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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Beurteilung der Biofilmausbreitung in murinen Wunden

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62136
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,2,3
1Department of Surgery, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Immunology and Molecular Microbiology, Texas Tech University Health Sciences Center, 3TTUHSC Surgery Burn Center of Research Excellence, Texas Tech University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Hier beschreiben wir ex vivo und in vivo Methoden zur Beurteilung der bakteriellen Ausbreitung aus einer Wundinfektion bei Mäusen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Wirksamkeit topischer antimikrobieller und Anti-Biofilm-Therapien zu testen oder die Ausbreitungskapazität verschiedener Bakterienstämme oder -arten zu bewerten.

Abstract

Biofilmbedingte Infektionen sind an einer Vielzahl chronischer Erkrankungen wie nicht heilenden diabetischen Fußgeschwüren, chronischer Sinusitis, wiederkehrender Mittelohrentzündung und vielem mehr beteiligt. Mikrobielle Zellen innerhalb dieser Infektionen werden durch eine extrazelluläre polymere Substanz (EPS) geschützt, die verhindern kann, dass Antibiotika und Wirtsimmunzellen die Infektion beseitigen. Um dieses Hindernis zu überwinden, haben die Forscher begonnen, Dispersionsmittel als potenzielle Therapeutika zu entwickeln. Diese Wirkstoffe zielen auf verschiedene Komponenten innerhalb des Biofilms EPS ab, schwächen die Struktur und initiieren die Ausbreitung der Bakterien, was theoretisch die Antibiotikapotenz und die Immunclearance verbessern kann. Um die Wirksamkeit von Dispersionsmitteln bei Wundinfektionen zu bestimmen, haben wir Protokolle entwickelt, die die Ausbreitung von Biofilmen sowohl ex vivo als auch in vivomessen. Wir verwenden ein chirurgisches Exzisionsmodell der Maus, das gut beschrieben wurde, um biofilm-assoziierte chronische Wundinfektionen zu erzeugen. Um die Ausbreitung in vivo zuüberwachen, infizieren wir die Wunden mit Bakterienstämmen, die Luciferase exprimieren. Sobald sich reife Infektionen etabliert haben, bewässern wir die Wunden mit einer Lösung, die Enzyme enthält, die Bestandteile des Biofilms EPS abbauen. Anschließend überwachen wir die Lage und Intensität des Leuchtsignals in den Wund- und Filterorganen, um Informationen über den erreichten Ausbreitungsgrad zu erhalten. Für die Ex-vivo-Analyse der Biofilmausbreitung wird infiziertes Wundgewebe in biofilmabbauende Enzymlösung getaummt, wonach die im Gewebe verbleibende Bakterienlast im Vergleich zur Bakterienlast in Lösung bewertet wird. Beide Protokolle haben Stärken und Schwächen und können optimiert werden, um die Wirksamkeit von Ausbreitungsbehandlungen genau zu bestimmen.

Introduction

Der Anstieg der Antibiotikaresistenz weltweit führt zu einem Mangel an Antibiotika-Optionen zur Behandlung einer Vielzahl von bakteriellen Infektionen1. Zusätzlich zur Antibiotikaresistenz können Bakterien eine Antibiotikatoleranz erlangen, indem sie einen Biofilm-assoziierten Lebensstilannehmen 2. Ein Biofilm ist eine Gemeinschaft von Mikroorganismen, die durch eine Matrix aus Polysacchariden, extrazellulärer DNA, Lipiden und Proteinen3geschützt sind, die zusammen als extrazelluläre polymere Substanz (EPS) bezeichnet werden. Da die Antibiotikaresistenzkrise andauert, werden neue Strategien, die den Einsatz von Antibiotika verlängern oder die Wirksamkeit von Antibiotika potenzieren, dringend benötigt. Anti-Biofilm-Wirkstoffe sind eine vielversprechende Lösung4.

Unter den verschiedenen Anti-Biofilm-Strategien, die vorgeschlagen wurden, steht die Verwendung von Dispersionsmitteln, die auf verschiedene Komponenten des Biofilm-EPS abzielen, an der Spitze der therapeutischen Entwicklung5. Glykosidhydrolasen (GH) sind eine solche Klasse von Dispersionsmitteln. GH sind eine große Klasse von Enzymen, die die Spaltung verschiedener Bindungen innerhalb der Polysaccharide katalysieren, die dem EPS strukturelle Integrität verleihen. Unsere Gruppe und andere haben gezeigt, dass GH Biofilme effektiv abbauen, Ausbreitung induzieren und die Antibiotikawirksamkeit für eine Reihe verschiedener Bakterienarten verbessern kann, sowohl in vitro als auch in vivo6,7,8,9,10,11.

Mit einem wachsenden Interesse an der Ausbreitung von Biofilmen ist es wichtig, wirksame Methoden zu entwickeln, die die Ausbreitungseffizienz bewerten. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Behandlung von Biofilm-assoziierten Wundinfektionen mit einem Ausbreitungsmittel bei Mäusen und die Beurteilung der Ausbreitungswirksamkeit, in vivo und ex vivo. Das übergeordnete Ziel ist es, effektive Methoden bereitzustellen, die mit präklinischen Modellen verwendet werden können, um die Biofilmausbreitung effektiv und effizient zu messen.

Ein murines chirurgisches Exzisionsinfektionsmodell wurde in diesen Studien verwendet, um eine Biofilm-assoziierte Infektion zu etablieren. Wir verwenden dieses Modell seit über 15 Jahren und veröffentlichen unsere Beobachtungen ausführlich7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Im Allgemeinen ist dies ein nicht-tödliches Infektionsmodell, bei dem Bakterien im Wundbett lokalisiert bleiben und biofilm-assoziiert sind (Bakterien in Aggregaten, die von EPS umgeben sind), was zu einer chronischen Infektion führt, die bis zu 3 Wochen dauert. Wenn Mäuse jedoch immungeschwächt sind (z. B. mit Typ-1-Diabetes), können sie in diesem Modell anfälliger für die Entwicklung einer tödlichen systemischen Infektion werden.

