة من هذه الفئة من عوامل التشتت. هرمون النمو هي فئة كبيرة من الانزيمات التي تحفز انشقاق الروابط المختلفة داخل السكريات التي توفر السلامة الهيكلية لEPS. وقد أظهرت مجموعتنا، فضلا عن غيرها، أن هرمون النمو يمكن أن تتحلل بشكل فعال الأغشية الحيوية، والحث على التشتت وتحسين فعالية المضادات الحيوية لعدد من الأنواع البكتيرية المختلفة، سواء في المختبر وفي الجسم الحي6،7،8،9،10،11.

مع تزايد الاهتمام في التشتت بيو فيلم، من المهم تطوير أساليب فعالة لتقييم فعالية التشتت. هنا، نقدم بروتوكول مفصل لعلاج التهابات الجروح المرتبطة بيو فيلم مع عامل التشتت في الفئران، وتقييم فعالية التشتت، في الجسم الحي وفي الجسم الحي السابق. الهدف العام هو توفير أساليب فعالة يمكن استخدامها مع نماذج ما قبل السريرية لقياس تشتت بيو فيلم بفعالية وكفاءة.

تم استخدام نموذج عدوى استئصال مورين الجراحية في هذه الدراسات لإنشاء عدوى مرتبطة بيو فيلم. لقد استخدمنا هذا النموذج لأكثر من 15 عاما ونشرنا ملاحظاتنا على نطاق واسع7،9،12،13،14،15،16،17،18،19،20،21. بشكل عام ، هذا هو نموذج العدوى غير المميتة حيث تظل البكتيريا مترجمة إلى سرير الجرح وترتبط بيو فيلم (البكتيريا التي ينظر إليها في المجاميع محاطة EPS) ، وإعداد عدوى مزمنة تستمر لمدة تصل إلى 3 أسابيع. ومع ذلك ، إذا كانت الفئران منقوصة المناعة (مع مرض السكري من النوع 1 على سبيل المثال) ، فإنها يمكن أن تصبح أكثر عرضة لتطوير عدوى جهازية قاتلة في هذا النموذج.

في هذا التقرير، نقدم بروتوكولات لتقييم تشتت البكتيريا من الجرح، سواء في الجسم الحي أو الجسم الحي السابق. يمكن استخدام كلا البروتوكولين لفحص فعالية عامل التشتت ويكون له نقاط قوته ونقاط ضعفه الخاصة. على سبيل المثال، يمكن لتقييم التشتت في الجسم الحي أن يوفر معلومات مهمة في الوقت الحقيقي حول انتشار البكتيريا إلى أجزاء أخرى من الجسم بعد التشتت، وكيفية استجابة المضيف. من ناحية أخرى ، قد يكون تقييم التشتت في الجسم الحي أكثر جاذبية لفحص عوامل أو جرعات أو تركيبات متعددة ، حيث يمكن تقسيم الأنسجة إلى أقسام متعددة يمكن اختبارها بشكل منفصل ، وبالتالي تقليل عدد الفئران المطلوبة. عند تقييم عوامل متعددة، ونحن عادة قياس التشتت أولا في المختبر كما هو موضح سابقا 6،9،22. ثم نقوم باختبار الجسم الحي السابق الأكثر فعالية والاحتياطي في اختبار الجسم الحي لعدد محدود من العوامل الواعدة للغاية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت مراجعة هذا البروتوكول الحيواني والموافقة عليه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه التابعة لمركز العلوم الصحية بجامعة تكساس للتكنولوجيا (البروتوكول رقم 07044). وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للتوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام المختبرات التابع للمعاهد الوطنية للصحة.

1. إعداد البكتيريا لالتهابات الماوس

ملاحظة: هنا نحن نصف الفئران المصابة فقط مع Pseudomonas aeruginosa. ومع ذلك، يمكن استخدام أنواع بكتيرية أخرى للتسبب في العدوى. يتم تفصيل السلالات والمواد البكتيرية في جدول المواد.

  1. استخدام Pseudomonas aeruginosa البرية نوع سلالة PAO1 تحمل البلازميد التلألؤ pQF50-لوكس23 لهذه التجارب كما هو موضح سابقا7.
  2. تنمو P. aeruginosa سلالات في قوارير إرلينماير حائرة، مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة، في لوريا-بيرتاني (LB) مرق في 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 20 ساعة. إضافة تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل من أمبيسلين لثقافة بين عشية وضحاها من PAO1 (pQF50-لوكس) للحفاظ على البلازميد.
  3. الثقافة الفرعية P. aeruginosa بإضافة 100 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى قارورة Erlenmeyer تحتوي على 10 مل من مرق LB مع تركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين. ثم تنمو لمدة 2-2.5 ساعة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز، إلى OD600 نانومتر من 0.4، ومن ثم تمييع تسلسليا (1:10) ثلاث مرات لجرعة إصابة ما يقرب من 104 خلايا.

2. إعداد إنزيم التشتت بيو فيلم

ملاحظة: لهذه الدراسة نستخدم حل 10٪ من أجزاء متساوية الأميليز والسيلولاز (5٪ من كل)، والتي سوف يشار إليها باسم "GH"، لعلاج التشتت.

  1. استخدام محلول GH 10٪ (ث / v) من الأميليز (من العصيات subtilis)والسيلولاز الفطرية (من النيجر Aspergillus) المخفف في 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS). استخدام برنامج تلفزيوني كعلاج التحكم في السيارة.
  2. قم بتسخين جميع العلاجات إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتنشيط الإنزيم.