In diesem Bericht stellen wir Protokolle zur Beurteilung der Ausbreitung von Bakterien aus einer Wunde sowohl in vivo als auch ex vivo zur Verfügung. Beide Protokolle können verwendet werden, um die Wirksamkeit eines Dispersionsmittels zu untersuchen und haben ihre eigenen Stärken und Schwächen. Zum Beispiel kann die Beurteilung der Ausbreitung in vivo wichtige Echtzeitinformationen über die Ausbreitung von Bakterien auf andere Teile des Körpers nach der Ausbreitung liefern und wie der Wirt reagiert. Auf der anderen Seite kann die Beurteilung der Ausbreitung ex vivo für das Screening mehrerer Wirkstoffe, Dosen oder Formulierungen wünschenswerter sein, da das Gewebe in mehrere Abschnitte unterteilt werden kann, die separat getestet werden können, wodurch die Anzahl der benötigten Mäuse reduziert wird. Bei der Beurteilung mehrerer Wirkstoffe messen wir typischerweise die Ausbreitung zuerst in vitro, wie zuvor beschrieben 6,9,22. Wir testen dann die effektivsten ex vivo und reservieren in vivo Tests für eine begrenzte Anzahl von sehr vielversprechenden Wirkstoffen.

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Protocol

Dieses Tierprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee des Texas Tech University Health Sciences Center (Protokollnummer 07044) überprüft und genehmigt. Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt.

1. Bakterien auf Mausinfektionen vorbereiten

HINWEIS: Hier beschreiben wir die Infektion von Mäusen nur mit Pseudomonas aeruginosa. Andere Bakterienarten können jedoch verwendet werden, um eine Infektion zu verursachen. Bakterienstämme und -materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

  1. Verwenden Sie Pseudomonas aeruginosa Wildtyp-Stamm PAO1, der das Lumineszenzplasmid pQF50-lux23 für diese Experimente trägt, wie zuvor beschrieben7.
  2. P. aeruginosa-Stämme in verblüfften Erlenmeyerkolben mit Schütteln bei 200 U/min in Luria-Bertani (LB)-Brühe bei 37 °C für 16 bis 20 h züchten. Fügen Sie der Nachtkultur von PAO1 (pQF50-lux) eine Endkonzentration von 100 μg/ ml Ampicillin hinzu, um das Plasmid zu erhalten.
  3. Subkultur P. aeruginosa durch Zugabe von 100 μL der Nachtkultur in einen Erlenmeyerkolben mit 10 ml LB-Brühe mit einer Endkonzentration von 100 μg/ml Ampicillin. Dann 2-2,5 h bei 37 °C unter Schütteln auf einen OD600 nm von 0,4 wachsen und dann für eine infektiöse Dosis von etwa 10 4 Zellen dreimal seriell verdünnen (1:10).

2. Herstellung des Biofilm-Dispersionsenzyms

HINWEIS: Für diese Studie verwenden wir eine 10% ige Lösung aus gleichen Teilen Amylase und Cellulase (jeweils 5%), die als "GH" bezeichnet wird, für die Ausbreitungsbehandlung.

  1. Verwenden Sie eine 10% ige GH-Lösung (w/v) von Amylase (aus Bacillus subtilis)und Pilzcellulase (aus Aspergillus niger),verdünnt in 1x Phosphatpuffersalzlösung (PBS). Verwenden Sie PBS als Fahrzeugsteuerungsbehandlung.
  2. Alle Behandlungen für 30 min zur Enzymaktivierung auf 37 °C erwärmen.

3. Versuchstiere und präoperativer Aufbau

  1. Hausmäuse, 5 Wurfgefährten pro Käfig, unter umweltkontrollierten Bedingungen, mit 12 h Hell-Dunkel-Zyklen und richtigem Zugang zu Nahrung und Wasser.
  2. Verwenden Sie vorzugsweise weibliche Schweizer Webster-Mäuse, die zwischen 8 und 10 Wochen alt sind.
  3. Wiegen Sie Mäuse, um die richtige Menge an Anästhesie zu bestimmen.
  4. Anästhesie durch intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg Ketamin 10 mg/kg Xylazin verabreichen.
  5. Tragen Sie die Augencreme (z. B. Refresh P.M.) vorsichtig mit einem Wattestäbchen auf das Auge auf, um die Trockenheit zu reduzieren.
  6. Überwachen Sie physiologische Parameter wie Atemfrequenz, Hautfärbung und Körpertemperatur während der gesamten Operation.

4. Dorsale Exzisionschirurgie mit voller Dicke

  1. Beurteilen Sie die chirurgische Ebene der Anästhesie durch Zehenklemme und Überwachung der Atemfrequenz und -anstrengung. Rasieren Sie die dorsale Oberfläche und tragen Sie eine Enthaarungscreme für 10 Minuten (oder gemäß den Anweisungen des Produkts) auf, wonach Sie sie sanft entfernen und sicherstellen, dass die Haut trocken ist.
  2. Zur Schmerzbehandlung 0,05 ml Lidocain subkutan in den zu entfernenden Bereich verabreichen und 0,02 ml Buprenorphin subkutan in den Halsspritze injizieren. Warten Sie 10 Minuten, um sicherzustellen, dass die Schmerzbehandlung erreicht wurde.
  3. Vor der Exzision die dorsale Oberfläche mit einem Alkoholtupfer desinfizieren und einen Kreis mit einem Durchmesser von 1,5 cm in Richtung des hinteren Teils des Rückens ziehen. Pflegen Sie während des gesamten Eingriffs ein steriles Operationsfeld und verwenden Sie autoklavierte Instrumente und sterile Handschuhe. Um die Kontamination zu begrenzen, führen Sie die Operation mit einem beleuchteten Bunsenbrenner durch und verwenden Sie saubere Werkzeuge für jedes Tier.
  4. Verabreichen Sie eine hautgroße, exzisive Hautwunde auf das Niveau des Panniculus-Muskels mit einer chirurgischen Schere.
  5. Nach der Exzision die Wunden sofort mit einem semipermeablen Polyurethanverband abdecken.
  6. Injizieren Sie etwa 104 KBE Bakterien in 100 μL PBS unter dem Verband auf das Wundbett, um eine Infektion zu etablieren.
    HINWEIS: Wunden können auch mit mehreren Bakterienarten und / oder Pilzen gleichzeitig infiziert werden, oder indem vorgeformte Biofilme12oder sogar Debridementgewebe von Patienten19auf das Wundbett gelegt werden.
  7. Legen Sie die Mäuse nach der Infektion in einen Käfig mit Heizkissen und überwachen Sie, bis sie ihren Aufrichtreflex wiedererlangt haben.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Mäuse nicht erkältet werden, da dies zum Tod führen kann.
  8. Stellen Sie Wundinfektionen für 48 h fest.
  9. Überprüfen Sie die Klebeverbände täglich auf Risse und Bereiche mit Nichthaftung und ersetzen Sie sie bei Bedarf.

5. In-vivo-Ausbreitungsbehandlung

HINWEIS: Hier beschreiben wir die Verabreichung der Dispersionsmittel durch Anwendung einer Reihe von 3 topischen Wundbewässerungslösungen (Abbildung 1). Das Protokoll kann jedoch für andere Arten der Verabreichung wie das Auftragen von Gelen, Cremes oder Dressings angepasst werden.

  1. Legen Sie Mäuse während der Verabreichung der Behandlungen unter Isoflurananästhesie (bei 3% und 1 L pro Minute Sauerstoff).
  2. Bereiten Sie drei 1-ml-Spritzen mit 25 G-Nadeln vor, die 200 μL Behandlung für jede Maus enthalten.
  3. Injizieren Sie 200 μL Enzymlösung oder PBS-Kontrolle auf die Wunde, indem Sie die Haut vorsichtig mit einer Zette etwas oberhalb der Wunde in Richtung des Kopfes des Tieres anheben und einklemmen. Stechen Sie die Spritze vorsichtig durch die angehobene Haut und injizieren Sie die Lösung langsam zwischen dem Verband und dem Wundbett. Der in dieser Studie verwendete Verband haftet oft sowohl am Wundbett als auch am umgebenden Gewebe.
    1. Um sicherzustellen, dass das gesamte Wundbett mit Lösung bedeckt ist, heben Sie den Verband vorsichtig mit einer Zette an, ziehen Sie ihn vom Wundbett weg, während Sie die Lösung langsam injizieren.
  4. Nach der Behandlung legen Sie die Mäuse für 30 Minuten wieder in ihre Käfige.
  5. Nach 30 Minuten Exposition gegenüber der Behandlung die Mäuse erneut mit Isofluran betäuben und die Lösung mit einer Spritze absaugen, wobei Sie sicherstellen, dass sie im selben Bereich wie zuvor punktiert wird.
    HINWEIS: Diese aspirierte Lösung enthält dispergierte Bakterienzellen, die für verschiedene nachgeschaltete Analysen gespeichert werden können.
  6. Verabreichen Sie die zweite und dritte Bewässerungsbehandlung als erste, wobei Sie jedes Mal eine neue Spritze verwenden.

6. In-vivo-Ausbreitungsbildgebung und -analyse

HINWEIS: Wenn ein lumineszierender Bakterienstamm verwendet wird, um eine Infektion auszulösen, kann ein In Vivo Imaging System (IVIS) verwendet werden, um die Ausbreitung aus dem Wundbett zu visualisieren.

  1. Bild von Mäusen unmittelbar vor und nach der Behandlung und nach 10 und 20 Stunden nach der Behandlung (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 1).
  2. Führen Sie die Bildgebung durch, während Mäuse unter Betäubung stehen, indem Sie sie einzeln in das IVIS legen und jede für 5 s bei einer Wellenlänge von 560 nm abbilden. Speichern Sie Bilder zur weiteren Analyse.
    HINWEIS: Die optimale Wellenlänge und Belichtungszeit hängt vom verwendeten Reporter und dem IVIS-Instrument und der Bildgebungssoftware ab.
  3. Zur Analyse öffnen Sie Bilder in der IVIS-Software und wählen den zu analysierenden Bereich in der Werkzeugpalette aus.
  4. Um den Hintergrund zu berücksichtigen, platzieren Sie einen Kreis auf dem Hintergrund eines Fotos und platzieren Sie dann den gleich großen Kreis auf dem Wundbett für jede Maus.
  5. Um Messwerte hochzuladen, wählen Sie View -> Region of Interest (ROI)-Messungen (Region of Interest) und laden Sie die Messtabelle in eine Tabelle hoch. Subtrahieren Sie den Hintergrundkreiswert von jeder der Wundbettmessungen, um die Lumineszenz für jede Probe zu berechnen. Berechnen Sie die prozentuale Lumineszenz, die sich geändert hat durch:
    ROI Vorbehandlung-ROI Nachbehandlung/ ROI Vorbehandlung) x 100.
    HINWEIS: Kontroll- und behandelte Mäuse sollten gleichzeitig analysiert werden, um variablen zu normalisieren, die die Bildaufnahme oder Die Strahlungsstärke beeinflussen können.