3. الحيوانات التجريبية والإعداد قبل الجراحة

  1. فئران المنزل، 5 زملاء القمامة في القفص الواحد، في ظروف تسيطر عليها البيئة، مع 12 ساعة دورات خفيفة / مظلمة والوصول السليم إلى الغذاء والماء.
  2. ويفضل استخدام الفئران ويبستر السويسرية الإناث، بين 8 و 10 أسابيع من العمر.
  3. وزن الفئران لتحديد الكمية المناسبة من التخدير لإدارة.
  4. إعطاء التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق من 100 ملغ / كجم الكيتامين 10 ملغ / كغ xylazine.
  5. ضعي كريم العين (مثل، تحديث P.M)بعناية على العين باستخدام مسحة قطنية للحد من الجفاف.
  6. رصد المعلمات الفسيولوجية بما في ذلك معدل الجهاز التنفسي، تلوين الجلد، ودرجة حرارة الجسم طوال الجراحة.

4. دورسال جراحة استئصال سمك كامل

  1. تقييم الطائرة الجراحية للتخدير عن طريق قرصة إصبع القدم ورصد معدل التنفس والجهد. حلق السطح الظهري وتطبيق كريم إزالة الشعر لمدة 10 دقيقة (أو وفقا لتعليمات المنتج)، وبعد ذلك إزالة بلطف، وضمان الجلد كان جافا.
  2. لإدارة الألم، وإدارة 0.05 مل من الليدوكائين تحت الجلد في المنطقة ليتم استئصالها، وحقن 0.02 مل من البوبرينورفين تحت الجلد في scruff من الرقبة. انتظر 10 دقائق لضمان الوصول إلى إدارة الألم.
  3. قبل استئصال، تطهير السطح الظهري باستخدام مسحة الكحول ورسم دائرة قطرها 1.5 سم نحو الجزء الخلفي من الظهر. الحفاظ على حقل جراحي معقم طوال العملية واستخدام الأدوات الاوتوسلافية والقفازات العقيمة. للحد من التلوث، قم بإجراء الجراحة بواسطة موقد بونسن مضاء واستخدم أدوات نظيفة لكل.
  4. إدارة كامل سمك، جرح الجلد استئصالي إلى مستوى العضلات panniculus مع مقص الجراحية.
  5. بعد استئصال، تغطية الجروح على الفور مع خلع الملابس البولي يوريثين شبه نفاذة.
  6. حقن ما يقرب من 104 CFU من البكتيريا في 100 μL PBS تحت خلع الملابس، على سرير الجرح، لإنشاء عدوى.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن تكون مصابة الجروح مع أنواع متعددة من البكتيريا و / أو الفطريات في وقت واحد، أو عن طريق وضع الأغشية الحيوية شكلت مسبقا12،أو حتى الأنسجة debridement المستخرجة من المرضى19،على سرير الجرح.
  7. بعد العدوى، ضع الفئران في قفص مع منصات التدفئة ورصد حتى استعادت منعكس الحق.
    ملاحظة: تأكد من أن الفئران لا تحصل الباردة لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى الموت.
  8. تحديد التهابات الجروح لمدة 48 ساعة.
  9. فحص الضمادات لاصقة يوميا للدموع ومناطق عدم الالتزام واستبدالها إذا لزم الأمر.

5. في علاج تشتت الجسم الحي

ملاحظة: هنا نحن وصف إدارة عوامل التشتت من خلال تطبيق سلسلة من 3 حلول الري الجرح الموضعي(الشكل 1). ومع ذلك، يمكن تكييف البروتوكول لأنواع أخرى من التسليم مثل تطبيق المواد الهلامية أو الكريمات أو الضمادات.

  1. ضع الفئران تحت تخدير الأيزوفلوران (بمعدل 3٪ و1 لتر في الدقيقة من الأكسجين) أثناء إدارة العلاجات.
  2. إعداد ثلاثة 1 مل المحاقن، مع الإبر 25 G، التي تحتوي على 200 ميكرولتر من العلاج لكل فأر.
  3. حقن 200 ميكرولتر من محلول الإنزيم أو التحكم في PBS على الجرح عن طريق رفع الجلد مع ملقط بعناية ، أعلى قليلا من الجرح نحو رأس الحيوان. ثقب المحاقن بعناية من خلال الجلد رفع وحقن ببطء الحل بين خلع الملابس وسرير الجرح. غالبا ما تلتزم الضمادات المستخدمة في هذه الدراسة بكل من سرير الجرح والأنسجة المحيطة به.
    1. لضمان تغطية سرير الجرح بأكمله بالمحلول ، ارفع الضمادة برفق مع ملقط ، وسحبها بعيدا عن سرير الجرح ، مع حقن المحلول ببطء.
  4. بعد العلاج، ضع الفئران مرة أخرى في أقفاصها لمدة 30 دقيقة.
  5. بعد 30 دقيقة من التعرض للعلاج ، قم بإعادة تخدير الفئران بالايسوففلوران وتوبيخ المحلول بحقنة ، مع التأكد من ثقب في نفس المنطقة كما كان من قبل.
    ملاحظة: يحتوي هذا الحل المهتلأ على خلايا بكتيرية مشتتة، والتي يمكن حفظها لمختلف التحليلات المصب.
  6. إدارة علاجات الري الثانية والثالثة كأول، وذلك باستخدام حقنة جديدة في كل مرة.

6. في التصوير والتحليل في تشتت الجسم الحي

ملاحظة: إذا تم استخدام سلالة من البكتيريا الإنارة لبدء العدوى، يمكن استخدام نظام التصوير في Vivo (IVIS) لتصور التشتت من سرير الجرح.