7. Bewertung der Ausbreitung durch Bestimmung der KBE

  1. Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 0,2 ml Pentobarbitalnatrium (z. B. Fatal Plus) unter Anästhesie mit 100 mg/kg Ketamin 10 mg/kg Xylazin human einschläfern.
  2. Ernten Sie Wundbettgewebe, indem Sie zuerst den Verband vorsichtig mit einer sterilen Handzette entfernen und dann mit einer sterilen chirurgischen Schere um den Umfang des Wundbettes schneiden. Heben Sie vorsichtig ein Ende des Wundbettes mit einer Zette an, während Sie die Probe mit einer Schere von der Muskelschicht abschneiden / necken.
  3. Legen Sie das Gewebe aus dem Wundbett in ein vormarkiertes und vorgewogenes 2-ml-Homogenisierungsröhrchen mit 1 ml PBS. Wiegen Sie die Röhrchen nach dem Einsetzen der Proben erneut und kehren Sie dann vorsichtig 3-5 Mal um, um dispergierte oder lose anhaftende Bakterien abzuspülen, und entfernen Sie das PBS. Fügen Sie 1 ml frisches PBS hinzu.
  4. Um die Milz zu ernten, legen Sie Mäuse in eine anatomische Rückenlage und sichern Sie sie, indem Sie ihre Extremitäten an eine Sezieroberfläche heften. Weichen Sie den zu sezierenden Bereich mit 70% Ethanol ein, um den Bereich zu desinfizieren und zu verhindern, dass das Fell die Probe kontaminiert.
  5. Machen Sie vorsichtig einen kleinen Schnitt senkrecht zur Mittellinie mit einer chirurgischen Schere in der Dermis des Unterbauchs und achten Sie darauf, die Haut von den inneren Organen nach oben und weg zu ziehen. Setzen Sie den Schnitt innerlich entlang der Mittellinie fort, bis das Brustbein erreicht ist. Sobald die Peritonealhöhle freigelegt war und die inneren Organe sichtbar waren, trennen Sie die Milz vorsichtig vom Bindegewebe und legen Sie sie in ein separates Homogenisierungsröhrchen.
  6. Milz wiegen und mit PBS abspülen, wie für das Wundbettgewebe beschrieben.
    HINWEIS: Andere Organe von Interesse können in ähnlicher Weise entnommen werden.
    1. Achten Sie beim ersten Schnitt darauf, dass der Darm oder andere Organe nicht punktiert werden.
  7. Homogenisieren Sie Proben in 2 ml vorgefüllten Perlenmühlenröhrchen mit einem Tischhomogenisator bei 5 m/s für 60 s zweimal.
  8. Um die KBE aufzuzählen, verdünnen Sie Proben und Spot-Plate seriell auf selektivem Agar. Zur seriellen Verdünnung 100 μL der Probe in 900 μL PBS in einem 1,5 ml Röhrchen, Wirbel, pipetten und 5 Mal wiederholen. Pipetten Sie 10 μL jeder Verdünnung auf eine Agarplatte, wie in Abbildung 3 dargestellt.
    HINWEIS: Wenn eine genauere CFU-Quantifizierung erforderlich ist, verteilen Sie 100 μL jeder Verdünnung der Probe auf separate Agarplatten.

8. Ex-vivo-Bewertung der Ausbreitung (Abbildung 4)

  1. Verwundete Mäuse und infizieren Sie sich mit etwa 104 PAO1 wie oben beschrieben, und euthanasieren Sie dann 48 h nach der Infektion.
  2. Entfernen Sie den Verband vorsichtig mit einer Zette, mit steriler Technik und ohne das Wundbett zu stören.
  3. Verwenden Sie eine sterile chirurgische Schere, um den Umfang des Wundbettes von der nicht infizierten Haut wegzuschneiden, indem Sie mit einer Ziffe ein Ende des Wundbettes anheben, und eine Schere, um infiziertes Wundgewebe aus der Muskelschicht unter und um das nicht infizierte Gewebe zu entfernen. Wundbettproben in gleiche Teile aufteilen oder ganz verwenden.
  4. Wundgewebe in leere, vorgewogene 2 mL Perlenmühle Homogenisierungsröhrchen geben. Wiegen Sie die Röhrchen nach dem Hinzufügen der Probe erneut. Berechnen Sie das Gewicht der Probe wie:
    Gewicht nach dem Hinzufügen der Probe - Gewicht vor dem Hinzufügen der Probe.
  5. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu und kehren Sie das Röhrchen 3-5 Mal vorsichtig um, um die Probe zu spülen und alle planktonischen Zellen zu entfernen. Entfernen und verwerfen Sie das PBS.
  6. 1 ml GH-Behandlung (oder PBS als Negativkontrolle) in die Probe geben und 2 h bei 37 °C mit Schütteln bei 80 U/min inkubieren.
  7. Entfernen Sie die Biofilm-Dispergierlösung und legen Sie sie in ein separates 1,5-ml-Röhrchen. Diese enthält die dispergierten Zellen.
  8. Fügen Sie 1 ml PBS zur verbleibenden Gewebeprobe hinzu und kehren Sie vorsichtig 3-5 Mal um, um die verbleibenden dispergierten Zellen abzuspülen. Entfernen und verwerfen Sie das PBS.
  9. Fügen Sie 1 ml PBS zum verbleibenden Gewebe hinzu und homogenisieren Sie mit 5 m/s für 60 s mit einem Tischhomogenisator.
  10. Verdünnen Sie die Lösung der dispergierten Zellen und die homogenisierte Gewebeprobe seriell, indem Sie 100 μL der Probe in 900 μL PBS in einem 1,5-ml-Röhrchen geben und fünfmal für insgesamt 6 Verdünnungen wiederholen.
  11. Spotplatte 10 μL jeder Verdünnung auf medienselektives Agar (z. B. Pseudomonas Isolation Agar für P. aeruginosa) und inkubieren die Platten bei 37 °C über Nacht.
  12. Zählen Sie die CFU und berechnen Sie den "prozentual dispergierten" als (CFU im Überstand/ (CFU im Überstand+ CFU im Biofilmgewebe)) x 100.