  1. الفئران صورة مباشرة قبل وبعد العلاج وعلى 10 و 20 ساعة بعد العلاج (الشكل 2 والشكل التكميلي 1).
  2. إجراء التصوير بينما الفئران تحت التخدير عن طريق وضعها بشكل فردي في IVIS والتصوير كل واحد لمدة 5 ق في الطول الموجي من 560 نانومتر. احفظ الصور لمزيد من التحليل.
    ملاحظة: يعتمد الطول الموجي الأمثل ووقت التعرض على المراسل المستخدم وأداة IVIS وبرامج التصوير.
  3. للتحليل، افتح الصور في برنامج IVIS وحدد المنطقة التي سيتم تحليلها في لوحة الأدوات.
  4. لحساب الخلفية، ضع دائرة على خلفية صورة ثم ضع نفس الدائرة الحجم فوق سرير الجرح لكل فأر.
  5. لتحميل قيم القياس، حدد عرض قياسات منطقة الاهتمام (ROI) > وتحميل جدول القياسات إلى جدول بيانات. طرح قراءة دائرة الخلفية من كل من قياسات سرير الجرح لحساب التلألؤ لكل عينة. حساب النسبة المئوية للتألق التي تم تغييرها بواسطة:
    عائد الاستثمار قبل العلاج-ROI بعد العلاج/ العائد على الاستثمار قبل العلاج) × 100.
    ملاحظة: يجب تحليل الماوس التحكم ومعالجتها في وقت واحد لتطبيع للمتغيرات التي قد تؤثر على الحصول على الصورة أو التألق.

7. تقييم التشتت من خلال تحديد CFU

  1. القتل الرحيم إنسانيا الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 0.2 مل من الصوديوم pentobarbital (على سبيل المثال، زائد فادح) تحت التخدير مع 100 ملغم / كجم كيتامين 10 ملغ / كغ xylazine.
  2. حصاد أنسجة سرير الجرح عن طريق إزالة أولا بلطف خلع الملابس مع ملقط معقم، ومن ثم قطع حول محيط سرير الجرح مع مقص الجراحية العقيمة. رفع بلطف نهاية واحدة من سرير الجرح مع ملقط أثناء استخدام مقص لقطع / ندف العينة بعيدا عن طبقة العضلات.
  3. ضع الأنسجة من سرير الجرح في أنبوب تجانس 2 مل قبل التسمية والوزن المسبق الذي يحتوي على 1 مل من PBS. وزن الأنابيب مرة أخرى بعد إدراج العينات، ومن ثم عكس بلطف 3-5 مرات لشطف قبالة أي البكتيريا المنتشرة أو فضفاضة الالتزام بها، وإزالة برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني جديد.
  4. من أجل حصاد الطحال ، ضع الفئران في وضع تشريحي قوي وآمن عن طريق تثبيت أطرافها على سطح تشريح. نقع المنطقة ليتم تشريحها مع الإيثانول 70٪ من أجل تطهير المنطقة والحفاظ على الفراء من تلويث العينة.
  5. قم بإجراء شق صغير عمودي على خط الوسط مع مقص جراحي في الأدمة في أسفل البطن ، مع التأكد من سحب الجلد صعودا وبعيدا عن الأعضاء الداخلية. استمر في الشق داخليا ، على طول الخط الأوسط ، حتى تم الوصول إلى القص. بمجرد تعرض التجويف البريتوني وكانت الأعضاء الداخلية مرئية ، افصل الطحال برفق عن النسيج الضام ووضعها في أنبوب تجانس منفصل.
  6. وزن الطحال وشطف مع برنامج تلفزيوني، كما هو موضح لأنسجة سرير الجرح.
    ملاحظة: يمكن حصاد أجهزة أخرى ذات أهمية مماثلة.
    1. عند إجراء الشق الأولي، يجب الحرص على تجنب ثقب الأمعاء أو الأعضاء الأخرى.
  7. تجانس العينات في 2 مل قبل مملوءة أنابيب مطحنة حبة باستخدام متجانس benchtop في 5 م / ث لمدة 60 ثانية، مرتين.
  8. لتعداد CFU، مخففة بشكل متسلسل عينات وبقعة لوحة على أجار انتقائية. لتخفيف المسلسل، ماصة 100 ميكرولتر من العينة إلى 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في أنبوب 1.5 مل، دوامة، وتكرار 5 مرات. ماصة 10 ميكرولتر من كل تخفيف على لوحة أجار كما هو مبين في الشكل 3.
    ملاحظة: إذا كان مطلوب كمية CFU أكثر دقة، انتشار 100 ميكرولتر من كل تخفيف العينة عبر لوحات أجار منفصلة.

8. تقييم الجسم الحي للتشتت ( الشكل4)

  1. الفئران الجرح وتصيب ما يقرب من 104 PAO1 كما هو موضح أعلاه، ومن ثم القتل الرحيم 48 ساعة بعد العدوى.
  2. إزالة بعناية خلع الملابس مع ملقط، وذلك باستخدام تقنية معقمة ودون إزعاج سرير الجرح.
  3. استخدم مقصا جراحيا معقما لقطع محيط سرير الجرح بعيدا عن الجلد غير المصاب باستخدام ملقط لرفع طرف واحد من سرير الجرح ومقص لاستئصال أنسجة الجرح المصابة من طبقة العضلات تحت الأنسجة غير المصابة المحيطة بها. تقسيم عينات سرير الجرح إلى أجزاء متساوية أو استخدام كامل.
  4. ضع أنسجة الجرح في فارغة، قبل وزنها 2 مل حبة مطحنة أنابيب التجانس. ثم وزن الأنابيب مرة أخرى بعد إضافة العينة. حساب وزن العينة عن طريق:
    الوزن بعد إضافة عينة - الوزن قبل إضافة عينة.
  5. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني، وانعكس بلطف أنبوب 3-5 مرات لشطف العينة وإزالة أي خلايا العوالق. إزالة وتجاهل برنامج تلفزيوني.
  6. أضف 1 مل من علاج هرمون النمو (أو PBS كتحكم سلبي) إلى العينة واحتضن لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 80 دورة في الدقيقة.
  7. إزالة محلول التشتت بيو فيلم ومكان في أنبوب منفصل 1.5 مل. هذا يحتوي على خلايا متفرقة.
  8. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني إلى عينة الأنسجة المتبقية وعكس بلطف 3-5 مرات لشطف قبالة أي خلايا مشتتة المتبقية. إزالة وتجاهل برنامج تلفزيوني.
  9. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني إلى الأنسجة المتبقية وتجانس في 5 م / ث لمدة 60 ثانية باستخدام متجانس benchtop.
  10. تمييع محلول الخلايا المشتتة وعينة الأنسجة المتجانسة بشكل متسلسل عن طريق وضع 100 ميكرولتر من العينة في 900 ميكرولتر من PBS في أنبوب 1.5 مل ، وتكرار خمس مرات لما مجموعه 6 تمييعات.
  11. بقعة لوحة 10 ميكرولتر من كل تخفيف على وسائل الإعلام أجار انتقائية (على سبيل المثال، Pseudomonas العزلة أغار لP. aeruginosa)واحتضان لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  12. عد CFU وحساب 'في المئة مشتتة' كما (CFU في supernatant / (CFU في supernatant + CFU في الأنسجة بيو فيلم)) × 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذه التجربة، أصيبت 8-10 أسابيع من الفئران السويسرية ويبستر القديمة مع 104 CFU من PAO1 تحمل البلازميد التلألؤ pQF50-لوكس. كما هو موضح أعلاه، سمح للعدوى لتحديد لمدة 48 ساعة قبل إعطاء العلاجات 3 × 30 دقيقة من برنامج تلفزيوني إما (مراقبة السيارة) أو 10٪ GH (العلاج) لهضم EPS بيو فيلم. تم تصوير الفئران قبل العلاج، مباشرة بعد العلاج (0 ساعة) وعلى 10 ساعة و 20 ساعة بعد العلاج. الشكل 2A والشكل التكميلي 1 تظهر عدوى راسخة داخل سرير الجرح توليد إشارة مضيئة الإضاءة الحيوية. يمكن تصور تشتت البكتيريا من سرير الجرح مباشرة بعد علاج هرمون النمو (0 ساعة) ، ولكن ليس بعد علاج PBS. وتجدر الإشارة إلى أنه في الدراسات السابقة، اكتشفنا البكتيريا في الدم والطحال في وقت مبكر من 5 ساعة بعد العلاج GH7. ويمكن أيضا أن ينظر إلى نشر البكتيريا في الأجهزة عن طريق وضع الماوس على جانبها للتصوير، كما هو مبين في اللوحة السفلى من الشكل 2A.

وأظهرت الصور من كل من برنامج تلفزيوني والفئران المعالجة GH زيادة في إشارة الإنارة في 20 ساعة بعد العلاج مقارنة مع ما قبل العلاج(الشكل 2B). ونحن نفترض أن هذا يرجع إلى التعطيل الميكانيكي للبيو فيلم الناجمة عن الري من الحل. في 20 ساعة بعد العلاج، تم القتل الرحيم الفئران، وتم جمع أسرة الجرح والطحال لتعداد CFU / غرام من الأنسجة. في حين أن الأحمال البكتيرية في أسرة الجرح كانت متشابهة(الشكل 2C)،تم الكشف عن البكتيريا فقط في طحال الفئران المعالجة GH(الشكل 2D)،مما يشير إلى انتشار البكتيريا المنتشرة.

سابقا, لقد أظهرنا أن العلاج GH يمكن تفريق المجاميع من البكتيريا, تحسين CFU التهم21. وهذا قد يفسر الزيادة الطفيفة في الحمل البكتيري في أسرة الجرح من الفئران المعالجة GH. وأخيرا، على الرغم من أن أسرة الجروح المعالجة GH كان لديها CFU/gram أعلى قليلا، كان هناك تغيير في الإنارة الحيوية بنسبة أقل في المائة. وتشير هذه النتائج إلى أهمية تأكيد التلألؤ مع التهم CFU. وتعطي هذه النتائج التمثيلية مثالا للبيانات التي يمكن جمعها باستخدام البروتوكولات المذكورة أعلاه.