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Representative Results

In diesem Experiment wurden 8-10 Wochen alte weibliche Schweizer Webster-Mäuse mit 104 KBE PAO1 infiziert, die das Lumineszenzplasmid pQF50-lux trugen. Wie oben beschrieben, durfte eine Infektion für 48 h etabliert werden, bevor 3 x 30 Minuten Behandlungen von entweder PBS (Fahrzeugkontrolle) oder 10% GH (Behandlung) verabreicht wurden, um das Biofilm-EPS zu verdauen. Mäuse wurden vor der Behandlung, direkt nach der Behandlung (0 h) und nach 10 h und 20 h nach der Behandlung abgebildet. Abbildung 2A und ergänzende Abbildung 1 zeigen eine etablierte Infektion im Wundbett, die ein helles biolumineszierendes Signal erzeugt. Die Ausbreitung von Bakterien aus dem Wundbett kann unmittelbar nach der GH-Behandlung (0 h), nicht aber nach der PBS-Behandlung sichtbar gemacht werden. Es sollte beachtet werden, dass wir in früheren Studien Bakterien im Blut und in der Milz bereits 5 h nach GH-Behandlung7nachgewiesen haben. Die bakterielle Ausbreitung in die Organe kann auch beobachtet werden, indem die Maus zur Bildgebung auf die Seite gelegt wird, wie in der unteren Abbildung 2Agezeigt.

Bilder sowohl von den PBS- als auch von den GH-behandelten Mäusen zeigten einen Anstieg des Lumineszenzsignals nach 20 Stunden nach der Behandlung im Vergleich zur Vorbehandlung (Abbildung 2B). Wir vermuten, dass dies auf die mechanische Störung des Biofilms zurückzuführen ist, die durch die Bewässerung der Lösung verursacht wird. Nach 20 Stunden nach der Behandlung wurden die Mäuse eingeschläfert und die Wundbetten und Milz wurden gesammelt, um CFU / Gramm Gewebe aufzuzählen. Während die Bakterienbelastungen in den Wundbetten ähnlich waren (Abbildung 2C), wurden Bakterien nur in der Milz von GH-behandelten Mäusen nachgewiesen (Abbildung 2D), was auf eine disseminierte Ausbreitung der verteilten Bakterien hindeutet.

Zuvor haben wir gezeigt, dass die GH-Behandlung Aggregate von Bakterien aufbrechen und die CFU-Anzahl verbessern kann21. Dies könnte die leichte Zunahme der Bakterienbelastung in den Wundbetten der GH-behandelten Mäuse erklären. Schließlich, obwohl die GH-behandelten Wundbetten etwas höhere CFU / Gramm hatten, gab es eine geringere prozentuale biolumineszierende Veränderung. Diese Ergebnisse legen nahe, wie wichtig es ist, die Lumineszenz mit CFU-Zählungen zu bestätigen. Diese repräsentativen Ergebnisse geben ein Beispiel für Daten, die mit den oben beschriebenen Protokollen gesammelt werden können.