Figure 1
الشكل 1. إنشاء التهابات الجروح المرتبطة بيو فيلم وتقييم فعالية عامل التشتت في الجسم الحي. تم فحص الضمادات بحثا عن الدموع أو فقدان التصاق بجلد الفأر قبل العلاج. تم استبدال الضمادات للخطر. تم وضع الفئران تحت التخدير مباشرة قبل إدارة العلاج. تم حقن 200 ميكرولتر من محلول الإنزيم ، أو التحكم في السيارة ، في المسافة بين سرير الجرح وخلع الملابس. تم رفع الضمادة بلطف باستخدام ملقط لضمان تشبع الجرح بأكمله في الحل. ترك العلاج على سرير الجرح لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، تم تسبيب العلاج بحقنة ، وأضيف 200 ميكرولتر آخر من العلاج. وقد تكرر ذلك لما مجموعه 3 علاجات. لقياس التشتت في الوقت الحقيقي ، تم تصوير الفئران باستخدام IVIS قبل العلاج ، مباشرة بعد العلاج (0 ساعة) ، 10 ساعة ، و 20 ساعة بعد العلاج. في 20 ساعة بعد العلاج، تم قتل الفئران، وتم جمع أسرة الجرح والطحال. تم شطف العينات في برنامج تلفزيوني ومن ثم تجانسها في برنامج تلفزيوني جديد مرتين في 5 م / ثانية لمدة 60 ثانية. ثم تم تخفيف العينات بشكل متسلسل ولوحتها. تم تعداد CFU وحساب CFU / غرام. يمكن لمستوى تشتت البكتيريا من الجرح إما عن طريق تقييمها من قبل IVIS أو عن طريق تحديد عدد CFU التي تنتشر بشكل منهجي إلى الطحال. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2. توضح البيانات التمثيلية كيفية تقييم التشتت في الجسم الحي. الجروح المصابة 104 PAO1 (pQF50-لوكس) ل 48 ح عولجت مع برنامج تلفزيوني، أو 10٪ GH (biofilm حل إنزيم التشتت). تم استخدام العلاج PBS كتحكم في السيارة. وعولجت أسرة الجرح بعلاجات 3 × 30 دقيقة. تم تصوير الفئران باستخدام IVIS قبل العلاج ، مباشرة بعد العلاج ، 10 ساعة بعد العلاج ، و 20 ساعة بعد العلاج. وتجدر الإشارة إلى أن الصور الجانبية هي من مختلف PBS والفئران المعالجة GH من تلك المعروضة في الصور النفقات العامة (A). وسجلت مؤشرات ROIs لكل سرير جرح قبل العلاج وكل سرير جرح بعد العلاج 20 ساعة. تم حساب النسبة المئوية للتغيير من مرحلة ما قبل العلاج على النحو (ROI قبل العلاج - ROI بعد العلاج / العائد على الاستثمار قبل العلاج) × 100 (B). في 20 ساعة بعد العلاج، تم قتل الفئران. تم جمع أسرة الجرح والطحال ووزنها لتحديد CFU / غرام (C و D، على التوالي). N = 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3. تخفيف المسلسل والطلاء بقعة. وكانت العينة المتجانسة دوامة ونقل 100 ميكرولتر إلى أنبوب إيبيندورف 1.5 مل تحتوي على 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. كانت العينة دوامة ونقل 100 ميكرولتر إلى أنبوب إيبيندورف آخر سعة 1.5 مل مع 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. تكررت هذه العملية 5 مرات. بدءا من أنبوب التخفيف الأخير ، تم تحديد 10 ميكرولتر من العينة على لوحة أجار في بقعة10-8. واستمر هذا حتى التخفيف10-3. عادة ، يؤدي التخفيف10-3 إلى حديقة من البكتيريا داخل البقعة. قد تتطلب بعض الأعضاء ، التي تحتوي على أحمال بكتيرية منخفضة ، طلاء بقعة تصل إلى تخفيف10-1. كرر لكل عينة من الأنسجة. ضع طبق أغار في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة، أو ازرع في ظل ظروف مثالية للأنواع البكتيرية ذات الاهتمام. تعداد CFU، عد المستعمرات الفردية في أدنى تخفيف ممكن، وتتكاثر من قبل عامل التخفيف المناسب لتحديد CFU / مل أو استخدام وزن الأنسجة لحساب CFU / ز من الأنسجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4. قياس التشتت من الأنسجة المصابة ex vivo. الفئران قتلت بالرصاص وأنسجة الجرح المصابة أزيلت بشكل مطهر. تم وضع الأنسجة المصابة في أنبوب تجانس مطحنة حبة 2 مل وشطفها لفترة وجيزة مع PBS. تمت إضافة 1 مل من عامل التشتت وتم احتضان العينة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 80 دورة في الدقيقة. بعد الحضانة، تمت إزالة المحلول الذي يحتوي على الخلايا المشتتة ووضعه في أنبوب منفصل سعة 1.5 مل. تم شطف الأنسجة المتبقية مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. تمت إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني جديد إلى الأنسجة ومتجانسة في 5 م / ث لمدة 60 ثانية. ثم تم تخفيف محلول الإنزيم والأنسجة المتجانسة بشكل متسلسل وتصفيحه على أجار انتقائي. تم تعداد CFU وتم حساب التشتت على النحو التالي: CFU من محلول الإنزيم / (CFU من محلول الإنزيم + CFU من الأنسجة) × 100. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1- الزيادة في النسبة إلى 100 في المائة من ال القياس في تشتت الجسم الحي. أصيبت الجروح مع 104 PAO1 (pQF50-لوكس) لمدة 48 ساعة ثم تعامل مع برنامج تلفزيوني، أو 10٪ GH (biofilm حل إنزيم التشتت). تم استخدام العلاج PBS كتحكم في السيارة. وعولجت أسرة الجرح بعلاجات ري 3 × 30 دقيقة. تم تصوير الفئران باستخدام IVIS قبل العلاج ، مباشرة بعد العلاج ، 10 ساعة بعد العلاج ، و 20 ساعة بعد العلاج (A). في 20 ساعة بعد العلاج، تم قتل الفئران. تم جمع أسرة الجرح والطحال ووزنها لتحديد CFU / غرام (B و C، على التوالي). N = 3. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا نحن وصف البروتوكولات التي يمكن استخدامها لدراسة فعالية عوامل التشتت بيو فيلم. ويمكن تكييف هذه البروتوكولات بسهولة لاستخدامها مع أنواع مختلفة من عوامل التشتت أو الأنواع البكتيرية أو عينات الجسم الحي السابق، بما في ذلك عينات الحطام السريري. يوفر هذا البروتوكول أيضا نموذجا مناسبا سريريا لجمع ودراسة الخلايا البكتيرية المشتتة. وقد تبين أن الأنماط الظاهرية للخلايا البكتيرية المشتتة متميزة عن تلك الموجودة في الخلايا العوالق أو الأغشية الحيوية 5و24و25و26؛ ومع ذلك ، فإن الأنماط الظاهرية للبكتيريا المنتشرة في الجسم الحي لم يتم وصفهابعد. إذا كانت عوامل التشتت لاستخدامها علاجيا، وتحديد فعاليتها، فضلا عن فهم النمط الظاهري أن هذه الخلايا تعتمد، من المهم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة كيفية تأثير الاختلافات في بنية EPS أو تغيير مسارات الإشارات على التشتت. على سبيل المثال، يمكن مقارنة تشتت سلالات P. aeruginosa مع الطفرات في مكونات exopolysaccharide المختلفة (على سبيل المثال، بيل، Psl، Alginate) إلى أن من سلالات البرية.