Figure 1
Abbildung 1. Etablierung biofilm-assoziierter Wundinfektionen und Beurteilung der Wirksamkeit von Dispersionsmitteln in vivo. Die Verbände wurden vor der Behandlung auf Tränen oder Verlust der Haftung auf der Haut der Maus überprüft. Kompromittierte Verbände wurden ersetzt. Mäuse wurden unmittelbar vor der Verabreichung der Behandlung unter Betäubung gestellt. 200 μL Enzymlösung oder eine Fahrzeugkontrolle wurden in den Raum zwischen Wundbett und Verband injiziert. Der Verband wurde vorsichtig mit einer Zette angehoben, um sicherzustellen, dass die gesamte Wunde in Lösung gesättigt war. Die Behandlung wurde 30 Minuten auf dem Wundbett belassen. Nach 30 Minuten wurde die Behandlung mit einer Spritze aspiriert und weitere 200 μL Behandlung hinzugefügt. Dies wurde für insgesamt 3 Behandlungen wiederholt. Um die Ausbreitung in Echtzeit zu messen, wurden Mäuse mit IVIS vor der Behandlung, unmittelbar nach der Behandlung (0 h), 10 h und 20 h nach der Behandlung abgebildet. Nach 20 Uhr nach der Behandlung wurden die Mäuse eingeschläfert und die Wundbetten und Milz gesammelt. Die Proben wurden in PBS gespült und dann zweimal bei 5 m/s für 60 s in frischem PBS homogenisiert. Die Proben wurden dann seriell verdünnt und punktuell plattiert. CFU wurden aufgezählt und CFU/Gramm berechnet. Der Grad der Ausbreitung von Bakterien aus der Wunde kann entweder durch IVIS oder durch Bestimmung der Anzahl der CFU, die sich systemisch auf die Milz ausbreiten, beurteilt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2. Repräsentative Daten zeigen, wie die Ausbreitung in vivo zu beurteilen ist. Wunden, die mit 104 PAO1 (pQF50-lux) für 48 h infiziert waren, wurden entweder mit PBS oder 10% GH (Biofilm dispersal enzyme solution) behandelt. Die PBS-Behandlung wurde als Fahrzeugsteuerung eingesetzt. Die Wundbetten wurden mit 3 x 30 min Behandlungen behandelt. Mäuse wurden mit IVIS vor der Behandlung, unmittelbar nach der Behandlung, 10 Stunden nach der Behandlung und 20 Stunden nach der Behandlung abgebildet. Es ist zu beachten, dass die Seitenansichtsbilder von anderen PBS- und GH-behandelten Mäusen stammen als die in den Overhead-View-Bildern (A)gezeigten . Die ROIs für jedes Wundbett vor der Behandlung und jedes Wundbett nach der Behandlung wurden aufgezeichnet. Die prozentuale Veränderung gegenüber der Vorbehandlung wurde berechnet als (ROI Vorbehandlung-ROI Nachbehandlung/ ROI Vorbehandlung) x 100 (B). Nach 20 Stunden nach der Behandlung wurden Mäuse eingeschläfert. Die Wundbetten und Milz wurden gesammelt und gewogen, um KBE/Gramm (C bzw. D)zu bestimmen. N=3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3. Serielle Verdünnung und Spotbeschichtung. Die homogenisierte Probe wurde vortexiert und 100 μL wurden in ein 1,5 mL Eppendorf-Röhrchen mit 900 μL PBS überführt. Die Probe wurde vortexed und 100 μL wurden in ein weiteres 1,5 mL Eppendorf Röhrchen mit 900 μL PBS überführt. Dieser Vorgang wurde 5 Mal wiederholt. Beginnend mit dem letzten Verdünnungsröhrchen wurden 10 μL Probe punktuell auf die Agarplatte an Spot 10-8 plattiert. Dies wurde bis zur Verdünnung10-3fortgesetzt. Typischerweise führt die10-3-Verdünnung zu einem Rasen von Bakterien innerhalb der Stelle. Einige Organe, die eine geringe Bakterienbelastung aufweisen, können eine Punktbeschichtung bis zur10-1-Verdünnung erfordern. Wiederholen Sie dies für jede Gewebeprobe. Legen Sie die Agarplatte für 24-48 h in einen Inkubator bei 37 °C oder wachsen Sie unter Bedingungen, die für die interessierende Bakterienart optimal sind. Um die KBE aufzuzählen, zählen Sie einzelne Kolonien mit der geringstmöglichen Verdünnung und multiplizieren Sie sie mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor, um die KBE / ml zu bestimmen, oder verwenden Sie das Gewebegewicht, um die KBE / g des Gewebes zu berechnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4. Messung der Ausbreitung von infiziertem Gewebe ex vivo. Mäuse wurden eingeschläfert und das infizierte Wundgewebe aseptisch entfernt. Das infizierte Gewebe wurde in ein 2 mL Wulstmühlen-Homogenisierungsröhrchen gegeben und kurz mit PBS gespült. 1 ml Dispergiermittel wurde zugegeben und die Probe wurde für 2 h bei 37 °C unter Schütteln bei 80 U/min inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Lösung, die die dispergierten Zellen enthielt, entfernt und in ein separates 1,5-ml-Röhrchen gegeben. Das restliche Gewebe wurde mit 1 ml PBS gespült. 1 ml frisches PBS wurde dem Gewebe zugesetzt und mit 5 m/s für 60 s homogenisiert. Die Enzymlösung und das homogenisierte Gewebe wurden dann seriell verdünnt und punktuell auf selektives Agar plattiert. Die CFU wurden aufgezählt und die Ausbreitung wurde wie folgt berechnet: CFU aus Enzymlösung/ (CFU aus Enzymlösung + CFU aus Gewebe) x 100. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1. Messung der In-vivo-Ausbreitung. Die Wunden wurden48 h lang mit 10 4 PAO1 (pQF50-lux) infiziert und dann entweder mit PBS oder 10% GH (Biofilm dispersal enzyme solution) behandelt. Die PBS-Behandlung wurde als Fahrzeugsteuerung eingesetzt. Die Wundbetten wurden mit 3 x 30 min Bewässerungsbehandlungen behandelt. Mäuse wurden mit IVIS vor der Behandlung, unmittelbar nach der Behandlung, 10 Stunden nach der Behandlung und 20 Stunden nach der Behandlung (A) abgebildet. Nach 20 Stunden nach der Behandlung wurden Mäuse eingeschläfert. Die Wundbetten und Milz wurden gesammelt und gewogen, um KBE/Gramm (B bzw. C)zu bestimmen. N=3. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Hier beschreiben wir Protokolle, mit denen die Wirksamkeit von Biofilm-Dispersionsmitteln untersucht werden kann. Diese Protokolle können leicht an die Verwendung mit verschiedenen Arten von Ausbreitungsmitteln, Bakterienarten oder Ex-vivo-Proben, einschließlich klinischer Debridementproben, angepasst werden. Dieses Protokoll bietet auch ein klinisch relevantes Modell zur Sammlung und Untersuchung verteilter Bakterienzellen. Es wurde gezeigt, dass sich die Phänotypen verteilter Bakterienzellen von denen der planktonischen oder Biofilmzellen unterscheiden 5,24,25,26; Die Phänotypen der in vivo dispergierten Bakterien müssen jedoch noch beschriebenwerden. Wenn Dispersionsmittel therapeutisch eingesetzt werden sollen, ist es wichtig, ihre Wirksamkeit zu bestimmen und den Phänotyp zu verstehen, den diese Zellen annehmen. Darüber hinaus könnte dieses Protokoll verwendet werden, um zu untersuchen, wie Variationen in der EPS-Struktur oder Veränderungen von Signalwegen die Ausbreitung beeinflussen. Beispielsweise könnte die Ausbreitung von P. aeruginosa-Stämmen mit Mutationen in verschiedenen Exopolysaccharidkomponenten (z. B. Pel, Psl, Alginat) mit der von Wildtypstämmen verglichen werden.