عموما، يمكن تقسيم هذا البروتوكول إلى أربعة أقسام رئيسية: (1) إنشاء عدوى (2) إعطاء العلاج أو (3) جمع الأنسجة المصابة لعلاج الجسم الحي السابق و (4) تحديد فعالية التشتت. الجزء الحاسم من القسم 1 هو النجاح في إنشاء العدوى في سرير الجرح. إذا كانت السلالات الإنارة ، التي تتطلب مضادات حيوية للحفاظ على استقرار البلازميد ، يتم استخدامها ، فمن الضروري إضافة المضادات الحيوية المناسبة عند زراعة السلالات استعدادا للعدوى. وينبغي أيضا أن يعتبر أن البلازميدات قد لا تكون الحفاظ عليها أثناء العدوى في الحيوان (دون ضغط المضادات الحيوية)، وبالتالي تقييم الحمل البكتيري لا ينبغي أن تعتمد اعتمادا كليا على التصوير IVIS، ولكن يتم تأكيدها من قبل CFU. جرعة تلقيح هو أيضا خطوة حاسمة لبدء العدوى. بالنسبة ل P. aeruginosa و S. aureus ، يتم استخدام جرعة إصابة من 104-5 CFU عادة ، ولكن الجرعة المثلى قد تختلف اعتمادا على أنواع البكتيريا والفأر المستخدمة.

الجزء الحاسم من القسم 2 هو ضمان تغطية سرير الجرح من خلال خلع الملابس طوال تطور العدوى والعلاج. إذا لم يتم الالتزام بخلع الملابس بشكل صحيح ، يمكن أن يتسرب العلاج من سرير الجرح وقد يكون غير فعال. كما أن التضميد مهم للحفاظ على سرير الجرح محميا من الملوثات المحتملة ، وإضعاف التئام القضيب بواسطة الماوس ، وهو أمر ضروري لمحاكاة التئام الجروح البشرية. وأخيرا، فإن الجزء الحاسم من الباب 3 هو التعامل مع العينات التي تم جمعها بشكل صحيح. لتعداد CFU ، يجب شطف الأنسجة المصابة ب 1 مل من PBS قبل إضافة 1 مل آخر من PBS للتجانس. قد تتطلب المزيد من الأعضاء الليفية، مثل الرئتين، تجانسا أكثر شمولا.

وتشمل القيود الأولية لهذه البروتوكولات الرصد الدقيق المطلوب لخلع الملابس واستخدام نظام IVIS لتصوير التشتت ووضع افتراضات حول فعالية التشتت. بالنسبة للدراسات طويلة الأجل ، يمكن أن تكون إعادة نمو الفراء إشكالية لأنها يمكن أن تعيق الالتزام بضمادات موقع الجرح. غالبا ما تتطلب الضمادات استبدالها ، ويمكن أن تؤدي إزالتها إلى حطام عرضي للجرح وفرصة للتلوث. لتصور التشتت من سرير الجرح ، يجب استخدام سلالة بكتيرية مضيئة بيولوجيا. إذا كانت الأنواع البكتيرية ذات الاهتمام تفتقر إلى مراسل الإنارة الحيوية ، فإن هذا الخيار غير ممكن. وثمة قيد آخر هو إمكانية علاج التشتت للحث على البكتيريا، والتي يمكن أن تؤدي إلى موت الفأر. ومع ذلك، رأينا أن الخلايا المشتتة يمكن أن تقتل بشكل فعال بالمضادات الحيوية في الجسم الحي7.