Insgesamt kann dieses Protokoll in vier Hauptabschnitte unterteilt werden: (1) Feststellung einer Infektion, (2) Verabreichung einer Behandlung oder (3) Sammeln von infiziertem Gewebe für die Ex-vivo-Behandlung und (4) Bestimmung der Ausbreitungswirksamkeit. Der kritische Teil von Abschnitt 1 ist die erfolgreiche Etablierung der Infektion im Wundbett. Wenn lumineszierende Stämme verwendet werden, die Antibiotika benötigen, um die Plasmidstabilität aufrechtzuerhalten, ist es unerlässlich, die entsprechenden Antibiotika bei der Kultivierung der Stämme in Vorbereitung auf die Infektion hinzuzufügen. Es sollte auch berücksichtigt werden, dass die Plasmide während der Infektion im Tier (ohne Antibiotikadruck) möglicherweise nicht erhalten bleiben, so dass die Beurteilung der Bakterienbelastung nicht vollständig auf der IVIS-Bildgebung beruhen sollte, sondern durch CFU bestätigt werden sollte. Die impfende Dosis ist auch ein kritischer Schritt, um eine Infektion einzuleiten. Für P. aeruginosa und S. aureus wird typischerweise eine Infektionsdosis von 104-5 KBE verwendet, aber die optimale Dosis kann je nach verwendeter Bakterien- und Mausart variieren.

Der kritische Teil von Abschnitt 2 besteht darin, sicherzustellen, dass das Wundbett während der gesamten Entwicklung der Infektion und Behandlung vom Verband bedeckt ist. Wenn der Verband nicht richtig haftet, kann die Behandlung aus dem Wundbett austreten und unwirksam sein. Der Verband ist auch wichtig, um das Wundbett vor möglichen Verunreinigungen zu schützen und die kontraktile Heilung durch die Maus zu beeinträchtigen, was für die Nachahmung der menschlichen Wundheilung unerlässlich ist. Schließlich besteht der kritische Teil von Abschnitt 3 darin, die gesammelten Proben ordnungsgemäß zu behandeln. Um die KBE aufzuzählen, sollte das infizierte Gewebe vor der Zugabe von weiteren 1 ml PBS zur Homogenisierung mit 1 ml PBS gespült werden. Mehr faserige Organe, wie die Lunge, können eine gründlichere Homogenisierung erfordern.

Zu den primären Einschränkungen dieser Protokolle gehören die erforderliche engmaschige Überwachung des Verbandes und die Verwendung von IVIS zur Bildausbreitung und zur Annahme von Annahmen über die Ausbreitungswirksamkeit. Für Langzeitstudien kann das Nachwachsen von Fell problematisch sein, da es die Verbandhaftung an der Wundstelle behindern kann. Verbände müssen oft ersetzt werden, und ihre Entfernung kann zu einem versehentlichen Debridement der Wunde und der Möglichkeit einer Kontamination führen. Um die Ausbreitung aus dem Wundbett sichtbar zu machen, muss ein biolumineszierter Bakterienstamm verwendet werden. Wenn der interessierenden Bakterienart ein biolumineszierender Reporter fehlt, ist diese Option nicht realisierbar. Eine weitere Einschränkung ist das Potenzial der Ausbreitungsbehandlung, Bakteriämie auszulösen, die zum Tod der Maus führen kann. Wir haben jedoch gesehen, dass dispergierte Zellen durch Antibiotika in vivo7effektiv abgetötet werden können.

Die in Abbildung 2 dargestellten repräsentativen Ergebnisse veranschaulichen eine Einschränkung von IVIS zur Messung der Ausbreitungswirksamkeit. Zunächst muss ein lumineszierender Stamm der interessierenden Bakterienart verwendet werden. Der Stamm muss ein lumineszierendes Signal erzeugen, das hell genug ist, um durch mehrere Gewebeschichten zu erkennen, um die Ausbreitung vom Wundbett auf andere Teile des Körpers sichtbar zu machen. Es wurde vorgeschlagen, dass mindestens etwa 106 Bakterien erforderlich sind, um ein Lumineszenzsignal zu erzeugen, das stark genug ist, um es nach IVIS27zu erkennen. Eine Abnahme des Leuchtsignals wurde auch beschrieben, wenn Bakterien in die stationäre Phase28eintreten. Dies kann zu einer Trennung zwischen den gemessenen ROIs und der aufgezählten CFU29führen. Diese Einschränkung kann zu falschen Annahmen führen, wenn es kein Signal gibt, das stark genug für den Nachweis ist, aber bakterien immer noch vorhanden sind. Wie in Abbildung 2Bgezeigt, führten die PBS- und 10% GH-Behandlungen zu einer erhöhten Lumineszenz nach der Behandlung. Dies ist eine merkwürdige und konsistente Beobachtung, die auch nach der Dispergierung von Zellen in vitro beobachtet wurde (CláudiaMarques, Binghamton University, persönliche Kommunikation). Es ist möglich, dass die physikalische Störung des Biofilms durch die Verabreichung der Behandlung einfach Zellen ausbreitet, die dicht gepackt waren, was zu einem erhöhten Lichtsignal führt. Alternativ könnte eine Ausbreitungsbehandlung Biofilmzellen "wecken", die zuvor metabolisch inaktiv waren, was zu einer erhöhten Biolumineszenz führt. In jedem Fall ist es entscheidend, die Ergebnisse der IVIS-Bildgebung mit CFU-Daten zu bestätigen. Schließlich gibt es eine heterogene Verteilung von Bakterien im infizierten Wundgewebe30,31. Wenn das Gewebe ex vivo geteilt wird, um mehr Proben zu liefern, sollte daher nicht davon ausgegangen werden, dass die Bakterienbelastung in jedem Wundabschnitt identisch ist.

Es gibt Modifikationen und Fehlerbehebungen, die durchgeführt werden können, um die Einschränkungen dieser Modelle zu überwinden. Erstens muss die Zeit, die für die Exposition der Enthaarungscreme vorgesehen ist, möglicherweise in Abhängigkeit von der verwendeten Mausart angepasst werden. Zum Beispiel wird 7 min typischerweise für Schweizer Webster-Mäuse verwendet, während C57BL / 6-Mäuse bis zu 10 Minuten Exposition benötigen, um das Fell erfolgreich zu entfernen. Dies hängt natürlich auch vom verwendeten Produkt ab, und die Einwirhzeiten sollten niemals die Anweisungen des Herstellers überschreiten. Wenn eine lange Studie (4+ Tage) durchgeführt wird, muss die Enthaarungscreme möglicherweise erneut aufträcht werden, um nachgewachsenes Fell zu entfernen und eine ordnungsgemäße Abdichtung des Verbandes sicherzustellen. Wenn ein Leuchtsignal schwer zu erkennen ist, kann die Belichtungszeit während der IVIS-Bildgebung erhöht werden. Die Impfdosis und die Infektionszeit können ebenfalls angepasst werden. Es ist wichtig, eine Infektionsdosis zu verwenden, die nicht zu hoch ist, dass sie die Maus überwältigt, aber auch nicht zu niedrig ist, dass die Bakterien sofort durch die Immunantwort beseitigt werden.

In diesem Protokoll beschreiben wir die Behandlung von 48 h-alten Wundinfektionen mit Ausbreitungsmitteln, da wir zu diesem Zeitpunkt gezeigt haben, dass Infektionen durch P. aeruginosa und / oder S. aureus etabliert sind und Biofilm-assoziierte 12,15,16. Abhängig von der Bakterienart können jedoch andere Zeitpunkte optimaler sein. Idealerweise sollte die Bakterienlast in der Wunde ein Plateau erreichen, sobald eine Infektion festgestellt ist. Zum Beispiel haben wir gesehen, dass sowohl bei P. aeruginosa als auch bei S. aureus die Bakterienlast in der Wunde bis 48 h nach der Infektion etwa10 8 KBE / g Gewebe erreicht und bis zum Wundverschluss auf diesem Niveau bleibt. Abbildung 1 zeigt die Behandlung mit einer Lösung, die 3 x 30 Minuten gewaschen werden muss. Wenn das Dispergiermittel jedoch in einer anderen Form vorliegt, wären die Waschungen nicht notwendig. Zum Beispiel könnte eine Creme, ein Gel oder ein künstlicher Verband einfach auf das Wundbett gelegt werden. Schließlich kann die Wunde auf verschiedene Arten infiziert werden, einschließlich der Impfung von planktonischen Bakterienzellen, vorgeformten Biofilmen12oder sogar infiziertem Debridementgewebe von einem anderen Tier oder Menschen19,32. Wir haben gesehen, dass die Transplantation einer vorgeformten Biofilm- oder Debridementprobe auf das Wundbett zu erfolgreicheren polymikrobiellen Infektionen führt, als wenn mehrere Spezies in ihrer planktonischen Form geimpft werden12.

Insgesamt beschreiben diese Protokolle Methoden zur Untersuchung der Biofilmausbreitung und zur Bewertung therapeutischer Biofilmdispergiermittel. Diese Modelle ermöglichen die Entwicklung komplexer polymikrobieller Biofilm-assoziierter Infektionen, die klinisch relevante Infektionen beim Menschen nachahmen. Wir hoffen, dass diese Protokolle genutzt und verfeinert werden, um die Entwicklung von Anti-Biofilm-Ausbreitungsmitteln für therapeutische Zwecke voranzutreiben.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (R21 AI137462-01A1), der Ted Nash Long Life Foundation, der Jasper L. and Jack Denton Wilson Foundation und des Verteidigungsministeriums (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher 14823434 Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle Fisher 14823434 Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt Fisher BP1760-5 Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase MP Biomedicals 2100447 Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) ZooPharm RX216118 Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase MP Biomedicals 2150583 Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream Walmart 287746 Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips Fisher 12-460-536 Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL Fisher 101406 Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer MP Biomedicals 6VFV9 Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus Vortech Pharmaceuticals 0298-9373-68 Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) Fisher 15340151 Used to homogenize samples for plating
Isoflurane Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN Sigma Aldrich K4138 Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller Fisher BP1426-2 Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable Diamond Back Drugs 2468 Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem Sigma Aldrich PHR1772-500MG Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges Fisher 13-761-52 Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain Ref [13] N/A PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes Fisher PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x Fisher BP3991 Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing Mckesson 66024007 Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar VWR 90004-394 Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M. Walmart Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads Fisher 22-363-750 Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors Fisher 89515 Can also use curved scissors
Swiss Webster mice Charles River 551NCISWWEB Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL Fisher 14823434 Used to administer drugs and enzyme treatment

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References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 174 Ex vivo In vivo Biofilm Ausbreitung Wundinfektion Antibiofilmmittel Pseudomonas aeruginosa
Beurteilung der Biofilmausbreitung in murinen Wunden
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Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds. J. Vis. Exp. (174), e62136, doi:10.3791/62136 (2021).

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