وتوضح النتائج التمثيلية المبينة في الشكل 2 وجود قيود على IVIS لقياس فعالية التشتت. أولا، يجب استخدام سلالة مضيئة من الأنواع البكتيرية ذات الاهتمام. يجب أن تنتج السلالة إشارة مضيئة مشرقة بما يكفي للكشف من خلال طبقات متعددة من الأنسجة من أجل تصور التشتت من سرير الجرح إلى أجزاء أخرى من الجسم. وقد اقترح أن ما لا يقل عن 106 بكتيريا مطلوبة لإنتاج إشارة الإنارة قوية بما يكفي للكشف عن طريق IVIS27. كما تم وصف انخفاض في إشارة الإنارة عندما تدخل البكتيريا المرحلة الثابتة28. يمكن أن يسبب هذا قطع اتصال بين ROIs قياس و CFU تعداد29. هذا القيد يمكن أن يؤدي إلى افتراضات خاطئة عندما لا تكون هناك إشارة قوية بما يكفي للكشف، ولكن البكتيريا لا تزال موجودة. كما هو مبين في الشكل 2B، وبرنامج تلفزيوني و 10 ٪ GH العلاجات أدى إلى زيادة التلألؤ بعد العلاج. هذه ملاحظة غريبة ومتسقة ، والتي شوهدت أيضا بعد تفريق الخلايا في المختبر (كلاوديو ماركيز، جامعة بنغهامتون ، الاتصال الشخصي). من الممكن أن التعطيل المادي للبيو فيلم من إدارة العلاج ينتشر ببساطة خارج الخلايا التي كانت معبأة بإحكام، مما أدى إلى زيادة إشارة الضوء. بدلا من ذلك، يمكن لعلاج التشتت "إيقاظ" خلايا بيو فيلم التي كانت في السابق غير نشطة التمثيل الغذائي، مما أدى إلى زيادة الإضاءة الحيوية. وفي كلتا الحالتين، من الأهمية بمكان تأكيد نتائج التصوير IVIS مع بيانات CFU. وأخيرا، هناك توزيع غير متجانس للبكتيريا داخل أنسجة الجرحالمصابة 30،31. لذلك ، إذا تم تقسيم الأنسجة في الجسم الحي السابق لتوفير المزيد من العينات ، فلا ينبغي افتراض أن الحمل البكتيري في كل قسم من أقسام الجرح متطابق.

هناك تعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها التي يمكن إجراؤها للتغلب على القيود المفروضة على هذه النماذج. أولا، قد تحتاج إلى تعديل مقدار الوقت المخصص للتعرض كريم إزالة الشعر اعتمادا على أنواع الماوس المستخدمة. على سبيل المثال، عادة ما تستخدم 7 دقائق لفئران ويبستر السويسرية، في حين أن الفئران C57BL/6 قد تحتاج إلى ما يصل إلى 10 دقائق من التعرض لإزالة الفراء بنجاح. وهذا بالطبع يعتمد أيضا على المنتج المستخدم، وأوقات التعرض يجب أن لا تتجاوز أبدا تعليمات الشركة المصنعة. إذا كانت هناك دراسة طويلة (4+ أيام) ، قد تحتاج إلى إعادة تطبيق كريم إزالة الشعر لإزالة الفراء الذي أعيد زراعته وضمان ختم مناسب لخلع الملابس. بعد ذلك، إذا كان من الصعب اكتشاف إشارة الإنارة، يمكن زيادة وقت التعرض أثناء التصوير IVIS. يمكن أيضا تعديل جرعة تلقيح ووقت العدوى. من المهم استخدام جرعة إصابة ليست عالية جدا بحيث تطغى على الماوس ، ولكنها أيضا ليست منخفضة جدا بحيث يتم مسح البكتيريا على الفور من خلال الاستجابة المناعية.

في هذا البروتوكول، ونحن نصف علاج 48 ح القديمة التهابات الجرح مع عوامل التشتت، كما أن هذه هي نقطة زمنية أظهرنا العدوى الناجمة عن P. aeruginosa و / أو S. أوريوس يتم تأسيس وbiofilm المرتبطة 12،15،16. ومع ذلك ، اعتمادا على الأنواع البكتيرية ، قد تكون النقاط الزمنية الأخرى أكثر مثالية. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون الحمل البكتيري في الجرح هضبة بمجرد إنشاء عدوى. على سبيل المثال، رأينا أنه مع كل من P. aeruginosa و S. aureus، يصل الحمل البكتيري في الجرح إلى ما يقرب من 108 CFU/g من الأنسجة بنسبة 48 ساعة بعد العدوى ويظل عند هذا المستوى حتى إغلاق الجرح. يوضح الشكل 1 العلاج بمحلول يتطلب غسل 3 × 30 دقيقة. ومع ذلك ، إذا كان عامل التشتت في شكل آخر ، فلن يكون من الضروري غسله. على سبيل المثال، يمكن ببساطة وضع كريم أو جل أو خلع الملابس المهندسة على رأس سرير الجرح. وأخيرا، يمكن أن يصاب الجرح في مجموعة متنوعة من الطرق بما في ذلك تلقيح الخلايا البكتيرية العوالق، والأغشية الحيوية مسبقة التشكيل12،أو حتى أنسجة الحطام المصابة من آخر أو الإنسان19،32. لقد رأينا أن زرع بيو فيلم حيوي مسبق التشكيل أو عينة debridement على سرير الجرح يؤدي إلى التهابات متعددة الميكروبات أكثر نجاحا مما كانت عليه عندما يتم تلقيح أنواع متعددة في شكلها العوالق12.

وعموما، تصف هذه البروتوكولات أساليب دراسة تشتت الأغشية الحيوية وتقييم عوامل تشتيت الأغشية الحيوية العلاجية. تسمح هذه النماذج بتطوير العدوى المعقدة المرتبطة بالأغشية الحيوية متعددة الميكروبات التي تحاكي العدوى البشرية ذات الصلة سريريا. ويحدونا الأمل في أن تستخدم هذه البروتوكولات وتصقلها لتعزيز تطوير عوامل تشتيت مكافحة الأغشية الحيوية للاستخدام العلاجي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل منح من المعاهد الوطنية للصحة (R21 AI137462-01A1) ومؤسسة تيد ناش للحياة الطويلة ومؤسسة جاسبر ل. وجاك دينتون ويلسون ووزارة الدفاع (وزارة الدفاع W0318_19_NM_PP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher 14823434 Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle Fisher 14823434 Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt Fisher BP1760-5 Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase MP Biomedicals 2100447 Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) ZooPharm RX216118 Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase MP Biomedicals 2150583 Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream Walmart 287746 Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips Fisher 12-460-536 Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL Fisher 101406 Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer MP Biomedicals 6VFV9 Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus Vortech Pharmaceuticals 0298-9373-68 Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) Fisher 15340151 Used to homogenize samples for plating
Isoflurane Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN Sigma Aldrich K4138 Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller Fisher BP1426-2 Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable Diamond Back Drugs 2468 Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem Sigma Aldrich PHR1772-500MG Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges Fisher 13-761-52 Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain Ref [13] N/A PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes Fisher PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x Fisher BP3991 Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing Mckesson 66024007 Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar VWR 90004-394 Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M. Walmart Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads Fisher 22-363-750 Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors Fisher 89515 Can also use curved scissors
Swiss Webster mice Charles River 551NCISWWEB Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL Fisher 14823434 Used to administer drugs and enzyme treatment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rossolini, G. M., Arena, F., Pecile, P., Pollini, S. Update on the antibiotic resistance crisis. Current Opinion in Pharmacology. 18, 56-60 (2014).
  2. Stewart, P. S. Antimicrobial Tolerance in Biofilms. Microbiology Spectrum. 3 (3), (2015).
  3. Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
  4. Rumbaugh, K. P. How well are we translating biofilm research from bench-side to bedside. Biofilm. 2 (100028), (2020).
  5. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 571-586 (2020).
  6. Fleming, D., Chahin, L., Rumbaugh, K. Glycoside Hydrolases Degrade Polymicrobial Bacterial Biofilms in Wounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (2), (2017).
  7. Fleming, D., Rumbaugh, K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Scientific Reports. 8 (1), 10738 (2018).
  8. Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1501632 (2016).
  9. Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Differential Efficacy of Glycoside Hydrolases to Disperse Biofilms. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 379 (2020).
  10. Zhu, L., et al. Glycoside hydrolase DisH from Desulfovibrio vulgaris degrades the N-acetylgalactosamine component of diverse biofilms. Environmental Microbiology. 20 (6), 2026-2037 (2018).
  11. Fell, C. F., Rumbaugh, K. P. Antibacterial Drug Discovery to Combat MDR. , 527-546 (2019).
  12. Dalton, T., et al. An in vivo polymicrobial biofilm wound infection model to study interspecies interactions. PLoS One. 6 (11), 27317 (2011).
  13. Wolcott, R. D., et al. Biofilm maturity studies indicate sharp debridement opens a time- dependent therapeutic window. Journal of Wound Care. 19 (8), 320-328 (2010).
  14. Korgaonkar, A., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Community surveillance enhances Pseudomonas aeruginosa virulence during polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (3), 1059-1064 (2013).
  15. Watters, C., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice. Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).
  16. Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infection and Immunity. 82 (1), 92-100 (2014).
  17. Turner, K. H., Everett, J., Trivedi, U., Rumbaugh, K. P., Whiteley, M. Requirements for Pseudomonas aeruginosa acute burn and chronic surgical wound infection. PLOS Genetics. 10 (7), 1004518 (2014).
  18. Harrison, F., et al. A 1,000-Year-Old Antimicrobial Remedy with Antistaphylococcal Activity. mBio. 6 (4), 01129 (2015).
  19. Wolcott, R., et al. Microbiota is a primary cause of pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wound Care. 25, Sup10 33-43 (2016).
  20. Ibberson, C. B., et al. Co-infecting microorganisms dramatically alter pathogen gene essentiality during polymicrobial infection. Nature Microbiology. 2, 17079 (2017).
  21. Fleming, D., et al. Utilizing Glycoside Hydrolases to Improve the Quantification and Visualization of Biofilm Bacteria. Biofilm. 2, (2020).
  22. DeLeon, S., et al. Synergistic interactions of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an in vitro wound model. Infection and Immunity. 82 (11), 4718-4728 (2014).
  23. Darch, S. E., et al. Phage Inhibit Pathogen Dissemination by Targeting Bacterial Migrants in a Chronic Infection Model. mBio. 8 (2), (2017).
  24. Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nature Communications. 5, 4462 (2014).
  25. Beitelshees, M., Hill, A., Jones, C. H., Pfeifer, B. A. Phenotypic Variation during Biofilm Formation: Implications for Anti-Biofilm Therapeutic Design. Materials (Basel). 11 (7), (2018).
  26. Sauer, K., et al. Characterization of nutrient-induced dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm. J Bacteriol. 186 (21), 7312-7326 (2004).
  27. Kuklin, N. A., et al. Real-time monitoring of bacterial infection in vivo: development of bioluminescent staphylococcal foreign-body and deep-thigh-wound mouse infection models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 2740-2748 (2003).
  28. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).
  29. Kadurugamuwa, J. L., et al. Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).
  30. Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. Heterogeneity in biofilms. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).
  31. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
  32. Tipton, C. D., et al. Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation. PLoS One. 14 (8), 0221656 (2019).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 174، الجسم الحي السابق، في الجسم الحي،بيو فيلم، التشتت، عدوى الجرح، عامل مضاد للبيو فيلم، Pseudomonas aeruginosa
تقييم تشتت بيو فيلم في جروح مورين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Redman, W. K., Welch, G. S.,… More

Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds. J. Vis. Exp. (174), e62136, doi:10.3791/62136 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter